一種抗高血壓的酪蛋白活性肽及其生產方法和應用的製作方法
2023-11-01 21:25:17 1
專利名稱：一種抗高血壓的酪蛋白活性肽及其生產方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種酪蛋白活性肽，特別涉及一種從酪蛋白中生產具有抗高 血壓功能的活性肽的方法，以及由該方法製得的具有抗高血壓功能的酪蛋白 活性肽及其應用。
背景技術：
動物乳，常見的如牛乳是一種成分複雜的生物流體，其中蛋白質含量為32g/L,主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，而酪蛋白大約佔80% (26g/L)，是 含磷的幾種蛋白質的複合體，以膠體形式存在於牛乳中。牛乳蛋白質在營養 上是優質的全價蛋白質，蘊藏著多種生物活性肽片段，在生理上有許多作用。血管緊張素轉化酶(Angiotensin-converting enzyme, ACE) (EC3.4.15.1) 是一種多功能的兩條肽鏈組成的酶，ACE是一種膜結合外在金屬蛋白酶，主 要存在於血管內皮細胞以及其他種類的細胞。人體腎臟可以分泌一種特異性 的蛋白酶，即腎素。腎素作用於血管緊張素(一個存在於血管中相對分子質 量為57Kda的糖蛋白)可以釋放出一種無活性的血管緊張素I (十肽 DRVYIHPFHL)， ACE可以使無活性的血管緊張素I的C-末端水解兩個氨基 酸後轉變成有活性血管緊張素II(八肽DRVYIHPF)，血管緊張素II可以降 低血液的流速，減少腎臟水分和鹽的分泌，會導致血管平滑肌收縮，引發高 血壓，同時ACE可水解血管舒緩激肽使其失活，而血管舒緩激肽可以舒張 血管，使血壓降低。目前文獻報導的大部分降血壓肽產品為ACE抑制物(ACEI)，但沒有 經過動物實驗的驗證環節，很難確定為是真正的抗高血壓活性肽產品。例如 1982年，Maruyama等(Maruyama S.， Suzuki H. A peptide inhibitor ofangiotensin I converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein . Agric. Biol. Chem. 1982,46:1393-1399.)採用胰蛋白酶水解酪蛋白，首次從酪蛋白中獲得 了具有抑制ACE活性的三種肽Pro-Pro、 Ala-Pro、 Ala-Hyp;而有些具有降 血壓功能的活性肽是經過酪蛋白發酵產生，而不是通過酶解作用產生，例如 用Z. /^/v幼'cws和S. cwevWae發酵得到的酸奶，以5mL / kg(體重)的劑量 飼餵SHR，可在6 8 h內明顯地降低其心臟收縮壓(MaenoM， YamamotoN， Takano T. Identification of an antihypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Z^ctoZ^c/// ^ /ze/ve"cws CP 790. J Dairy Sci. 1996,79:1316-1321.)。發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種從酪蛋白中生產具有抗高血壓功 能的活性肽的方法，以及由該方法製得的具有抗高血壓功能的酪蛋白活性 肽。本發明人選用鹼性蛋白酶Alcalase，通過控制一定的條件，如底物濃度、 酶與底物的用量比例、酶解溫度、pH值及時間等來水解酪蛋白，經過純化、 脫鹽、乾燥等常規後續處理步驟得到肽產品，意外地發現其不僅具有良好的 抑制ACE功能，還具有良好的降血壓功能。因此，本發明通過下列技術方案來解決上述技術問題 一種從酪蛋白中 生產具有抗高血壓功能的活性肽的方法，其包括酶解反應及將酶解物脫鹽的 步驟，其中所述的酶解反應中底物為酪蛋白水溶液，酶選用蛋白酶Alcalase， 酶的用量為0.072AU/g酪蛋白，整個反應過程中的溫度控制在55°C~60°C， pH在8.4~8.6範圍， 一般酶解時間為5~6小時左右。其中，底物酪蛋白的濃度太低太高，反應均不易控制。本發明優選的底 物濃度約為12 18w/v%，當濃度低於12%時，易造成酶浪費，反之當濃度 超過18%時，酪蛋白水溶液太濃稠，不利於在酶解過程中進行攪拌，從而造成水解不徹底。本發明最優選的底物濃度則在15%左右，此時，濃度適合， 最利於攪拌，水解反應均衡。本發明所採用的蛋白酶Alcalase的酶活力為2.4AU/g，故其用量換算成 佔酪蛋白的重量百分比為3%。通過控制酶解條件在上述範圍，根據下列公式，可計算出本發明酶解液 的水解度為25%。,、薛解液中游離氨基氮酪蛋白水解度(DH)=-x 100%樣品中總含氮量其中，酪蛋白水解後產生的游離氨基氮採用甲醛滴定法測定(北京大學生物系生化教研室主編，生物化學實驗指導，北京人民教育出版社)，樣品酪蛋白中的總氮含量為150mg/g。根據本發明，酶解液的水解度達25%時 即為本發明酶解反應終點。同常規，所述的酶解反應通常採用酶反應器進行。在酶反應器中，按照 常規方法將酪蛋白溶於水中而製得所述的酪蛋白水溶液，不同的是控制溶解 溫度為55。C 60。C， pH為8.4~8.6。較佳地，所述酶解反應的pH優選8.5。同常規，所述酶解反應還包括去除未水解酪蛋白的步驟，較佳地包括將 酶解反應結束後的水解液冷卻至室溫，調節pH為4.6析出沉澱，以10000rpm 速度離心30分鐘除去沉澱的未水解酪蛋白。根據本發明，所述的酶解物脫鹽最優選採用大孔樹脂DA201-C， 70%的 乙醇為洗脫液對酶解物進行脫鹽處理，比較集中的在大約1小時將大部分吸 附的肽洗脫下來，解吸附率為82%，脫鹽率達到98%，利用DA201-C對蛋 白水解液進行動態脫鹽處理達到很好的效果，而且無毒害。顯然，如有與大 孔樹脂DA201-C性質類似的大孔樹脂也可以用於本發明。由於得到的酶解液體積太大，濃度太小，在用大孔樹脂進行脫鹽之前， 通常將酶解液濃縮或乾燥。本發明可以採用現有乾燥技術將酶解液千燥，優選冷凍乾燥等低溫乾燥方法，以更好地保存活性成分。收集洗脫下來的溶液，按常規，可通過旋轉蒸發等方法回收乙醇，得到 濃縮液。濃縮液噴霧乾燥後得到淡黃色的粉末樣品即為本發明抗高血壓肽。本發明生產方法有以下優點1) 所用器械、試劑、樹脂價格便宜，來源方便，有利於大規模加工生產；2) 生產過程中溫度、pH等條件易控制，生產方法重複性很好，簡便；3) 大孔樹脂脫鹽易於操作，效果好。而本發明抗高血壓的酪蛋白活性肽即為由上述的方法製得的酪蛋白活性肽。體外試驗顯示其是優良的ACEI，而動物體內試驗則進一步顯示本發 明的酪蛋白活性肽具有良好的降血壓功效。因此，本發明酪蛋白活性肽可用 於製備抗高血壓的藥品或飲食品。
具體實施方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。 實施例11、採用酶反應器進行酶的反應(1) 酪蛋白溶解將1000ml水加入反應器中，升溫至最佳溫度55'C左右，稱取150g酪 蛋白(上海化學試劑公司)，在磁力攪拌下緩慢、逐漸放入水中，用2mol/L NaOH調節pH至8.5左右，在55'C的條件下使酪蛋白全部溶解，使反應器 中酪蛋白的濃度為15% (w/v， g/ml)。(2) 酶解按照酶活力單位/底物重量為0.072AU/g酪蛋白的比例，加入4.5g食品 級蛋白酶Alcalase (諾維信生物技術有限公司，2.4L，酶活力2.4AU/g)，維 持反應溫度為55°C,並通過ZDJ-4A自動電位滴定儀滴加2mol/L NaOH維持酶解液的pH為8.5左右，酶解時間為5小時。採用甲醛滴定法測定酶解液 中的游離氨基氮為5.625g，根據上述公式計算得水解度為25%。 (3)冷卻、乾燥以上述水解度時為反應終點，將酶解液快速冷卻至室溫，用10% (v/v) 的鹽酸調pH值至4.6，待沉澱析出後，以10000r/min速度離心30min除去 未水解的酪蛋白。離心後得到的上清液真空濃縮後，冷凍乾燥。2、 大孔樹脂脫鹽用水將樣品溶解，樣品濃度為40mg/ml，採用大孔樹脂DA201-C (江陰 市有機化工廠)進行脫鹽，70% (v/v)的乙醇為洗脫液，比較集中的在大約 1小時將大部分吸附的多肽洗脫下來，解吸附率為82%，脫鹽率達到98%。3、 乾燥樣品收集上述洗脫液，旋轉蒸發回收乙醇，得到濃縮液。將濃縮液進一步噴 霧乾燥後得到本發明抗高血壓肽的淡黃色的粉末樣品。 實施例2將上述步驟l (1)酪蛋白溶解及步驟l (2)酶解過程中的溫度改為60 'C， pH為8.6，底物濃度為12% (w/v， g/ml)，餘同實施例1，製得本發明 抗高血壓肽。實施例3將上述步驟l (1)酪蛋白溶解及步驟l (2)酶解過程中的溫度改為58 °C， pH為8.4,底物濃度為18% (w/v， g/ml)，餘同實施例1，製得本發明 抗高血壓肽。試驗實施例l抗高血壓體外試驗在5ml試管中分別加入200pl的5mmol/LHHL (馬尿醯組氨醯亮氨酸) 溶液和作為ACEI的80^1的30u g/mL本發明的酶解液樣品(實施例2步驟 1製得的脫鹽前乾燥品或步驟3製得的脫鹽後乾燥品溶於水製得)，於37°C 下保溫3min，加入20|al血管緊張素轉換酶(ACE 0.1U/ml)混勻後在37°C下保溫30min。再加250W的l.ON鹽酸溶液終止反應。在上述溶液中加入 1.7ml乙酸乙酯和硼酸鈉緩衝液(pH8.3) 750ul的混合液中，經15s振蕩混 勻後，靜置5min，用移液管吸取l.Oml的乙酸乙酯層，在228nm處測吸光 度OD值。同時設立對照組(B)和空白組(C)，具體操作步驟如下表A(樣品)B (對照)C (空白)100mU/mlACE(ul)00201N HCl(ul)002505mM HHL(ul)200200200ACEI(ul)80080硼酸鈉緩衝液(ul)0750037。C水浴3min100mU/ml ACE(ul)2020037。C水浴30-60min1N HCl(ul)2502500ACEI(ul)0800硼酸鈉緩衝液(ul)7500750乙酸乙酯(ml)1.71.71.715S振蕩混勻靜置5min取lml的乙酸乙酯層，採用N2吹乾超純水(ml)1.51.51.5228nm檢測光吸收值ACE抑制活性(％) =[(B-A)/(B-C)]X100%A:在有ACE及ACE抑制物(ACEI)存在的條件下的OD值(實測值) B:無ACE抑制物存在的條件下測得的OD值(對照值) C:無ACE抑制物存在的條件下測得的OD值(空白值)脫鹽前對ACE抑制活性為40.7%，脫鹽處理後ACE抑制活性升高，樣 品的活性升高幅度較大，達到80.1%。試驗實施例2抗高血壓動物體內試驗採用RBP-1B型大鼠血壓儀進行尾靜脈測定血壓的方法，測定大鼠的收 縮壓(SBP)。在SHR大鼠清醒狀態下，首先在4(TC的恆溫箱內保溫20min，採用 RBP-1B型大鼠血壓儀進行尾靜脈測定血壓的方法，測定大鼠的收縮壓 (SBP)。於實驗前一周開始隔天測定大鼠的血壓，待大鼠穩定適應後開始實 驗記錄。先測定灌胃前的大鼠血壓(BP， mmHg)和心率(HR，次/min)， 然後500mg/kg劑量(根據大鼠的體重灌胃)樣品(實施例1的活性肽)灌 胃，對照組予以同樣劑量純水灌胃，連續灌胃樣品10天，測定灌胃樣品後 的第ld、 3d、 5d、 7d、 9d、 10d大鼠血壓和心率，而且測定第一天大鼠灌胃 樣品後2h、 4h、 6h、 10h的血壓和心率。每個測試點均測定2次大鼠的血壓 和心率，2次測定的間隔時間約lmin，取2次測定值的平均值作為該測試點 大鼠的血壓和心率值。SBP(mmHg)Odld3d5d7d9d7士SD/>值對照組192.0l卯.O191.2196.4194.4196.8192.7±2.31試驗組202.2173.6170,4168.0169.6173.2176.1 ±12.86<0.05注將測得的數據用SPSS統計軟體進行統計處理，採用t檢驗方法。試驗結果表明，在產品應用過程中採用500mg^g劑量與對照組相比有 明顯的降壓作用。
權利要求
1、一種從酪蛋白中生產具有抗高血壓功能的活性肽的方法，其包括酶解反應及將酶解物脫鹽的步驟，其中所述的酶解反應中底物為酪蛋白水溶液，酶選用蛋白酶Alcalase，酶的用量為0.072AU/g酪蛋白，整個反應過程中的溫度控制在55℃～60℃，pH在8.4～8.6範圍，酶解時間為5～6小時。
2、 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的酪蛋白水溶液由酪蛋 白在溫度55。C 60。C， pH8.4 8.6條件下溶於水製得。
3、 如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述酪蛋白水溶液的濃度為 12~18w/v%。
4、 如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述酪蛋白水溶液的濃度為 15%。
5、 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述酶解反應還包括去除未 水解酪蛋白的步驟。
6、 如權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的去除未水解酪蛋白的 步驟包括將酶解反應結束後的水解液冷卻至室溫，調節pH為4.6，以 10000rpm速度離心30分鐘除去沉澱。
7、 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的酶解反應採用酶反應 器進行。
8、 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的酶解物脫鹽採用大孔 樹脂DA201-C， 70%的乙醇為洗脫液對酶解物進行脫鹽處理。
9、 一種由權利要求1~8任一項所述的方法製得的具有抗高血壓功能的 酪蛋白活性肽。
10、 如權利要求9所述的酪蛋白活性肽在製備抗高血壓的藥品或飲食品 中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種從酪蛋白中生產具有抗高血壓功能的活性肽的方法，其包括酶解反應及將酶解物脫鹽的步驟，其中所述的酶解反應中底物為酪蛋白水溶液，酶選用蛋白酶Alcalase，酶的用量為0.072AU/g酪蛋白，整個反應過程中的溫度控制在55℃～60℃，pH在8.4～8.6範圍，酶解時間為5～6小時。本發明還公開了該方法製得的酪蛋白活性肽。該活性肽具有良好的抗高血壓功能，可用於製備抗高血壓的飲食品或藥品。
文檔編號A61P9/12GK101326953SQ20071004220
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月19日 優先權日2007年6月19日
發明者霞 宮, 王蔭榆, 郭本恆 申請人:光明乳業股份有限公司