變體枯草桿菌蛋白酶(枯草桿菌酶)的製作方法

2023-11-10 09:44:17 2

專利名稱：變體枯草桿菌蛋白酶(枯草桿菌酶)的製作方法
技術領域：
本發明涉及對汙潰，尤其卵汙潰具有改良性能的新枯草桿菌酶(subtilase)。當這些枯草桿菌酶用於如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣組合物和洗盤組合物中，包括自動洗盤組合物中時，對卵汙潰表現出優良的或改進的性能。本發明也涉及編碼該枯草桿菌酶的分離的多核苷酸、核酸構建體、重組表達載體、包含該核酸構建體的宿主細胞，以及生產和使用本發明的枯草桿菌酶的方法。而且,本發明涉及包含本發明枯草桿菌酶的清潔和洗滌劑組合物，以及這些酶在洗滌劑組合物中的用途 和用於除去卵汙潰的用途。
背景技術：
在洗滌劑工業，酶已在洗滌配方中使用了 30年以上。用於這些配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶、纖維素酶、甘露糖苷酶和其它酶或它們的混合物。商業上最為重要的酶是蛋白酶。數量不斷增長的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質工程化變體，如 DURAZYM (Novozymes A/S)、RELASE (NovozymesA/S)、MAXAPEM (Gist-Brocades N. V.) >PURAFECT (Genencor International, Inc.)。此夕卜，本領域，如EP130756 (GENENTECH)(對應於美國重新發行(Reissue)專利號 34，606 (GENENCOR));EP 214435 (HENKEL) ;W087/04461 (AMGEN) ;W087/05050(GENEX);EP 260105(GENENCOR);Thomas, Russell,和 Fersht(1985)Nature318375-376;Thomas, Russell,和 Fersht(1987)J. Mol. Biol. 193 803-813;Russel和 Fersht Nature 328496-500 (1987) ;W0 88/08028 (Genex) ;W088/08033 (Amgen) ;W0 95/27049 (S0LVAY S.A.) ;WO 95/30011 (PROCTER&GAMBLE COMPANY) ;WO95/30010 (PROCTER&GAMBLE COMPANY) ;W095/29979 (PR0CTER&GAMBLEC0MPANY) ;US 5.543.302 (S0LVAY S.A.) ;EP 251446 (GENENCOR) ;W089/06279 (NOVOZYMES A/S);W091/00345(NOVOZYMES A/S);EP 525610A1(SOLVAY);W0 94/02618(GIST-BROCADESN. V.)中描述了許多蛋白酶變體。在WO 02/42740 (NOVOZYMES A/S)中描述了用於篩選(AMSA)的試驗方法。WO 01/75087 (MAXYGEN, INC. /NOVOZYMES A/S)描述了枯草桿菌蛋白酶同系物，其改進了多種特定性質，包括熱穩定性、低溫下的活性和鹼性穩定性。WO 01/68821 (NOVOZYMES A/S)描述了枯草桿菌酶，其適於從例如衣物和/或硬表面除去卵汙潰。然而,儘管已經描述了許多有用的蛋白酶和蛋白酶變體,仍然需要對許多工業用途進一步改進蛋白酶或蛋白酶變體。具體地，由於存在於卵白中的物質抑制許多絲氨酸蛋白酶這一事實，從例如衣物或者硬表面除去卵汙潰的問題已經變得突出。因此，本發明的一個目的是提供改良的枯草桿菌酶，其適於例如從衣物或者硬表面除去卵汙潰。發明概述從而，一方面，本發明涉及對卵汙潰具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶，所述枯草桿菌酶選自(a)枯草桿菌酶，其胺基酸序列與SEQ ID NO: 2的胺基酸I到269所示胺基酸序列具有99. 26%以上同一性；和

(b)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)MT173 DSM15575中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有至少99. 26%同一性的所述枯草桿菌酶的變體；和(C)枯草桿菌酶，其胺基酸序列與SEQ ID NO:4的胺基酸I到269所示胺基酸序列具有97. 40%以上同一性；和(d)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體。在第二方面，本發明涉及分離的多核苷酸，其含有編碼本發明的枯草桿菌酶的核酸序列。在第三方面，本發明涉及編碼枯草桿菌酶的分離的多核苷酸，其選自(a)與SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示核酸序列具有至少88%同一性的多核苷酸；和(b)已經克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88%同一性的變體，(c)與SEQ ID NO: 3的核苷酸I到807所示核酸序列具有至少88%同一性的多核苷酸；和Cd)已經克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88%同一性的變體。在第四方面，本發明涉及核酸構建體，其含有根據本發明的核酸序列，其有效連接到指導枯草桿菌酶在適宜的宿主中表達的一個或多個控制序列。在第五方面，本發明涉及重組表達載體，其含有根據本發明的核酸構建體、啟動子、轉錄和翻譯終止信號。在第六方面，本發明涉及重組宿主細胞，其含有本發明的核酸構建體。在第七方面，本發明涉及產生根據本發明的枯草桿菌酶的方法，該方法包括(a)在有助於產生枯草桿菌酶的條件下培養重組宿主細胞；和(b)回收枯草桿菌酶。在第八方面，本發明涉及清潔或洗滌劑組合物，優選洗衣和洗盤組合物，其含有本發明的枯草桿菌酶。本發明還涉及I.枯草桿菌酶，其選自
(a)枯草桿菌酶，其胺基酸序列與SEQ ID NO: 2的胺基酸I到269所示胺基酸序列具有99. 26%以上同一性；或(b)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌(Escherichia coli)MT173DSM 15575中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有99. 26%以上同一丨I"生的所述枯草桿菌酶的變體；或(c)枯草桿菌酶，其胺基酸序列與SEQ ID NO: 4的胺基酸I到269所示胺基酸序列具有97. 40%以上同一性；或(d)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體。 2.根據項I的枯草桿菌酶,其具有I)與Ia)或者Ib)中描述的胺基酸序列具有99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的胺基酸序列；或者II)與Ic)或者Id)中描述的胺基酸序列具有97. 40%以上，或者97. 77%以上，或者98. 14%以上，或者98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上
同一性的胺基酸序列。3.根據項2的枯草桿菌酶，其由SEQ ID NO:2的胺基酸I到269所示胺基酸序列組成，或者由SEQ ID NO: 4的胺基酸I到269所示胺基酸序列組成。4.根據項I的枯草桿菌酶,其具有I)與克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的胺基酸序列；或者II)與克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有97. 40%以上，或者97. 77%以上，或者98. 14%以上，或者98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的胺基酸序列。5.根據項4的枯草桿菌酶，其由I)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶；或II)克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶組成。6.前面項任意一項的枯草桿菌酶,其中所述枯草桿菌酶是I)具有如SEQ ID NO:2的胺基酸I到269所示胺基酸序列的枯草桿菌酶變體，其含有一個或多個胺基酸殘基替換、缺失和/或插入；或II)具有如SEQ ID NO: 4的胺基酸I到269所示胺基酸序列的枯草桿菌酶變體，其含有一個或多個胺基酸殘基替換、缺失和/或插入。7.根據項6的枯草桿菌酶，其含有如下位置之一的至少一種修飾27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252 和 274 (BASBPN 編號)。
8.根據項I的枯草桿菌酶，其中所述修飾選自K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和 T274A (BASBPN 編號)。9.分離的多核苷酸,其含有編碼項I 一 8任意一項中定義的枯草桿菌酶的多核苷酸。10.分離的多核苷酸，其編碼枯草桿菌酶，所述多核苷酸選自(a)與SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示多核苷酸具有至少88%同一性的多核苷酸；或(b)已經克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質粒的多核 苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88%同一性的變體，(c)與SEQ ID NO: 3的核苷酸I到807所示多核苷酸具有至少88%同一性的多核苷酸；或(d)已經克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88%同一性的變體。11.根據項10的多核苷酸，其具有I)與SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示的多核苷酸具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列；或II)與SEQ ID NO: 3的核苷酸I到807所示的多核苷酸具有至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的核酸序列。12.根據項10的多核苷酸，其具有I)與已經克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15575中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分具有至少89 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列；或II)與已經克隆到大腸桿菌MT173 DSM 15574中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分具有至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一性的核酸序列。13.核酸構建體，其含有項9 一 12任意一項的核酸序列，所述核酸序列與指導枯草杆囷酶在適宜宿王中表達的一種或多種控制序列有效連接。14.重組表達載體，其含有項13的核酸構建體、啟動子、轉錄和翻譯終止信號。15.重組宿主細胞，其含有項13的核酸構建體。16.根據項15的宿主細胞，其是細菌，優選芽孢桿菌屬，特別是遲緩芽孢桿菌。17.根據項15的宿主細胞，其是真菌或酵母，優選絲狀真菌，特別是麴黴屬。18.產生根據項I 一 8任意一項的枯草桿菌酶的方法，該方法包括(a)在有助於產生枯草桿菌酶的條件下培養項15 — 17任意一項中定義的重組宿主細胞；和(b)回收枯草桿菌酶。19.清潔或洗滌劑組合物，優選洗衣或洗盤組合物，其含有根據項I 一 8任意一項的枯草桿菌酶。20.根據項19的組合物，其還含有纖維素酶、脂肪酶、角質酶、氧化還原酶、其他蛋白酶、澱粉酶或者它們的混合物。21.項I 一 8任意一項中定義的枯草桿菌酶的用途，用於清潔或洗滌劑組合物中。22.項I 一 8任意一項中定義的枯草桿菌酶的用途，用於除去卵汙潰。23.項19 - 20任意一項中定義的清潔或洗滌劑組合物的用途，用於除去卵汙潰。24.清潔或盤洗滌的、洗滌硬表面或者衣物的方法，所述方法包括將硬表面或者衣物與項19 - 20中定義的組合物接觸。25.從硬表面或者衣物除去卵汙潰的方法，所述方法包括將含有卵汙潰的硬表面或者含有卵汙潰的衣物與項19 - 20中定義的組合物接觸。本發明的其他方面涉及本發明的枯草桿菌酶用於清潔或洗滌劑組合物中的用途；本發明的枯草桿菌酶或組合物用於除去卵汙潰的用途；清除或洗滌的方法，其包括從硬表面或者衣物除去卵汙潰的方法，該方法包括將硬表面或者衣物與本發明的組合物接觸。圖I進行了相關比對和編號參考，所述圖I顯示了枯草桿菌蛋白酶BPN』 (a)(BASBPN)和本發明的新的枯草桿菌酶(b)和(c)之間的比對。

這些比對在本專利申請中用作對殘基編號的參照。定義在更詳細地討論本發明之前，首先定義以下的術語和慣用語。胺基酸命名法A=Ala=丙氨酸V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸I=Ile=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸M=Met=甲硫氨酸G=Gly=甘氨酸S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸N=Asn=天冬醯胺Q=Gln=穀氨醯胺D=Asp=天冬氨酸E=Glu=穀氨酸K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸H=His=組氨酸
X=Xaa=任意胺基酸核酸命名法A=腺嘌呤G=鳥嘌呤C=胞嘧啶T=胸腺嘧啶(僅在DNA中)U=尿嘧啶(僅在RNA中)變體命名的命名法和慣用語 在描述本發明的產生的或期待的多種枯草桿菌酶變體時，採用以下的命名法和慣用語以易於參照首先通過將分離的或親本酶與枯草桿菌蛋白酶BPN』 (BASBPN)對比來定義參考框。在本發明上下文中，「同源性」或「同源的」以其常規意思理解，兩種胺基酸序列之間的「同源性，，用 University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG)包的GAP程序，對比對參數、比較矩陣、缺口和缺口延伸罰分使用默認設置定義的「相似性」來確定。缺口(GAP)罰分的默認值即缺口產生罰分3. 0，缺口延伸罰分0. I(Wisconsin Package,版本 8,1994 年 8 月的程序手冊，Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)。該方法還描述於 S. B. Needleman 和C. D. ffunsch, Journal of Molecular Biology, 48，443-445 (1970)。可以從相同計算提取同一性。兩種胺基酸序列之間同源性還可以用GCG包9. I版的GAP常規方法，對比對參數、t匕較矩陣使用默認參數通過「同一性」或者「相似性」確定，還可以應用缺口和缺口延伸罰分，使用下面的參數缺口產生罰分=8，缺口延伸罰分=8並且所有其他參數保持默認值。除了胺基酸比對，該方法還輸出兩條序列之間「同一性百分率」和「相似性」的計算。使用GCG軟體包9. I版計算的數目與8. 0計算的略有不同。另一種方法是使用公知的枯草蛋白酶之間的比對，如WO 91/00345中指出的比對。在多數情況中，方法之間差異將不重要。枯草桿菌蛋白酶BPN』 (BASBPN)和本發明的新枯草桿菌酶之間的序列對比如圖I所示。因此，將定義許多與BASBPN相關的缺失和插入。在圖I中，本發明的新枯草桿菌酶與BASBPN相比，在36、58、158、162、163和164位有6處缺失。這些缺失在圖I中由星號0)表示。一般採用以下的三個成分來表示對親本酶所進行的多種修飾原始胺基酸位置替換的胺基酸符號G195E意指195位的甘氨酸被穀氨酸替換。位置替換的胺基酸在原始胺基酸殘基可以是任意胺基酸殘基的情況下，有時可以用簡略表達方式僅表示位置和替換的胺基酸170Ser或者170S。這種符號尤其與同源枯草桿菌酶的修飾相關(見下文)。原始胺基酸位置
當鑑定替換胺基酸殘基不重要時，這種符號尤其相關。用任意胺基酸殘基替換195位的甘氨酸表示為Glyl95或者G195。位置當原始胺基酸和替換胺基酸均可以包含任意胺基酸時，則只指出位置，如170。原始胺基酸位置{替換的胺基酸y ...，替換的胺基酸J當原始胺基酸和/或替換的胺基酸可以包含一種以上但不是所有的胺基酸時，所選擇的胺基酸表不在括號{}內對於特定的變體,使用特定的三個或一個字母代碼,包括代碼Xaa和X用來表示任何胺基酸殘基。

替換用穀氨酸替換195位的甘氨酸表示為Glyl95Glu 或 G195E或者用任意胺基酸殘基酸替換195位的甘氨酸表示為Glyl95Xaa 或 G195X或Glyl95 或 G195因此用絲氨酸替換170位的任意胺基酸殘基表示為Xaal70Ser 或 X170S或170Ser 或 170S這種符號尤其與同源枯草桿菌酶的修飾相關(見下文)。因此170Ser意指包含例如BASBPN中的Lysl70Ser修飾和本發明枯草桿菌酶的Argl70Ser的修飾(參見圖I)。對於其中的原始胺基酸和/或替換的胺基酸可以包含一種以上但不是所有的胺基酸的修飾而言，由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸替換170位的精氨酸表示為Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}或 R170 {G, A, S, T}以表示變體R170G、R170A、R170S 和 R170T。缺失195位甘氨酸的缺失表示為Glyl95* 或 G195*相應地，一個以上胺基酸殘基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示為Gly195*+Leul96* 或 G195*+L196*插入額外的胺基酸殘基的插入，如在G195後插入賴氨酸表示為Glyl95GlyLys 或 G195GK ；或者，當插入一個以上的胺基酸殘基，如在G195後插入Lys和Ala時，這種插入表示為Glyl95GlyLysAla 或 G195GKA
在這些情況下，通過將小寫字母加到插入胺基酸殘基之前的胺基酸殘基的位置號來對插入胺基酸殘基進行編號。在以上的實施例中，序列194-196因此為194 195 196BLSAVI A-G-L194 195 195a 195b 196變體A-G-K-A-L當插入與所存在的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基時，顯然是在命名中出現了簡併。如果例如在以上的實施例中，在甘氨酸之後插入甘氨酸，則將它表示為G195GG。對從194 195 196 BLSAVI A-G-L194 195 195a 196至變體A-G-G —L194 194a 195 196的同一現行變化還可以表示為A194AG。這些例子對本領域技術人員來說是顯而易見的，且表示法G195GG和這種類型插入的相應表示法因此是指包含此類等同的簡併表示法。填補缺口 當與用於編號的枯草桿菌蛋白酶BPN』序列進行比較，在參照的酶中存在缺失時，則對於在36位天冬氨酸的插入而言，這種位置處的插入表示為*36Asp 或 *36D多重修飾用加號分隔含多重修飾的變體，如Argl70Tyr+Glyl95Glu 或 R170Y+G195E代表在170和195位分別用酪氨酸和穀氨酸替換精氨酸和甘氨酸的修飾。因此，Tyrl67{Gly, Ala, Ser, Thr} +Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}表不以下變體Tyrl67Gly+Argl70Gly, Tyrl67Gly+Argl70Ala,Tyrl67Gly+Argl70Ser, Tyrl67Gly+Argl70Thr,Tyrl67Ala+Argl70Gly, Tyrl67Ala+Argl70Ala,Tyrl67Ala+Argl70Ser, Tyrl67Ala+Argl70Thr,Tyrl67Ser+Argl70Gly, Tyrl67Ser+Argl70Ala,Tyrl67Ser+Argl70Ser, Tyrl67Ser+Argl70Thr,Tyrl67Thr+Argl70Gly, Tyrl67Thr+Argl70Ala,Tyrl67Thr+Argl70Ser 和 Tyrl67Thr+Argl70Thr。這種命名法與針對替換、取代、插入或缺失具有特定共同性質的胺基酸殘基，如帶正電荷(K、R、H)、帶負電荷(D、E)的殘基的修飾，或用一種小胺基酸替換另一種小胺基酸的諸如 Tyrl67 {Gly, Ala, Ser, Thr} +Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}的保守胺基酸的修飾特別相關。進一步的詳細描述參見「發明詳述」部分。蛋白酶分解蛋白質底物中的醯胺鍵的酶歸類為蛋白酶，或(可互換地)肽酶(見Walsh, 1979,酶反應機理(Enzymatic Reaction Mechanisms). ff. H. Freeman andCompany, San Francisco,第 3 章)。胺基酸位置/殘基的編號如果沒有另外指出，本文所用的胺基酸編號對應於枯草桿菌酶BPN』 (BASBPN)序列的胺基酸編號。對BPN』序列的詳細描述,參見圖I或Siezen等人，蛋白質工程(ProteinEngng. ) 4(1991)719-737。絲氡酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性部位存在必需的絲氨酸殘基(White, Handler 和 Smith, 1973 「生物化學原理(Principles of Biochemistry)，」 第五版，McGraw-Hill Book 公司，紐約，第 271-272 頁)。細菌絲氨酸蛋白酶的分子量在20，000-45，000道爾頓的範圍內。它們被二異 丙基氟代磷酸酯抑制。它們水解簡單末端脂類，且其活性與真核生物糜蛋白酶(也是一種絲氨酸蛋白酶)相似。一個更為狹義的術語包括在一個亞組的鹼性蛋白酶反映某些絲氨酸蛋白酶的高pH最佳值，為pH 9. 0-11.0(綜述參見Priest (1977)細菌學評論(Bacteriological Rev. ) 41 :711-753)。枯草桿菌酶Siezen等人提出絲氨酸蛋白酶的一個亞組,其暫稱為枯草桿菌酶(subtilase)，見蛋白質工程，4 (1991) 719-737和Siezen等人，蛋白質科學(Protein Science)6 (1997) 501-523。它們是通過對170多個先前稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的胺基酸序列進行同源性分析而定義的。枯草桿菌蛋白酶以前通常被定義為由革蘭氏陽性細菌或真菌產生的絲氨酸蛋白酶，而現在根據Siezen等人則為枯草桿菌酶的一個亞組。已鑑定了大量的枯草桿菌酶，並已測定了一些枯草桿菌酶的胺基酸序列。對此類枯草桿菌酶及其胺基酸序列的更詳細描述參見Siezen等人(1997)。枯草桿菌酶的一個亞組，I-Sl或〃真〃枯草桿菌蛋白酶，包含「標準的」枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168(BSS168)、枯草桿菌蛋白酶BPN』、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg ( ALCALASE , Novozymes A/S)和枯草桿菌蛋白酶 DY (BSSDY)。Siezen等人(見上文)識別了枯草桿菌酶的另一亞組，I_S2或強鹼性枯草桿菌蛋白酶。亞組I-S2蛋白酶被描述為強鹼性枯草桿菌蛋白酶並包括枯草桿菌蛋白酶 PB92 (BAALKP) ( MAXACAL , Gist-BrocadesNV)、枯草桿菌蛋白酶 309 (BLSAVI)
(SAVINASE , Novozymes A/S)、枯草桿菌蛋白酶 147 (BLS147) ( ESPERASE ,Novozymes A/S)和喊性彈性蛋白酶 YaB (BSEYAB)。親本枯草桿菌酶術語「親本枯草桿菌酶」描述一種根據Siezen等人(1991和1997)定義的枯草桿菌酶。關於進一步的細節，參見上述對「枯草桿菌酶」的描述。親本枯草桿菌酶也可以是從天然來源分離的枯草桿菌酶，其中，在保持枯草桿菌酶特性的情況下經過進一步修飾。而且，親本枯草桿菌酶還可以是通過如以下文獻所述的DNA改組技術製備的枯草桿菌酶J. E. Ness 等人，自然生物技術(Nature Biotechnology) , 17, 893-896 (1999)。術語「親本枯草桿菌酶」可另外稱為「野生型枯草桿菌酶」。
枯草桿菌酶的修飾本文所用的術語「修飾」定義為包括枯草桿菌酶的化學修飾以及對編碼枯草桿菌酶的DNA所進行的遺傳操作。修飾可以是胺基酸側鏈的取代、目標胺基酸處的替換、缺失和/或插入。枯草桿菌酶變體在本發明的上下文中，術語枯草桿菌酶變體或突變的枯草桿菌酶指由表達突變基因的生物體產生的枯草桿菌酶,該突變基因來源於含原始或親本基因並產生相應親本酶的親本微生物，所述親本基因已發生突變以產生突變基因，這種突變基因在適宜的宿主中表達時產生所述的突變枯草桿菌酶。類似地,所述突變基因還可以來自通過DNA改組技術產生的未本基因。同源枯草桿菌酶序列

在本上下文中，兩種胺基酸序列之間的同源性用參數「同一性」描述。為了確定兩種枯草桿菌酶之間的同一性程度，可以使用相同的設置應用(下文)GCG程序包9. I版的GAP方法。此方法的計算結果除了胺基酸序列對比外，還有兩個序列之間的「同一性百分率」的計算結果。根據此說明，本領域技術人員可常規地鑑定適宜的同源性枯草桿菌酶和相應的同源活性部位環區，它們可以根據本發明進行修飾。分離的多核苷酸本文所用的術語「分離的多核苷酸」指經分離和純化並因此為適用於遺傳工程化的蛋白質產生體系的形式的多核苷酸。這些分離的分子可以從其自然環境中分離，並包括cDNA和基因組克隆以及來自DNA改組實驗或定點突變實驗的多核苷酸。本發明的分離的多核苷酸不含其它通常與之相關的基因，但可包括5』和3』非翻譯區如啟動子和終止子。相關區域的鑑定對本領域技術人員來說是顯而易見的(例如，參見Dynan和Tijan,自然316:774-78，1985)。術語「分離的核酸序列」另外可稱為「分離的DNA序列」、「克隆的核酸序列」或「克隆的DNA序列」。分離的蛋白質術語「分離的」在應用於蛋白質時指此蛋白質已從其自然環境中分離出。在優選的形式中，分離的蛋白質基本上不含其它蛋白質，特別是其它同源蛋白質(即「同源雜質」(參見以下))。通過SDS-PAGE測定分離的蛋白質的純度大於10%，優選大於20%，更優選大於30%。還優選提供通過SDS-PAGE測定純度大於40%，大於60%，大於80%，更優選大於95%，並最優選大於99%的高度純化形式的蛋白質。術語「分離的蛋白質」可另稱為「純化的蛋白質」。同源雜質術語「同源雜質」意指任何來源於最初獲得本發明枯草桿菌酶的同源細胞的雜質(如除了本發明枯草桿菌酶之外的另一多肽)。自……獲得本文所用與特定的微生物源相關的術語「自……獲得」意指該多核苷酸和/或枯草桿菌酶是由特定來源或由細胞產生，其中所述細胞中已插入來自於所述來源的基因。
底盤本文所用的與蛋白酶的底物相關的術語「底物」應以其最廣義的形式解釋為包括含有至少一個易於被枯草桿菌蛋白酶水解的肽鍵的化合物。產物本文所用的與來自蛋白酶酶促反應的產物有關的術語「產物」在本發明的上下文中應解釋為包括涉及蛋白酶枯草桿菌酶的水解反應的產物。產物可以是在隨後的水解反應中的底物。洗滌性能在本發明上下文中，術語「洗滌性能」用作酶在例如洗滌或硬表面清潔過程中除去存在於目標上的汙潰，尤其卵汙潰至清潔的能力。還參見實施例2中的「標準的洗滌劑洗滌性能試驗」。 %除去的蛋白質膜在本發明上下文中，術語除去的蛋白質膜」用作酶在自動洗盤期間除去所要清洗的目標上存在的汙潰，尤其卵汙潰的能力。性能數據來自乾淨、髒的和洗過的鋼盤的重力測量
權利要求
1.枯草桿菌酶用於除去卵汙潰的用途，所述枯草桿菌酶為胺基酸序列為SEQID NO:2的胺基酸I到269所示的枯草桿菌酶或者在SEQ ID NO: 2的胺基酸I到269中經過替換一個或多個胺基酸而由SEQ ID N0:2的胺基酸I到269衍生的枯草桿菌酶，其顯示出改進的洗滌性能，其中所述替換選自根據BASBPN編號的如下位置27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、.100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、.252 和 274。
2.根據權利要求I的枯草桿菌酶的用途，其中所述替換選自根據BASBPN編號的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和 T274A。
3.清潔或盤洗滌的、洗滌硬表面或者衣物的方法，所述方法包括將硬表面或者衣物與清潔或洗滌劑組合物接觸，所述清潔或洗滌劑組合物包含胺基酸序列為SEQ ID NO:2的胺基酸I到269所示的枯草桿菌酶或者在SEQ ID NO: 2的胺基酸I到269中經過替換一個或多個胺基酸而由SEQ ID NO:2的胺基酸I到269衍生的枯草桿菌酶，其顯示出改進的洗滌性能，其中所述替換選自根據BASBPN編號的如下位置27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、.100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、.252 和 274。
4.根據權利要求3的方法，其中所述替換選自根據BASBPN編號的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和T274A。
5.從硬表面或者衣物除去卵汙潰的方法，所述方法包括將含有卵汙潰的硬表面或者含有卵汙潰的衣物與清潔或洗滌劑組合物接觸，所述清潔或洗滌劑組合物包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 2的胺基酸I到269所示的枯草桿菌酶或者在SEQ ID NO: 2的胺基酸I到269中經過替換一個或多個胺基酸而由SEQ ID NO: 2的胺基酸I到269衍生的枯草桿菌酶，其顯示出改進的洗滌性能，其中所述替換選自根據BASBPN編號的如下位置27、36、56、76、87、95、.96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、.236、245、248、252 和 274。
6.根據權利要求5的方法，其中所述替換選自根據BASBPN編號的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和T274A。
7.枯草桿菌酶，其選自 (a)枯草桿菌酶，其胺基酸序列與SEQID NO: 2的胺基酸I到269所示胺基酸序列具有.99. 26%以上同一性；或 (b)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌(Escherichiacoli)MT173DSM 15575中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有99. 26%以上同一'I"生的所述枯草桿菌酶的變體；或 (c)枯草桿菌酶，其胺基酸序列與SEQID NO: 4的胺基酸I到269所示胺基酸序列具有.97.40%以上同一性；或 (d)枯草桿菌酶，其由克隆到大腸桿菌MT173DSM 15574中存在的質粒片段的編碼枯草桿菌酶的多核苷酸部分編碼，或者與所述枯草桿菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草桿菌酶的變體。
8.根據權利要求7的枯草桿菌酶，其具有 I)與Ia)或者Ib)中描述的胺基酸序列具有99.26%以上，或者99. 63%以上同一性的胺基酸序列；或者 II)與Ic)或者Id)中描述的胺基酸序列具有97.40%以上，或者97. 77%以上，或者.98.14%以上，或者98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的胺基酸序列。
9.根據權利要求8的枯草桿菌酶，其由SEQID NO:2的胺基酸I到269所示胺基酸序列組成，或者由SEQ ID NO:4的胺基酸I到269所示胺基酸序列組成。
10.根據權利要求7的枯草桿菌酶，其具有 I)與克隆到大腸桿菌MT173DSM15575中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的胺基酸序列；或者 II)與克隆到大腸桿菌MT173DSM15574中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶具有97. 40%以上，或者97. 77%以上，或者98. 14%以上，或者.98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的胺基酸序列。
11.根據權利要求10的枯草桿菌酶,其由 I)克隆到大腸桿菌MT173DSM15575中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶；或 II)克隆到大腸桿菌MT173DSM15574中存在的質粒片段的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分編碼的枯草桿菌酶組成。
12.前面權利要求任意一項的枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是 I)具有如SEQID NO:2的胺基酸I到269所示胺基酸序列的枯草桿菌酶變體，其含有一個或多個胺基酸殘基替換、缺失和/或插入；或 II)具有如SEQID N0:4的胺基酸I到269所示胺基酸序列的枯草桿菌酶變體，其含有一個或多個胺基酸殘基替換、缺失和/或插入。
13.根據權利要求12的枯草桿菌酶，其含有如下位置之一的至少一種修飾27、36、56、.76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、.232、235、236、245、248、252 和 274 (BASBPN 編號)。
14.根據權利要求13的枯草桿菌酶，其中所述修飾選自K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和 T274A (BASBPN編號)。
15.分離的多核苷酸,其含有編碼權利要求7— 14任意一項中定義的枯草桿菌酶的多核苷酸。
16.分離的多核苷酸，其編碼枯草桿菌酶，所述多核苷酸選自 (a)與SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示多核苷酸具有至少88%同一性的多核苷酸；或 (b)已經克隆到大腸桿菌MT173DSM15575中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88%同一性的變體， (c)與SEQID NO: 3的核苷酸I到807所示多核苷酸具有至少88%同一性的多核苷酸；或 (d)已經克隆到大腸桿菌MT173DSM15574中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分，或者所述核酸序列的與該核酸序列具有至少88%同一性的變體。
17.根據權利要求16的多核苷酸，其具有 I)與SEQID NO: I的核苷酸I到807所示的多核苷酸具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列；或 II)與SEQID NO:3的核苷酸I到807所示的多核苷酸具有至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的核酸序列。
18.根據權利要求16的多核苷酸，其具有 I)與已經克隆到大腸桿菌MT173DSM15575中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分具有至少89 %、至少90 %、至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列；或 II)與已經克隆到大腸桿菌MT173DSM15574中存在的質粒的多核苷酸的枯草桿菌酶編碼部分具有至少89 %、至少90 %、至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列。
19.核酸構建體，其含有權利要求15- 18任意一項的核酸序列，所述核酸序列與指導枯草桿菌酶在適宜宿主中表達的一種或多種控制序列有效連接。
20.重組表達載體，其含有權利要求19的核酸構建體、啟動子、轉錄和翻譯終止信號。
21.重組宿主細胞,其含有權利要求19的核酸構建體。
22.根據權利要求21的宿主細胞，其是細菌，優選芽孢桿菌屬，特別是遲緩芽孢桿菌。
23.根據權利要求21的宿主細胞，其是真菌或酵母，優選絲狀真菌，特別是麴黴屬。
24.產生根據權利要求7— 14任意一項的枯草桿菌酶的方法,該方法包括 (a)在有助於產生枯草桿菌酶的條件下培養權利要求21— 23任意一項中定義的重組宿主細胞；和 (b)回收枯草桿菌酶。
25.清潔或洗滌劑組合物，優選洗衣或洗盤組合物，其含有根據權利要求7— 14任意一項的枯草桿菌酶。
26.根據權利要求25的組合物，其還含有纖維素酶、脂肪酶、角質酶、氧化還原酶、其他蛋白酶、澱粉酶或者它們的混合物。
27.權利要求7— 14任意一項中定義的枯草桿菌酶的用途，用於清潔或洗滌劑組合物中。
28.權利要求7— 14任意一項中定義的枯草桿菌酶的用途，用於除去卵汙潰。
29.權利要求25- 26任意一項中定義的清潔或洗滌劑組合物的用途，用於除去卵汙潰。
30.清潔或盤洗滌的、洗滌硬表面或者衣物的方法，所述方法包括將硬表面或者衣物與權利要求25 - 26中定義的組合物接觸。
31.從硬表面或者衣物除去卵汙潰的方法，所述方法包括將含有卵汙潰的硬表面或者含有卵汙潰的衣物與權利要求25 - 26中定義的組合物接觸。
全文摘要
對卵汙漬具有改良的洗滌性能的新的枯草桿菌酶。這些枯草桿菌酶當用於例如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣組合物和洗盤組合物，包括自動洗盤組合物中時對卵汙漬具有優秀的或者改進的洗滌性能。
文檔編號C12N9/52GK102766545SQ20121021350
公開日2012年11月7日 申請日期2004年5月6日 優先權日2003年5月7日
發明者J.C.F.克內澤, J.E.內斯, J.S.米舒爾, J.徹麗, L.J.吉韋爾, M.D.韋爾奇, N.H.澤倫森, S.米寧, T.維德爾博爾歇特 申請人:諾維信公司, 麥克西根公司