百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20ox蛋白及其編碼基因和探針的製作方法
2023-11-10 16:29:22
百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20ox蛋白及其編碼基因和探針的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20ox蛋白及其編碼基因和探針，所述蛋白質為如SEQ?ID?NO.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質。本發明還提供相應的核酸序列，以及檢測探針；步驟如下：通過RACE技術分別擴增得到APGA20ox基因的3′和5′端，進行基因全長序列拼接和同源性分析，通過時空表達模式分析以及外源調控物質處理，分析APGA20ox基因表達差異情況進而驗證基因的功能。為了驗證本發明涉及的APGA20ox的功能，通過RNAi技術轉化百子蓮胚性愈傷組織，APGA20ox基因沉默可以得到矮化的百子蓮植株，更加確切表明本發明涉及的APGA20ox核苷酸序列在百子蓮株高改良中具有特異的效果。本發明可調控百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20ox基因的時空表達特性，進而能夠改變植物株高發育。
【專利說明】百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20OX蛋白及其編碼基因
和探針
【技術領域】
[0001]本發明涉及百子蓮赤黴素合成途徑中的關鍵酶及其編碼基因和探針，具體涉及一種百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20OX蛋白及其編碼基因和探針。
【背景技術】
[0002]觀賞植物的株型是決定商品價值和觀賞價值的重要因素之一。改變和定向調控株型，創造矮化緊湊的株型，可以增加觀賞植物的商品價值和觀賞價值，通過增加株高可以獲得良好的切花性狀。赤黴素(Gibberellin，GA)是決定植物莖的伸長的最重要的植物激素，赤黴素的合成和代謝直接調控植物的株型發育。赤黴素種類多樣，生物合成途徑十分複雜，僅有少數種類的GAs具有生物活性，中間產物大多不具備生物活性，在轉化為活性GAs的過程中，必須有GAs合成的雙加氧酶類參與，其中GA20ox雙加氧酶參與GAs生物合成反應的多個步驟，具有重要的作用，GA20ox的突變體由於GA生物合成途徑受阻，多表現為矮化性狀。一些研究表明，通過調控GA20ox的表達可以顯著改變植物株高，提高農作物抗性和產量，提高觀賞植物商品價值。
[0003]GA20ox在一些植物中已被分離，如:楊樹(Populus tomentosa)、擬南芥(Arabidopsis thalian a)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、水稻(Oryza sativa)、矮牽牛(Petunia hybrida Vilm)、大麥(Hordeum vulgare)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、玉米(Zeamays)等,但對於球根花丼百子蓮(Agapanthus praecox), APGA20ox基因的克隆、表達模式及APGA20OX蛋白編碼序列目前尚不清楚。在本發明被公布之前，未有任何與本專利申請中所提及的百子蓮APGA20OX蛋白序列相關的文獻報導。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於填補赤黴素合成雙加氧酶APGA20ox基因家族成員的克隆、表達以及赤黴素合成雙加氧酶APGA20ox蛋白的空白，提供了一種赤黴素合成雙加氧酶蛋白APGA20OX，本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列以及檢測所述核酸序列的探針；本發明公開了百子蓮APGA20OX蛋白及其核酸序列在百子蓮不同器官、不同發育階段的表達模式，為今後利用基因工程技術對APGA20OX基因表達的時空特性進行調控，從而改變株高、創造合理株型提供了理論依據，具有很大的應用價值。
[0005]一方面，本發明提供了具有百子蓮赤黴素合成雙加氧酶活性的蛋白質，所述蛋白質是由如SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或由SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有百子蓮赤黴素合成雙加氧酶活性的蛋白質。該多肽在百子蓮發育的不同階段，不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。
[0006]優選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.2所示胺基酸序列經過I~50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內胺基酸而得到的序列。
[0007]進一步優選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.2所示胺基酸序列中I~10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成的序列。
[0008]另一方面，本發明提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。
[0009]優選的，所述核酸序列具體為:(a)鹼基序列如SEQ ID N0.1第I~1086位所示；或(b)與SEQ ID N0.1第I~1086位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能與SEQ ID N0.1第I~1086位所示的核酸進行雜交的序列。
[0010]優選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.1第I~1086位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內核苷酸形成的序列。
[0011]此外，本發明還提供了一種檢測上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述核酸序列8~100個連續核苷酸的核酸分子，該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼百子蓮APGA20ox相關的核酸分子。
[0012]本發明還涉及一種百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20ox蛋白編碼基因的應用，其所述基因的鹼基序列如SEQ ID N0.1第I~1086位所示，所示的應用是:通過基因工程對基因表達進行調控進而改變植株株高，獲得新的百子蓮株型。 [0013]優選地，所述應用具體為:通過常規手段提高APGA20OX蛋白編碼基因的表達量，使得百子蓮的株高增加，獲得新的百子蓮株型。
[0014]進一步優選地，所述應用具體為:使用GA處理百子蓮，使得植株APGA20OX基因表達量提高，進而使得百子蓮的株高增加，獲得新的百子蓮株型。
[0015]在本發明中，「分離的DNA」、「純化的DNA」是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。
[0016]在本發明中，術語「百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20OX蛋白編碼序列」指編碼具有百子蓮APGA20OX蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示的第I~1086位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID N0.1所示的第I~1086位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID N0.1所示的第I~1086位核苷酸序列同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出SEQ ID N0.2所示的序列。該術語還包括與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0017]該術語還包括能編碼天然百子蓮APGA20OX蛋白的相同功能、SEQ ID N0.1所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):通常為I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個以內核苷酸。
[0018]在本發明中，術語「百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20OX蛋白」指具有百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20OX蛋白活性的SEQ ID N0.2所示序列的多肽。該術語還包括具有與天然百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20OX蛋白相同功能的、SEQ ID N0.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):通常為I~50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20OX蛋白的活性片段和活性衍生物。[0019]本發明的百子蓮APGA20ox蛋白的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與百子蓮APGA20OX相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用百子蓮APGA20OX蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0020]在本發明中，「百子蓮APGA20OX保守性變異多肽」指與SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列相比，有至多10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
[0021]表1
[0022]
【權利要求】
1.一種如SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質。
2.一種編碼權利要求1所述蛋白質的核酸序列。
3.如權利要求2所述的核酸序列，其特徵是，所述核酸序列具體如SEQID N0.1第I~.1086位所示。
4.一種百子蓮赤黴素合成雙加氧酶APGA20OX蛋白編碼基因的應用，其特徵在於，所述基因的鹼基序列如SEQ ID N0.1第I~1086位所示，所示的應用是:百子蓮APGA20ox基因通過RNAi技術沉默，進而能得到矮化的百子蓮植株。
【文檔編號】C12N15/53GK104017781SQ201410240613
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2013年6月4日
【發明者】申曉輝, 嶽建華, 張荻, 任麗 申請人:上海交通大學