Hiv－1通用引物及探針pcr檢測技術的製作方法
2023-11-02 06:51:57 1
專利名稱：Hiv－1通用引物及探針pcr檢測技術的製作方法
技術領域：
屬於體外生物醫學診斷技術(PCR螢光檢測技術)領域。
背景技術：
螢光探針是高度特異的定量PCR技術，利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切斷探針，產生螢光信號。由於探針與模板是特異性結合，所以螢光信號的強弱就代表了模板的數量。探針的5′端標記有報告基團FAM，3′端標記有螢光淬滅基團TAMRA。當探針完整的時候，報告基團所發射的螢光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生螢光信號。所以，每經過一個PCR循環，螢光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。螢光定量技術正是基於這樣的原理設計的，該技術為HIV感染的早期診斷、大規模篩查、療效動態分析、新藥開發等提供良好的技術支持。
該技術通過篩選數千條HIV基因序列，獲得針對HIV各亞型、各分離株檢測的特異、通用引物及螢光探針，通過檢測各種HIV標準血清及臨床血清，確定該試劑盒的各種檢測指標，並以國際上公認的HIV bDNA檢測試劑盒作為對照，確定該試劑盒檢測的特異性、敏感性及檢測的最低拷貝數，為HIV的確診、大規模篩選、病情程度判斷、療效評價、新藥開發等提供一個簡便、價廉的檢測手段，並最終將取代極為昂貴的進口bDNA定量檢測試劑盒。其關鍵技術為獲得針對各種HIV亞型及分離株的特異、敏感的通用引物及通用探針，製備高特異性、高敏感性、重複性好的HIV螢光定量PCR檢測試劑盒。
發明內容
該技術選用了針對HIV-1各亞型特異、通用的引物及螢光探針，通過檢測各種HIV-1標準血清及臨床血清，確定其檢測HIV的各種檢測指標特異性100％、敏感性95％、重複性CV值＜10％，HIV檢測的最低含量為50拷貝/ml，證實所採用的通用引物及通用螢光探針具有很好的敏感性、特異性及重複性。
具體實施例方式
1、標本種類待測標本為咽拭子、漱口液等。
標本採集咽拭子用棉籤擦拭雙側咽，扁桃體及咽後壁，將棉籤頭浸入含生理鹽水的試管中，棄去尾部。
標本存貯當天不處理的標本置-70℃保存。
2、樣本處理200ul血清+400ul RNA裂解液，振蕩15S；混勻60℃水浴15min；離心數秒；加入600ul異丙醇，室溫5min；600ul 75％乙醇洗滌沉澱，吸水紙洗幹，37℃晾乾10min，備用(如需保存RNA，則加入DEPC處理水，一20℃(保存)。加入28ul逆轉錄反應液(內含0.2uM反義引物，1.8mM Mg2+，50mMTris-HCl(pH8.5)，50mM KCl)及2ul AMV酶，12000r/min離心10S，42℃水浴45min。
3、探針標記螢光探針序列的5』端及3』端分別用FAM及DABCYL/TAMRA標記。
4、PCR擴增體系和條件取Taq酶2.5U加入反應液管內(反應液0.4uM正義引物，0.4uM反義引物，0.2uM螢光分探針，5.0mM Mg2+，50mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM KCl)，然後將樣本、陰性對照或陽性對照的反轉錄液各5μl分別加入反應液管內，混勻後10000r/min離心10s上機(ABI PRISM 7700)擴增和檢測分析。
PCR擴增參數37℃2min；94℃3min；94℃15sec，60℃30sec，40個循環螢光信號的收集定為FAM(激發波長480nm，發射波長520nm)，數據的採集定在60℃。
5、結果分析在File菜單中選擇 將出現 對話框，指定保存文件的名字，單擊 保存文件。
在 頁面選中所有樣品檢測孔，在 菜單中選取 軟體將對實驗結果進行分析，使用PE 7700螢光PCR檢測儀進行結果分析時，基線取3-10或3-15個循環的螢光信號。
閾值設定原則以陰性對照擴增曲線的最高點Ct值＝40為準(其它儀器基線和閾值設定根據儀器可作相應調整)。
6、質量控制①試劑盒陽性對照CT值＜35；②陰性對照CT值為40，③全程系統參照物CT值＜38，若對照樣品檢測結果不符合上述條件，認為實驗不成立，全部試驗重做。
7、結果判斷①若檢測樣本的CT值＜38，則判該樣本為陽性。
②若檢測樣本的CT值＝40，則判該樣本為陰性。
③若檢測樣本的CT值38-40之間，為實驗灰區，需重複實驗一次，若重複實驗結果樣本＞38，判為陽性，否則判為陰性。
權利要求
1.本試劑盒所使用的探針序列ACYACTGCCCCTTCACCTTTCCASAG要求保護，其它類似ACYACTGCCCCTTCACCTTTCCASAG序列製備的HIV-1探針或引物的方法也要求保護；
2.本試劑盒所使用的PCR正鏈引物序列TTTGGAARGGACCAGCMAA要求保護，其它類似TTTGGAARGGACCAGCMAA序列製備的HIV-1 PCR引物及探針的方法也要求保護；
3.本試劑盒所使用的PCR反義引物序列AKCACCTCCATCTGTTTTCC，其正義鏈為GGAAAACAGATGGCAGGTGMT要求保護，其它類似AKCACCTGCCATCTGTTTTCC序列製備的HIV-1 PCR引物及探針的方法也要求保護。
全文摘要
人類免疫缺陷病毒(HIV)通用探針及引物PCR檢測技術是體外生物診斷的一部分。該技術選用了針對HIV－1各亞型的通用正義引物、通用反義引物及通用螢光探針，並用螢光探針PCR檢測技術。該探針5』標記FAM，3』標記TAMRA。由該方法組成的檢測試劑盒對各種HIV－1亞型標準血清及臨床血清，獲得該試劑盒用於HIV檢測的各種參數為特異性100％、敏感性95％、重複性CV值＜10％、HIV檢測的最低含量為50拷貝/ml。本發明還詳述了螢光探針的基本原則及HIV螢光探針PCR檢測技術的具體方法。
文檔編號C12Q1/68GK1966716SQ20051004854
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月15日 優先權日2005年11月15日
發明者王雲龍, 李智濤, 王麗, 周淨, 陳小科 申請人:河南省生物工程技術研究中心