一種從混合植物甾醇中分離提取β-谷甾醇的方法

2023-11-12 03:55:22 1

專利名稱：：一種從混合植物甾醇中分離提取β-谷甾醇的方法
技術領域：
：本發明屬於生物分離
技術領域：
，具體涉及混合植物甾醇中分離提取P-谷甾醇的新方法。
背景技術：
：植物甾醇是一類廣泛分布於自然界植物中的，具有多種重要生理功能的天然活性物質。就存在形式的不同，可以將植物甾醇分為酯化型和游離型兩種，其中常見的P-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇屬於後者。隨著科學研究特別是生命科學、油脂科學與工程技術的迅猛發展，近年來植物甾醇在醫藥、食品、化工、紡織、飼料、生物工程等領域多方面的開拓應用逐步展現出其良好的應用價值和廣闊的市場前景。在醫藥領域中，植物甾醇對於降低血液膽固醇、預防心血管疾病、防治前列腺肥大等方面表現出的效果，早在幾十年前就已被人們所認識。最新研究表明，植物甾醇對預防腫瘤、治療宮頸癌和潰瘍性皮膚鱗癌都有明顯療效。此外，p-谷甾醇還具有類似於羥基保泰松和氫化可的松的抗炎作用以及類似於阿司匹林的退熱功能，效果顯著，應用安全彭鶯，劉福禎,高欣.天然植物甾醇的應用與提取工藝[J].化工進展,2002,(l):49-53.。治療口腔潰瘍、支氣管哮喘、放射性皮炎、褥瘡、宮頸炎、老年陰道炎、外陰白斑、肛周黏膜白斑等的軟膏、片劑、栓劑及薄膜等，均採用P-谷甾醇、豆甾醇直接入藥吳素萍,章中.植物甾醇的研究現狀[J].中國食物與營養,2007，(9):20-22。同時，|3-谷甾醇和豆甾醇也是甾體激素藥物的重要原料。由於p-谷甾醇具有良好的抗氧化、抗腐敗作用，因此，在食品工業中被廣泛用於防止煎炸油劣變的抗氧化劑和乳化劑，也可以用作食品添加劑(包括航空食品)李月，陳景萍，段玉峰.植物甾醇功能及開發前景展望[J].糧食與油脂,2004,(5):11-13.。植物甾醇具有延緩皮膚衰老的作用，它們的乙氧基化物可用於化妝品工業，起到美容、護膚、護髮等作用。此外，植物甾醇可以作為汽油乳化劑；還可作為磨木漿光穩定劑用於紙張精壓加工；在印刷行業中作為油墨顏料分散劑；在紡織工業中作為柔軟劑姚專.植物甾醇的開發現狀和發展趨勢[J].糧食與食品工業,2003,(3):22-24.；在詞料工業中|3-谷甾醇作為動物生長劑；在農業領域，植物甾醇可作為大規模合成除草劑和殺蟲劑原料；在光學領域，植物甾醇也可用於液晶製造。作為天然有機化合物，絕大部分植物甾醇來自於植物油脂工業副產物。目前，工業上生產混合植物甾醇的原料主要是植物油脫臭餾出物、植物油瀝青、塔爾油瀝青、塔爾油等。植物油精練脫臭餾出物是混合植物甾醇的重要來源，脫臭餾出物中一般含有IO%30%的不皂化物，其中15%是生育酚，大約40%是植物甾醇的混合物。通過皂化、蒸餾回收，然後經有機溶劑結晶、絡合或者兩種方法結合等工藝步驟可以得到含量較高的混合植物甾醇。植物甾醇與膽固醇結構基本相似，都屬於4-無甲基甾醇，它們具有相同的手性結構，結構上的唯一不同之處是側鏈，正是這些側鏈上的微小差異導致了它們生理功能的極大不同。同時，也正是由於植物甾醇中各組分的物化性質極其相似，導致了甾醇單體的分離非常困難。最新調査顯示，目前市售混合植物甾醇的價格為12~15萬元/噸，而純度為97W的p-谷甾醇或者純度為65%的菜油甾醇價格至少是市售混合植物甾醇價格的幾千倍。無論從社會經濟價值、藥用價值還是科研價值來看，高品質單體甾醇始終是世界各國科研學者所關注的焦點和研究的熱點。Yu-Hsuan等人使用乙醚和丙酮分步多級結晶回收混合植物甾醇中的l3-谷甾醇和菜油甾醇，再使用沸石和乙醇分別作為吸附劑和解吸劑，通過P-谷甾醇和菜油甾醇在兩者之間的分配差異，成功得到純度為95.2%的|3-谷甾醇和95.4%的菜油甾醇，但兩種甾醇的收率都只能達到3%左右Chuang，Y.H.,Widjaja^A.,andJu，Y.H.(2007)Kineticstudiesofphytosteroladsorptiononzeolite.Se/.Sd.!Tec/mo/"42:611~624.Chuang,Y.H.，Widjaja，A.,andJu,Y.H.(2006)Separationofcampesterolandp陽sitosterolfromasterolmixture.S印.Sd.Tec/mo/.,41:3027-3038.。許文林等人利用P-谷甾醇和豆甾醇在環己酮和戊醇中的溶解度隨溫度變化的差異，用重結晶法提純P-谷甾醇和豆甾醇，經過數次重結晶操作，^谷甾，和豆甾醇的純度分別達到85%和卯％之多，但使用的有機溶劑過多且回收困難Xu，W丄.，Huang，Y.B"Qian,J.H.,Sha,O.，andWang,Y.Q.(2005)Separationandpurificationofstigmasteroland卩-sitosterolfromphytosterolmixturesbysolventcrystallizationmethod.Se戸r.屍m;-《rec/mo/.，41:173—178.IXu,W丄.，Huang,Y.B.，Qian,J.H.,andWu,J.F.(2003)StudiesonthesolubilityofstigmasterolandP-sitosterolincyclohexanoneandn-pentanol.J.Chem.Eng.Chin.Univ.,17:707.。清華大學的周玉傑等人利用高速逆流色譜法，選用v(庚烷)v(乙腈)v(乙酸乙酯"5:5:l的溶劑體系，從混合植物甾醇標準品中成功分離得到質量分數為97y。的p-谷甾醇，產品收率為50%，但該方法只適用於實驗室精製，不易於大規模生產Zhou,Y.,Chen,F.,andLi,Z.(2002)Preparativeseparationof|3-sitosterolbyhighspeedcountercurrentchromatography./■Oiram.cfeie/.rec/mo/.,25:1693-170.。MikhailYu等人利用沸石(NaY)的分子篩效應，在正己垸體系中特異性選擇吸附空間大小與沸石孔徑尺寸接近的甾醇，但是該方法目前只處於理論研究階段Berezin，M.Y.,Dzenitis，J.M.，Hughes,B.M.,andHo,S.V.(2001)Separationofsterolsusingzeolites./Vz^w.CTiew.CTzew./Vz>^.,3:2184~2189.。本實驗室對混合植物甾醇中單體的分離純化進行了多年的探索，自行研製開發了對甾族化合物具有高效特異性選擇吸附的金屬螯合樹脂。金屬螯合樹脂是吸附樹脂中的一部分，它將具有配位性能的金屬離子固載於樹脂上，通過金屬離子與吸附質間的配位作用將吸附質吸附在樹脂上，多用於水不溶或脂溶性藥物成分的提取何炳林，黃文強，離子交換與吸附樹脂[M],上海:上海科教出版社，1995.孫為銀，配位化學[M]，北京:化學工業出版社，2004。將金屬螯合樹脂的活性基團與甾醇的羥基配位結合，通過改變甾醇的溶劑體系，使上述配位作用的大小差異增大。正是由於上述作用力強弱差別的存在，再通過合適的洗脫劑，利用個別甾醇在洗脫劑與吸附劑之間的分配差異，將與樹脂結合較弱的目標產物最先洗脫下來，從而達到分離混和植物甾醇中一種甾醇單體化合物的目的。對於採用金屬螯合樹脂吸附法分離混合植物甾醇中的單體甾醇，到目前為止，尚未見到相關文獻和專利的報導。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種能從混合植物甾醇中高效分離提取p-谷甾醇的方法，以製備純度較高的P-谷甾醇單體。為解決上述技術問題，本發明的思路是採用金屬螯合樹脂吸附法從混合植物甾醇中分離提取P-谷甾醇。將不同功能單體和基團的樹脂經不同的金屬離子修飾改性後，樹脂的活性基團能與植物甾醇中各組分物質的羥基通過配位作用結合。改變植物甾醇的溶劑體系，會使上述配位作用的大小差異增大。正是由於上述作用力強弱差別的存在，通過適當的有機溶劑，利用個別甾醇在洗脫劑與吸附劑之間的分配差異，可以將與樹脂結合較弱的目標產物最先洗脫下來，從而達到分離混和植物甾醇中一種甾醇單體化合物的目的。具體技術方案如下一種金屬螯合樹脂吸附分離混合植物甾醇中(3-谷甾醇的方法，將混合植物甾醇溶於有機溶劑中，經金屬螯合樹脂吸附，使混合物中各組分有選擇性的吸附在金屬螯合樹脂上，金屬螯合樹脂再經洗脫劑洗脫下|3-谷甾醇，實現混合植物甾醇中P-谷甾醇的分離，金屬螯合樹脂經再生處理後，重複使用。其中，所述的有機溶劑為正丁醇、乙酸乙酯和異丁醇中的任意一種，優選正丁醇。其中，混合植物甾醇與有機溶劑按質量(g)與體積(L)比為i~io:i混合。其中，所述的金屬螯合樹脂是以聚苯乙烯、聚丙烯酸或縮聚酚醛作為惰性骨架，以磺酸基、膦酸基、磷酸基或砷酸基作為樹脂的功能基團，固載二價金屬離子的強酸型樹脂。上述二價金屬離子優選Ti2+、Hg2+、Pd2+、Sn2+、Co2+、S一+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+中的任意一種，更優選Co2+、Ca2+、Mg2+、或Zn2、最優選Mg2+。上述金屬螯合樹脂按如下步驟製備而得(1)配製濃度為18mol/L的二價金屬離子水溶液；(2)將預處理過的強酸型樹脂用去離子水洗至中性後抽乾，以幹樹脂的質量(g)與二價金屬離子水溶液的體積(L)比為60:1~150:1進行混合，在20~50'C下，攪拌或振蕩4~20小時，以徹底交換樹脂上的tf，使各金屬陽離子結合到樹脂上；(3)將樹脂抽濾，用去離子水洗滌後依次用無水乙醇、正己烷淋洗至流出液在紫外光區吸收值S0.005;(4)將樹脂在3(K7(TC真空乾燥後可得到金屬螯合樹脂，密閉封存於4'C下備用。其中，所述的洗脫劑為有機溶劑。洗脫劑優選庚烷、乙醚、正己烷、丙酮、乙醇、正戊垸和甲醇中的任意一種或兩種以上任意比例的混合物。最優選以下三種混合溶劑中的任意一種(1)庚垸和乙醚的混合物，體積比為7:5;(2)正己烷、丙酮和乙醇的混合物，體積比為8:6:1;(3)正戊烷和甲醇的混合物，體積比為9:4。金屬螯合樹脂的再生方法為用丙酮、石油醚和丙烯腈中的任意一種有機溶劑抽提處理，優選丙酮。有益效果本發明提供的一種金屬螯合樹脂吸附分離混合植物甾醇中p-谷甾醇的方法，首次將金屬螯合樹脂吸附法應用於甾醇單體的分離，取得了較好的效果，本發明所設計的金i鏨合樹脂吸附容量大、選擇吸附特異性能強，使用本發明方法分離混合植物甾醇中p-谷甾醇，|3-谷甾醇的分離純度能達80%以上，收率能達50%以上，本發明方法簡單，易於產業化，且投資成本低，並且金屬螯合樹脂經再生處理後重複使用率高。圖1為實施例4的氣相檢測圖譜，其中1為膽甾醇(內標物)，2為P-谷甾醇。圖2為實施例5的氣相檢測圖譜，其中1為膽甾醇(內標物)，2為p-谷甾醇。具體實施方案根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。以下實施例中均採用含量為95.1%的混合植物甾醇，其中P-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇含量分別為45.1%、30.5%、18.8%、0.7%。甾醇含量的檢測方法高效氣相色譜法內標定量。配製濃度均為10.0mg/mL的混合植物甾醇正丁醇溶液和膽甾醇正丁醇溶液，備用。分別移取上述植物甾醇溶液和膽甾醇溶液各0.8mL和0.2mL,混合均勻，以膽甾醇作為內標物，高效氣相色譜檢測甾醇含量。檢測條件如下高效氣相色譜儀AgilentGC7890A;色譜柱AgilentTechnologiesJ&WScientificHP-5石英毛細管柱(30mx0.247mmx0.25pm);柱溫285°C;汽化室溫度320°C;FID檢測器溫度300°C;載氣高純N"純度99.99%);柱流速1.2mL/min;分流比20:1;進樣量1.0pL。實施例l:金屬螯合樹脂的製備試驗。分別配製濃度為1mol/L的Ti、Hg、Pd、Sn、Co、Sr、Mn、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn金屬離子水溶液；將預處理過的樹脂用去離子水洗至中性後抽乾，分別稱取30g加入300mL的上述金屬離子溶液中，在搖床溫度為20°C、轉速為60rpm下，恆溫連續振蕩20小時；再將樹脂抽濾，用去離子水洗滌後依次用無水乙醇、正己烷淋洗至流出液在紫外光區吸收值S0.005;最後將樹脂在30'C真空乾燥，得到固載金屬離子的金屬螯合樹脂，密閉封存於4'C下備用。實施例2:植物甾醇的靜態吸附和靜態解吸附試驗。稱取2.0g混合植物甾醇，溶解在1.0L的正丁醇溶液中，配成濃度為2.0g/L的甾醇正丁醇溶液。分別稱取製備好的固載不同金屬離子的金屬螯合樹脂各1g置於錐形瓶表l金屬螯合樹脂在正丁醇體系中的吸附和在正己烷、丙酮和乙醇洗脫體系中的解吸附情況tableseeoriginaldocumentpage8(其中，R表示以聚苯乙烯為惰性骨架，以磺酸基為功能基團的樹脂)中，各加入上述混合植物甾醇的正丁醇溶液25mL，在搖床溫度為25°C、轉速為120rpm下，恆溫連續振蕩10小時後測定反應液中各組分的含量，計算樹脂的吸附容量。將反應過的金屬螯合樹脂經抽濾處理後，加入到120mL的正己烷、丙酮和乙醇的混合物(體積比為8:6:1)中，在搖床溫度為25°C、轉速為120rpm下，恆溫連續振蕩10小時後測定p-谷甾醇在洗脫液中的含量和收率情況。結果見表l。實施例3:植物甾醇的靜態吸附和靜態解吸附試驗。將實施例2中的混合植物甾醇的溶解有機溶劑體系換成乙酸乙酯，洗脫劑換成庚垸和乙醚的混合物(體積比為7:5)，樹脂以聚丙烯酸為惰性骨架，以磷酸基為功能基團，其他條件和方法不變，結果見表2。表2金屬螯合樹脂在乙酸乙酯體系中的吸附和在庚烷和乙醚洗脫體系中的解吸附情況tableseeoriginaldocumentpage9(其中，R表示以聚丙烯酸為惰性骨架，以磷酸基為功能基團的樹脂)實施例4:植物甾醇的動態吸附和動態解吸附試驗。在直徑15mm、長300mm的層析柱裡幹法裝填20.0gR-Mg樹脂(R表示以聚丙烯酸為惰性骨架，以磷酸基為功能基團的樹脂)，濃度為5.0g/L的混和植物甾醇正丁醇溶液經蠕動泵以恆速為1.2mL/min的流速過柱。採用正戊烷和甲醇的混合物(體積比為9:4)為洗脫劑，經蠕動泵以恆速為1.0mL/min的流速進行動態洗脫，自動收集器收集洗脫液，測定各組分在洗脫液中的含量，P-谷甾醇分離純度為81.5。/。，收率為51.0%。實施例5:植物甾醇的動態吸附和動態解吸附試驗。在直徑15mm、長300mm的層析柱裡幹法裝填20.0gR-Mg樹脂(R表示以聚苯乙烯為惰性骨架，以磺酸基為功能基團的樹脂)，濃度為5.0g/L的混和植物甾醇正丁醇溶液經蠕動泵以恆速為1.2mL/min的流速過柱。採用正己烷、丙酮和乙醇的混合物(體積比為8:6:l)為洗脫劑，經蠕動泵以恆速為1.0mL/min的流速進行動態洗脫，自動收集器收集洗脫液，測定各組分在洗脫液中的含量，|3-谷甾醇分離純度為86.4%，收率為59.6%。實施例6:金屬螯合樹脂的重複使用試驗。將使用過的R-Mg樹脂(R表示以聚苯乙烯為惰性骨架，以磺酸基為功能基團的樹脂)裝入沙氏提取器中，用丙酮抽提處理後真空乾燥，重複實施例2的靜態吸附實驗，測定其重複使用性能，結果見表3。表3R-Mg金屬螯合樹脂的重複使用試驗tableseeoriginaldocumentpage10實驗表明，樹脂的吸附容量變化很小，說明樹脂再生後的使用率很高。權利要求1.一種從混合植物甾醇中分離提取β-谷甾醇的方法，其特徵在於將混合植物甾醇溶於有機溶劑中，經金屬螯合樹脂吸附，使混合物中各組分有選擇性的吸附在金屬螯合樹脂上，金屬螯合樹脂再經洗脫劑洗脫下β-谷甾醇，實現混合植物甾醇中β-谷甾醇的分離，金屬螯合樹脂經再生處理後，重複使用。2、根據權利要求1所述的從混合植物甾醇中分離提取P-谷甾醇的方法，其特徵在於所述的有機溶劑為正丁醇、乙酸乙酯和異丁醇中的任意一種。3、根據權利要求1所述的從混合植物甾醇中分離提取P-谷甾醇的方法，其特徵在於混合植物甾醇與有機溶劑按質量(g)與體積(L)比為i~io:i混合。4、根據權利要求1所述的從混合植物甾醇中分離提取P-谷甾醇的方法，其特徵在於所述的金屬螯合樹脂是以聚苯乙烯、聚丙烯酸或縮聚酚醛作為惰性骨架，以磺酸基、膦酸基、磷酸基或砷酸基作為樹脂的功能基團，固載二價金屬離子的強酸型樹脂。5、根據權利要求4所述的從混合植物甾醇中分離提取P-谷甾醇的方法，其特徵在於所述的二價金屬離子為Ti2+、Hg2+、Pd2+、Sn2+、Co2+、Sf、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Q^+和Z^+中的任意一種。6、根據權利要求4所述的從混合植物甾醇中分離提取p-谷甾醇的方法，其特徵在於所述的金屬螯合樹脂按如下步驟製備而得(1)配製濃度為18mol/L的二價金屬離子水溶液；(2)將預處理過的強酸型樹脂用去離子水洗至中性後抽乾，以幹樹脂的質量(g)與二價金屬離子水溶液的體積(L)比為60:1~150:1進行混合，在20~50'C下，攪拌或振蕩4~20小時；(3)將樹脂抽濾，用去離子水洗滌後依次用無水乙醇、正己垸淋洗至流出液在紫外光區吸收值^).005;(4)將樹脂在307(TC真空乾燥後可得到金屬螯合樹脂，密閉封存於4。C下備用。7、根據權利要求1所述的從混合植物甾醇中分離提取P-谷甾醇的方法，其特徵在於所述的洗脫劑為有機溶劑。8、根據權利要求7所述的從混合植物甾醇中分離提取p-谷甾醇的方法，其特徵在於所述的洗脫劑為庚烷、乙醚、正己烷、丙酮、乙醇、正戊垸和甲醇中的任意一種或兩種以上任意比例的混合物。9、根據權利要求8所述的從混合植物甾醇中分離提取p-谷甾醇的方法，其特徵在於所述的洗脫劑為以下三種混合溶劑中的任意一種(1)庚烷和乙醚的混合物，體積比為7:5;(2)正己烷、丙酮和乙醇的混合物，體積比為8:6:1;(3)正戊烷和甲醇的混合物，體積比為9:4。10、根據權利要求i所述的從混合植物甾醇中分離提取p-谷甾醇的方法，其特徵在於金屬螯合樹脂的再生方法為用丙酮、石油醚和丙烯腈中的任意一種有機溶劑抽提處理。全文摘要本發明公開了一種從混合植物甾醇中分離提取β-谷甾醇的方法，將混合植物甾醇溶於有機溶劑中，經金屬螯合樹脂吸附，使混合物中各組分有選擇性的吸附在金屬螯合樹脂上，金屬螯合樹脂再經洗脫劑洗脫下β-谷甾醇，實現混合植物甾醇中β-谷甾醇的分離，金屬螯合樹脂經再生處理後，重複使用。本發明所涉及的金屬螯合樹脂吸附容量大、選擇吸附特異性能強，使用本發明方法分離混合植物甾醇中β-谷甾醇，β-谷甾醇的分離純度能達80％以上，收率能達50％以上，本發明方法簡單，易於產業化，且投資成本低，並且金屬螯合樹脂經再生處理後重複使用率高。文檔編號C07J9/00GK101367860SQ200810156090公開日2009年2月18日申請日期2008年9月27日優先權日2008年9月27日發明者應漢傑,磊張,李振江,柏建新,健熊,琦陳申請人:南京工業大學