人參皂甙單體Rb的製作方法

2023-11-03 03:17:42 2

專利名稱：人參皂甙單體Rb的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製品在製藥中的應用。
背景技術：
心臟機能受體內神經，體液等因素的影響，可能導致疾病的發生。內皮素-1是近年來新被發現的生物活性物質，在體內若過量的分泌能引起細胞內Ca2+超負載，致使細胞的損傷，導致各種疾病的發生。這表明血漿內皮素含量增高與疾病的發生有密切的關係。目前雖有內皮素合成抑制劑，內皮素生物效應拮抗劑，如鈣通道阻斷劑(硝苯地平、維拉帕米、尼索地平、非洛地平、氨氟地平、米貝拉地爾等)一些研究報導，但是這些都沒有在心肌細胞離子通道水平用於研究對抗內皮素-1導致的鈣超負載及心肌細胞損傷作用。更沒有研究人參皂甙單體Rb1對抗內皮素-1引起的心肌細胞L-型鈣通道紊亂致鈣超負載導致心肌細胞損傷的保護作用。因此，迫切的需要開發在離子通道水平的高效、無毒的一類新藥中藥即新型的鈣通道阻斷劑。

發明內容
本發明的目的是在離子通道水平提供新型的拮抗內皮素-1的鈣通道阻斷劑，即提供一種新藥，該藥對內皮素導致心肌細胞Ca2+超負荷而破壞心肌細胞起保護作用。
將人參皂甙單體Rb1(C54H92O23·H2O)作為鈣通道阻斷劑的藥物放置於細胞外液中即可達到上述目的，Rb1置於含有內皮素-1的心肌細胞浴液中，用於研究對抗內皮素-1所致的心肌細胞L-型鈣通道電流的增加，心肌細胞鈣超負載及心肌細胞的損傷的保護作用。其結果表明藥效明顯、穩定、無毒，劑量依賴性的阻斷了L-型鈣通道電流的增加及細胞內鈣超負載，對心肌細胞起到了明顯的改善保護作用。
下面通過實例詳細說明本發明的效果。
例1 Rb1阻滯內皮素-1增加心肌全細胞L-型Ca2+通道電流設若干實驗劑量組。每組15個豚鼠心肌細胞。用膠原酶分離豚鼠心室肌細胞，用連細胞膜片鉗技術記錄單個心室肌細胞。根據L型鈣通道的電生理學特性與藥理學特性；分別在電極充灌液與細胞浸浴液中加入TEA和TTX等試劑，以阻斷除L型鈣通道以外的其它有關類型的離子通道活動(K+通道與Na+)；根據L型鈣通道的電壓激活範圍，將保持電壓設制在-50mv，命令電壓從-50mv至+60，命令電壓間隔是10mv，每次命令電壓持續時間400ms。首先記錄正常的細胞的L-型Ca2+通道電流作為對照組，在15個心肌細胞的浴液中灌流ET-150nmol/L，在明顯的增加L-型Ca2+通道電流之後，向心肌細胞內加Rb1(100μmol)。結果表明Rb1劑量依賴性的阻滯ET-1導致的心肌細胞L-型Ca2+電流增加作用，起到了鈣通道阻斷劑的作用。結果列於表1。
表1 Rb1阻滯內皮素-1增加心肌全細胞L-型Ca2+通道電流Rb1Rb1Rb1Rb1ET-1Rb1Rb1(100μContr (100(200 (300 (400 Washi (50 Contr(μ mol)+ET-1(50ol μ μμμ ng out nmol/ olmol) nmol/L)mol)mol) mol) mol) L)-215. -177. -132. -125. -192. -423. -273.
Ampli -302.
2±8± 5± 1± 5± 6± -222.3±8±tude 7±22.42 20.35 18.14 17.56 20.13 48.56 23.25** 24.65(pA) 28.16** * * **** ** *n＝15，X±S，*p＜0.05，**p＜0.01，例2 Rb1對抗內皮素-1導致心肌細胞L-型單Ca2+通道開放概率增加的效果設若干個實驗劑量組。實驗的方法與實施例1相同。記錄正常細胞L-型單Ca2+通道開放概率，在15個穩定的心肌細胞溶液中灌流ET-1 50nmol，在明顯的增加L-型單Ca2+通道開放概率之後，向心肌細胞內再加入Rb1(100μmol)。結果表明Rb1明顯的拮抗ET-1，導致的心肌細胞L-單Ca2+通道開放概率增加的作用。結果列於表2。
表2Rb1對抗內皮素-1導致心肌細胞L-型單Ca2+通道開放概率增加的效果Open-stateDrugOpen time(mS) Close time(mS)probabilityControl 0.718±0.018.344±0.04 0.105±0.0161.044±ET 5.247±0.9** 0.179±0.015**0.0042**Et-1+Rb10.403±0.007** 7.57±0.02** 0.137±0.013**
n＝15，X±S，*p＜0.05 **p＜0.01(compared with control group).
例3 Rb1對抗ET-1導致心肌細胞延遲外向K+電流設若干個實驗劑量組。為獲得Ik電流，實驗記錄前分別將TTX(10μmol/L)和CdCl(0.1mmol/L)加入細胞浸浴液，以阻斷Na+電流與Ca2+電流。根據Ik電流的激活電壓範圍，將保持電壓設制於-40mv，命令電壓從-40mv至+50，命令電壓間隔是10mv，每次命令電壓持續時間是800ms。記錄15個細胞外向Ik電流作為對照組，15個心肌在細胞溶液中灌流ET-150nmol，可增加Ik電流，記錄15個心肌之後，向心肌細胞內加Rb1(100μmol)。觀察記錄Rb1對抗ET-1，導致的心肌Ik電流增加作用。結果列於表-3。
表-3Rb1對抗ET-1導致心肌細胞延遲外向K+電流MedicationAmplitude(pA)Control 1000.35±81.83ET 5nM2000.56±85.90**Rb1300μM+ET 5nM828.42±81.34**n＝15，X±S，**P＜0.01例4 Rb1對抗內皮素-1導致的心肌細胞內鈣超負載設若干個實驗劑量組。將成年健康豚鼠用膠原酶分離成單個心肌細胞，實驗採用Fura-2/AM測定心肌細胞內[Ca2+]i。FA-2/AM進入細胞後，經酶水解成Fura-2並與Ca2+結合，則峰值從380nm降至340nm，此時固定激發光和發射之波長，分別測定加入各種藥及對照的螢光強級F，根據公式計算出[Ca2+]i。結果列於表4表4Rb1對抗內皮素-1導致的心肌細胞內鈣超負載藥物 Original value(對照)N mol/L 5minControl對照 172.4±5.0 172.4±5.0ET-1 60nmol/L170.2±5.5 485.3±14.5**Rb1100+ET-1228±4.8169.5±5.9**Rb1200+ET-1216±5.9108.6±8.7**
Rb1300+ET-1205.6±7.6104.6±5.8**n＝15，X±S，**p＜0.01例5 Rb1改善內皮素-1導致的心肌細胞損傷作用設若干個實驗劑量組。取10隻正常的健康的成年大白鼠心臟作為對照組，經戊二醛、餓酸固定後，epon812環氧樹脂常規包埋，70μm超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色，透射電鏡照相觀察正常心肌細胞的超微結構。取10隻正常成年健康的大白鼠用內皮素-1(10μg/kg)靜脈注入，製備心肌缺血模型，取心臟，通過電鏡對比觀察內皮素-1對心肌細胞超微結構的損傷。另取10隻正常健康成年大白鼠用內皮素-1(10μg/kg)靜脈注入，五分鐘之後再從靜脈注入Rb1(40mg/kg)，通過電鏡觀察Rb1改善內皮素-1對心肌細胞超微結構損傷的作用。結果列於表-5。
表5Rb1改善內皮素-1對大鼠心肌細胞超微結構損傷的作用

藥效明顯、穩定、無毒，對心肌細胞起到了明顯的改善保護作用。
權利要求
1.人參皂甙單體Rb1在製備治療由內皮素-1導致的心細胞損傷的藥物中的應用。
全文摘要
人參皂甙單體Rb
文檔編號A61K31/7028GK1569014SQ20041001083
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月30日 優先權日2004年4月30日
發明者曾慶華, 馬越 申請人:東北師範大學