一株短小芽孢桿菌、該菌株的獲取方法及該菌株在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用的製作方法

2023-11-10 14:07:32

一株短小芽孢桿菌、該菌株的獲取方法及該菌株在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株短小芽孢桿菌、該菌株的獲取方法及該菌株在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用，屬於微生物應用【技術領域】。所述短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）05-5402，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.7418。獲取方法包括分離、篩選、純化工序，首先從煙株或土壤中分離能降解尼古丁的菌株，再用以NNK為唯一碳源和氮源的培養基篩選，最後在培養基平板上純化即得。菌株的應用包括發酵、接種、降解工序，首先將菌株在25~30℃下培養48~72h得發酵菌劑，於菸葉調製或制絲過程中，將發酵菌劑按菸草重量的3~5%噴施，保持4~7天的降解時間即可。所述菌株能實現菸草特有亞硝胺的高效定向降解，且抗逆性好，簡便易得，使用方便，具有較高的推廣應用價值。
【專利說明】一株短小芽孢桿菌、該菌株的獲取方法及該菌株在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用
【技術領域】[0001]本發明屬於微生物應用【技術領域】，具體涉及一株能實現菸草特有亞硝胺定向降解的短小芽孢桿菌，及其獲取方法和在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用。
【背景技術】
[0002]TSNAs是菸草特有的N-亞硝基類化合物，是菸葉中重要的有害成分，對吸菸者的健康存在嚴重影響。NNN、NNK, NAB, NAT是菸草和煙氣中主要的TSNAs，尤其NNN與NNK均為動物強致癌物，危害極大。影響菸草中TSNAs含量的因素很多，其中主要有菸草類型、菸草組織、栽培方式、調製方法、微生物群落、氮肥施用量、硝酸還原酶及亞硝化酶的活性等。通過這些影響因子的改變可以調控TSNAs的形成量，但目前關於TSNAs降解的方法還不多。因此，針對菸葉調製過程或菸葉制絲過程中，菸葉或菸絲內的水、熱交換特點，分離、選育一株抗逆性好，能實現菸草特有亞硝胺定向降解的菌株，同時結合菸葉調製過程或菸葉制絲過程中環境溫、溼度變化的階段性特徵，選擇適宜的施用方法，對於提高菸草品質，降低菸草特有亞硝胺對人體健康及生活環境帶來的危害都具有十分重要的意義。

【發明內容】

[0003]本發明的第一目的在於提供一株能實現菸草特有亞硝胺定向降解的短小芽孢桿菌。本發明的第二目的在於提供所述短小芽孢桿菌的獲取方法。本發明的第三目的在於提供所述短小芽孢桿菌在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用。
[0004]本發明的第一目的是這樣實現的:一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus),命名為05-5402，經鑑定為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的一個株系，是從煙株組織或植煙土壤中分離得到，已於2013年4月7日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號為CGMCC N0.7418。
[0005]本發明的第二目的是這樣實現的:一種所述短小芽孢桿菌的獲取方法，包括分離、篩選及純化工序，具體包括:
A、分離:將煙株組織或植煙土壤研磨後加入無菌水，於室溫下振蕩提取25~35min，得到提取懸濁液，將提取懸濁液用稀釋平板的方法分離能在分離培養基上生長的菌株；
培養條件為25~30°C，時間40~55h ；
分離培養基成分以g/L計為:瓊脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、尼古丁 0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ；
B、篩選:將分離出的菌株轉接到篩選培養基平板上，得到一菌落長勢旺盛的細菌菌
株;培養條件為:25~30°C，時間40~55h ；
篩選培養基成分以g/L計為:瓊脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002,NNK0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ;
C、純化:將篩選出的菌株用純化培養基平板進行劃線純化，獲得長勢旺盛的單菌落，即短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)05-5402 ;
培養條件為:25~30°C，時間40~55h ；
純化培養基成分以g/L計為:蛋白腖8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、瓊脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5。
[0006]本發明的第三目的是這樣實現的:一種所述短小芽孢桿菌在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用，包括發酵、接種及降解工序，具體包括:
a、發酵:首先將短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)05-5402接種到斜面培養基上，得到發酵種子；
培養條件為:25~30°C，時間24~36h ；
斜面培養基成分以g/L計為:蛋白腖8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、瓊脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5。
[0007]然後將發酵種 子接種到種子培養液中，接種量為3~5ν/ν%,搖瓶裝液量為25~35ν/ν%，得到發酵菌劑；
培養條件為:25~30°C，時間24~36h ；
種子培養液成分以g/L計為:胰蛋白腖8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaC14.0~
6.0 ；
b、接種:在菸葉調製或制絲過程中，將發酵菌劑按照菸葉或菸絲重量的3~5%進行噴
施；
C、降解:噴施過發酵菌劑的菸葉或菸絲需保持4~7天的降解時間，即可實現菸葉或菸絲中NNN、NNK, NAB和NAT的有效降解。
[0008]本發明所述短小芽孢桿菌可應用於菸草特有亞硝胺的定向降解，具有以下優點:
1、本發明所述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)05-5402是一種菸草特有亞硝胺的高
效降解菌，對調製或制絲過程菸葉或菸絲中NNN、NNK、NAB和NAT四種主要TSNAs的總降解率可達12.2~17.3%。
[0009]2、本發明所述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)05-5402大量存在於煙株與土壤中，來源廣泛，易於分離、培養。同時，生產工藝簡單，成本低廉，使用便利，且對人體無害，有利於該菌株的工業化生產和應用普及。
[0010]3、本發明所述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)05-5402能在含有O~80g/LNaCl，pH3.0~10.0的培養基中生長，生長溫度範圍為10~45°C，具有良好的抗逆性，能充分適應菸葉調製和制絲過程中的溫、溼度環境變化和水、熱交換特點，定殖效果好，活性高。
【具體實施方式】
[0011]下面對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或改進，均落入本發明的保護範圍。[0012]一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)05-5402,已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCC N0.7418。
[0013]所述菌株為革蘭氏陽性，芽孢橢圓形中生或端生，不膨大，芽孢比菌體小，存在於菌體中，在培養基上菌落呈圓形，直徑2~3mm，扁平無凸起，乳白色，有光澤，邊緣不整齊，為好氧菌。所述菌株可在含有O~80g/L NaCl, pH3.0~10.0的培養基中生長，生長溫度範圍為10~45°C。
[0014]所述菌株可在以NNK為唯一碳源和氮源的培養基中生長。
[0015]所述NNK指的是4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基_1_ 丁酮(4_ (N-NITR0S0METHYLAΜΙΝ0)-1-(3-PYRIDYL)-1-BUTAN0NE)。
[0016]所述菌株對調製或制絲過程菸葉或菸絲中NNN、NNK, NAB和NAT的總降解率為12.2 ~17.3%。
[0017]一種所 述短小芽孢桿菌的獲取方法，包括分離、篩選及純化工序，具體包括:
A、分離:將煙株組織或植煙土壤研磨後加入無菌水，於室溫下振蕩提取25~35min，得到提取懸濁液，將提取懸濁液用稀釋平板的方法分離能在分離培養基上生長的菌株；
培養條件為25~30°C，時間40~55h ；
分離培養基成分以g/L計為:瓊脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、尼古丁 0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ；
B、篩選:將分離出的菌株轉接到篩選培養基平板上，得到一菌落長勢旺盛的細菌菌
株;
培養條件為:25~30°C，時間40~55h ；
篩選培養基成分以g/L計為:瓊脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002,NNK0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ;
C、純化:將篩選出的菌株用純化培養基平板進行劃線純化，獲得長勢旺盛的單菌落，即短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)05-5402 ;
培養條件為:25~30°C，時間40~55h ；
純化培養基成分以g/L計為:蛋白腖8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、瓊脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5。
[0018]步驟A所述的煙株組織為煙株的葉片或莖。
[0019]步驟A所述的煙株組織優選為烤菸Κ326的葉片或莖。所述的植煙土壤為烤菸Κ326的植煙土壤。
[0020]步驟A所述的分離優選將菸葉0.8~1.2g進行組織研磨後，加入90~IlOml無菌水，於室溫下130~170rpm振蕩提取25~35min，得到提取懸濁液。
[0021]步驟A所述的室溫指的是20~25°C。
[0022]步驟A所述的尼古丁指的是N-甲基-2 [α (β，Y)]-吡啶基四氫吡咯。
[0023]步驟A所述的培養條件優選為28°C，時間48h。
[0024]步驟B及步驟C所述的NNK指的是4_甲基亞硝胺基-1_3_吡啶基_1_ 丁酮。[0025]步驟B所述的培養條件優選為28°C，時間48h。
[0026]步驟B所述的篩選培養基優選由不加葡萄糖的M9培養基加入0.1 % NNK製成。
[0027]步驟C所述的培養條件優選為28°C，時間48h。
[0028]一種所述短小芽孢桿菌在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用，包括發酵、接種及降解工序，具體包括:
a、發酵:首先將短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)05-5402接種到斜面培養基上，得到發酵種子；
培養條件為:25~30°C，時間24~36h ；
斜面培養基成分以g/L計為:蛋白腖8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、瓊脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5 ;
然後將發酵種子接種到種子培養液中，接種量為3~5v/v%，搖瓶裝液量為25~35v/ ，得到發酵菌劑；
培養條件為:25~30°C，時間24~36h ；
種子培養液成分以g/L計為:胰蛋白腖8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaC14.0~
6.0 ；
b、接種:在菸葉調製或制絲過程中，將發酵菌劑按照菸葉或菸絲重量的3~5%進行噴
施；
C、降解:噴施過發酵菌劑的菸葉或菸絲需保持4~7天的降解時間，即可實現菸葉或菸絲中NNN、NNK, NAB和NAT的有效降解。
[0029]步驟a所述的發酵,搖瓶轉速為140~160rpm。
[0030]步驟a所述的培養條件優選為28°C，時間30h。
[0031]步驟a所述的發酵菌劑的有效活菌數為I X IO9~I X IO10個/ml。
[0032]步驟b所述的接種也可以在菸葉調製前進行。
[0033]步驟b及步驟c所述的菸葉包括白肋煙、烤菸或曬煙中的任一種。
[0034]步驟b及步驟c所述的菸葉優選白肋煙。
[0035]步驟b所述的調製指的是由鮮菸葉到幹菸葉的過程，具體為烤菸的烘烤過程和晾曬煙的晾曬過程。
[0036]步驟b所述的制絲指的是將菸葉原料加工成適合煙支卷制工藝要求的菸絲的加工過程。
[0037]步驟c所述的降解，對於在調製前接種的菸葉，無需設定特殊降解條件，對於在制絲過程中接種的菸絲，需調節菸絲的水分含量為30~40%，並於25~35°C的條件下保持5天的降解時間。
[0038]步驟c所述的降解，噴施過發酵菌劑的菸葉或菸絲保持4~7天的降解時間後，菸葉或菸絲中NNN、NNK, NAB和NAT的總降解率為12.2~17.3%。
[0039]下面通過實施例加以說明:
實施例1
-短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)05-5402的獲取與鑑定
(I)短小芽抱桿菌(·Bacillus pumilus)05-5402的獲取
A、分離:烤菸K326的葉片樣品採自雲南省玉溪市。將菸葉樣品Ig進行組織研磨，加入無菌水100ml，於室溫下150rpm振蕩提取30min，得到提取懸濁液。將提取的懸濁液用稀釋平板的方法分離能在分離培養基上生長的菌株；
培養條件為28°C，時間48h ；
分離培養基成分以g/L計為:瓊脂15.0、K2HPO4L 6、KH2PO40.4、NaCl0.1、MgSO4.7Η200.2、CaCl20.05、MnSO4.Η200.002、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、尼古丁 1.0, ρΗ7.0。
[0040]B、篩選:將分離出的菌株轉接到篩選培養基平板上，得到一菌落長勢旺盛的細菌菌株；
培養條件為:28°C，時間48h ；
篩選培養基成分以g/L計為:瓊脂15.0、K2HPO4L 6、KH2PO40.4、NaCl0.1、MgSO4.7Η200.2、CaCl20.05、MnSO4.Η200.002、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、NNK1.0, ρΗ7.0。
[0041]C、純化:將篩選出的菌株用純化培養基平板進行劃線純化，獲得長勢旺盛的單菌落，定名為05-5402菌株；
培養條件為:28°C，時間48h ；
純化培養基成分以g/L計為:蛋白腖10.0、牛肉浸膏3.0、NaC15.0、瓊脂17.0,ρΗ7.2。
`[0042](2)短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)05-5402 的鑑定
對上述選育的菌株05-5402，通過常規方法進行生物學和生理生化特性檢測與分子生物學方法鑑定。分子鑑定方法如下:細菌基因組DNA的提取用TaKaRa MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction Kit Ver.2.0,方法參見試劑盒說明書。PCR擴增選用引物F27/R1492，常規條件擴增，擴增產物經 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收後，連接於載體PMD18-T Vector，轉化入感受態細胞E.coli DH5a，挑取白色菌落以M13F/M13R為引物進行菌落PCR鑑定。陽性克隆委託上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。
[0043]以上實驗結果記錄如下:
1、形態特徵:該菌株於26°C培養，在顯微鏡下，芽孢橢圓形中生或端生，不膨大，芽孢比菌體小，存在於菌體中。菌體平均大小為0.61~0.68 μ mX 2.2~2.8 μ m，革蘭氏染色為陽性。
[0044]2、培養特徵:該菌株於28 V在NA平板培養基上培養24h，菌落呈圓形，直徑2~3mm,扁平無凸起，乳白色，有光澤，邊緣不整齊，為好氧菌。
[0045]3、生理生化特徵:該菌株生理生化反應呈陽性的是:過氧化氫酶實驗、VP實驗、產H2S實驗、明膠液化實驗、卵磷脂酶實驗；生理生化反應呈陰性的反應為:水解澱粉實驗、產NH3實驗、甲基紅實驗、吲哚實驗、水解脂肪實驗、硝酸鹽還原實驗。
[0046]4、穩定性特徵:該菌株可在含有O~80g/L NaCl,pH3.0~10.0的培養基中生長，生長溫度範圍為10~45°c，最適宜生長溫度為28~35°C，最適宜pH值為7.2~7.4。
[0047]5、16S rDNA序列分析:通過序列比對和生理生化特性將05-5402菌株鑑定為短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)。
[0048]本發明所述的05-5402菌株其16S rDNA序列見序列表。
[0049](3)短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)05-5402 的保藏通過上述鑑定結果，確認菌株05-5402為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的一個株系，命名為05-5402。於2013年4月7日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號為CGMCC N0.7418。
[0050]實施例2
——短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)05-5402對菸草浸提液中TSNAs的降解實驗實驗方法:按白肋煙末:蒸餾水=I: 10的比例混勻，超聲波浸提30min後過濾，濾液加入酵母膏(1.5g/L)，調節pH至7.2~7.4。300ml三角瓶分裝100ml滅菌，挑取一環篩選的05-5402菌株接種，150rpm振蕩培養48h。以不接菌的白肋煙浸提液作為對照(CK)。菌液以8000rpm的速度常溫離心IOmin,濾液再經0.22 μ m水相濾膜過濾,取濾液進行UPLC-MS/MS分析(範多青等，中國菸草學報，2012，18 (6):10-16)。
[0051]實驗結果:由表1數據可知，菌株05-5402對白肋煙浸提液中的TSNAs降解效果良好。經48h處理，浸提液中TSNAs含量較對照降低了 22.3%。其中，NNK和NAT的含量分別降低了 47.6%和 55.8%。
[0052]表1菌株05-5402對菸草浸提液中TSNAs的降解效果
【權利要求】
1.一株短小芽孢桿菌Cfeci77w5./7--Υ7?5.) 05-5402,已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCC N0.7418。
2.如權利要求1所述的短小芽孢桿菌，其特徵在於所述菌株可在以4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1- 丁酮為唯一碳源和氮源的培養基中生長。
3.如權利要求1或2所述的短小芽孢桿菌，其特徵在於所述菌株對調製或制絲過程菸葉或菸絲中NNN、NNK, NAB和NAT的總降解率為12.2~17.3%。
4.一種權利要求3所述的短小芽孢桿菌的獲取方法，包括分離、篩選及純化工序，具體包括: A、分離:將煙株組織或植煙土壤研磨後加入無菌水，於室溫下振蕩提取25~35min，得到提取懸濁液，將提取懸濁液用稀釋平板的方法分離能在分離培養基上生長的菌株； 培養條件為:25~30°C，時間40~55h ； 分離培養基成分以 g/L 計為:瓊脂 12.0-18.0、K2HPO4 1.4^1.8、KH2PO4 0.3^0.5、NaCl0.08~0.12、MgSO4.7Η20 0.1~θ.3、CaCl2 0.04~0.06、MnS04.H20 0.ΟΟ1~Ο.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η20 0.0002、NaMoO4CH2O 0.0002、尼古丁 0.8~1.2，pH 6.5~7.5 ； B、篩選:將分離出的菌株轉接到篩選培養基平板上，得到一菌落長勢旺盛的細菌菌株; 培養條件為:25~30°C，時間40~55h ； 篩選培養基成分以 g/L 計為:瓊脂 12.0-18.0、K2HPO4 1.4^1.8、KH2PO4 0.3^0.5、NaCl0.08~0.12、MgSO4.7Η20 0.1~0.3、CaCl2 0.04~0.06、MnS04.H20 0.001~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η20 0.0002、NaMoO4.2Η20 0.0002、NNK 0.8~1.2，pH 6.5~7.5 ； C、純化:將篩選出的菌株用純化培養基平板進行劃線純化，獲得長勢旺盛的單菌落，即短小芽抱桿菌pumilus) 05-5402 ； 培養條件為:25~30°C，時間40~55h ； 純化培養基成分以g/L計為:蛋白腖8.0-12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、瓊脂15.0~19.0, ρΗ7.0~7.5。
5.如權利要求4所述的獲取方法，其特徵在於步驟A所述的煙株組織為烤菸Κ326的葉片或莖。
6.一種權利要求3所述的短小芽孢桿菌在菸草特有亞硝胺定向降解中的應用，包括發酵、接種及降解工序，具體包括: a、發酵:首先將短小芽孢桿菌pumilus)05-5402接種到斜面培養基上，得到發酵種子； 培養條件為:25~30°C，時間24~36h ； 斜面培養基成分以g/L計為:蛋白腖8.0-12.0、牛肉浸膏2.0-4.0、NaC14.0~6.0、瓊脂.15.0-19.0, ρΗ7.0-7.5 ； 然後將發酵種子接種到種子培養液中，接種量為3~5ν/ν%，搖瓶裝液量為25~35ν/ν%，得到發酵菌劑； 培養條件為:25~30°C，時間24~36h ； 種子培養液成分以g/L計為:胰蛋白腖8.0-12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaC14.0~6.0 ； b、接種:在菸葉調製或制絲過程中，將發酵菌劑按照菸葉或菸絲重量的3~5%進行噴施； C、降解:噴施過發酵菌劑的菸葉或菸絲需保持4~7天的降解時間，即可實現菸葉或菸絲中NNN、NNK, NAB和NAT的有效降解。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於步驟a所述的發酵菌劑的有效活菌數為I X IO9~I X 101° 個/ml。
8.如權利要求6或7所述的應用，其特徵在於步驟b所述的接種也可以在菸葉調製前進行。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於步驟c所述的降解，對於在調製前接種的菸葉，無需設定特殊降解條件，對於在制絲過程中接種的菸絲，需調節菸絲的水分含量為30^40%,並於25~35°C的條件下保持5天的降解時間。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於步驟c所述的降解，噴施過發酵菌劑的菸葉或菸絲保持4~7天的降解時間後，菸葉或菸絲中NNN、NNK, NAB和NAT的總降解率為12.2~17.3%。
【文檔編號】C12N1/02GK103667120SQ201310610097
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】夏振遠, 雷麗萍, 汪安雲, 吳玉萍, 莫笑晗, 馬雁軍, 周俊 申請人:雲南省菸草農業科學研究院