一種誘導水稻系統防禦反應產生的方法
2023-11-03 01:30:07
專利名稱：一種誘導水稻系統防禦反應產生的方法
技術領域：
本發明涉及一種稻瘟病菌基因的原核表達產物處理水稻根尖誘導水稻系統防禦反應的方法，屬於植物保護和生物技術領域。
背景技術：
植物與其病原菌共同進化了上百萬年，自然選擇促使植物產生了各種各樣的識別和抗性機制來防止和限制病原菌侵染。植物進化的同時也促使病原菌基因進化以適應或抵抗植物防禦反應使其侵染寄主達到致病的最終目的。系統防禦反應是指防禦反應的激活不只局限於病原菌侵植物的侵染點，而且植物自身未被病原菌侵染的部分也產生了防禦反應。系統防禦反應在增強植物抵抗病原菌方面具有很重要的作用。因此，研究植物系統防禦反應可為進一步研究植物與病原菌互作機制提供理論依據，同時可為今後植物病害有效防治提供重要的參考依據。
發明內容
本發明的主要目的是為鑑定植物系統防禦反應產生提供一種快速、簡便和準確的方法。本發明實施例是這樣實現的，一種稻瘟病菌基因的原核表達產物處理水稻根尖誘導水稻系統防禦反應的方法，利用一定濃度的融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處24h,苯胺藍和DAB染色後觀察除去0.5cm根尖以外的根組織的其他部位的胼胝質形成及活性氧產生情況。進一步，該基因的原核表達產物按照5.0mg/ml濃度處理黑谷根組織24h後進行苯胺藍和DAB染色，螢光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧產生，根據胼胝質和活性氧產生確定水稻系統防禦反應產生。進一步，將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物於4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配製的緩衝液懸浮菌體；在冰水浴上進行超生破碎細胞後離心收集上清；處理是將該基因的原核表達產物純化後按照5.0mg/ml的濃度處理抗病水稻品種麗江新團黑谷根尖0.5cm處24h，苯胺藍和DAB直接染色進行胼胝質和活性氧觀察。進一步，新鮮配製的緩衝液為20mM Tris-HCl, pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ；IOmM β-巰基乙醇。本發明的有益效果是利用稻瘟病菌基因的原核表達產物處理水稻根尖0.5cm處，通過觀察根尖0.5cm以外根組織其他部分胼胝質和活性氧產生，可明確水稻系統防禦反應產生的情況，克服了直接利用病原菌接種水稻葉片觀察胼胝質和活性氧產生周期長且易受到葉片組織大量自發螢光幹擾等弊端，最終達到為今後鑑定病原菌效應蛋白誘導植物系統防禦反應產生提供簡便有效的方法的目的。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。本發明實施例是保持目前原核表達產物表達純化、胼胝質及活性氧觀察方法不變，包括原核表達技術、蛋白純化技術、DAB染色、苯胺藍染色方法均與常規相同，其特徵是利用一定濃度的融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處24h，苯胺藍和DAB染色後觀察除去0.5cm根尖以外的根組織的其他部位的胼胝質形成及活性氧產生情況。該基因的原核表達產物按照5.0mg/ml濃度處理水稻品種麗江新團黑谷根組織24h後進行苯胺藍和DAB染色，螢光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧產生，根據胼胝質和活性氧產生確定水稻系統防禦反應產生，這種通過觀察未經蛋白處理的根尖以外的根組織其他部分根組織胼胝質和活性氧產生確定病原菌蛋白誘導植物系統防禦反應產生的方法較為簡便、準確、快速。實施例:5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處24h，苯胺藍和DAB染色後直接觀察根尖0.5cm以外的根組織的其他部分的胼胝質和活性氧產生情況。將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物於4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配製的緩衝液(20mM Tris-HCl, pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTAlOmMβ -巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進行超生破碎細胞後離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產物純化後按照
5.0mg/ml的濃度處理抗病水稻品種麗江新團黑谷根尖0.5cm處24h，苯胺藍和DAB直接染色進行胼胝質和活性氧觀察。對照是用PBS處理麗江新團黑谷根尖0.5cm處24h，苯胺藍和DAB直接染色進行胼胝質和活性氧觀察。結果發現麗江新團黑谷根尖0.5cm以外的根組織的其他部分均觀察到了胼胝質和活性氧產生。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種稻瘟病菌基因的原核表達產物處理水稻根尖誘導水稻系統防禦反應的方法，其特徵在於，利用一定濃度的融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處24h，苯胺藍和DAB染色後觀察除去0.5cm根尖以外的根組織的其他部位的胼胝質形成及活性氧產生情況。
2.如權利要求1所述的誘導水稻系統防禦反應的方法，其特徵在於，該基因的原核表達產物按照5.0mg/ml濃度處理黑谷根組織24h後進行苯胺藍和DAB染色，螢光顯微鏡直接觀察胼胝質和活性氧產生，根據胼胝質和活性氧產生確定水稻系統防禦反應產生。
3.如權利要求2所述的誘導水稻系統防禦反應的方法，其特徵在於，將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物於4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配製的緩衝液懸浮菌體；在冰水浴上進行超生破碎細胞後離心收集上清；處理是將該基因的原核表達產物純化後按照5.0mg/ml的濃度處理抗病水稻品種麗江新團黑谷根尖0.5cm處24h，苯胺藍和DAB直接染色進行胼胝質和活性氧觀察。
4.如權利要求3所述的誘導水稻系統防禦反應的方法，其特徵在於，新鮮配製的緩衝液為 20mM Tris-HCl，ρΗ7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ；10mM β -巰基乙醇。
全文摘要
本發明公開了一種稻瘟病菌基因的原核表達產物處理水稻根尖誘導水稻系統防禦反應的方法，利用一定濃度的融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處24h，苯胺藍和DAB染色後觀察除去0.5cm根尖以外的根組織的其他部位的胼胝質形成及活性氧產生情況。本發明的有益效果是利用稻瘟病菌基因的原核表達產物處理水稻根尖0.5cm處，通過觀察根尖0.5cm以外根組織其他部分胼胝質和活性氧產生，可明確水稻系統防禦反應產生的情況，克服了直接利用病原菌接種水稻葉片觀察胼胝質和活性氧產生周期長且易受到葉片組織大量自發螢光幹擾等弊端，最終達到為今後鑑定病原菌效應蛋白誘導植物系統防禦反應產生提供簡便有效的方法的目的。
文檔編號G01N21/64GK103175809SQ201210554679
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者楊靜, 李成雲, 劉林, 朱有勇, 趙婧, 徐暢, 施竹鳳 申請人:雲南農業大學