耐鹽鹼絨毛白蠟scar標記及其在輔助選擇育種中的應用的製作方法

2023-11-10 05:31:12

專利名稱：耐鹽鹼絨毛白蠟scar標記及其在輔助選擇育種中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種SCAR標記及其應用，尤其涉及一種耐鹽鹼絨毛白蠟SCAR標記及其在輔助選擇育種中的應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
白蠟屬全世界約70餘種，大多數分布在北半球暖溫帶，中國已有34種，其中原產 26種，國外引進8種。續毛白臘(Fraxinus VelutinaTorr.)為木庫科(Oleaceae)白臘屬 (Fraxinus Linn.)落葉喬木,原產為美國，生長快,樹幹通直,木質結構均勻，紋理美觀,易繁殖、抗逆，是優良鹽鹼地造林、園林綠化和珍貴的用材樹種。早在1911年引種到濟南(孟昭和等，2001)，1953年被轉引到天津(楊瑞興等，1996)，80年代後在華北華東地區廣泛栽培。目前已成為我國華北、華東主要沿海城市及鹽鹼地區造林和園林綠化優良樹種(時明芝，1996 ;王勤等，2000 ;倪國祥等，1995 ;王友平等，2007)。國內關於白蠟生態特性、生長習性方面的研究較多，主要側重於白蠟的耐鹽鹼性、 苗木繁育、造林技術等方面。樊寶敏(1992)報導，絨毛白蠟對呈鹼性反應的濱海鹽土較為敏感；孟康敏(1999)對5個濱海鹽鹼地引種的樹種幼苗進行盆栽耐鹽性試驗，根據光合速率、葉綠素含量、細胞膜透性、丙二醛含量、游離脯氨酸含量等5個耐鹽性生理指標進行綜合評判，結果表明絨毛白蠟耐鹽力最強；劉德璽等(2008)以鹽潰生境下1-3年生紅涔為材料，對不同樹齡紅涔的各營養器官中鹽離子分布規律進行了研究；王友平等(2009)研究了鹽潰生境下1-3年生絨毛白蠟不同營養器官中鹽離子分布規律。近年來國外報導多集中在歐洲白臘(F. excelsior)的核DNA微衛星、葉綠體微衛星標記、EST-SST標記篩選分離，以及微衛星標記在種群遺傳分析與系統發生生物地理學研究上。Heurtz等(2004)通過對全歐洲野生F. excelsior群體的葉綠體DNA與葉綠體微衛星分析認為,較低的單倍體多態是由於風媒植物的基因流影響。Bacles等(2008)利用微衛星標記進行了大尺度景觀下蘇格蘭 F. excelsior群體的花粉基因流的父本分析，花粉基因流的交換取決於群體大小，而不是地理位置。Goto等(2006)利用5個微衛星位點對日本北部濱海森林的F. mandshurica var. japonica的親本與後代的基因型分析，結果表明小範圍內親本的個體分析可以為風媒植物提供定量的分析。對絨毛白臘(F. Velutina)的相關DNA標記序列未能在GenBank上檢索到，遺傳學基礎研究十分薄弱，遺傳背景信息匱乏，這在很大程度上限制了選擇育種工作的順利開展。因此開展相應的遺傳學基礎研究、定位重要經濟性狀是我國白蠟選育工作中首先需要解決的問題。此外，傳統的白蠟分類主要依靠果實形狀和果翅數目的不同，該分類方法無法有效的在幼樹早期進行應用。因此利用分子生物學辦法、建立有效、快捷的種質鑑別方法對解決我國白蠟樹良種選育具有重要的意義。分子標記輔助選擇育種是一種新型的育種方式，應用分子標記輔助選擇育種，可有效的檢測基因型，進行QTL定位，直接通過標記基因輔助選擇含有目標基因型的個體。與傳統的育種方法相比，分子標記輔助選擇育種方法，直接以DNA形式出現，在植物體的各個組織、各發育時期均可檢測到，不受季節、環境的限制，不存在表達與否的問題；數量多，遍及整個基因組；多態性高，利用大量引物、探針可完成覆蓋基因組的分析；中性標記，即不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖共顯性標記，能夠鑑別出純合的基因型與雜合的基因型，提供完整的遺傳信息。RFLP標記、AFLP標記操作較為繁瑣，而RAPD標記準確性和穩定性較差，均不適合於大規模的田間材料的鑑定工作；SCAR標記操作簡便、準確性高、穩定性高克服了上述標記的缺點，為首選的分子標記方法。由於林木育種周期長，要改變在絨毛白蠟育種領域上的落後局面，關鍵在於儘快廣泛收集品種資源，走現代分子生物學技術與常規育種相結合的道路，縮短育種年限，加快分子標記輔助選擇利用的研究。因此，獲得耐鹽鹼絨毛白蠟SCAR標記，對於絨毛白蠟良種選育具有重要的意義，為我國耐鹽鹼林木種質的選育研究提供理論基礎和技術體系；豐富耐鹽鹼綠化樹種的遺傳多樣性，扼制土地鹽潰化，提高土地生產力；增加生態、社會和經濟效益都具有現實而深遠的意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種耐鹽鹼絨毛白蠟SCAR標記及其在用於輔助選擇育種中的應用。本發明所述的耐鹽鹼絨毛白蠟SCAR標記，其特徵在於，該SCAR標記是全長592bp 的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示。為實現上述任務，本發明採取如下步驟的技術方案(I)、以2株高耐鹽型絨毛白蠟分別為R36、R39和5株普通絨毛白蠟為材料；(2)、採用CTAB法提取絨毛白蠟葉片總DNA ；
(3)、建立並優化絨毛白蠟RAPD反應體系，獲得穩定高效的RAPD擴增結果；(4)、應用RAPD 分析篩選出一個與耐鹽鹼相關聯的分子標記S20-592 ； (5)、將耐鹽鹼基因的RAPD分子標記 S20-592克隆、測序並轉化為SCAR標記。其中步驟(I)所述的高耐鹽型絨毛白蠟R36、R39是山東省林業科學研究院劉德璽通過 20年的選育獲得。步驟⑵所述的採用CTAB法提取絨毛白蠟葉片總DNA的具體方法是1)取0. I
0.2g絨毛白蠟葉片，於液氮中研磨。加入800 ill DNA提取緩衝液含有2% (w/v)CTAB, 20mmol/LEDTA(pH = 8. 0) UOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. 0),1. 4mol/LNaCl 和 2% @ -巰基乙酉享，輕輕顛倒混勻；2)於65°C水浴中溫育30min,每IOmin顛倒輕輕混勻，12000rpm,離心 IOmin ;3)取上清700 ii L,加入等體積氯仿/異戍醇(24 I, v v),輕輕顛倒混勻,4°C, 12000rpm,離心IOmin ;4)取上清600ii I,加入等體積氯仿/異戍醇(24 : I, v : v),輕輕顛倒混勻，4°C，12000rpm,離心IOmin ；5)取上清500 U 1，加入2倍體積的冰冷的無水乙醇， 顛倒混勻，-20°C靜置30min ;6) 4°C，12000rpm，離心IOmin ；7)去上清，用預冷的75%乙醇洗漆沉澱2次，4°C, IOOOOrpm,離心5min ；8)在超淨工作檯乾燥沉澱30min,加30 y I的滅菌蒸水(ddH20)溶解沉澱，待濃度和純度檢測後，置_20°C或_70°C冰箱保存備用。步驟(3)所述的RAPD擴增的具體方法是PCR反應總體積25 yl，IOX反應緩衝液 2. l，25mM/L MgCl2 I. 8u 1,10mM/L dNTPs I. 5 y 1，30ng/y I 引物 P 2 yl，模板 DNA 2u l，2u/ul TaqDNA 聚合酶 0. 25 ii 1，ddH20 14. 95 u I ;PCR 反應條件95 °C 預變性 5min， 94°C變性 30s, 36°C退火 lmin,72°C延伸 2min,循環 44 次,72°C延伸 IOmin0 電泳 Marker 和試劑為TAKARA公司生產，擴增後用I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，GeneGenius全自動凝膠成像分析系統觀察結果並照相。
步驟(4)所述的具體方法是隨機抽取5株普通絨毛白蠟和2株高耐鹽鹼植株 R36、R39，分別建立5株普通絨毛白蠟混合基因池和R36、R39高耐鹽鹼植株3個基因池，利用上海生物工程公司合成的S系列引物150個，對高耐鹽鹼和普通絨毛白蠟混合基因池進行了 RAPD分析，發現只有S20引物的擴增產物在高耐鹽植株和普通植株中表現多態性。圖 I是引物S20的RAPD擴增結果，在耐鹽鹼植株中能觀察到一條分子量約為600bp的特異條帶的分子標記S20-592，重複試驗3次，此帶仍能穩定出現。步驟(5)所述分子標記S20-592克隆、測序並轉化為SCAR標記的具體方法是將 PCR擴增出的特異片斷S20-592DNA經I. 0%瓊脂糖凝膠電泳後，用博大泰克生產的玻璃奶試劑盒回收，操作按照試劑盒說明書進行。回收後的DNA片斷與PMD-18T Vector連接，轉化大腸桿菌DH5 a，重組質粒經T7、Sp6PCR電泳檢測，獲得陽性克隆子，送上海生物工程公司測序，其核酸序列全長592bp，具體為ggacccttaccaaatgacaatcaatttctatgtgcttggtttgttcgtggaaaactggat60
tacttgctatgcctatagcaaatgactattacagaacaacaaagcaggtctggtgtgatc120
aatttgcaagttattcaatatagtttttggccatgtaaactcacggacggctgcagccat180
tgatctgtattcagcttcagctgaagatcttgatacagtgtgttgcttcttggacttcca240
tgacacaagggaattgcccaaaaagatacaatatcctgtaatcgactgtcttgtatccga300
acatgctgcccgatcagcatCBCBBCBBCCtttgagcagaagatcagatttgctagaaat360
gaataaccctgtcttgatgagttctacagataccttaggcgtgataagctgcctccagat420
gagactgtcttggggactgaaggaattgactcagaacttgtacaggattaaataaatctg480
gcctggtaatagttaggtacaaaatcctcccaacaagccttttgtaggcattaagatcat540
ctacaggctcttcttcatcctttctcaactttaggttgcacggtaagggtCC592
將測序結果用生物信息學SMS進行分析，並通過Internet與GenBank國際基因數
據庫進行同源性分析，沒有查詢到相關的基因序列與該片斷同源，說明該片斷是與耐鹽鹼續毛白臘相關聯的新的分子標記。根據克隆片斷的DNA序列，合成了 SCAR標記特異引物(上海生物工程公司合成)， 其序列為正向引物FS20-592:5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，反向引物RS20-592:5』 CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3』用上述引物在高耐鹽鹼R36、R39和普通絨毛白蠟的5個單株中分別進行擴增，PCR反應體系總體積為25iU，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 (天根生化科技有限公司),FS20-592 (10 u mol/L) lul, Rs20-592 (10 u mol/L) I u I,模板 DNA (20ng) 2 y I， ddH208. 5 ill ;擴增反應條件為94 °C預變性4min，94 V變性30s，55 °C退火45s， 72°C I. 5min，循環 30 次，72°C延伸 lOmin。電泳 Marker 為 TAKARA 公司生產的 DL2000，擴增後用1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色後在紫外燈下觀察拍照。擴增結果表明，在高耐鹽鹼絨毛白蠟中擴增出592bp特異條帶，而在普通絨毛白蠟單株中未擴增出特異條帶，如圖2所
/Jn o為了驗證SCAR標記的可靠性，對R36高耐鹽植株Fl代分離群體抗鹽性進行了分析。結果表明在抗鹽植株個體中檢測到了 SCAR標記，而在感性植株中未檢測到SCAR標記。本發明所述耐鹽鹼絨毛白蠟的SCAR標記在用於輔助選擇育種中的應用。
本發明採用RAPD技術，尋找與耐鹽鹼性狀相關聯的RAPD分子標記，進一步轉化為穩定性、重複性強的SCAR標記，為開展耐鹽鹼絨毛白蠟分子標記輔助育種奠定了基礎，為縮短育種周期提供了技術保障。本發明獲得了續毛白臘耐鹽喊相關基因的一個穩定SCAR標記，提不該續毛白臘耐鹽鹼SCAR標記在輔助選育絨毛白臘耐鹽鹼新品系中具有廣泛應用。本發明的有益效果本發明是利用分子標記方法得到一個新的與絨毛白蠟抗鹽鹼基因相關聯的RAPD分子標記，並通過克隆、測序、引物設計，又將RAPD標記轉換成穩定的 SCAR標記，為絨毛白蠟分子標記輔助選擇育種體系奠定了基礎，與目前技術相比，其優點是1)本標記為穩定的SCAR標記，可廣泛用於耐鹽鹼絨毛白蠟分子標記的輔助選擇育種， 同時為克隆絨毛白蠟耐鹽鹼基因、基因序列分析奠定了良好的基礎，為進一步了解絨毛白蠟抗鹽鹼的分子遺傳學機理有積極意義。2)分子標記輔助選擇操作簡便，節約成本；絨毛白蠟為多年生木本植株，常規選育方法，周期長，成本高，費時費力。通過本發明只需進行簡單的PCR擴增，即可有效的鑑定材料的耐鹽性，避免了常規選育方法所需時間周期長及繁瑣的篩選過程等缺點。3)本發明通過SCAR標記可對個體進行苗期鑑定，大大提高了育種效率，縮短了育種進程。


圖I :高耐鹽鹼絨毛白蠟R36、R39和5株普通絨毛白蠟混合基因池DNA的RAPD分子標記S20-592篩選電泳譜帶圖。M-DL2000Mark ；0 :1_5株普通絨毛白蠟混合基因池DNA 的RAPD結果；R36、R39-分別為高耐鹽鹼絨毛白蠟的RAPD結果。圖2 :SCAR標記在高耐鹽鹼絨毛白蠟和普通絨毛白蠟單株中的PCR電泳譜帶圖。 M-DL2000Mark ;R36、R39-分別為高耐鹽鹼絨毛白蠟；1_5 :普通絨毛白蠟單株。圖3 :本發明應用SCAR標記對已經鑑定的抗感植株基因組DNA的電泳圖譜。M DL2000Mark ;1_10 :R36的Fl代抗性植株10株；11-20 :R36的Fl代感性植株10株。
具體實施例方式實施例I :與耐鹽鹼基因相關聯的RAPD多態性標記的獲得一、材料高耐鹽鹼絨毛白蠟R36、R39和普通絨毛白蠟由山東省林業科學研究院東營分院劉德璽提供。二、小量法DNA提取I)取0.2g絨毛白蠟葉片，於液氮中研磨。加入800iil DNA提取緩衝液含有2% (w/v)CTAB,20mmoI/LEDTA(pH = 8. 0)UOOmmoI/L Tris-HCl (pH = 8. 0),1. 4mol/LNaCl 和 2% ￠-巰基乙醇，輕輕顛倒混勻；2)於65°C水浴中溫育30min,每IOmin顛倒輕輕混勻，12000rpm,離心IOmin ；3)取上清700 ii I,加入等體積氯仿/異戍醇(24 I, V V),輕輕顛倒混勻，4°C, 12000rpm,離心 IOmin ；4)取上清600 ill，加入等體積氯仿/異戊醇(24 : I，V : V)，輕輕顛倒混勻，4°C， 12000rpm,離心 IOmin ；
6
5)取上清500 Ul，加入2倍體積的冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，_20°C靜置30min ； 6) 4°C，12000rpm,離心 IOmin ；7)去上清，用預冷的75%乙醇洗滌沉澱2次，4°C，IOOOOrpm,離心5min ；8)在超淨工作檯乾燥沉澱30min，加30 的滅菌ddH20溶解沉澱，待濃度和純度檢測後，置_20°C或_70°C冰箱保存備用。三、RAPD擴增多態性標記分析RAPD引物為S系列S1-S150，共150個，購自上海生物工程公司。優化的RAPD擴增體系為(I) PCR反應體系為IOX 反應緩衝液 2. l，25mM/L MgCl2 I. 8u 1,10mM/L dNTPs I. 5u l,30ng/u I 引物 P 1，模板 DNA(20ng)2ii l，2u/ul Taq DNA 聚合酶 0. 25 y 1，ddH20 14. 95 y I 總體積 25u I ；(2) PCR反應程序為95°C預變性 5min，94°C變性 30s，36。。退火 lmin，72°C延伸 2min，循環 44 次，72°C 延伸IOmin0取8li L擴增產物用I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳,GeneGenius全自動凝膠成像分析系統觀察結果並照相，電泳Marker和試劑為TAKARA公司生產。用150個隨機引物，分別對高耐鹽鹼和普通低絨毛白蠟基因池進行RAH)擴增，發現只有S20引物的擴增產物在高耐鹽鹼基因池和普通低耐鹽鹼基因池中表現多態性，經3 次重複擴增，在兩基因池間表現穩定、一致的差異，S20在高耐鹽鹼基因池擴增出特異條帶 S20-592，而在普通基因池缺失這條帶，獲得了與耐鹽鹼性狀相關聯的的特異片斷S20-592， 分子量大小為592bp。實施例2 :與耐鹽鹼基因相關聯的SCAR標記的獲得及鑑定一、特異片斷S20-592的回收將PCR擴增出的特異片斷S20-592DNA經I. 0%瓊脂糖凝膠電泳後，用博大泰克生產的玻璃奶試劑盒回收，操作按照試劑盒說明書進行。二、連接反應連接反應體積為IOii 1，其中含回收的DNA 5 ii I (30 50ng)，PMD-18T Vector Iu I, T4連接酶I i! I，連接緩衝液I U 1，滅菌CldH2Ol u I。反應混合物充分混勻後，在16°C 連接12小時。三、轉化I、從_70°C冰箱中取200 U I大腸桿菌DH5 a (本實驗室製備保存)感受態細胞室溫下使其解凍，解凍後立即至於冰上。2、加入10 U I連接混合物，搖勻後冰上放置30min。3、42°C熱擊混合物90s，熱擊後快速轉移到冰上冷卻2 3min。4、向離心管中加入800 ill液體LB培養基，37°C 180rpm振蕩Ih後，濃縮菌液，去掉上清800 iil，取200 ill轉化混合物塗布於固體LB培養基的平板上。將塗布好的平板在室溫下正面向上放置30min後，倒置平板，放入37°C恆溫培養箱中培養16-24h。待顯現白色菌落後，挑取白色菌落，置於IOml的LB液體培養基中，37 °C 180rpm培養過夜至對數中期，用PCR方法鑑定，將陽性克隆的菌液送至上海生物工程公司測序。四、SCAR標記的獲得及檢測I、得到了長度592bp的特異片斷SCAR標記，其核酸序列為ggacccttaccaaatgacaatcaatttctatgtgcttggtttgttcgtggaaaactggat60
tacttgctatgcctatagcaaatgactattacagaacaacaaagcaggtctggtgtgatc120
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ctacaggctc ttcttcatcc tttctcaact 2、SCAR標記獲得的PCR引物序列ttaggttgcacggtaagggtCC592根據SCAR標記序列,通過Primer軟體設計了特異引物序列為正向引物FS20-592:5』 TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3』反向引物RS20-592 :5』 CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3』，由上海生物工程公司合成。3、SCAR標記檢測用SCAR-PCR引物在高耐鹽鹼R36、R39和普通絨毛白蠟的5個單株中分別進行擴 +
>曰oPCR 反應體系為總體積為 25 ill，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 (天根生化科技有限公司)，FS20-592 (IOii mol/L) Iii 1，RS20-592 (10 u mol/L) I U 1，模板 DNA (20ng) 2u I, ddH208. 5 y I。PCR 反應條件為94°C預變性 4min，94°C變性 30s，55。。退火 45s，72。。I. 5min,循環 30 次，72°C延伸 IOmin0電泳結果擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色後在紫外燈下觀察拍照。擴增結果表明，在高耐鹽鹼絨毛白蠟中擴增出592bp特異條帶，而在普通絨毛白蠟單株中未擴增出特異條帶(圖2)。PCR擴增試劑和Marker購自TAKARA公司。實施例3 :耐鹽鹼絨毛白蠟的SCAR標記在用於輔助選擇育種中的應用取已鑑定的穩定的抗鹽植株R36的Fl代抗性植株10株及感性植株10株，分別用 CTAB法提取各個植株的DNA，然後以提取的DNA為模板進行SCAR分析。具體的，分別以上述基因組DNA為模板，利用SCAR標記的兩條引物(引物I : 5』TGCTTGGITTGITCGTGG 3』；引物 2 :5』 CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)進行 PCR 擴增，反應總體積為25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 iU (天根生化科技有限公司)，引物I (10 ii mol/ L) I u 1，引物 2(10 ii mol/L) Iii l，20ng 基因組 DNA2ii 1，ddH20 8. 5 u I0在55°C的退火溫度下，進行PCR擴增，反應參數為94°C預變性4min，94°C變性 30s, 55°C退火45s, 72°C I. 5min,循環30次，72°C延伸IOmin0 PCR擴增產物在I. 0%瓊脂糖凝膠電泳上分離，GeneGenius全自動凝膠成像分析系統觀察結果並照相。
電泳Marker DL2000 和試劑為 TAKARA 公司。分析結果如圖3。從圖3中可見，對抗性植株1-10分別以SCAR特異性引物進行擴增，結果分別擴增出了特異性譜帶。而在感性植株11-20的擴增產物中都沒有擴增出任何產物。這再一次證實了 SCAR標記檢測的可靠性及其應用苗期與抗鹽性狀相關聯的分子標記作為抗鹽育種輔助選擇的可行性。
權利要求
1.一種耐鹽鹼絨毛白蠟SCAR標記，其特徵在於，所述SCAR標記是全長592bp的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據權利要求I所述的耐鹽鹼絨毛白蠟SCAR標記，其特徵在於所述SCAR標記引物是正向引物FS20-592 :5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3』反向引物RS20-592 :5』 CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3』。
3.權利要求I所述耐鹽鹼絨毛白蠟的SCAR標記在用於輔助選擇育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種絨毛白蠟耐鹽鹼SCAR標記，該SCAR標記是全長592bp的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明的SCAR標記可廣泛用於耐鹽鹼絨毛白蠟分子標記的輔助選擇育種，同時為克隆絨毛白蠟耐鹽鹼基因、基因序列分析奠定了良好的基礎。本發明可實現對個體進行苗期鑑定，大大提高了育種效率，縮短了育種進程。
文檔編號C12N15/11GK102533745SQ20121000644
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者劉翠蘭, 夏陽, 李麗, 李雙雲, 燕麗萍 申請人:山東省林業科學研究院