涉及保護性葡萄球菌抗原的方法和組合物與流程

2023-11-02 03:15:37

涉及保護性葡萄球菌抗原的方法和組合物本申請要求分別於2010年9月9日和2011年1月24日提交的美國臨時專利申請No.61/381,372和61/435,617的權益，其整體通過引用併入本文。發明背景本發明在美國國立衛生研究院的資助AI057153、AI052474和GM007281的政府支持下完成。政府享有本發明的一些權益。I.發明領域本發明一般地涉及免疫學、微生物學和病理學領域。更特別地，本發明涉及與細菌蛋白A變體相關的方法和組合物，它們可用於引發針對細菌的免疫應答。II.
背景技術：
：近年來，社區獲得性感染和醫院獲得性感染兩者的數量隨著血管內裝置使用的增加而增加。醫院獲得性(醫院內)感染是發病率和死亡率的一個主要原因，特別是在美國每年影響超過兩百萬名患者。最常見的感染是尿路感染(33％的感染)，其後是肺炎(15.5％)、手術部位感染(14.8％)和原發性血流感染(13％)(Emorl和Gaynes，1993)。主要的醫院內病原體包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、凝固酶陰性葡萄球菌(主要為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis))、腸球菌物種(enterococcusspp.)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。雖然這些病原體導致的感染數目大致相同，但是它們可引起的疾病的嚴重程度與抗生素抗性分離株的出現頻率一起使得金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌被列為最重要的醫院內病原體。通過產生毒素或侵染，葡萄球菌可以在人和其他動物中引起多種疾病。葡萄球菌毒素還是食物中毒的常見原因，因為該細菌可在保存不當的食物中生長。表皮葡萄球菌是正常皮膚的共生菌，也是導致受損醫療裝置感染和手術部位感染的重要條件性病原體。表皮葡萄球菌感染的醫療裝置包括心臟起搏器、腦脊液分流器、持續性不臥床式腹膜透析導管、整形外科裝置和人工心臟瓣膜。金黃色葡萄球菌是具有高發病率和死亡率的醫院內感染的最常見原因。它是骨髓炎、心內膜炎、膿毒性關節炎、肺炎、膿腫和中毒性休克症候群的一些病例的原因。金黃色葡萄球菌可以在乾燥表面存活，這增加了傳播的機會。任何金黃色葡萄球菌感染可引起葡萄球菌燙傷樣皮膚症候群(staphylococcalscaldedskinsyndrome)，這是對吸收到血流中的外毒素的皮膚反應。它還可以導致可危及生命的稱為膿毒症的一類敗血症。成問題的是，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)已成為醫院獲得性感染的主要原因。通常用抗生素治療金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，其中青黴素是首選藥物，而萬古黴素被用於耐甲氧西林分離株。針對抗生素顯示廣譜耐藥性的葡萄球菌菌株的比例已經越來越高，對有效的抗微生物治療構成威脅。此外，最近耐萬古黴素金黃色葡萄球菌菌株的出現引起對MRSA菌株出現並傳播卻沒有有效療法的擔心。葡萄球菌感染的抗生素治療的替代性方法正在研究之中，其使用靶向葡萄球菌抗原的抗體。該療法包括施用多克隆抗血清(WO00/15238，WO00/12132)或用抗脂磷壁酸的單克隆抗體治療(WO98/57994)。一種替代方法是用主動接種產生針對葡萄球菌的免疫應答。已對金黃色葡萄球菌的基因組進行測序並確定了許多編碼序列(WO02/094868，EP0786519)，這可導致鑑定到潛在抗原。對表皮葡萄球菌也是如此(WO01/34809)。作為對該方法的改進，其他人已經鑑定出被葡萄球菌感染患者的超免疫血清識別的蛋白質(WO01/98499，WO02/059148)。金黃色葡萄球菌向細胞外環境分泌大量的毒力因子(Archer，1998；Dinges等，2000；Foster，2005；Shaw等，2004；Sibbald等，2006)。如同大多數分泌蛋白，這些毒力因子通過Sec機制穿過質膜轉運。通過Sec機制分泌的蛋白具有N端前導肽，一旦前體蛋白被Sec易位子捕獲，該前導肽則被前導肽酶去除(Dalbey和Wickner，1985；vanWely等，2001)。最近的基因組分析表明，放線菌和厚壁菌(Firmicutes)的成員編碼以Sec非依賴性的方式識別蛋白質亞類型的其他分泌系統(Pallen，2002)。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的ESAT-6(早期分泌性抗原靶標(earlysecretedantigentarget)6kDa)和CFP-10(培養濾液抗原(culturefiltrateantigen)10kDa)代表在結核分枝桿菌中稱為ESX-1或Snm的這種新分泌系統的第一底物(Andersen等，1995；Hsu等，2003；Pym等，2003；Stanley等，2003)。在金黃色葡萄球菌中，兩個ESAT-6樣因子(稱為EsxA和EsxB)通過Ess途徑(ESAT-6分泌系統，ESAT-6secretionsystem)分泌(Burts等，2005)。靶向金黃色葡萄球菌或其產生的胞外蛋白的第一代疫苗獲得了有限的成功(Lee，1996)。仍需要開發針對葡萄球菌感染的有效疫苗。還需要治療葡萄球菌感染的其他組合物。發明概述蛋白A(SpA)(SEQIDNO：33)是金黃色葡萄球菌的細胞壁錨定表面蛋白，它使細菌逃避固有和獲得性免疫應答。蛋白A結合免疫球蛋白的Fc部分，與B細胞受體VH3結構域相互作用從而不當地刺激B細胞增殖和凋亡，與vonWillebrand因子A1結構域結合來激活細胞內凝集(intracellularclotting)，並且還結合TNF受體-1從而導致葡萄球菌性肺炎的發病。由於蛋白A捕獲免疫球蛋白並顯示毒性特徵，該表面分子可作為人疫苗發揮功能的可能性未被仔細研究。在本文中，本發明人證明，不能結合免疫球蛋白從而去除其產毒潛力的(即非產毒的)蛋白A變體刺激針對葡萄球菌疾病進行保護的體液免疫應答。在某些實施方案中，所述SpA變體是包含變體A、B、C、D和/或E結構域的全長SpA變體。在某些方面，所述SpA變體包含與SEQIDNO：34的胺基酸序列有80、90、95、98、99或100％同一性的胺基酸序列或由其組成。在另一些實施方案中，所述SpA變體包含SpA的區段。所述SpA的區段可包含至少或至多1、2、3、4、5個或更多個IgG結合結構域。所述IgG結構域可以是至少或至多1、2、3、4、5個或更多個變體A、B、C、D或E結構域。在某些方面，所述SpA變體包含至少或至多1、2、3、4、5個或更多個變體A結構域。在另一方面，所述SpA變體包含至少或至多1、2、3、4、5個或更多個變體B結構域。在又一方面，所述SpA變體包含至少或至多1、2、3、4、5個或更多個變體C結構域。在另一方面，所述SpA變體包含至少或至多1、2、3、4、5個或更多個變體D結構域。在某些方面，所述SpA變體包含至少或至多1、2、3、4、5個或更多個變體E結構域。在另一方面，所述SpA變體包含多種組合和排列的A、B、C、D和E結構域的組合。所述組合可包含全部或部分的SpA信號肽區段、SpA區域X區段和/或SpA分選信號區段。在另一些方面，SpA變體不包含SpA信號肽區段、SpA區域X區段和/或SpA分選信號區段。在某些方面，變體A結構域包含SEQIDNO：4的第7、8、34和/或35位的替換。在另一方面，變體B結構域包含SEQIDNO：6的第7、8、34和/或35位的替換。在又一方面，變體C結構域包含SEQIDNO：5的第7、8、34和/或35位的替換。在某些方面，變體D結構域包含SEQIDNO：2的第9、10、36和/或37位的替換。在另一方面，變體E結構域包含SEQIDNO：3的第6、7、33和/或34位的替換。在某些方面，SpA結構域D變體或其等同物可包含SEQIDNO：2以下位的突變：第9和36位；第9和37位；第9和10位；笫36和37位；第10和36位；第10和37位；第9、36和37位；第10、36和37位；第9、10和36位；或第9、10和37位。在另一方面，類似的突變可包括在一個或更多個結構域A、B、C或E中。在另一些方面，SEQIDNO：2第9位的胺基酸穀氨醯胺(Q)(或其他SpA結構域中的其類比(analogous)胺基酸)可被替換為以下胺基酸：丙氨酸(A)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。在一些方面，第9位的穀氨醯胺可被替換為精氨酸(R)。在另一方面，SEQIDNO：2第9位的穀氨醯胺或其等同物可被替換為賴氨酸或甘氨酸。可明確地排除所述替換中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個。在另一方面，SEQIDNO：2的第10位的胺基酸穀氨醯胺(Q)(或其他SpA結構域中的其類比胺基酸)可被替換為丙氨酸(A)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。在一些方面，第10位的穀氨醯胺可被替換為精氨酸(R)。在另一方面，SEQIDNO：2中第10位的穀氨醯胺或其等同物可被替換為賴氨酸或甘氨酸。可明確地排除所述替換中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個。在某些方面，SEQIDNO：2的第36位的天冬氨酸(D)(或其他SpA結構域中的其類比胺基酸)可被替換為丙氨酸(A)、天冬醯胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、穀氨醯胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。在一些方面，第36位的天冬氨酸可被替換為穀氨酸(E)。在某些方面，SEQIDNO：2的第36位的天冬氨酸或其等同物可被替換為丙氨酸或絲氨酸。可明確地排除所述替換中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個。在另一方面，SEQIDNO：2的第37位的天冬氨酸(D)(或其他SpA結構域中的其類比胺基酸)可被替換為丙氨酸(A)、天冬醯胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、穀氨醯胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。在一些方面，第37位的天冬氨酸可被替換為穀氨酸(E)。在某些方面，SEQIDNO：2的第37位的天冬氨酸或其等同物可被替換為丙氨酸或絲氨酸。可明確地排除所述替換中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個。在一個具體實施方案中，SEQIDNO：2的第9位的氨基(或另一SpA結構域中的類比胺基酸)被替換為丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)或纈氨酸(V)。在某些方面，SEQIDNO：2的第9位的胺基酸被替換為甘氨酸。在另一方面，SEQIDNO：2的笫9位的胺基酸被替換為賴氨酸。在一個具體實施方案中，SEQIDNO：2的第10位的氨基(或另一SpA結構域中的類比胺基酸)被替換為丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)或纈氨酸(V)。在某些方面，SEQIDNO：2的第10位的胺基酸被替換為甘氨酸。在另一方面，SEQIDNO：2的笫10位的胺基酸被替換為賴氨酸。在一個具體實施方案中，SEQIDNO：2的第36位的氨基(或另一SpA結構域中的類比胺基酸)被替換為丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)或纈氨酸(V)。在某些方面，SEQIDNO：2的第36位的胺基酸被替換為絲氨酸。在另一方面，SEQIDNO：2的笫36位的胺基酸被替換為丙氨酸。在一個具體實施方案中，SEQIDNO：2的第37位的氨基(或另一SpA結構域中的類比胺基酸)被替換為丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)或纈氨酸(V)。在某些方面，SEQIDNO：2的第37位的胺基酸被替換為絲氨酸。在另一方面，SEQIDNO：2的笫37位的胺基酸被替換為丙氨酸。在某些方面，SpA變體包含：(a)SpA結構域A、B、C、D和/或E的IgGFc結合亞結構域中幹擾或降低與IgGFc結合的一個或更多個胺基酸替換，和(b)SpA結構域A、B、C、D和/或E的VH3結合亞結構域中幹擾或降低與VH3結合的一個或更多個胺基酸替換。在另一方面，SpA變體的胺基酸序列包含與SEQIDNO：2-6的胺基酸序列有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(包括其間所有數值和範圍)同一性的胺基酸序列。在另一方面，SpA變體包括(a)SpA結構域D的IgGFc結合亞結構域中或其他IgG結構域中相應胺基酸位置處幹擾或降低與IgGFc結合的一個或更多個胺基酸替換，和(b)SpA結構域D的VH3結合亞結構域中或其他IgG結構域中相應胺基酸位置處幹擾或降低與VH3結合的一個或更多個胺基酸替換。在某些方面，結構域D的IgGFc結合亞結構域的胺基酸殘基F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和/或K35(SEQIDNO：2，QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNES)被修飾或替換。在某些方面，結構域D的VH3結合亞結構域的胺基酸殘基Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43和/或E47(SEQIDNO：2)被修飾或替換以減弱與Fc或VH3的結合。在另一些方面，可以將結構域A、B、C和/或E的相應位置改造成相應的修飾或替換。通過將結構域D的胺基酸序列和SpA其他IgG結合結構域的一個或更多個胺基酸序列比對來確定相應位置，例如參見圖2A。在某些方面，胺基酸替換可以是其他20個胺基酸中的任一個。在另一方面，可以從可能的胺基酸替換中特別地排除保守胺基酸替換。在另一些方面僅包括非保守替換。在任何情況下，考慮降低該結構域的結合以顯著降低SpA毒性的任何替換或替換組合。結合的顯著降低是指引入對象後產生最小毒性或不產生毒性的變體，可以使用本文描述的體外方法來對其進行評估。在一些實施方案中，SpA變體包含至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個SpA結構域D肽變體。在某些方面，SpA變體的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個或更多個胺基酸殘基被替換或修飾——包括但不限於結構域D的IgGFc結合亞結構域的F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和/或K35位(SEQIDNO：2)以及結構域D的VH3結合亞結構域的Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43和/或E47位(SEQIDNO：2)。在本發明的一個方面中，SEQIDNO：2的9和/或10位(或其他結構域的相應位置)的穀氨醯胺殘基被突變。在另一方面，SEQIDNO：2的36和/或37位(或其他結構域的相應位置)的天冬氨酸殘基被突變。在另一方面，穀氨醯胺9和10以及天冬氨酸殘基36和37被突變。本文所述純化的非產毒SpA或SpA-D突變體/變體不再能顯著結合(即顯示親合力減弱或被幹擾)Fcγ或F(ab)2VH3，並且也不刺激B細胞凋亡。這些非產毒的蛋白A變體可以用作亞單位疫苗，而且提高體液免疫應答並賦予對金黃色葡萄球菌攻擊的保護性免疫。與野生型全長蛋白A或野生型SpA結構域D相比，用SpA-D變體免疫使蛋白A特異性抗體增加。使用葡萄球菌攻擊和膿腫形成的小鼠模型觀察發現，用非產毒蛋白A變體免疫產生對葡萄球菌感染和膿腫形成的顯著保護。因為基本上所有金黃色葡萄球菌菌株都表達蛋白A，用非產毒蛋白A變體免疫人可以中和該毒性因子，從而建立保護性免疫。在某些方面，保護性免疫對耐藥葡萄球菌(Staphylococcus)菌株(例如USA300和其他MRSA)的感染提供保護或改善。一些實施方案包括蛋白A變體在治療細菌和/或葡萄球菌感染的方法和組合物中的用途。本申請還提供包含蛋白A變體或其免疫原性片段的免疫原性組合物。在某些方面，所述免疫原性片段是蛋白A結構域D區段。另外，本發明提供可以用於治療(例如在對象中限制葡萄球菌膿腫形成和/或持續)或預防細菌感染的方法和組合物。在一些情況下，用於刺激免疫應答的方法涉及向對象施用有效量的包含或編碼全部或部分蛋白A變體多肽或抗原(在某些方面其他細菌蛋白)的組合物。其他細菌蛋白包括但不限於(i)分泌的毒性因子和/或細胞表面蛋白質或肽，或(ii)編碼分泌的毒性因子和/或細胞表面蛋白質或肽的重組核酸分子。在另一些方面，可以向對象施用蛋白A變體的全部或部分，例如蛋白A結構域D變體區段。本發明的多肽可以配製在可藥用的組合物中。所述組合物還可以包含一種或更多種至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個另外的葡萄球菌抗原或其免疫原性片段(例如Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、EsxA-B融合蛋白(即EsxAB或EsxBA)、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla(例如H35突變)、IsdC、SasF、vWbp、FhuD2、sta011、sta0048、sta0069或vWh)。可以與蛋白A變體聯合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限於52kDa玻連蛋白(vitronectin)結合蛋白(WO01/60852)、Aaa(GenBankCAC80837)、Aap(GenBank登錄號AJ249487)、Ant(GenBank登錄號NP_372518)、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素醯胺酶、Cna、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、纖連蛋白(Fibronectin)結合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫顯性ABC轉運蛋白、IsaA/PisA、層粘連蛋白受體、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+轉運蛋白、MHCII類似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNAIII激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和NiABC轉運蛋白、SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2、玻連蛋白結合蛋白(參見PCT公開WO2007/113222、WO2007/113223、WO2006/032472、WO2006/032475、WO2006/032500，其中每個均通過引用整體併入本文)和/或PCT公開號WO2010119343(其通過引用併入本文)所述的那些抗原中的任何一個。在某些方面，所述SpA變體組合物可還包含SdrD、ClfA和/或FnbpB(FnbB)葡萄球菌抗原或其免疫原性片段。因此，在某些方面，一些實施方案的組合物包含SpA變體、SdrD、ClfA和FnbpB(FnbB)葡萄球菌抗原。在一些方面，這類組合物可基本上不含其他葡萄球菌抗原，例如葡萄球菌多肽或碳水化合物(例如，包含葡萄球菌抗原的組合物，所述葡萄球菌抗原基本上包含SpA變體、SdrD、ClfA和FnbpB(FnbB)葡萄球菌抗原)。在另一方面，本發明的一些實施方案提供了SpA變體、SdrD、ClfA和FnbpB多肽在製備用於治療或預防葡萄球菌感染的藥物中的用途。一些實施方案的一種或更多種葡萄球菌抗原或一種或更多種免疫原性片段可以與蛋白A變體同時施用。葡萄球菌抗原或免疫原性片段可以與蛋白A變體在同一組合物中施用。蛋白A變體還可以是編碼蛋白A變體的重組核酸分子。重組核酸分子可以編碼蛋白A變體和至少一種葡萄球菌抗原或其免疫原性片段。本文所用術語「調節」涵蓋詞語「增強」或「抑制」的含義。活性「調節」可以是增強或降低活性。本文所用術語「調節物」是指影響結構(moiety)的功能的化合物，包括上調、誘導、刺激、增強、阻止、下調或抑制蛋白質、核酸、基因、有機體等。在另一些方面，免疫原性組合物包含SdrD、ClfA和/或FnbpB(FnbB)葡萄球菌抗原或其免疫原性片段。在另一些實施方案中，如本文所述，包含SdrD、ClfA和/或FnbpB(FnbB)葡萄球菌抗原或其免疫原性片段的免疫原性組合物可用於治療、改善或抑制葡萄球菌感染。因此，本發明的一些實施方案涉及包含SdrD、ClfA和FnbpB(FnbB)葡萄球菌抗原的組合物。在一些方面，這類組合物可基本上不含其他葡萄球菌抗原，例如葡萄球菌多肽或碳水化合物(例如，包含葡萄球菌抗原的組合物，所述葡萄球菌抗原基本上包含SdrD、ClfA和FnbpB(FnbB)葡萄球菌抗原)。在另一方面，本發明的一些實施方案提供了SdrD、ClfA和FnbpB多肽在製備用於治療或預防葡萄球菌感染的藥物中的用途。在某些方面，SdrD、ClfA和/或FnbpB(FnbB)葡萄球菌抗原來自金黃色葡萄球菌。在某些實施方案中，所述方法和組合物使用或包含或編碼蛋白A變體或抗原的全部或一部分。在另一些方面，蛋白A變體可以與分泌的因子或表面抗原聯合使用，所述因子或表面抗原包括但不限於一種或更多種分離的Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、EsxA-B融合蛋白(即EsxAB或EsxBA)、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、FhuD2、sta011、sta0048、sta0069或vWh多肽或其免疫原性區段。可以與蛋白A變體聯合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限於52kDa玻連蛋白結合蛋白(WO01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素醯胺酶、Cna、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫顯性ABC轉運蛋白、IsaA/PisA、層粘連蛋白受體、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+轉運蛋白、MHCII類似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNAIII激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和NiABC轉運蛋白、SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻連蛋白結合蛋白。在一些實施方案中，可以從本發明的製劑中特別地排除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種的Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、CltA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、vWh、52kDa玻連蛋白結合蛋白(WO01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素醯胺酶、Cna、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫顯性ABC轉運蛋白、IsaA/PisA、層粘連蛋白受體、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+轉運蛋白、MHCII類似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNAIII激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和NiABC轉運蛋白、SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻連蛋白結合蛋白。在另一些實施方案中，所述方法和組合物使用或包含或編碼SdrD、ClfA和/或FnbpB(FnbB)抗原的全部或部分。在一些實施方案中，所述方法和組合物使用、包含或編碼與FhuD2、sta011、Hla(例如，H35突變體，如HLA35L或HLA35A)和EsxAB(即EsxA-B融合蛋白)葡萄球菌抗原或這些抗原的部分相組合的蛋白A變體。在另一些方面，這種組合還包含SdrD、ClfA和/或FnbpB抗原。下表(表1)列出所述實施方案中的SpA變體與多種其他的葡萄球菌抗原的組合。對本領域技術人員顯而易見的是，例如選自28種抗原集合有378種可能成對的組合，3,276種可能的三向組合和20,475種可能的四向組合等對於更大的抗原子集合以此類推，它們都涵蓋在本文中。因此，表1的任何一種抗原組合也可與選自以下的一種、兩種或更多種抗原組合：Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、HlaH35A、IsdC、SasF、vWbp、vWh、FnbpB、FhuD2、sta011、sta0048、sta0069和EsxA與EsxB的融合蛋白(即EsxAB或EsxBA)。這些組合可包含的另外的抗原，包括但不限於PCT公開號WO2010119343(其通過引用併入本文)所述的那些。表1.SpA與葡萄球菌抗原的組合在另一些方面，分離的蛋白A變體為多聚化(例如二聚化)的或為兩個或更多個多肽或肽區段的線性融合物。在本發明的某些方面，組合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個分離的細胞表面蛋白或其區段的多聚體或串聯體(concatamer)。串聯體是具有一個或更多個重複肽單元的線性多肽。SpA多肽或片段可以是連續的，或者被間隔子(spacer)或其他肽序列(例如一個或更多個另外的細菌肽)分隔。在另一方面，所述多聚體或串聯體中包含的其他多肽或肽可以包括但不限於Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、vWh或其免疫原性片段中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19種。可以與蛋白A變體聯合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限於52kDa玻連蛋白結合蛋白(WO01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素醯胺酶、Cna、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫顯性ABC轉運蛋白、IsaA/PisA、層粘連蛋白受體、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+轉運蛋白、MHCII類似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNAIII激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和NiABC轉運蛋白、SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻連蛋白結合蛋白。在某些方面，所述SpA變體與SdrD、ClfA和/或FnbpB(FnbB)抗原組合使用。術語「蛋白A變體」或「SpA變體」是指包含SpAIgG結構域的多肽，所述結構域具有幹擾與Fc和VH3的結合的兩個或更多個胺基酸替換。在某些方面，SpA變體包括變體結構域D肽以及SpA多肽變體及其區段，它們非產毒並且刺激針對葡萄球菌細菌蛋白A和/或表達其的細菌的免疫應答。本發明的一些實施方案包括在對象中引發針對葡萄球菌細菌或葡萄球菌的免疫應答的方法，其包括向對象提供有效量的蛋白A變體或其區段。在某些方面，在對象中引發針對葡萄球菌細菌或葡萄球菌的免疫應答的方法包括向對象提供有效量的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19種或更多種分泌蛋白和/或細胞表面蛋白或其區段/片段。分泌蛋白或細胞表面蛋白包括但不限於Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp和/或vWh蛋白及其免疫原性片段。可以與蛋白A變體聯合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限於52kDa玻連蛋白結合蛋白(WO01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素醯胺酶、Cna、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、纖連接白結合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫顯性ABC轉運蛋白、IsaA/PisA、層粘連蛋白受體、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+轉運蛋白、MHCII類似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNAIII激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和NiABC轉運蛋白、SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻連蛋白結合蛋白。在某些方面，SpA變體與SdrD、ClfA和/或FnbpB(FnbB)抗原組合使用。本發明的一些實施方案包括含有多肽、肽或蛋白質的組合物，所述多肽、肽或蛋白質與蛋白A或作為分泌的細菌蛋白或細菌細胞表面蛋白的第二蛋白質或肽具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性。在本發明的另一實施方案中，組合物可以包含與蛋白A結構域D多肽(SEQIDNO：2)、結構域E(SEQIDNO：3)、結構域A(SEQIDNO：4)、結構域C(SEQIDNO：5)、結構域B(SEQIDNO：6)具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質，或者組合物可以包含編碼蛋白A結構域D、結構域E、結構域A、結構域C或結構域B多肽的核酸序列。在某些方面，蛋白A多肽區段具有胺基酸序列SEQIDNO：8。本領域公知相似性或同一性(優選同一性)並且可以使用很多不同程序確定蛋白質(或核酸)是否與已知序列具有序列同一性或相似性。序列同一性和/或相似性使用本領域已知的標準技術確定，其包括但不限於Smith&Waterman的局部序列同一性算法(1981)、Needleman&Wunsch的序列同一性比對算法(1970)、Pearson&Lipman的相似性搜索法(1988)、計算機執行的這些算法(GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wis.的Wisconsin遺傳學軟體包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、Devereux等(1984)描述的BestFit序列程序(優選使用默認設置或通過觀查)。優選地，通過使用本領域技術人員已知並容易確定的比對工具計算同一性百分比。同一性百分比基本上是相同的胺基酸數除以比較的胺基酸總數再乘以100。另一實施方案包括在對象中刺激針對葡萄球菌細菌的保護性或治療性免疫應答的方法，其包括向對象施用有效量的組合物，所述組合物包含(i)SpA變體，例如SpA多肽變體結構域D或其肽；或(ii)編碼這種SpA多肽變體或其肽的核酸分子；或(iii)與本文所述細菌蛋白的任何組合或排列一起施用SpA結構域D多肽變體。在一個優選的實施方案中，所述組合物不是葡萄球菌細菌。在某些方面，所述對象是人或奶牛。在另一方面，所述組合物在可藥用製劑中配製。葡萄球菌可以是金黃色葡萄球菌。另一些實施方案包括疫苗，其包含具有分離的SpA變體多肽或任何其他本文所述蛋白質或肽之組合或排列的可藥用組合物，其中所述組合物能刺激針對葡萄球菌細菌的免疫應答。疫苗可包含分離的SpA變體多肽或任何其他所述蛋白質或肽的組合或排列。在本發明的某些方面，分離的SpA變體多肽或任何其他所述蛋白質或肽的組合或排列是多聚化(例如二聚化)的或串聯的。在另一方面，疫苗組合物摻雜有少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.05％(或其中導出的任何範圍)的其他葡萄球菌蛋白。組合物還可以包含分離的非SpA多肽。通常疫苗包含佐劑。在某些方面，本發明的蛋白質或肽與佐劑連接(共價或非共價)，優選地，佐劑與所述蛋白質化學綴合。在又一些實施方案中，疫苗組合物是可藥用的組合物，其具有編碼SpA多肽變體的全部或部分或任何其他本文所述蛋白質或肽的組合或排列的重組核酸，其中該組合物能刺激針對葡萄球菌細菌的免疫應答。疫苗組合物可以包含編碼SpA多肽變體的全部或部分或任何其他本文所述蛋白質或肽的組合或排列的重組核酸。在某些實施方案中，所述重組核酸包含異源啟動子。優選地，所述重組核酸是載體。更優選地，所述載體是質粒或病毒載體。在一些方面，疫苗包含含有所述核酸的重組非葡萄球菌細菌。重組非葡萄球菌可以是沙門氏菌(Salmonella)或另一種革蘭氏陽性細菌。疫苗可以包含可藥用賦形劑，更優選佐劑。另一些實施方案包括在對象中刺激針對葡萄球菌細菌的保護性或治療性免疫應答的方法，其包括向對象施用有效量的SpA變體多肽或其區段/片段的組合物，並且該組合物還包含Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp或vWh蛋白質或其肽中的一種或更多種。在一個優選的實施方案中，組合物包含非葡萄球菌細菌。在另一方面，組合物配製成可藥用的製劑。對象中所治療的葡萄球菌可以是金黃色葡萄球菌。本發明的一些方法還包括SpA變體組合物，其包含多種組合分泌的毒性因子和/或細胞表面蛋白中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19種或更多種，例如Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp或vWh。在某些方面，疫苗製劑包括Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp和vWh。在某些方面，抗原組合可以包括(1)SpA變體和IsdA；(2)SpA變體和ClfB；(3)SpA變體和SdrD；(4)SpA變體和Hla或Hla變體；(5)SpA變體以及ClfB、SdrD和Hla或Hla變體；(6)SpA變體、IsdA、SdrD和Hla或Hla變體；(7)SpA變體、IsdA、ClfB和Hla或Hla變體；(8)SpA變體、IsdA、ClfB和SdrD；(9)SpA變體、IsdA、ClfB、SdrD和Hla或Hla變體；(10)SpA變體、IsdA、ClfB和SdrD；(11)SpA變體、IsdA、SdrD和Hla或Hla變體；(12)SpA變體、IsdA和Hla或Hla變體；(13)SpA變體、IsdA、ClfB和Hla或Hla變體；(14)SpA變體、ClfB和SdrD；(15)SpA變體、ClfB和Hla或Hla變體；或(16)SpA變體、SdrD和Hla或Hla變體。在某些方面，遞送本發明組合物的細菌在延長或持續的生長或膿腫形成方面被限制或減弱。在另一方面，SpA變體可以在被減弱的細菌中過表達以進一步增強或補充免疫應答或疫苗製劑。術語「EsxA蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型EsxA多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌EsxA蛋白的免疫應答的變體。術語「EsxB蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型EsxB多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌EsxB蛋白的免疫應答的變體。術語「SdrD蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型SdrD多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌SdrD蛋白的免疫應答的變體。例如，NCBI登錄號CAA06651(SEQIDNO：65)提供了野生型SdrD的胺基酸序列。根據一些實施方案用於抗原的SrdD多肽可包含這樣的胺基酸序列，所述胺基酸序列包含SEQIDNO：65或與SEQIDNO：65有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。在另一方面，所述SrdD多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸區段，所述胺基酸區段包含約、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25to25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、30、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300或1315個胺基酸的長度(包括其之間的所有值和範圍)，並且與SEQIDNO：65的胺基酸區段有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。術語「SdrE蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型SdrE多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌SdrE蛋白的免疫應答的變體。術語「IsdA蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型IsdA多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌IsdA蛋白的免疫應答的變體。術語「IsdB蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型IsdB多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌IsdB蛋白的免疫應答的變體。術語「Eap蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型Eap多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌Eap蛋白的免疫應答的變體。術語「Ebh蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型Ebh多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌Ebh蛋白的免疫應答的變體。術語「Emp蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型Emp多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌Emp蛋白的免疫應答的變體。術語「EsaB蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型EsaB多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌EsaB蛋白的免疫應答的變體。術語「EsaC蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型EsaC多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌EsaC蛋白的免疫應答的變體。術語「SdrC蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型SdrC多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌SdrC蛋白的免疫應答的變體。術語「ClfA蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型ClfA多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌ClfA蛋白的免疫應答的變體。例如，NCBI登錄號YP_001331790(SEQIDNO：66)提供了野生型ClfA的胺基酸序列。根據一些實施方案用於抗原的ClfA多肽可包含這樣的胺基酸序列，所述胺基酸序列含有SEQIDNO：66或與SEQIDNO：66有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。在另一方面，所述ClfA多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸區段，所述胺基酸區段包含約、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25to25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、30、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900或933個胺基酸的長度(包括其之間的所有值和範圍)，並且與SEQIDNO：66的胺基酸區段有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。術語「ClfB蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型ClfB多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌ClfB蛋白的免疫應答的變體。術語「Coa蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型Coa多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌Coa蛋白的免疫應答的變體。術語「FnbpB蛋白」或「FnbB蛋白」指包含來自葡萄球菌細菌的分離的野生型FnbpB多肽及其區段的蛋白質和能刺激針對葡萄球菌細菌FnbpB蛋白的免疫應答的變體。例如，NCBI登錄號YP_001333431(SEQIDNO：67)提供了野生型FnbpB的胺基酸序列。根據一些實施方案用於抗原的FnbpB多肽可包含這樣的胺基酸序列，所述胺基酸序列包含SEQIDNO：67或與SEQIDNO：67有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。在另一方面，所述FnbpB多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸區段，所述胺基酸區段包含約、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25to25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、30、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650或677個胺基酸的長度(包括其之間的所有值和範圍)，並且與SEQIDNO：67的胺基酸區段有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。術語「Hla蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型Hla多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌Hla蛋白的免疫應答的變體。術語「IsdC蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型IsdC多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌IsdC蛋白的免疫應答的變體。術語「SasF蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型SasF多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌SasF蛋白的免疫應答的變體。術語「vWbp蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型vWbp(vonWillebrand因子結合蛋白，vonWillebrandfactorbindingprotein)多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌vWbp蛋白的免疫應答的變體。術語「vWh蛋白」指一種蛋白質，其包括來自葡萄球菌細菌的分離的野生型vWh(vonWillebrand因子結合蛋白同系物，vonWillebrandfactorbindingproteinhomolog)多肽及其區段和能刺激針對葡萄球菌細菌vWh蛋白的免疫應答的變體。免疫應答指有機體中的體液應答、細胞應答或體液和細胞應答兩者。免疫應答可以通過測定進行測量，所述測定包括但不限於測量特異識別某蛋白質或細胞表面蛋白的抗體的存在或量的分析，測量T細胞活化或增殖的分析和/或測量一種或更多種細胞因子活性調節或表達調節的分析。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與EsxA蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，EsxA蛋白具有SEQIDNO：11的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與EsxB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，EsxB蛋白具有SEQIDNO：12的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與SdrD蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，SdrD蛋白具有SEQIDNO：13的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與SdrE蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，SdrE蛋白具有SEQIDNO：14的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與IsdA蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，IsdA蛋白具有SEQIDNO：15的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與IsdB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，IsdB蛋白具有SEQIDNO：16的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的一些實施方案包括組合物，其包括與EsaB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，EsaB蛋白具有SEQIDNO：17的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與ClfB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，ClfB蛋白具有SEQIDNO：18的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與IsdC蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，IsdC蛋白具有SEQIDNO：19的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與SasF蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，SasF蛋白具有SEQIDNO：20的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與SdrC蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，SdrC蛋白具有SEQIDNO：21的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與ClfA蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，ClfA蛋白具有SEQIDNO：22的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與Eap蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，Eap蛋白具有SEQIDNO：23的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與Ebh蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，Ebh蛋白具有SEQIDNO：24的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與Emp蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，Emp蛋白具有SEQIDNO：25的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與EsaC蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，EsaC蛋白具有SEQIDNO：26的胺基酸序列的全部或部分。EsaC多肽的序列可以在蛋白質資料庫中找到，並且包括但不限於登錄號ZP_02760162(GI：168727885)、NP_645081.1(GI：21281993)和NP_370813.1(GI：15923279)，其中每個均通過引用本申請的優先權日時的內容併入本文。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與Coa蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，Coa蛋白具有SEQIDNO：27的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與Hla蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，Hla蛋白具有SEQIDNO：28的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與vWa蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，vWa蛋白具有SEQIDNO：29的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的另一些實施方案中，組合物可以包括與vWbp蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，vWbp蛋白具有SEQIDNO：32的胺基酸序列的全部或部分。在本發明的又一些實施方案中，組合物可包含與FnbpB蛋白具有或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或相似性的多肽、肽或蛋白質。在某些方面，FnbpB蛋白具有SEQIDNO：64的胺基酸序列的全部或部分。在某些方面，多肽或區段/片段可以具有與參照多肽的胺基酸序列有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或更高同一性的序列。術語「相似性」指具有這樣序列的多肽，即它的特定百分比的胺基酸與參照多肽相同或者構成對參照多肽的保守替換。本文所述多肽可以在SEQIDNO：2-30或SEQIDNO：32-34的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個或更多個連續的胺基酸內(或其中導出的任何範圍內)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個變體胺基酸。本文所述多肽區段可以包括SEQIDNO：2-30或SEQIDNO：33-34或SEQIDNO：64的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個或更多個連續的胺基酸(或其中導出的任何範圍)。該組合物可以製備成可藥用組合物。在本發明的某些方面，葡萄球菌細菌是金黃色葡萄球菌。在另一些方面，可以多於一次向對象施用組合物，並且可以施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20次或更多次。組合物的施用包括但不限於經口、腸胃外、皮下、肌內、靜脈內或其多種組合，包括吸入或噴霧。在另一些實施方案中，組合物包含編碼本文所述多肽或其區段/片段的重組核酸分子。通常編碼本文所述多肽的重組核酸分子包含異源啟動子。在某些方面，本發明的重組核酸分子是載體，在另一些方面載體是質粒。在某些實施方案中，載體是病毒載體。在某些方面，組合物包括含有或表達本文所述多肽的重組非葡萄球菌細菌。在一些具體方面，重組非葡萄球菌細菌是沙門氏菌或另一種革蘭氏陽性細菌。組合物通常施用給哺乳動物，例如人對象，但是也考慮施用給能引發免疫應答的其他動物。在另一些方面，含有或表達多肽的葡萄球菌細菌是金黃色葡萄球菌。在另一些實施方案中，免疫應答是保護性免疫應答。在另一些實施方案中，組合物包含編碼全部或部分Eap、Ebh、Emp、EsaB、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、SpA、vWbp或vWh蛋白或肽或其變體的重組核酸分子。可以與本文所述多肽聯合使用的另外的葡萄球菌抗原包括但不限於52kDa玻連蛋白結合蛋白(WO01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素醯胺酶、Cna、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫顯性ABC轉運蛋白、IsaA/PisA、層粘連蛋白受體、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+轉運蛋白、MHCII類似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNAIII激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和NiABC轉運蛋白、SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻連蛋白結合蛋白。在一些具體方面，細菌是重組非葡萄球菌細菌，例如沙門氏菌或其他革蘭氏陽性細菌。本發明的組合物通常施用給人對象，但是也考慮施用給能由葡萄球菌細菌引發免疫應答的其他動物，特別是牛、馬、山羊、綿羊和其他家畜，即哺乳動物。在某些方面，葡萄球菌細菌是金黃色葡萄球菌。在另一些實施方案中，免疫應答是保護性免疫應答。在另一些方面，本發明的方法和組合物可以用於預防、改善、減少或治療組織或腺體感染，例如乳腺感染(特別是乳腺炎)和其他感染。其他方法包括但不限於在未顯示感染徵兆的對象中預防性降低細菌負載，特別是懷疑或有風險被目標細菌定殖的對象，例如在住院、治療和/或康復期間被感染或有感染風險或懷疑被感染的患者。對本發明一個方面所討論的任何實施方案都適用於本發明的其他方面。特別地，對SpA變體多肽或肽或核酸的內容所討論的任何實施方案都可以實施於其他抗原，反之亦然，所述抗原如Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、vWh、52kDa玻連蛋白結合蛋白(WO01/60852)、Aaa、Aap、Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素醯胺酶、Cna、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫顯性ABC轉運蛋白、IsaA/PisA、層粘連蛋白受體、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+轉運蛋白、MHCII類似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNAIII激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和NiABC轉運蛋白、SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻連蛋白結合蛋白(或核酸)。應理解可以從所要求的組合物中特別排除任一個或更多個Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsxA、EsxB、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、Coa、Hla、IsdC、SasF、vWbp、vWh、52kDa玻連蛋白結合蛋白(WO01/60852)、Aaa、Aap，Ant、自溶素氨基葡萄糖苷酶、自溶素醯胺酶、Cna、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、EFB(FIB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EPB、FbpA、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、FnbA、FnbB、GehD(US2002/0169288)、HarA、HBP、免疫顯性ABC轉運蛋白、IsaA/PisA、層粘連蛋白受體、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+轉運蛋白、MHCII類似物(US5648240)、MRPII、Npase、RNAIII激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SdrF(WO00/12689)、SdrG/Fig(WO00/12689)、SdrH(WO00/12689)、SEA外毒素(WO00/02523)、SEB外毒素(WO00/02523)、SitC和NiABC轉運蛋白、SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5,801,234)、SsaA、SSP-1、SSP-2和/或玻連蛋白結合蛋白。本發明的一些實施方案包括包含或不包含細菌的組合物。組合物可以包括或不包括被減弱或有活力或完整的葡萄球菌細菌。在某些方面，組合物包含非葡萄球菌的細菌或者不包含葡萄球菌。在某些實施方案中，細菌組合物包含分離的或重組表達的葡萄球菌蛋白A變體或編碼它的核苷酸。組合物可以是以如下方式改變的重組改造的葡萄球菌細菌或包含所述細菌：該方式包括在分泌的毒性因子或細胞表面蛋白方面對細菌進行特定的改變。例如，可重組修飾該細菌以表達與比未修飾時相比更多的毒性因子或細胞表面蛋白。術語「分離的」可以指基本不含其來源中的細胞物質、細菌物質、病毒物質或培養基(通過重組DNA技術產生時)或者化學前體或其他化學物(化學合成時)的核酸或多肽。另外，分離的化合物指可作為分離的化合物施用給對象的化合物，換言之，如果該化合物吸附到柱上或包埋在瓊脂凝膠中則不會被簡單地認為是「分離的」。另外，「分離的核酸片段」或「分離的肽」包括不作為非片段形式天然存在和/或通常不處於功能狀態的核酸或蛋白質片段。本發明的結構(如多肽、肽、抗原或免疫原)可以綴合或者共價或非共價連接至其他結構(如佐劑、蛋白質、肽、支持物、螢光結構或標記)。廣義地使用術語「綴合」或「免疫綴合」定義一個結構與另一試劑的可操作連接，並且不旨在單獨指任何類型的可操作連接，特別不限於化學「綴合」。特別考慮的是重組融合蛋白質。本發明的組合物還可以包含佐劑或可藥用賦形劑。佐劑可以共價或非共價偶聯到本發明的多肽或肽上。在某些方面，佐劑化學綴合至蛋白質、多肽或肽。術語「提供」使用其普通含義，指「提供或配備來使用」。在一些實施方案中，通過施用蛋白質來直接提供所述蛋白質，而在另一些實施方案中，通過施用編碼蛋白質的核酸來有效地提供蛋白質。在某些方面，本發明考慮的組合物包括核酸、抗原、肽和/或表位的多種組合。對象將患有(例如，診斷為葡萄球菌感染)、被懷疑患有或有風險發生葡萄球菌感染。本發明的組合物包括免疫原性組合物，其中包含有效量的抗原或表位以達到預期目的。更特別地，有效量是刺激或引發免疫應答或提供對感染的抵抗、改善或緩和所必需的活性成分的量。在更具體的方面，有效量預防、減輕或改善疾病或感染的症狀，或延長被治療對象的存活。有效量的測定在本領域技術人員能力範圍內，尤其在參考本文提供的詳細公開內容的情況下。對於本發明方法中使用的任何製劑，可以從體外研究、細胞培養和/或動物模型測定初步估計有效量或劑量。例如，可以在動物模型中制定劑量，以達到期望的免疫應答或循環抗體濃度或效價。這些信息可用於更準確地確定對人有效的劑量。實施例部分的實施方案應被理解為可應用於本發明所有方面的本發明的實施方案。儘管本公開內容支持指代唯一性替換和「和/或」的定義，但是除非明確指明僅指代替換或指代替換之間彼此不共存，否則權利要求中所使用的術語「或」用於表示「和/或」。它也表示任何用術語「或」列舉的內容也可以被特別地排除。在本申請中，術語「約」用於表示數值包括測定該數值所用裝置或方法的誤差的標準差。根據長期存在的專利法，除非特別指明，當在權利要求書或說明書中詞語「包含」未聯合使用表明數量的詞時，表示一個或更多個。根據以下的詳細描述本發明的其他目的、特點和優點會更明確。然而應理解，詳細的說明和具體的實例雖然說明本發明的具體實施方案，但是僅通過示例方式給出，本領域技術人員根據此詳細的說明會明確本發明精神和範圍內的多種變化和改進。附圖說明為了實現並可以詳細理解本發明上述特徵、優點和目的以及會明確的其他內容，在附圖中顯示了更具體的描述和上文簡要概括的一些本發明實施方案。這些附圖是本說明書的一部分。但應注意附圖說明了本發明的某些實施方案，因此不應認為限制於附圖的範圍。圖1A-1B.(圖1A)蛋白A前體的一級結構，其具有N端YSIRK基序信號肽，稱為E、D、A、B、C的串聯重複的五個免疫球蛋白結合結構域，區域X和LPXTG分選信號。(圖1B)在合成蛋白A前體之後，葡萄球菌經由Sec途徑分泌該產物，並且分選酶A在T與G殘基之間切割LPXTG分選信號。脂質II內氨基的親核攻擊分選酶-蛋白A硫酯連接的中間體形成醯胺鍵，其使蛋白A連接至細胞壁包膜並且使其能夠展示在細菌表面。圖2.蛋白A的SpA結構域D、B細胞受體的VH3Fab結構域與免疫球蛋白的Fcγ結構域之間的分子相互作用的三維模型。所述模型來源於兩種晶體結構(Graille等，2000和Gouda等，1992)，其揭示出參與使這些複合物形成之離子鍵的形成的側鏈殘基。SpA-D的Gln-9和Gln-10促進與Fcγ的結合，而Asp-36和Asp37使得與VH3Fab形成複合物。圖3.左圖-考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE揭示經純化的His標記的SpA、SpA-D、SpA-DQ9，10K；D36，37A，人IgG和分選酶A(SrtA，對照蛋白)的遷移位置。右圖-考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE揭示在用His標記的SpA、SpA-D、SpA-DQ9，10K；D36，37A或SrtA進行預裝載的Ni-NTA柱上，通過人IgG的親和色譜洗脫的蛋白A-免疫球蛋白複合物的洗脫。圖4.對人免疫球蛋白(hIgG)、人F(ab)2IgG片段和人免疫球蛋白的Fc片段(hFc)進行定量的ELISA測定。板上包被有等量的His標記的SpA、SpA-D、SpA-DQ9，10K；D36，37A或SrtA。將hIgG-HRP、F(ab)2-HRP和hFc-HRP添加到板上並孵育1小時。記錄450nm處的吸光度並繪圖以確定半數最大效價(halfmaximaltiters)。圖5.將經純化的SpA-D、SpA-DQ9，10K；D36，37A或PBS模擬對照注入到小鼠腹膜內並且分析其在實驗性BALB/c小鼠的脾中減少B細胞群體的能力。注射後4小時處死小鼠，移出其脾、將組織勻漿，然後用針對B細胞的CD19抗體進行染色。通過FACS分選對B細胞數目進行定量。圖6.非產毒的蛋白A疫苗的產生。a，金黃色葡萄球菌Newman株和USA300LAC的蛋白A(SpA)翻譯產物，其具有N末端信號肽(白色框)、5個免疫球蛋白結合結構域(IgBD，稱為E、D、A、B和C)、可變區域X和C末端分選信號(黑色框)。b，5個IgBD和非產毒SpA-DKKAA的胺基酸序列，其中標明了三α-螺旋束(H1、H2和H3)和穀氨醯胺(Q)9、10和天冬氨酸(D)36、37的位置。c，存在或不存在人免疫球蛋白(hIgG)時，用Ni-NTAsepharose純化的SpA、SpA-D、SpA-DKKAA或SrtA的考馬斯亮藍染色SDS-PAGE。d，ELISA檢測固定化的SpA、SpA-D或SpA-DKKAA與人IgG及其Fc或F(ab)2片段和vonWillebrand因子(vWF)之間的結合。e，通過FACS對模擬免疫或者用SpA-D或SpA-DKKAA處理的BALB/c小鼠脾組織中的CD19+B淋巴細胞進行定量。圖7.非產毒蛋白A疫苗預防膿腫形成。BALB/c小鼠經模擬免疫(PBS)或SPA、SPA-D和SPA-DKKAA接種並被金黃色葡萄球菌Newman株攻擊後，屍檢分離的腎組織的組織病理。薄切片組織用蘇木精-伊紅染色。白色箭頭標識多形核白細胞(PMN)浸潤。深色箭頭標識葡萄球菌膿腫集落。圖8.非產毒蛋白A疫苗產生的抗體阻斷SpA的B細胞超抗原功能。a，將針對SpA-DKKAA產生的兔抗體在固定了抗原的基質上純化，並且通過考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE進行分析。抗體用胃蛋白酶酶切，通過在SpA-DKKAA基質上的第二輪親和層析純化F(ab)2片段。SpA-DKKAA特異性F(ab)2幹擾SpA或SpA-D與人免疫球蛋白(hIgG)(b)或vonWillebrand因子(vWF)(c)的結合。圖9.全長非產毒蛋白A產生改善的免疫應答。a，將全長SpAKKAA在Ni-NTAsepharose上純化並通過考馬斯亮藍染色SDS-PAGE分析。b，通過FACS對模擬免疫或者用SpA或SpAKKAA處理的BALB/c小鼠脾臟組織的CD19+B淋巴細胞進行定量。c，ELISA檢測固定化的SpA或SpAKKAA與人IgG及其Fc或F(ab)2片段或vonWillebrand因子(vWF)的結合。d，針對白喉類毒素(CRM197)和非產毒SpAKKAA或SpA-DKKAA的人或小鼠血清抗體效價。通過定量點印跡(quantitativedotblot)檢測有DTaP免疫史和葡萄球菌感染史的人志願者(n＝16)以及已被金黃色葡萄球菌Newman株或USA300LAC感染或者經SpAKKAA或SpA-DKKAA免疫的小鼠(n＝20)。圖10.葡萄球菌感染不產生保護性免疫。將BALB/c小鼠(n＝20)用金黃色葡萄球菌Newman株感染或模擬攻擊(PBS)30天並用氯黴素治療清除感染。隨後兩組動物均用金黃色葡萄球菌Newman株攻擊，在第4天屍檢後分析腎組織勻漿的細菌負荷(CFU)。圖11.經PBS、SpA、SpA-D和SpA-DKKAA處理的小鼠中膿腫形成的比較。圖12A-12C.(A)ELISA檢測固定化的SpA、SpA-D、SpA-DKKAA或SpA-DGGSS與人IgG及其Fc或F(ab)2片段和IgM的結合。相對於SpA-D比較SpA-DKKAA和SpA-DGGSS與每種配體結合的統計學顯著性；針對SpA比較SpA-D結合(n＝3)；＊表示P＜0.05；＊＊表示P＜0.01a(B)ELISA檢測從SpA-D、SpA-DKKAA和SpA-DGGSS主動免疫小鼠(n＝5)中收集的超免疫血清樣本的交叉反應性抗體水平。(C)經PBS、SpA-D、SpA-DKKAA和SpA-DGGSS處理的小鼠中的膿腫形成。圖13A-13B.BALB/c小鼠(n＝18-20)經PBS/佐劑模擬免疫或注射25μg每種抗原(Combo1，ClfA+SdrD+FnBPB；Combo2，Combo1+SpAKKAA)。通過靜脈內接種1×107CFU金黃色葡萄球菌Newman株攻擊經免疫小鼠。攻擊後第4天(A)和第18天(B)檢查腎組織中的細菌負荷。用未配對雙尾Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。圖14A-14H.基因疫苗學揭示的用抗原主動免疫引發小鼠對抗葡萄球菌膿腫形成的保護。在第0和11天用模擬(PBS)、Combo1(ClfA、FnbpB和SdrD)或Combo2(ClfA、FnBpB、SdrD和SpAKKAA)主動免疫BALB/c小鼠的組(n＝18-20)。在第21天，通過眶後注射(retro-orbitalinjection)1×107CFU金黃色葡萄球菌Newman株攻擊動物。在攻擊後第4天(A)和第18天(B)，處死動物以計算腎組織中的葡萄球菌負載。(C-H)示出每組(n＝10，攻擊後第4天)的經蘇木精-伊紅染色的代表性組織病理學薄切片。白色箭頭標識多形核白細胞(PMN)浸潤。深色箭頭標識葡萄球菌膿腫集落。動物數據代表兩組獨立的實驗。圖15.基因疫苗學揭示的用抗原主動免疫引發小鼠對抗葡萄球菌敗血症的保護。在第0和11天用模擬(PBS)、Combo1(ClfA、FnBpB和SdrD)或Combo2(ClfA、FnBpB、SdrD和SpAKKAA)主動免疫BALB/c小鼠的組(n＝20)。在第21天，通過眶後注射1×108CFU金黃色葡萄球菌Newman株攻擊動物並監測其存活。動物數據代表兩組獨立的實驗。發明詳述金黃色葡萄球菌是人皮膚和鼻孔的共生菌，並且是血流、皮膚及軟組織感染的首要原因(Klevens等，2007)。近期金黃色葡萄球菌疾病死亡率大幅增加歸因於通常對抗生素不敏感的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株的傳播(Kennedy等，2008)。在一項大型回顧性研究中，在美國所有醫院收治者中MRSA感染的發病率是4.6％(Klevens等，2007)。在美國，94,300名MRSA感染者年醫療保健費用超過24億美元(Klevens等，2007)。目前的MRSA流行已成為公共健康危機，需要開發預防性疫苗加以應對(Boucher和Corey，2008)。迄今還沒有FDA許可的預防金黃色葡萄球菌疾病的疫苗。本發明人在本文中描述了蛋白A(葡萄球菌的細胞壁錨定表面蛋白)在產生可作為亞單位疫苗的變體中的用途。金黃色葡萄球菌感染的發病是隨細菌通過外傷、手術傷口或醫療器械侵入皮膚或血流而開始的(Lowy，1998)。雖然侵入的病原體可被吞噬和殺死，但葡萄球菌也可以逃脫先天免疫防禦並在器官組織中引發感染，誘發吸引巨噬細胞、中性粒細胞和其他吞噬細胞的炎症反應(Lowy，1998)。因為宿主試圖防止金黃色葡萄球菌的傳播，免疫細胞到感染部位的反應性侵入伴隨著液化性壞死，並能清除壞死的組織碎片(Lam等，1963)。通過顯微鏡對這種病變可觀察到含有壞死組織、白細胞和細菌中央病灶的高細胞區(Lam等，1963)。除非葡萄球菌膿腫通過手術排除並用抗生素治療，否則彌散性感染和敗血症會導致致命結果(Sheagren，1984)。I.葡萄球菌抗原A.葡萄球菌蛋白A(SpA)所有金黃色葡萄球菌菌株都表達蛋白A的結構基因(spa)(Jensen，1958；Said-Salim等，2003)，該蛋白是特徵已明確的毒性因子，其細胞錨定表面蛋白產物(SpA)包含五個高度同源的稱為E、D、A、B和C的免疫球蛋白結合結構域(Sjodahl，1977)。這些結構域在胺基酸水平顯示約80％的同一性，長56至61個殘基，並且組織成串聯重複形式(Uhlen等，1984)。SpA被合成為前體蛋白，其具有N末端YSIRK/GS信號肽和C末端LPXTG基序分選信號(DeDent等，2008；Schneewind等，1992)。在葡萄球菌表面有非常豐富的細胞壁錨定蛋白A(DeDent等，2007；Sjoquist等，1972)。蛋白A的每個免疫球蛋白結合結構域都由反平行α-螺旋構成，它們組裝成三螺旋束並結合免疫球蛋白G(IgG)的Fc結構域(Deisenhofer，1981；Deisenhofer等，1978)、IgM的VH3重鏈(Fab)(即B細胞受體)(Graille等，2000)、vonWillebrand因子的A1結構域[vWFA1是一種血小板配體](O′Seaghdha等，2006)和位於呼吸道上皮表面(Gomez等，2004；Gomez等，2007)的腫瘤壞死因子α(TNF-α)受體I(TNFRI)(Gomez等，2006)。SpA通過與IgG的Fc部分結合來阻礙中性粒細胞吞噬葡萄球菌(Jensen，1958；Uhlen等，1984)。另外，SpA能通過結合vonWillebrand因子AI結構域激活血管內凝血(Hartleib等，2000)。血漿蛋白如纖維蛋白原和纖連蛋白在葡萄球菌(CIfA和CIfB)和血小板整合素GPIIb/IIIa之間起橋梁的作用(O′Brien等，2002)，該作用通過蛋白A和vWFAI的相互作用得到補充，從而使葡萄球菌通過GPIb-α血小板受體捕獲血小板(Foster，2005；O′Seaghdha等，2006)。SpA還結合TNFRI，並且該相互作用促成葡萄球菌性肺炎的發病(Gomez等，2004)。SpA通過TNFR1介導的TRAF2、p38/c-Jun激酶、有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和Rel-轉錄因子NF-KB活化來激活促炎症信號傳導。SpA結合還誘導TNFR1的脫落，該活性似乎需要TNF-轉化酶(TACE)(Gomez等，2007)。所有上述SpA活性都通過它的5個IgG結合結構域介導，並且可以通過胺基酸替換來幹擾，所述胺基酸是最初根據蛋白A和人IgG1相互作用的需要所限定的胺基酸(Cedergren等，1993)。SpA還通過捕獲含VH3的IgM的Fab區(B細胞受體)發揮B細胞超抗原作用(Gomez等，2007；Goodyear等，2003；Goodyear和Silverman，2004；Roben等，1995)。靜脈內攻擊後，金黃色葡萄球菌蛋白A(SpA)突變顯示減少的器官組織金黃色葡萄球菌負荷，並且形成膿腫的能力明顯降低(本文描述)。野生型金黃色葡萄球菌感染期間，膿腫在48小時內形成，並且可以用光學顯微鏡通過蘇木精-伊紅染色的腎組織超薄切片觀察到，最初標誌為多形核白細胞(PMN)的內流。感染第5天，膿腫大小增加並包封有金黃色葡萄球菌中心群，周圍是嗜酸、無定形物質層和大的PMN套。組織病理學顯示膿腫病變中心接近金黃色葡萄球菌病灶處有大量壞死的PMN，並覆蓋有健康的吞噬細胞。本發明人還觀察到在膿腫病變區周圍是一圈壞死的PMN，其緊鄰將健康腎組織與感染病變區隔開的嗜酸假包膜。缺失蛋白A的金黃色葡萄球菌變種不能建立膿腫的組織病理學特性，並在感染過程中被清除。在之前的研究中，Cedergren等(1993年)在SpA結構域B的Fc片段結合亞結構域改造出5個單獨的替換--L17D、N28A、I31A和K35A。這些作者創造這些蛋白來測試從SpA的一個結構域與Fc1的複合物的三維結構中收集到的數據。Cedergren等測定了這些突變對穩定和結合的影響，但沒有考慮使用這些替換來生產疫苗抗原。Brown等(1998)描述了設計用於以SpA為基礎改造新蛋白質的研究，該蛋白用作親和配體時允許使用更有利的洗脫條件。研究的突變包括單突變Q13A、Q14H、N15A、N15H、F17H、Y18F、L21H、N32H或K39H。Brown等報導Q13A、N15A、N15H和N32H替換對解離常數值幾乎沒有影響，Y18F替換導致與野生型SpA相比結合親和力降低2倍。Brown等還報導L21H和F17H替換分別使結合親合力減少5倍和100倍。作者還研究了兩個串聯結構域的類似替換。因此，Brown等的研究涉及產生具有更有利洗脫譜的SpA，因此使用His替換以使結合親和力發生pH敏感性改變。Brown等未提及使用SpA作為疫苗抗原。Graille等(2000)描述了SpA結構域D與人IgM抗體Fab片段的晶體結構。通過分析晶體結構，Graille等將Q26、G29、F30、Q32、S33、D36、D37、Q40、N43、E47或L51殘基確定為與Fab片段相互作用的結構域D胺基酸殘基，並且確定了形成結構域D亞結構域間界面的胺基酸殘基。Graille等確定了這兩個蛋白質之間的分子相互作用，但未提及使用任何相互作用殘基的替換來生產疫苗抗原。O′Seaghdha等(2006年)描述的研究涉及闡明結構域D的哪個亞結構域結合vWF。作者在Fc或VH3結合亞結構域生成單突變，即胺基酸殘基F5A、Q9A、Q10A、F13A、Y14A、L17A、N28A、I31A、K35A、G29A、F30A、S33A、D36A、D37A、Q40A、E47A或Q32A。作者發現vWF與Fc結合同樣的亞結構域。O′Seaghda等確定了負責與vWF結合的結構域D亞結構域，但未提及使用任何相互作用殘基的替換來生產疫苗抗原。Gomez等(2006)描述了使用單突變F5A、F13A、Y14A、L17A、N21A、I31A、Q32A和K35A來鑑定負責激活TNFR1的殘基。Gomez等未提及使用任何相互作用殘基的替換來生產疫苗抗原。帶親和標籤的重組蛋白A是包括5個IgG結構域(EDCAB)(Sjodahl，1977)但缺乏C末端區域X(Guss等，1984)的多肽，將其從重組大腸桿菌中純化並用作疫苗抗原(Stranger-Jones等，2006)。由於SpA在結合IgGFc部分中的作用，所以無法測量應答於蛋白A的特異性體液免疫(Stranger-Jones等，2006)。本發明人通過產生SpA-DQ9，10K；D36，37A克服了這一障礙。經重組蛋白A(SpA)免疫的BALB/c小鼠對金黃色葡萄球菌菌株靜脈內攻擊顯示出顯著的保護：與野生型相比，金黃色葡萄球菌負荷減少2.951log(P＞0.005；Student’st-檢驗)(Stranger-Jones等，2006)。SpA特異性抗體可以在膿腫形成之前導致吞噬清除和/或影響膿腫中上述將免疫細胞和金黃色葡萄球菌區域隔開的嗜酸性障礙的形成，因為這些在蛋白A突變株感染中不形成。5個SpA結構域(即由三螺旋束形成的結構域，稱為E、D、A、B和C)每個均顯示類似的結合特性(Jansson等，1998)。含或者不含Fc和VH3(Fab)配體的結構域D的溶液結構和晶體結構已經解開，這些配體在不同的位點以非競爭性的方式結合蛋白A(Graille等，2000)。已知參與IgG結合的殘基(FS、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和K35)的突變對於vWFAI和TNFR1結合也是必需的(Cedergren等，1993；Gomez等，2006；O′Seaghdha等，2006)，而對VH3相互作用重要的殘基(Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43、E47)未顯示出對其他結合活性的影響(Graille等，2000；Jansson等，1998)。SpA特異性靶向在表面表達VH3家族相關IgM的B細胞亞群，即VH3型B細胞受體(Roben等，1995)。與SpA相互作用後，這些B細胞增殖並凋亡，導致偏好性並且延長的先天樣B淋巴細胞(即邊緣區B細胞和濾泡B2細胞)缺失(Goodyear等，2003；Goodyear等，2004)。蛋白A表面展示和功能的分子基礎。蛋白A在細菌細胞質中以前體形式合成並通過其YSIRK信號肽在橫壁(crosswall)(即葡萄球菌的細胞分裂間隔)處分泌(圖1)(DeDent等，2007；DeDent等，2008)。在切割C末端LPXTG分選信號後，蛋白A通過分選酶A錨定到細菌肽聚糖交聯橋(crossbridge)上(Mazmanian等，1999；Schneewind等，1995；Mazmanian等，2000)。蛋白A是豐度最高的葡萄球菌表面蛋白；幾乎所有金黃色葡萄球菌菌株都表達該分子(Cespedes等，2005；Kennedy等2008；Said-Salim等，2003)。葡萄球菌每個分裂周期轉換其15-20％的細胞壁(Navarre和Schneewind，1999年)。鼠水解酶切割肽聚糖的聚糖鏈和細胞壁肽，從而釋放蛋白A及其所附的C末端細胞壁二糖四肽到細胞外基質中(Ton-That等，1999)。因此，通過生理學設計，蛋白A不僅錨定在細胞壁上並且在細菌表面展示，還在宿主感染時釋放到到周圍組織(Marraffini等，2006)。蛋白A捕獲細菌表面的免疫球蛋白，並且此生物化學活性使葡萄球菌能逃避宿主的先天和獲得性免疫應答(Jensen，1958；Goodyear等，2004)。有趣的是，蛋白A的區域X(Guss等，1984)(將IgG結合結構域連接到LPXTG分選信號/細胞壁錨定的重複結構域)也許是葡萄球菌基因組中變異性最高的部分(Said-Salim，2003年；Schneewind等，1992)。蛋白A(SpA)的5個免疫球蛋白結合結合域的每個均由三螺旋束形成，並且被稱為E、D、A、B和C，它們顯示類似的結構和功能特性(Sjodahl，1977；Jansson等，1998)。含或者不含Fc和VH3(Fab)配體的結構域D的溶液結構和晶體結構已經解出，這些配體在不同的位點以非競爭性方式結合蛋白A(Graille等，2000)。在晶體結構複合物中，Fab通過由4個VH區β-股形成的表面與結構域D的螺旋II和螺旋域III相互作用(Graille2000)。結構域D的螺旋II的主軸與股的方向約成50°，結構域D的螺旋內部分最靠近C0股。Fab的相互作用位點遠離Ig輕鏈和重鏈的恆定區。相互作用涉及結構域D的下列殘基：螺旋II的Asp-36，螺旋II和螺旋III之間環的ASP-37和Gln-40，以及幾個其他殘基(Graille2000)。這兩個相互作用表面都主要由極性側鏈構成，參與相互作用的結構域D的三個負電荷殘基和在2A2Fab上的兩個正電荷殘基提供兩個分子間的整體靜電吸引。在Fab和結構域D之間鑑定的5個極性相互作用中，三個在側鏈之間。在Arg-H19和Asp-36之間形成鹽橋，在Tyr-H59和Asp-37之間以及Asn-H82a和Ser-33之間形成兩個氫鍵。由於Asp-36和Asp-37在蛋白A的所有五個IgG結合結構域中是保守的，本發明人對這些殘基進行突變。負責Fab結合的SpA-D位點在結構上與介導Fcγ結合的結構域表面分隔開。Fcγ與結構域D的相互作用主要涉及螺旋I的殘基，並且有較少螺旋II殘基參與(Gouda等，1992；Deisenhofer，1981)。除Gln-32(兩個複合物中的輕微接觸)外沒有介導Fcγ相互作用的殘基參與Fab結合。為了研究這些不同的Ig結合位點之間的空間關係，這些複合物中的SpA結構域被疊加來構建Fab、SpA-結構域D和Fcγ分子之間複合物的模型。在這個三重模型中，Fab和Fcγ在螺旋II的相反面形成「三明治」夾心，而沒有證據表明任一相互作用存在空間位阻。這些結果說明儘管體積小(即56-61個胺基酸)，SpA結構域如何可以同時顯示兩種活性，這解釋了Fab與單個結構域的相互作用是非競爭性的實驗證據。SpA-D和Fcγ之間的相互作用殘基是Gln-9和Gln-10。與此不同，IgG的Fc部分對結構域D的佔據阻斷其與vWFA1的相互作用，並且也可能阻斷與TNFR1的相互作用(O′Seaghdha等，2006)。對IgGFc結合必不可少的殘基(F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和K35)突變對於vWFA1和TNFR1結合也是必需的(O′Seaghdha等，2006；Cedergren等，1993；Gomez等，2006)，而對於VH3相互作用必需的殘基(Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43、E47)對IgGFc、vWFA1或TNFR1的結合活性沒有影響(Jansson等，1998；Graille等，2000)。蛋白A免疫球蛋白Fab結合活性靶向在表面表達VH3家族相關IgM的B細胞亞群，即這些分子作為VH3型B細胞受體發揮作用(Roben等，1995)。與SpA相互作用後，這些B細胞迅速增殖而後凋亡，導致偏好性和延長的先天樣B淋巴細胞(即邊緣區B細胞和濾泡B2細胞)缺失(Goodyear和Silverman，2004；Goodyear和Silverman，2003)。超過40％的循環B細胞被蛋白A相互作用所靶定，VH3家族是賦予針對病原體的保護性體液應答的最大人B細胞受體家族(Goodyear和Silverman，2004年，Goodyear和Silverman，2003)。因此，蛋白A的作用類似於葡萄球菌超抗原(Roben等，1995)，但後一類的分子(例如SEB、TSST-1、TSST-2)與T細胞受體形成複合物，不適當地刺激宿主的免疫應答，從而引發葡萄球菌感染的特徵性疾病特徵(Roben等，1995；Tiedemann等，1995)。這些發現總體證明了蛋白A在建立葡萄球菌感染和調節宿主免疫應答中的作用。總之，蛋白A結構域可以看作是顯示兩種不同的界面以與宿主分子結合，並且開發基於蛋白A的任何疫苗都必須考慮產生的變體不會擾亂宿主細胞信號轉導、血小板聚集、免疫球蛋白隔離，或者B細胞增殖和凋亡的誘導。這些蛋白A變體還應可以用於分析疫苗產生阻止上述SpA活性並在其雙結合界面佔據五個重複結構域的抗體的能力。該目標在本申請中首次被明確和解決，並且詳細描述了可用作人安全疫苗的蛋白A變體的產生方法。為了幹擾IgGFcγ、vWFAI和TNFR1結合，對穀氨醯胺(Q)9和10[編號來自於Uhlen等，1984描述的SpA結構域D]進行突變，對這兩個穀氨醯胺產生賴氨酸替換，預期這些替換消除第一個結合界面的配體屬性。為了幹擾IgMFabVH3的結合，對天冬氨酸(D)36和37進行了突變，其每個都是與B細胞受體結合所需的。D36和D37均由丙氨酸替換。在重組分子SpA-DQ9，10K；D36，37A中將Q9，10K和D36，37A突變進行了組合，並檢測蛋白A的結合屬性。此外，在小鼠和兔中對SpA-D和SpA-DQ9，10K；D36，37A進行免疫研究並分析[1]特異性抗體(SpA-DAb)的產生；[2]SpA-DAb阻止蛋白A與其四個不同的配體結合的能力，和[3]SpA-DAb對產生針對葡萄球菌感染的保護性免疫的作用。(參見下文實施例部分)。B.葡萄球菌凝固酶凝固酶是由葡萄球菌細菌產生的將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的酶。Coa和vWh無需蛋白水解就能激活凝血酶原(Friedrich等，2003)。凝固酶·凝血酶原複合物識別纖維蛋白原作為特異性底物，將其直接轉化成纖維蛋白。活性複合物的晶體結構表明D1和D2結構域與凝血酶原結合，其Ile1-Val2N末端插入到Ile16口袋，通過構象變化誘導酶原的功能活性位點(Friedrich等，2003)。α-凝血酶的外部位點(Exosite)I(纖維蛋白原識別位點)和凝血酶原上的外部位點前體(proexosite)I被Coa的D2封閉(Friedrich等，2003)。然而，四聚體(Coa-凝血酶原)2複合物的結合在新位點以高親和力結合纖維蛋白原(Panizzi等，2006)。這個模型解釋了凝固酶的凝結特性和高效的纖維蛋白原轉化(Panizzi等，2006)。纖維蛋白原是大的糖蛋白(Mr～340,000)，由三對Aα-，Bβ-和γ-鏈共價連接形成的「三聚體的二聚體」構成，其中A和B指凝血酶切割釋放的纖維蛋白肽(fibrinopeptide)(Panizzi等，2006)。延伸的分子摺疊成三個獨立的結構域，包含所有6條鏈的N末端的中央片段E和主要由Bβ-和γ-鏈的C末端構成兩個側翼片段D。這些球狀結構域由長的三螺旋結構連接。凝固酶-凝血酶原複合物將人纖維蛋白原轉換成自聚合的纖維蛋白，該複合物不是循環中的凝血酶抑制劑的靶標(Panizzi等，2006)。因此，葡萄球菌凝固酶繞過了生理性凝血途徑。所有金黃色葡萄球菌菌株均分泌凝固酶和vWbp(Bjerketorp等，2004；Field和Smith，1945)。雖然早期工作報導了凝固酶對葡萄球菌感染的發病機理的重要作用(Ekstedt和Yotis，1960；Smith等，1947年)，但近期使用分子遺傳學工具進行的研究在小鼠心內膜炎、皮膚膿腫和乳腺炎模型中沒有觀察到毒性表型，從而對上述觀點提出質疑(Moreillon等，1995；Phonimdaeng等，1990)。通過生成金黃色葡萄球菌Newman株(具有完全毒性的臨床分離株(Duthie等，1952))的等基因變體，本文描述了在小鼠致命菌血症和腎膿腫模型中，coa突變的確顯示毒性缺陷。根據本發明人的經驗，金黃色葡萄球菌8325-4不具有完全毒性，推斷這株菌的突變損害可能不能在體內揭示毒性缺陷。此外，針對Coa或vWbp的抗體幹擾金黃色葡萄球菌Newman株感染的發病，其程度反映了基因缺失的影響。Coa和vWbp促成葡萄球菌膿腫形成和致命菌血症，並且還可在亞單位疫苗中作為保護性抗原發揮作用。生物化學研究證明了針對Coa和vWbp的抗體的生物學價值。通過結合抗原並阻斷其與凝血因子的結合，抗體防止Coa·凝血酶原和vWbp·凝血酶原複合物的形成。被動轉移研究揭示Coa和vWbp抗體保護實驗動物免於葡萄球菌膿腫形成和致命攻擊。因此，Coa和vWbp中和性抗體產生針對葡萄球菌疾病的免疫保護。早期研究揭示抵抗血液中的細胞吞噬需要凝固酶(Smith等，1947)，本發明人觀察到在來匹盧定處理的小鼠血液中Acoa突變體有類似的現象(參見下文實施例3)。因為vWbp對人凝血酶原比對小鼠凝血酶原顯示更高的親和力，因此懷疑人血液中的AvWbp變體也是如此。此外，膿腫損傷中Coa和vWbp的表達以及它們在嗜酸假包膜周圍(葡萄球菌膿腫區(SAC))或外周纖維蛋白壁上的大量分布提示，分泌的凝固酶有助於這些損傷的發生。對此假說進行了測試，的確Δcoa突變體在建立膿腫方面有缺陷。相應的測試(用特異性抗體阻斷Coa功能)產生了同樣的效果。因此，認為纖維蛋白凝集是葡萄球菌膿腫建立中的關鍵事件，這可用於開發保護性疫苗。由於其對人凝血酶原的功能重疊，認為Coa和vWbp都是疫苗開發的極佳候選者。C.其他葡萄球菌抗原過去幾十年的研究發現金黃色葡萄球菌外毒素、表面蛋白和調節分子是重要的毒性因子(Foster，2005；Mazmanian等，2001；Novick，2003)。對這些基因的調控已取得很大進展。例如，葡萄球菌通過分泌在閾值濃度下結合相應受體的自誘導肽進行細菌普查(bacterialcensus)，從而激活磷酸級聯反應並且轉錄激活很多外毒素基因(Novick，2003年)。葡萄球菌感染的發病依賴於這些毒性因子(分泌的外毒素，胞外多糖和表面粘附素)。葡萄球菌疫苗的開發受到葡萄球菌侵染機制的多面性的阻礙。公認活減毒微生物是高效的疫苗；這類疫苗引發的免疫應答通常比非複製性免疫原引發的幅度更大並且持續時間更長。對此，一種解釋可能是活減毒菌株在宿主內建立有限的感染，模仿自然感染的早期階段。本發明的一些實施方案涉及的組合物和方法包括革蘭氏陽性菌的SpA多肽和肽的變體以及其他免疫原性細胞外蛋白、多肽和肽(包括分泌的和細胞表面的蛋白質或多肽)在減輕感染或對其進行免疫中的用途。在一些具體的實施方案中，細菌是葡萄球菌細菌。胞外蛋白、多肽或肽包括但不僅限於所靶向細菌的分泌蛋白和細胞表面蛋白。人病原體金黃色葡萄球菌穿過細菌包膜分泌兩種ESAT-6樣蛋白EsxA和EsxB(Burts等，2005年，通過引用併入本文)。葡萄球菌esxA和esxB按照轉錄順序(esxAesaAessAesaBessBessCesaCesxB)與其他六個基因形成簇。縮寫esa、ess和esx分別表示ESAT-6分泌輔助、系統和細胞外，這取決於所編碼的蛋白質是否發揮輔助(esa)或直接(ess)分泌的作用，或分泌到(esx)細胞外環境中。整個八個基因的簇在本文中稱為Ess簇。EsxA和EsxB的合成或分泌需要esxA、esxB、essA、essB、和essC的全部。不能表達EsxA、EsxB和EssC的突變體在金黃色葡萄球菌鼠膿腫發病中顯示出缺陷，表明該專門的分泌系統可能是人體細菌發病的通用策略。對幾個抗原(包括EspA、EspB、Rv3483c和Rv3615)已報導通過ESX-1途徑分泌非WXG100底物(Fortune等，2005；MacGurn等，2005；McLaughlin等，2007；Xu等，2007)。還證明在病原性分枝桿菌中替代性ESX-5途徑分泌WXG100和非WXG100蛋白兩者(Abdallah等，2007；Abdallah等，2006)。金黃色葡萄球菌Ess途徑可以被視為配備了專門的轉運組件(Ess)、輔助因子(Esa)和相應分泌底物(Esx)的分泌模塊。EsxA和EsxB分泌需要EssA、EssB和EssC。因為EssA、EssB和EssC都被預測為跨膜蛋白，所以設想這些蛋白質形成分泌裝置。ess基因簇的一些蛋白可主動轉運分泌的底物(作為馬達發揮作用)，而其他可調節轉運(調節因子)。所實現的調節可以是針對(但不限於)分泌多肽的轉錄或翻譯後機制、分選特定底物到確定的位置(例如細胞外基質或宿主細胞)，或感染期間分泌事件的時間。對此，還不清楚是否所有分泌的Esx蛋白作為毒素髮揮功能還是間接促成發病。葡萄球菌依賴對宿主細胞的表面蛋白介導的粘附或對組織的侵染作為逃避免疫防禦的策略。此外，在感染期間，金黃色葡萄球菌利用表面蛋白螯合宿主的鐵。金黃色葡萄球菌發病涉及的大多數表面蛋白質帶有C末端分選信號，即，它們通過分選酶與細胞壁包膜共價連接。此外，缺乏表面蛋白錨定所需的基因(即分選酶A和B)的葡萄球菌菌株在幾個不同疾病的小鼠模型在顯示毒性的明顯缺失。因此，表面蛋白抗原是有效的疫苗靶標，因為相應基因對於葡萄球菌疾病的發生至關重要，並且其可以在本發明的多種實施方案中予以利用。分選酶超家族是負責將表面蛋白毒性因子錨定到肽聚糖細胞壁層的革蘭氏陽性菌轉肽酶。在金黃色葡萄球菌中已鑑定兩種分選酶同工型，SrtA和SrtB。這些酶已被證明識別底物蛋白的LPXTG基序。SrtB同工型在血紅素鐵的獲得和鐵的體內平衡中顯示重要作用，而SrtA同工型在革蘭氏陽性菌的發病中發揮關鍵作用，這是通過將粘附素和其他蛋白共價錨定到細胞壁肽聚糖上來調節細菌粘附宿主組織的能力。在某些實施方案中，本文所述的SpA變體可以與其他葡萄球菌蛋白聯合使用，所述蛋白如Coa、Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsaB、EsxA、EsxB、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasF、vWbp和/或vWh蛋白。本發明的某些方面包括涉及蛋白質性組分的方法和組合物，所述蛋白質性組分包括多肽、肽或編碼SpA變體和其他葡萄球菌抗原(例如Ess途徑轉運的其他蛋白或分選酶底物)的核酸。這些蛋白質可以通過缺失、插入和/或替換進行修飾。Esx多肽包括葡萄球菌細菌Esx蛋白的胺基酸序列。Esx序列可以來自於特定的葡萄球菌物種(如金黃色葡萄球菌)，也可以來自於特定的菌株例如Newman株。在某些實施方案中，EsxA序列是來自於Mu50株的SAV0282(與Newman株具有相同的胺基酸序列)，它可以通過GenBank登錄號Q99WU4(gi|68565539)獲得，其通過引用併入本文。在另一些實施方案中，EsxB序列是來自於Mu50株的SAV0290(與Newman株具有相同的胺基酸序列)，它可以通過GenBank登錄號Q99WT7(gi|68565532)獲得，其通過引用併入本文。在另一些實施方案中，可以使用其他由Ess途徑轉運的多肽，其序列可由本領域技術人員使用資料庫和可獲得的網絡資源確定。分選酶底物多肽包括但不限於葡萄球菌細菌的SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC或SasF蛋白的胺基酸序列。分選酶底物多肽序列可以來自於特定的葡萄球屬物種(如金黃色葡萄球菌)，也可以來自於特定的菌株，例如Newman株。在某些實施方案中，SdrD序列來自於N315株並可使用GenBank登錄號NP_373773.1(gi|15926240)獲取，其通過引用併入本文。在另一些實施方案中，SdrE序列來自於N315株並可使用GenBank登錄號NP_373774.1(gi|15926241)獲取，其通過引用併入本文。在另一些實施方案中，IsdA序列是來自於Mu50株的SAv1130(與Newman株具有相同的胺基酸序列)並且可以使用GenBank登錄號NP_371654.1(gi|15924120)獲得，其通過引用併入本文。在另一些實施方案中，IsdB序列是來自於Mu50株的SAV1129(與Newman株具有相同的胺基酸序列)並且可以使用GenBank登錄號NP_371653.1(gi|15924119)獲得，其通過引用併入本文。在另一些實施方案中，也可以使用由Ess途徑轉運或由分選酶加工的其他多肽，其序列可由本領域技術人員使用資料庫和可獲得的網絡資源確定。在某些實施方案中，纖連蛋白結合蛋白B序列可包含FnbpB的前體或成熟形式的全部或部分。在SEQIDNO：64或登錄號為NC_009641.1、AAW37288.(GI：57285194)、ZP_07362431(GI：304379700)、EEV81932(GI：257859074)、NP_373026(GI：15925492)的GenBank目錄或GenBank鑑定的其他FnbpB胺基酸序列中可找到FnbpB序列。本發明可以使用的多種蛋白質的例子可以通過分析資料庫中提交的細菌基因組而確定，它們包括但不限於登錄號NC_002951(GI：57650036和GenBankCP000046)、NC_002758(GI：57634611和GenBankBA000017)、NC_002745(GI：29165615和GenBankBA000018)、NC_003923(GI：21281729和GenBankBA000033)、NC_002952(GI：49482253和GenBankBX571856)、NC_002953(GI：49484912和GenBank中BX571857)、NC_007793(GI：87125858和GenBankCP000255)NC_007795(GI：87201381和GenBankCP000253)，每個均通過引用併入本文。本文所用「蛋白質」或「多肽」是指含有至少十個胺基酸殘基的分子。在一些實施方案中，使用蛋白質或多肽的野生型形式，但是在本發明的許多實施方案中，使用經修飾的蛋白質或多肽來產生免疫應答。上述術語可互換使用。「經修飾的蛋白質」或「經修飾的多肽」或「變體」是指其化學結構(特別是其胺基酸序列)與野生型蛋白質或多肽相比發生改變的蛋白質或多肽。在一些實施方案中，經修飾的/變體蛋白質或多肽具有至少一種改變的活性或功能(應理解蛋白質或多肽可具有多種活性或功能)。本發明特別考慮的是，可針對一種活性或功能來改變被修飾的/變體蛋白質或多肽，而在其它方面保留野生型活性或功能(如免疫原性)。在某些實施方案中，蛋白質或多肽(野生型或經修飾的)的大小可以包括但不限於5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500個(以及其中導出的任何範圍)氨基分子或更多，或者本文所述或所引用的對應氨基序列的衍生物。本發明還涉及的是，可通過截短(使其短於相應的野生型形式)來突變多肽，也可通過融合或綴合具有特定功能(例如用於靶向或定位、用於增強免疫原性、用於純化目的等)的異源蛋白質序列來改變多肽。本文使用的「氨基分子」是指本領域所知的任何胺基酸、胺基酸衍生物或胺基酸模擬物。在某些實施方案中，蛋白質性分子的殘基是連續的，沒有任何非氨基分子間插氨基分子殘基的序列。在另一些實施方案中，所述序列可包含一個或多個非氨基分子部分。在一些具體實施方案中，蛋白質性分子的殘基序列可以被一個或多個非氨基分子部分所間插。因此，術語「蛋白質性組合物」包括氨基分子序列，所述序列含有天然合成蛋白質中20種常見胺基酸的至少一種或者至少一種經修飾的或非常見胺基酸。可採用本領域技術人員所知的任何技術來製造蛋白質性組合物，所述技術包括(i)通過標準分子生物學技術表達蛋白質、多肽或肽，(ii)從天然來源中分離蛋白質性化合物，或(iii)化學合成蛋白質性物質。之前已經公開了多種基因的核苷酸及蛋白質、多肽和肽的序列，還可以在公認的計算機化資料庫中找到上述序列。其中一個資料庫是國立生物技術信息中心的Genbank和GenPept資料庫(網址為ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本文公開的或為本領域普通技術人員所知的技術來擴增和/或表達這些基因的編碼區。SpA、凝固酶和其他本發明的多肽的胺基酸序列變體可以是替換、插入或缺失變體。相比野生型，本發明多肽的變體可以影響多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多個非連續或連續的胺基酸。變體可以包含與本文提供或引用的任何序列(例如SEQIDNO：2-8或SEQIDNO：11-30)有至少50％、60％、70％、80％或90％(包括其間所有數值和範圍)同一性的胺基酸序列。變體可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個替換的胺基酸。來自任何葡萄球菌菌種和菌株的Ess途徑加工或分泌的多肽或其他表面蛋白(參見表2)或分選酶底物都被考慮在本文所述的組合物和方法中使用。缺失變體通常缺少天然或野生型蛋白質中的一個或多個殘基。可以缺失單個殘基，或者可以缺失多個連續的胺基酸。可將終止密碼子(通過替換或插入)引入編碼核酸序列中以產生截短的蛋白質。插入突變體通常包括在多肽非末端位點處加入物質。這可包括插入一個或多個殘基。還可產生稱作融合蛋白的末端添加。這些融合蛋白包括本文描述或引用的一個或更多個肽或多肽的多聚體或串聯體。替換變體通常包含在蛋白質一個或多個位點處將一種胺基酸替換為另一種，並可被設計成調節多肽的一個或多個特性，同時丟失或不丟失其它功能或特性。替換可以是保守性的，即將一種胺基酸替換成形狀和電荷相似的胺基酸。保守性替換為本領域所熟知，包括例如以下改變：丙氨酸變為絲氨酸；精氨酸變為賴氨酸；天冬醯胺變為穀氨醯胺或組氨酸；天冬氨酸變為穀氨酸；半胱氨酸變為絲氨酸；穀氨醯胺變為天冬醯胺；穀氨酸變為天冬氨酸；甘氨酸變為脯氨酸；組氨酸變為天冬醯胺或穀氨醯胺；異亮氨酸變為亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸變為纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸變為精氨酸；甲硫氨酸變為亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸變為酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸變為蘇氨酸；蘇氨酸變為絲氨酸；色氨酸變為酪氨酸；酪氨酸變為色氨酸或苯丙氨酸；和纈氨酸變為異亮氨酸或亮氨酸。或者，替換可以是非保守的，從而影響多肽的功能或活性。非保守性改變通常包括將殘基替換成化學性質上不相似的殘基，如極性或帶電胺基酸替換非極性或不帶電胺基酸，反之亦然。表2金黃色葡萄球菌菌株示例性表面蛋白SAV號SA號表面MW2Mu50N315NewmanMRSA252*MSSA476*SAV0111SA0107Spa492450450520516492SAV2503SA2291FnBPA101510381038741-1015SAV2502SA2290FnBPB943961961677965957SAV0811SA0742ClfA9469359899331029928SAV2630SA2423ClfB907877877913873905NpNpCna1183---11831183SAV0561SA0519SdrC955953953947906957SAV0562SA0520SdrD1347138513851315-1365SAV0563SA0521SdrE114111411141116611371141NpNpPls------SAV2654SA2447SasA227522712271227113512275SAV2160SA1964SasB6862481248124812222685SA1577SasC21862132186218621892186SAV0134SA0129SasD241241241241221241SAV1130SA0977SasE/IsdA350350350350354350SAV2646SA2439SasF635635635635627635SAV2496SasG1371525927--1371SAV0023SA0022SasH772-772772786786SAV1731SA1552SasI895891891891534895SAV1129SA0976SasJ/IsdB645645645645652645SA2381SasK198211211--197NpSasL-232----SAV1131SA0978IsdC227227227227227227本發明的蛋白質可以是重組的或體外合成的。或者，可以從細菌中分離出非重組或重組的蛋白質。還考慮可將含有上述變體的細菌應用於本發明的組合物和方法中。因此，不需要分離蛋白質。本文中使用的術語「功能等同密碼子」是指編碼同一胺基酸的密碼子(如精氨酸或絲氨酸的六個密碼子)，也指編碼生物學等同胺基酸的密碼子(見下表3)。表3密碼子表還應當理解，只要該序列滿足上文設定的標準(包括保持與蛋白質表達相關的蛋白質生物活性(例如免疫原性))，胺基酸和核酸序列可包含額外的殘基(如額外的N端或C端胺基酸或分別地5′或3′序列)，但仍然基本如本文公開的序列之一所示。末端序列的添加特別適用於核酸序列，例如，其可包含位於編碼區5′或3′部分之側翼的多種非編碼序列。下文是基於改變蛋白質的胺基酸來產生變體多肽或肽的討論。例如，蛋白質結構中的某些胺基酸可以替換為其他胺基酸，同時有或沒有與結構(例如抗體的抗原結合區或底物分子的結合位點)的相互結合能力的明顯損失。由於蛋白質的相互作用能力和性質決定了蛋白質的功能活性，因此可在蛋白質序列(及其DNA編碼序列)中進行某些胺基酸替換，而仍產生具有期望特性的蛋白質。因此，本發明人考慮可在基因的DNA序列中進行多種改變。考慮在本發明的組合物中，每毫升中多肽、肽和/或蛋白總量為約0.001mg至約10mg。組合物中的蛋白質濃度可以是約、至少約或至多約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或其中導出的任何範圍)。這其中約、至少約或至多約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％可以是SpA變體或凝固酶，並且可以與其他肽或多肽(例如其他細菌肽和/或抗原)聯合使用。本發明涉及施用SpA變體多肽或肽來影響預防性治療或治療效果，其針對葡萄球病原體感染相關的疾病或病症的發生。在某些方面，將葡萄球菌抗原的組合用於生產有效治療或預防葡萄球菌感染的免疫原性組合物。葡萄球菌感染經歷幾個不同階段。例如，葡萄球菌的生活周期包含共生定殖，通過進入鄰近組織或血流起始感染，和/或在血液中厭氧性擴增。金黃色葡萄球菌毒性決定簇與宿主防禦機制相互作用可誘導併發症如心內膜炎、轉移性膿腫形成和敗血症症候群。細菌表面上的不同分子參與感染周期的不同階段。某些抗原的組合可引發免疫應答，其針對葡萄球菌感染的多個階段進行保護。可在動物模型測定和/或使用調理吞噬測定來測量免疫應答的效力。D.多肽和多肽的生產本發明描述了用於本發明多個實施方案的多肽、肽和蛋白質及其免疫原性片段。例如，對特定多肽進行測定或使用以引發免疫應答。在一些具體實施方案中，也可根據常規技術在溶液中或在固體支持物上合成本發明蛋白質的全部或部分。多種自動合成儀是可購得的，且可以根據已知的方案加以使用。參見例如Stewart和Young(1984)、Tam等(1983)、Merrifield(1986)、Barany和Merrifield(1979)，其均通過引用併入本文。或者，可使用重組DNA技術，其中將編碼本發明肽的核苷酸序列插入表達載體中，轉化或轉染入合適的宿主細胞並在適於表達的條件下培養細胞。本發明的一個實施方案包括利用轉移至細胞(包括微生物)的基因來產生和/或呈現多肽或肽。可將目的多肽或肽的基因轉移到合適的宿主細胞中，接著在合適條件下培養細胞。重組表達載體的產生和其中包含的元件是現有技術公知的，並在本文中簡單討論。或者，要生產的蛋白質可以是分離並純化的由細胞正常合成的內源蛋白質。本發明的另一實施方案使用了自體B淋巴細胞細胞系，所述細胞系轉染有表達免疫原產物(更具體地為具有免疫原活性的蛋白質)的病毒載體。哺乳動物宿主細胞系的其它實例包括但不限於Vero和HeLa細胞、其他B和T細胞系(如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji)以及中國倉鼠卵巢細胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK細胞。此外，可選擇調節插入序列表達的或以期望方式修飾和加工基因產物的宿主細胞株。蛋白質產物的這種修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可以對蛋白質功能是重要的。不同宿主細胞在蛋白質的翻譯後加工和修飾方面具有特徵性和特定的機制。可選擇合適的細胞系或宿主系統來確保所表達外源蛋白質的正確修飾和加工。可使用多種選擇系統，包括但不局於分別位於tk-、hgprt-或aprt-細胞中的HSV胸苷激酶、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶基因。此外，還可使用代謝物抗性作為選擇基礎：dhfr賦予對甲氧苄氨嘧啶和氨甲蝶呤的抗性；gpt賦予對黴酚酸的抗性；neo賦予對氨基糖苷G418的抗性；hygro賦予對潮黴素的抗性。動物細胞可以兩種方式在體外增殖：非錨著依賴性細胞，其在整個培養物體積中懸浮生長，或者錨著依賴性細胞，其需要附著在固體基底上進行增殖(即單層類型的細胞生長)。來源於連續的已建立細胞系的非錨著依賴性或懸浮培養物是大規模生產細胞和細胞產物的最常用方法。但是，懸浮培養的細胞具有局限性，例如致瘤潛力和低於貼附細胞的蛋白質產量。當本文具體提及蛋白質時，優選表示天然或重組蛋白質，或者任選地已去除任何信號序列的蛋白質。所述蛋白質可直接從葡萄球菌菌株分離出來或者通過重組DNA技術產生。蛋白質的免疫原性片段可併入本發明的免疫原性組合物中。它們是包含連續取自蛋白質胺基酸序列的至少10個胺基酸、20個胺基酸、30個胺基酸、40個胺基酸、50個胺基酸或100個胺基酸(包括其間所有值和範圍)的片段。另外，此類免疫原性片段與針對葡萄球菌蛋白產生的抗體或者與用葡萄球菌感染哺乳動物宿主產生的抗體具有免疫反應性。免疫原性片段還包括當以有效劑量施用時(單獨地或作為結合載體的半抗原)引發針對葡萄球菌感染之保護性或治療性免疫應答的片段，在某些方面，其具有針對金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染的保護作用。這些免疫原性片段可包含例如缺少N端前導序列和/或跨膜結構域和/或C端錨定結構域的蛋白質。在一個優選方面中，本發明的免疫原性片段包含與本文所述或引用得多肽的所選區段序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或者至少97-99％同一性(包括其間所有值和範圍)的蛋白質的基本上全部的細胞外結構域。本發明的免疫原性組合物還包含由一種或更多種葡萄球菌蛋白或葡萄球菌蛋白免疫原性片段構成的融合蛋白。這些融合蛋白可以通過重組產生，可包含至少1、2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白或區段的一部分。或者，融合蛋白可包含至少1、2、3、4或5種葡萄球菌蛋白的多個部分。它們可在同一蛋白質中組合不同的葡萄球菌蛋白和/或多個相同的蛋白質或蛋白質片段或者其免疫原性片段(形成多聚體或串聯體)。或者，本發明還包括葡萄球菌蛋白或其免疫原性片段的各個融合蛋白，所述融合蛋白具有異源序列，例如其提供T-細胞表位或純化標籤(例如：β-半乳糖苷酶、穀胱甘肽-S-轉移酶、綠色螢光蛋白(GFP))、表位標籤(例如FLAG、myc標籤、多聚組氨酸)或者病毒表面蛋白質(例如流感病毒血凝素)或細菌蛋白質(例如破傷風類毒素、白喉類毒素或CRM197)。IV.核酸在某些實施方案中，本發明涉及編碼本發明蛋白質、多肽、肽的重組多核苷酸。包括SpA、凝固酶和其他細菌蛋白的核酸序列，所有均通過引用併入本文，並且可以用於製備肽或多肽。本申請所用術語「多核苷酸」是指重組的或從總基因組核酸中分離出的核酸分子。術語「多核苷酸」包括寡核苷酸(長度少於等於100個殘基的核酸)、重組載體，包括如質粒、粘粒、噬菌體、病毒等。在某些方面，多核苷酸包括基本與其天然存在的基因或蛋白質編碼序列分離的調控序列。多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈的，並且可以是RNA、DNA(基因組，cDNA或合成的)、其類似物或其組合。多核苷酸內可以存在另外的編碼或非編碼序列，但這不是必須的。在該方面，術語「基因」、「多核苷酸」或「核酸」用於指編碼蛋白質、多肽或肽的核酸(包括正確轉錄、翻譯後修飾或定位所需的任何序列)。本領域技術人員會理解該術語涵蓋表達或可適於表達蛋白質、多肽、結構域、肽、融合蛋白質和突變體的基因組序列、表達盒、cDNA序列和經改造的小核酸區段。編碼全部或部分多肽的核酸可以包含編碼一種或更多種本文所述或引用之胺基酸序列的多核苷酸中10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000個或更多個核苷酸、核苷或鹼基(包括其間所有值和範圍)的連續核酸序列。還包括的是由包含變體(具有稍有不同核酸序列)的核酸編碼但仍編碼相同或基本類似的蛋白質的特定多肽(參見上表3)。在一些具體的實施方案中，本發明涉及分離的核酸區段和整合編碼SpA變體或凝固酶的核酸序列的重組載體。術語「重組」可以與多核苷酸或多肽聯合使用，並且一般指體外產生和/或操作的多肽或多核苷酸，或該分子的複製產物。在另一些實施方案中，本發明涉及分離的核酸區段和整合編碼SpA變體或凝固酶多肽或肽的核酸序列的重組載體在對象中產生免疫應答。在多種實施方案中，本發明的核酸可用於基因疫苗。本發明中所用的核酸區段可以與其它核酸序列(例如啟動子、多聚腺苷酸化信號、額外的限制性酶切位點、多克隆位點、其它編碼區段等)相組合，從而使它們的全長可變化很大。因此，考慮到可使用幾乎任何長度的核酸片段，其總長度優選受到製備簡便性和在預定使用的重組核酸方案的限制。在某些情況下，核酸序列可編碼具有額外異源編碼序列的多肽序列，例如以允許純化所述多肽、轉運、分泌、翻譯後修飾或者為了治療益處(例如靶向或效力)。如上所述，可將標籤或其他異源多肽添加到修飾的多肽編碼序列，其中「異源」表示與所修飾多肽不同的多肽。在另一些實施方案中，本發明涉及分離的核酸區段和重組載體，在其序列內包含來自SEQIDNO：1(SpA結構域D)或SEQIDNO：3(SpA)的連續核酸序列或其他核酸序列，所述其他核酸序列編碼凝固酶或其他分泌毒性因子和/或表面蛋白，包括由Ess途徑轉運的蛋白、分選酶加工的蛋白或通過引用併入本文的蛋白質。在某些實施方案中，本發明提供的多核苷酸變體與本文公開的序列具有基本同一性；它們包括使用本文所述方法(如使用標準參數的BLAST分析)與本發明多核苷酸序列比較具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高(包括其間所有數值和範圍)序列同一性的那些。與所有上述多核苷酸互補的多核苷酸的使用也在本發明考慮之內。A.載體本發明的多肽可由載體中包含的核酸分子編碼。所使用的術語「載體」是指運載體核酸分子，異源核酸序列可插入其中以引入到其可複製和表達的細胞中。核酸序列可以是「異源的」，這是指其所在環境對於待引入載體的細胞或者被整合入的核酸而言是外源的，其包含與所述細胞或核酸中之序列同源的序列，但是該序列在宿主細胞或核酸中通常不存在它的位置。載體包括DNA、RNA、質粒、粘粒、病毒(噬菌體、動物病毒和植物病毒)和人工染色體(例如YAC)。本領域技術人員能夠通過標準重組技術(例如Sambrook等，2001；Ausubel等，1996，兩者均通過引用併入本文)容易地構建載體。除了編碼SpA變體多肽之外，載體還可編碼其他多肽序列，例如一種或多種其他細菌肽、標籤或免疫原性增強肽。編碼這些融合蛋白的可用載體包括pIN載體(Inouye等，1985)、編碼一段組氨酸的載體和用於產生穀胱甘肽S-轉移酶(GST)可溶性融合蛋白的pGEX載體，以用於後期純化和分離或切割。術語「表達載體」是指含有編碼能夠轉錄的基因產物之至少一部分的核酸序列的載體。在一些情況下，RNA分子隨後翻譯成蛋白質、多肽或肽。表達載體可含有多種「控制序列」，其表示可操作性連接的編碼序列在特定宿主生物體內轉錄和可能的翻譯所需的核酸序列。除了調控轉錄和翻譯的控制序列之外，載體和表達載體還可含有用作其他功能的核酸序列，其在本文中有描述。1.啟動子和增強子「啟動子」是控制序列。啟動子通常是控制轉錄起始和速率的核酸序列區域。它可含有可結合調節性蛋白和分子(例如RNA聚合酶及其他轉錄因子)的遺傳元件。短語「可操作性位於」、「可操作性連接」、「控制之下」和「處於轉錄控制之下」表示啟動子相對於核酸序列處於控制該序列的轉錄起始和表達的正確功能的位置和/或方向。啟動子可以或可以不與「增強子」配合使用，所述增強子是指參與核酸序列轉錄活化的順式作用調節序列。自然地，利用在選擇用於表達的細胞類型或生物體中有效指導DNA區段表達的啟動子和/或增強子可以是重要的。分子生物學領域技術人員一般知道使用啟動子、增強子和細胞類型的組合用於蛋白質表達(參見Sambrook等，2001，通過引用併入本文)。可用的啟動子可以是組成型、組織特異性或可誘導的，在某些實施方案中，在特定條件下(例如大規模生產重組蛋白質或肽)可指導引入的DNA區段高水平表達。在本發明的背景下，可利用多種元件/啟動子來調節基因的表達。作為可響應於特定刺激而活化的核酸序列區域的這些可誘導元件的實例包括但不限於：免疫球蛋白重鏈(Banerji等，1983；Gilles等，1983；Grosschedl等，1985；Atchinson等，1986，1987；Imler等，1987；Weinberger等，1984；Kiledjian等，1988；Porton等；1990)、免疫球蛋白輕鏈(Queen等，1983；Picard等，1984)、T細胞受體(Luria等，1987；Winoto等，1989；Redondo等；1990)、HLADQα和/或DQβ(Sullivan等，1987)、β幹擾素(Goodbourn等，1986；Fujita等，1987；Goodbourn等，1988)、白介素-2(Greene等，1989)、白介素-2受體(Greene等，1989；Lin等，1990)、MHCII類5(Koch等，1989)、MHCII類HLA-DRα(Sherman等，1989)、β-肌動蛋白(Kawamoto等，1988；Ng等；1989)、肌肉肌酸激酶(MCK)(Jaynes等，1988；Horlick等，1989；Johnson等，1989)、前白蛋白(轉甲狀腺素)(Costa等，1988)、彈性蛋白酶I(Ornitz等，1987)、金屬硫蛋白(MTII)(Karin等，1987；Culotta等，1989)、膠原酶(Pinkert等，1987；Angel等，1987)、白蛋白(Pinkert等，1987；Tronche等，1989，1990)、α-甲胎蛋白(Godbout等，1988；Campere等，1989)、γ-珠蛋白(Bodine等，1987；Perez-Stable等，1990)、β-珠蛋白(Trudel等，1987)、c-fos(Cohen等，1987)、c-Ha-Ras(Triesman，1986；Deschamps等，1985)、胰島素(Edlund等，1985)、神經細胞粘附分子(NCAM)(Hirsh等，1990)、α1-抗胰蛋白酶(Latimer等，1990)、H2B(TH2B)組蛋白(Hwang等，1990)、小鼠和/或I型膠原(Ripe等，1989)、葡萄糖調節蛋白(GRP94和GRP78)(Chang等，1989)、大鼠生長素(Larsen等，1986)、人血清澱粉樣蛋白A(SAA)(Edbrooke等，1989)、肌鈣蛋白I(TNI)(Yutzey等，1989)、血小板衍生生長因子(PDGF)(Pech等，1989)、杜氏肌營養不良(Klamut等，1990)、SV40(Banerji等，1981；Moreau等，1981；Sleigh等，1985；Firak等，1986；Herr等，1986；Imbra等，1986；Kadesch等，1986；Wang等，1986；Ondek等，1987；Kuhl等，1987；Schaffner等，1988)、多形瘤(Swartzendruber等，1975；Vasseur等，1980；Katinka等，1980，1981；Tyndell等，1981；Dandolo等，1983；deVilliers等，1984；Hen等，1986；Satake等，1988；Campbell等，1988)、逆轉錄病毒(Kriegler等，1982，1983；Levinson等，1982；Kriegler等，1983，1984a，b，1988；Bosze等，1986；Miksicek等，1986；Celander等，1987；Thiesen等，1988；Celander等，1988；Choi等，1988；Reisman等，1989)、乳頭狀瘤病毒(Campo等，1983；Lusky等，1983；Spandidos和Wilkie，1983；Spalholz等，1985；Lusky等，1986；Cripe等，1987；Gloss等，1987；Hirochika等，1987；Stephens等，1987)、B肝病毒(Bulla等，1986；Jameel等，1986；Shaul等，1987；Spandau等，1988；Vannice等，1988)、人免疫缺陷病毒(Muesing等，1987；Hauber等，1988；Jakobovits等，1988；Feng等，1988；Takebe等，1988；Rosen等，1988；Berkhout等，1989；Laspia等，1989；Sharp等，1989；Braddock等，1989)、巨細胞病毒(CMV)IE(Weber等，1984；Boshart等，1985；Foecking等，1986)、長臂猿類人猿白血病病毒(Holbrook等，1987；Quinn等，1989)。可誘導元件包括但不限於：MTII-佛波酯(TFA)/重金屬(Palmiter等，1982；Haslinger等，1985；Searle等，1985；Stuart等，1985；Imagawa等，1987；Karin等，1987；Angel等，1987b；McNeall等，1989)；MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)-糖皮質激素(Huang等，1981；Lee等，1981；Majors等，1983；Chandler等，1983；Lee等，1984；Ponta等，1985；Sakai等，1988)；β-幹擾素-聚(rI)x/聚(rc)(Tavernier等，1983)；腺病毒5E2-ElA(Imperiale等，1984)；膠原酶-佛波酯(TPA)(Angel等，1987a)；基質裂解素-佛波酯(TPA)(Angel等，1987b)；SV40-佛波酯(TPA)(Angel等，1987b)；鼠MX基因-幹擾素，新城疫病毒(Hug等，1988)；GRP78基因-A23187(Resendez等，1988)；α-2-巨球蛋白-IL-6(Kunz等，1989)；中間絲蛋白-血清(Rittling等，1989)；MHCI類基因H-2Kb-幹擾素(Blanar等，1989)；HSP70-ElA/SV40大T抗原(Taylor等，1989，1990a，1990b)；增殖蛋白-佛波酯/TPA(Mordacq等，1989)；腫瘤壞死因子-PMA(Hensel等，1989)；以及甲狀腺刺激激素α基因-甲狀腺素(Chatterjee等，1989)。認為用於控制本發明肽或蛋白質編碼多核苷酸表達的特定啟動子不是關鍵性的，只要其能夠在靶細胞(優選細菌細胞)中表達多核苷酸即可。當靶向人細胞時，優選使得多核苷酸編碼區域位於鄰近能夠在人細胞中表達的啟動子並且處於其控制之下。一般而言，此類啟動子可包括細菌、人或病毒啟動子。在向對象施用載體以表達蛋白質的實施方案中，考慮用於所述載體的理想啟動子是不受細胞因子下調的啟動子，或者是足夠強到即使下調也能產生引發免疫應答的有效量的SpA變體的啟動子。這樣的非限制性實例有CMVIE和RSVLTR。可使用組織特異性啟動子，特別是如果表達是在希望表達抗原的細胞(例如樹突狀細胞或巨噬細胞)中進行的話。哺乳動物MHCI和MHCII啟動子是此類組織特異性啟動子的實例。2.起始信號和內部核糖體結合位點(IRES)特異性起始信號也可以是編碼序列有效翻譯所需的。這些信號包括ATG起始密碼子或相鄰序列。可能需要提供外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。本領域技術人員能夠容易地確定這一點並提供必要的信號。在本發明的某些實施方案中，使用內部核糖體進入位點(internalribosomeentrysite，IRES)元件產生多基因或多順反子信使。IRES元件能夠繞過5′-甲基加帽依賴性翻譯的核糖體掃描模型，並在內部位點開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988，Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可與異源開放讀碼框相連。多個開放讀碼框可一起轉錄，其各自被IRES隔開，形成多順反子信使。可使用單個啟動子/增強子轉錄單個信使有效地表達多個基因(參見美國專利5,925,565和5,935,819，其通過引用併入本文)。3.選擇和篩選標記物在本發明的某些實施方案中，可通過在表達載體中編碼篩選或選擇標記物從而在體外或體內鑑定含有本發明核酸構建物的細胞。當轉錄和翻譯時，標記物賦予細胞可鑑定的改變，使得容易鑑定含有所述表達載體的細胞。通常，選擇標記物是賦予允許進行選擇的性質的標記物。陽性選擇標記物是指標記物的存在允許其的選擇的標記物，而陰性選擇標記物是指其存在阻礙其的選擇的標記物。陽性選擇標記物的實例有抗藥性標記物。B.宿主細胞本文使用的術語「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可互換地使用。所有這些術語還包括其後代(其為任意和所有的後代)。應了解，由於人為或偶然的突變，可能並非所有後代都是相同的。在表達異源核酸序列的情形下，「宿主細胞」是指原核或真核細胞，其包括任何可進行轉化的、能夠複製載體或表達由載體編碼的異源基因的生物體。宿主細胞可以並且已用作載體或病毒的接受者。宿主細胞可以被「轉染」或「轉化」，其表示外源核酸(例如重組的蛋白質編碼序列)轉移或引入宿主細胞的過程。經轉化細胞包括原代對象細胞及其後代。宿主細胞可來源於原核生物或真核生物，包括細菌、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞，用以複製載體或者表達核酸序列的部分或全部。許多細胞系和培養物可用作宿主細胞，並且它們可通過美國典型培養物保藏中心(ATCC)(其是活培養物和遺傳物質存檔的機構(www.atcc.org))獲得。C.表達系統存在多種表達系統，其包括上述組合物的至少一部分或全部。基於原核生物和/或真核生物的系統可用於本發明，以產生核酸序列或其相應多肽、蛋白質和肽。許多這樣的系統是可購得的並且易於得到。昆蟲細胞/杆狀病毒系統可產生高水平的異源核酸區段的蛋白質表達，例如美國專利5,871,986、4,879,236中所述(其兩者均通過引用併入本文)，並且其可購得，如的2.0以及的BACPACKTMBACULOVIRUSEXPRESSIONSYSTEM。除了公開的本發明表達系統之外，其它表達系統實例包括的COMPLETECONTROLTM可誘導哺乳動物表達系統，其涉及合成的蛻皮素誘導受體，或者其pET表達系統(一種大腸桿菌表達系統)。可誘導表達系統的另一個例子是的T-REXTM(四環素調節表達)系統，其是使用全長CMV啟動子的可誘導哺乳動物表達系統。還提供了酵母表達系統，稱為甲醇畢赤酵母(PichiamethanolicaPichiamethanolica)表達系統，其設計成在甲基營養型酵母甲醇畢赤酵母中高水平生產重組蛋白質。本領域技術人員了解如何表達載體(例如表達構建物)，以產生核酸序列或其相應多肽、蛋白質或肽。III.多糖本發明的免疫原性組合物還可包含莢膜多糖，包括下列一種或多種：PIA(也稱為PNAG)和/或金黃色葡萄球菌V型和/或VlII型莢膜多糖和/或表皮葡萄球菌I型和/或II型和/或III型莢膜多糖。A.PIA(PNAG)目前已清楚鑑定為PS/A、PIA和SAA的多種形式葡萄球菌表面多糖是同一化學實體——PNAG(Maira-Litran等，2004)。因此，術語PIA或PNAG涵蓋所有這些多糖或衍生自它們的寡糖。PIA是多糖細胞間粘附素，其由N-乙醯基和O-琥珀醯基成分取代的β-(1→6)-連接葡糖胺組成。此多糖在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都存在，並可從任一來源中分離出來(Joyce等，2003；Maira-Litran等，2002)。例如，PNAG可分離自金黃色葡萄球菌MN8m株(WO04/43407)。分離自表皮葡萄球菌的PIA是生物膜的整合成分。它負責介導細胞-細胞粘附，可能也發揮為生長的群落屏蔽宿主免疫應答的功能。先前稱為聚-N-琥珀醯-β-(1→6)-葡糖胺(PNSG)的多糖最近顯示出不具有預期的結構，這是因為對N-琥珀醯基化的鑑定是不正確的(Maira-Litran等，2002)。因此，之前稱為PNSG現在被稱為PNAG的多糖也涵蓋在術語PIA中。PIA(或PNAG)可具有不同的大小，從超過400kDa到75～400kDa到10～75kDa到最多由30個重複單位(N-乙醯基和O-琥珀醯基組分取代的β-(1→6)-連接的葡糖胺)組成的寡糖不等。任何大小的PIA多糖或寡糖都可用於本發明的免疫原性組合物中，在一方面多糖超過40kDa。可通過本領域已知的任何方法實現大小的調整，例如微流化(microfluidization)、超聲照射或化學切割(WO03/53462、EP497524、EP497525)。在某些方面PIA(PNAG)至少或至多40～400kDa、40～300kDa、50～350kDa、60～300kDa、50～250kDa和60～200kDa。由於乙酸酯對氨基的取代，PIA(PNAG)可具有不同程度的乙醯化。體外產生的PIA的氨基幾乎完全被取代(95～100％)。或者，可使用具有少於60％、50％、40％、30％、20％、10％乙醯化的脫乙醯化PIA(PNAG)。脫乙醯化PIA(PNAG)的使用是優選的，因為PNAG的非乙醯化表位在介導調理素殺傷革蘭氏陽性細菌(優選金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌)方面是高效的。在某些方面，PIA(PNAG)具有40kDa至300kDa的大小，並且是脫乙醯化的，從而少於60％、50％、40％、30％或20％的氨基是乙醯化的。術語「脫乙醯化的PNAG(dPNAG)」是指PNAG多糖或寡糖，其被乙醯化以使少於60％、50％、40％、30％、20％或10％的氨基是乙醯化的。在某些方面，通過化學處理天然多糖使得PNAG脫乙醯化形成dPNAG。例如，用鹼溶液處理天然PNAG，使得pH升高至10以上。例如，用0.1～5M、0.2～4M、0.3～3M、0.5～2M、0.75～1.5M或1M的NaOH、KOH或NH4OH處理PNAG。在20～100、25～80、30～60或30～50或35～45℃的溫度下處理至少10～30分鐘，或者1、2、3、4、5、10、15或20個小時。dPNAG可如WO04/43405所述製備。多糖可以可與運載體蛋白綴合或是非綴合的。B.來自金黃色葡萄球菌的5型和8型多糖大多數在人體中造成感染的金黃色葡萄球菌含有5型或8型多糖。約60％的人菌株是8型，約30％的是5型。5型和8型莢膜多糖抗原的結構由Moreau等(1990)和Fournier等(1984)所描述。兩者都在重複單元中具有FucNAcp以及可用於引入巰基的ManNAcA。其結構為：5型→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→8型→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→最近(Jones，2005)，NMR光譜將結構修正為：5型→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→8型→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→可使用本領域技術人員公知方法(美國專利6,294,177)從合適的金黃色葡萄球菌菌株提取多糖。如ATCC12902是5型金黃色葡萄球菌菌株，ATCC12605是8型金黃色葡萄球菌菌株。多糖具有天然大小，或者可通過如微流化、超聲照射或化學處理改變其大小。本發明還包括源自金黃色葡萄球菌5型和8型多糖的寡糖。本發明免疫原性組合物中包含的5型和8型多糖優選如下所述與運載體蛋白綴合或者是非綴合的。或者，本發明的免疫原性組合物含有5型或8型多糖。C.金黃色葡萄球菌336抗原在一個實施方案中，本發明免疫原性組合物包含美國專利6,294,177中所述的金黃色葡萄球菌336抗原。所述336抗原包含β-連接己糖胺，其不含O-乙醯基，並特異性結合針對金黃色葡萄球菌336型(以ATCC55804保藏)的抗體。在一個實施方案中，所述336抗原是多糖，其具有天然大小，或者可通過如微流化、超聲照射或化學處理改變其大小。本發明還涵蓋了來源於336抗原的寡糖。336抗原可與運載體蛋白綴合或者是非綴合的。D.來自表皮葡萄球菌的I、II和III型多糖在與免疫接種中使用多糖有關的問題中，事實是多糖本身是弱的免疫原。優選地，本發明中所用的多糖與提供旁觀T細胞的蛋白質運載體相連以改善免疫原性。此類可綴合多糖免疫原的運載體的實例包括白喉和破傷風類毒素(分別為DT、DTCRM197和TT)、匙孔槭血藍蛋白(KLH)和純化的結核菌素蛋白衍生物(PPD)、綠膿假單胞菌外蛋白A(rEPA)、來自流感嗜血桿菌的蛋白D、肺炎球菌溶血素或者上述任一的片段。適用的片段包括含有T輔助細胞表位的片段。特別地，來自流感嗜血桿菌的蛋白D片段優選含有所述蛋白N端的1/3。蛋白D是來自流感嗜血桿菌的IgD結合蛋白(EP0594610B1)，其為潛在的免疫原。另外，葡萄球菌蛋白可用作本發明多糖綴合物中的運載體蛋白。特別有利地用於葡萄球菌疫苗背景中的運載體蛋白是葡萄球菌α類毒素。其天然形式可與多糖綴合，因為綴合加工減少毒性。優選地，由於殘存毒性較低，所以優選經遺傳改造解毒的α毒素(例如His35Leu或His35Arg變體)用作運載體。或者，通過用交聯劑甲醛或戊二醛處理對α毒素進行化學解毒。遺傳解毒的α毒素任選地是化學解毒的，優選地通過用交聯劑甲醛或戊二醛處理以進一步降低毒性。可以通過任何已知方法(例如美國專利4,372,945、4,474,757和4,356,170)將多糖與運載蛋白相連。優選地，進行CDAP綴合化學方法(參見WO95/08348)。在CDAP中，優選使用氰基化劑1-氰基-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)合成多糖-蛋白質綴合物。氰基化反應可在相對溫和條件下進行，其避免了鹼敏感多糖的水解。該合成允許直接偶聯運載體蛋白。綴合優選包括在運載體蛋白和多糖之間產生直接連接。任選地，可在運載體蛋白和多糖之間引入間隔物(例如二氫己二酸(adipicdihydride，ADH))。IV.免疫應答和分析如上文所述，本發明涉及引發或誘導對象中針對SpA變體或凝固酶肽的免疫應答。在一個實施方案中，免疫應答可保護或治療患有、懷疑患有或有風險發生感染或相關疾病(特別是與葡萄球菌有關的那些)的對象。本發明的免疫原性組合物的一種用途是通過在住院治療或解除其他增加感染風險的環境前接種對象來預防醫源性感染。A.免疫分析本發明包括實施血清學測定以評價本發明組合物是否誘導或引發免疫應答及其程度。有許多類型的免疫測定可以實施。本發明所涵蓋的免疫測定包括但不限於美國專利4,367,110(雙單克隆抗體夾心法測定)和美國專利4,452,901(western印跡)所述的那些。其他測定包括體外和體內的帶標記配體的免疫沉澱和免疫細胞化學。免疫測定一般是結合測定。某些優選免疫測定是本領域已知的多種類型的酶聯免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。使用組織切片的免疫組織化學檢測也是特別有用的。在一個實例中，將抗體或抗原固定在所選表面(例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔、試片或柱支持物)上。然後，將懷疑含有目標抗原或抗體的測試組合物(例如臨床樣品)添加到孔中。在結合以及清洗以除去非特異性結合的免疫複合物之後，可檢測所結合的抗原或抗體。檢測一般通過添加另一種與可檢出標記相連的特異性針對目標抗原或抗體的抗體來實現。此類ELISA被稱為「夾心法ELISA」。檢測也可通過以下實現：添加特異性針對目標抗原的第二抗體，然後添加對第二抗體有結合親和力的第三抗體，第三抗體連接有可檢出標記。也可以實施競爭性ELISA，其中測試樣品競爭性結合已知量的經標記抗原或抗體。通過在與經包被的孔一起孵育之前或其間，將樣品與已知經標記物質混合來確定未知樣品中反應性物質的量。樣品中反應性物質的存在減少了可用於結合孔的經標記物質的量，因此減少了最終的信號。不論所使用的形式如何，ELISA都具有某些共同的特徵，例如包被、孵育或結合，清洗以除去非特異性結合的物質，以及檢測所結合的免疫複合物。抗原或抗體也可以連接到固相支持物上，例如板，珠，試片，膜，或柱基質，並且將待分析樣品加到固定化的抗原或抗體上。用抗原或抗體包被平板時，一般將抗原或抗體溶液在平板孔內孵育過夜或特定時間。然後清洗平板的孔，去除不完全吸附的物質。然後用與測試抗血清抗原中性的非特異性蛋白「包被」孔內任何殘留的表面。這包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和乳粉溶液。包被允許阻斷固定化表面的非特異性吸附位點，從而減少抗血清非特異性結合到表面產生的背景。B.細菌感染的診斷除了如上所述使用蛋白質、多肽和/或肽，以及結合這些多肽、蛋白質和/或肽的抗體來治療或預防感染之外，本發明還考慮以多種方式使用這些多肽、蛋白質、肽和/或抗體，包括檢測葡萄球菌的存在以及診斷感染，不論是在患者中還是在也可被汙染的醫療器械上。根據本發明，檢測感染存在的優選方法包括下列步驟：獲得懷疑被一種或多種葡萄球菌物種或菌株感染的樣品，例如取自個體的樣品(例如來自其血液、唾液、組織、骨、肌肉、軟骨或皮膚)。分離出樣品之後，可利用本發明多肽、蛋白質、肽和/或抗體進行診斷測定，以檢測葡萄球菌的存在，並且確定樣品中此類存在的這種測定技術是本領域技術人員公知的，包括例如放射性免疫測定、western印跡分析和ELISA測定的方法。一般說來，根據本發明，設想了下述診斷感染的方法，其中將懷疑感染葡萄球菌的樣品加入到本發明的多肽、蛋白質、肽、抗體或單克隆抗體中，通過與所述多肽、蛋白質和/或肽結合的抗體或者與樣品中所述抗體結合的多肽、蛋白質和/或肽來指示葡萄球菌。因此，本發明的抗體可用於預防葡萄球菌的感染(即被動免疫)，用於治療進行中的感染，或者用作研究工具。本文使用的術語「抗體」包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、猿源化抗體和人源化抗體或靈長動物源化抗體以及Fab片段，例如保持所述抗體結合特異性的片段，包括Fab免疫球蛋白表達文庫的產物。因此，本發明設想了使用單鏈抗體，例如抗體可變重鏈和輕鏈。任意這些類型抗體或抗體片段的產生是本領域技術人員公知的。產生針對細菌蛋白質的抗體的具體實例可見美國專利申請公開20030153022，其通過引用以整體併入本文。可直接用可檢出標記對任意上述多肽、蛋白質、肽和/或抗體進行標記，用以鑑定和定量葡萄球菌。用於免疫測定的標記物是本領域技術人員一般所知的，包括酶、放射性同位素以及螢光、發光和顯色物質，包括有色顆粒(例如膠體金或乳膠珠)。合適的免疫測定包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)。C.保護性免疫在本發明的一些實施方案中，蛋白質性組合物向對象提供了保護性免疫。保護性免疫是指機體建立特異性免疫應答的能力，其保護對象免於發生某種物質參與的特定疾病或病症，其中有針對所述物質的免疫應答。免疫原性有效量能夠賦予對象保護性免疫。本文說明書和後附權利要求書中使用的術語多肽或肽是指通過肽鍵彼此共價相連的一段胺基酸。根據本發明，不同的多肽具有不同的功能。根據一個方面，多肽源自為誘導接受者中的主動免疫應答而設計的免疫原，根據本發明的另一方面，多肽源自在例如動物中引發主動免疫應答後產生的、且可用於誘導接受者中的被動免疫應答的抗體。但是，在這兩種情況下，多肽均可根據任何可用的密碼子由多核苷酸編碼。本文使用的短語「免疫應答」或其等同詞「免疫學應答」是指在接受患者中產生針對本發明蛋白質、肽、碳水化合物或多肽的體液應答(由抗體介導)、細胞應答(由抗原特異性T細胞或其分泌產物介導)或體液和細胞應答兩者。這些應答可以是由施用免疫原誘導的主動應答，或者是由施用抗體、含抗體的物質或預致敏T細胞誘導的被動應答。呈遞與I類或II類MHC分子相結合的多肽表位引發細胞免疫應答，從而活化抗原特異性CD4(+)T輔助細胞和/或CD8(+)細胞毒T細胞。應答也可涉及單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、嗜鹼細胞、樹突狀細胞、星形細胞、小膠質細胞、嗜酸性粒細胞或其他先天免疫組分的活化。本文所用「主動免疫」指任何通過施用抗原賦予對象的免疫力。本文使用的「被動免疫」是指不向對象施用抗原而賦予對象的任何免疫力。因此「被動免疫」包括但不限於施用活化的免疫效應物，其包括免疫應答的細胞介導物或蛋白質介導物，例如單克隆和/或多克隆抗體。單克隆或多克隆抗體組合物可用於被動免疫，用以預防或治療攜帶被所述抗體識別的抗原的生物體的感染。抗體組合物可包含與多種抗原結合的抗體，所述抗體可與多種生物相關。抗體組分可以是多克隆抗血清。在某些方面中，從已用抗原攻擊的動物或第二對象親和純化抗體。或者，可使用抗體混合物，其是針對相同、相關或不同微生物或生物體(例如革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌，包括但不限於葡萄球菌)中存在之抗原的單克隆和/或多克隆抗體的混合物。可通過向患者施用免疫球蛋白(Ig)和/或其他免疫因子給予患者或對象被動免疫，所述免疫球蛋白和/或其他免疫因子獲得自供體或其他具有已知免疫反應性的非患者來源。在另一些方面中，可向作為球蛋白來源或供體的對象施用本發明的抗原組合物，所述球蛋白響應於抗原組合物的攻擊而產生，其含有針對葡萄球菌或其他生物體的抗體(「超免疫球蛋白」)。如此處理的對象貢獻出血漿，然後通過常規血漿分級分離方法從中獲得超免疫球蛋白，並施用給另一對象從而賦予其對葡萄球菌感染的抗性或者治療。根據本發明，超免疫球蛋白特別可用於免疫受損的個體、接受了介入手術的個體或者時間不允許個體響應於接種而產生自身抗體的情況。對於涉及被動免疫的示例性方法和組合物，參見美國專利6,936,258、6,770,278、6,756,361、5,548,066、5,512,282、4,338,298和4,748,018，每個均通過引用以整體併入本文。出於本說明書和權利要求的目的，術語「表位」和「抗原決定簇」可互換地用於表示抗原上B和/或T細胞應答或識別的部位。B細胞表位可由連續胺基酸形成，或者由通過蛋白質三級摺疊而靠近的非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後仍保留，而由三級摺疊形成的表位通常在用變性溶劑處理之後丟失。表位通常包括有獨特空間構象的至少3個、更常見至少5個或8～10個胺基酸。確定表位空間構象的方法包括例如X-射線晶體衍射和二維核磁共振。參見例如EpitopeMappingProtocols(1996)。可在簡單的免疫測定中鑑定出識別相同表位的抗體，所述免疫測定顯示一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原結合的能力。對於CD8細胞，T細胞識別約9個胺基酸的連續表位，而對於CD4細胞，為約13～15個胺基酸。可通過測量抗原依賴性增殖的體外測定鑑定出識別表位的T細胞，該增殖決定於測定預致敏T細胞響應於表位的3H-胸苷摻入(Bruke等，1994)、測定抗原依賴性殺傷(細胞毒性T淋巴細胞測定，Tigges等，1996)或者測定細胞因子分泌。可通過增殖測定(CD4(+)T細胞)或CTL(細胞毒T淋巴細胞)測定來確定細胞介導免疫應答的存在。體液應答和細胞應答對免疫原的保護性或治療性作用的相對貢獻可通過以下方式進行區分：從經免疫的同基因動物中分別分離IgG和T細胞，在第二對象中測量保護性或治療性作用。本文和權利要求中使用的術語「抗體」或「免疫球蛋白」可互換地使用，並表示作為動物或接受者免疫應答的一部分發揮作用的幾類結構上相關蛋白質中的任一種，所述蛋白質包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相關蛋白。在正常生理條件下，抗體存在於血漿及其他體液中以及某些細胞的膜中，其由稱為B細胞的淋巴細胞類型或者其功能等同物產生。IgG類別的抗體由通過二硫鍵連接的四條多肽鏈組成。完整IgG分子的四條鏈是兩條相同的重鏈(稱為H鏈)和兩條相同的輕鏈(稱為L鏈)。為了產生多克隆抗體，用抗原或抗原片段(通常與佐劑一起，必要時，與運載體偶連)免疫宿主例如兔、山羊。隨後從宿主的血清中收集針對所述抗原的抗體。可針對所述抗原親和純化多克隆抗體，使其成為單特異性的。單克隆抗體的產生可以通過用抗原超免疫適當的供體，或者使用脾的脾細胞或細胞系的原代培養物進行離體生產(Anavi，1998；Huston等，1991；Johnson等，1991；Memaugh等，1995)。本文及權利要求中所用的短語「抗體的免疫部分」包括抗體的Fab片段、抗體的Fv片段、抗體的重鏈、抗體的輕鏈、由抗體的重鏈和輕鏈組成的異二聚體、抗體輕鏈的可變片段、抗體重鏈的可變片段以及抗體的單鏈變體(也稱為scFv)。另外，該術語包括嵌合免疫球蛋白，其是來源於不同物種的融合基因的表達產物。所述物種之一可以是人，此時嵌合免疫球蛋白稱為人源化的。通常，抗體的免疫部分與其所來源的完整抗體競爭特異性結合抗原。任選地，抗體(或優選地，抗體的免疫部分)可以與其他蛋白質化學綴合或者表達為融合蛋白。出於本說明書和所附權利要求的目的，所有此類融合蛋白均包含在抗體或抗體免疫部分的定義中。本文使用的術語「免疫原性物質」或「免疫原」或「抗原」可互換地用於表示在施用給接受者後(單獨地、與佐劑一起或者呈現於展示載劑上)能夠誘導針對其自身的免疫應答的分子。D.治療方法本發明的方法包括治療由葡萄球菌病原體引起的疾病或病症。本發明的免疫原性多肽可被施用到被葡萄球菌感染或懷疑曾暴露於葡萄球菌的人中，誘導免疫應答。對於葡萄球菌暴露測試陽性或基於可能的暴露而被視為有感染風險的個體可以使用本發明的方法。特別地，本發明涵蓋葡萄球菌感染(特別是醫院獲得的醫源性感染)的治療方法。本發明的免疫原性組合物和疫苗對於擇期手術來說特別有利。這些患者預先知曉手術的日期，因此可預先進行接種。本發明的免疫原性組合物和疫苗對於接種醫療保健工作者也是有利的。在一些實施方案中，所述治療在佐劑或運載體或其他葡萄球菌抗原存在下施用。此外，在某些實例中，治療包括施用常用於抗細菌感染的其他藥劑，例如一種或多種抗生素。用於接種的多肽需要(但不必需)綴合所述肽至免疫原性運載體蛋白，例如B肝表面抗原、鑰孔血藍蛋白或牛血清白蛋白。進行這些綴合的方法是本領域公知的。V.疫苗和其他藥物組合物和施用A.疫苗本發明包括預防或減輕葡萄球菌感染(特別是醫院獲得的醫源性感染)的方法。因此，本發明涉及在主動和被動免疫的實施方案中使用的疫苗。被認為適合用作疫苗的免疫原性組合物可以從免疫原性SpA多肽如SpA變體結構域D或免疫原性凝固酶製備。在另一些實施方案中，SpA或凝固酶可與其他分泌的毒性蛋白、表面蛋白或其免疫原性片段聯合使用。在某些方面，將抗原性物質充分透析以去除不期望的小分子量分子，和/或凍幹以備配製進期望的載劑。對基於蛋白質/肽的疫苗而言其他替代方案包括引入編碼抗原的核酸作為DNA疫苗。對此，近期的報導描述了構建重組痘苗病毒，並成功使用此類構建體免疫小鼠，用於引發保護性免疫應答，所述重組疫苗病毒表達10個連續的最小CTL表位(Thomson，1996)或者來自幾種微生物的B細胞、細胞毒T淋巴細胞(CTL)和T輔助細胞(Th)表位的組合(An，1997)。因此，對成功利用肽、肽脈衝抗原呈遞細胞(peptide-pulsedantigenpresentingcell，APC)和編碼肽的構建體在體內有效引發保護性免疫應答已在文獻中有充分的證據。美國專利5,958,895和5,620,896中示例了使用核酸序列作為疫苗。包含多肽或肽序列作為活性成分的疫苗的製備一般為本領域公知，如美國專利4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792和4,578,770所示例，所有專利都通過引用併入本文。這種疫苗通常以注射劑(作為液體溶液或混懸液)的形式製備；還可製備適於在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式。所述製劑也可以被乳化。活性免疫原性成分通常與可藥用並與活性成分相容的賦形劑相混合。合適的賦形劑例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如期望，疫苗可含有一定量的輔助性物質，如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝劑或者增強疫苗效力的佐劑。在一些具體實施方案中，疫苗與一些物質的組合一起進行配製，如美國專利6,793,923和6,733,754所述，其通過引用併入本文。疫苗可常規地通過胃腸外注射(例如皮下注射或肌內注射)來施用。適用於其他施用方式的另外製劑包括栓劑，以及在某些情況下的口服製劑。對於栓劑，傳統粘合劑和運載體可包括例如聚亞烷基二醇(polyalkaleneglyco1)或甘油三脂；這些栓劑可由含有活性成分(範圍為約0.5％至約10％，優選約1％至約2％)的混合物形成。口服製劑包含常用的賦形劑，例如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物採用溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、持續釋放製劑或粉末劑的形式，包含約10％至約95％(優選約25％至約70％)的活性成分。多肽、肽和編碼肽的DNA構建體可以配製成中性或鹽形式的疫苗。可藥用鹽包括酸加成鹽(由肽的游離氨基形成)和與無機酸(例如鹽酸或磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽。疫苗一般以與藥劑劑型相容的方式、以治療有效和免疫原性的量來施用。施用量取決於待治療的對象，包括個體免疫系統合成抗體的能力和所期望的保護程度。待施用的活性成分的精確量取決於醫生的判斷。但是，合適的劑量範圍為每次接種幾百微克左右的活性成分。初次施用和加強免疫的適用方案也是可變的，但一般為初次施用之後再進行後續接種或其他施用。應用的方式可以是多種多樣的。疫苗施用的任何常規方法都是可應用的。這些方法應包括在生理學可接受的固體基質中口服應用，或者在生理學可接受的分散劑以腸胃外、通過注射等來施用。疫苗的劑量取決於施用途徑，且根據對象的體形和健康狀況而變化。在許多情形中，期望多次施用疫苗，例如2、3、4、5、6次或更多次施用。接種一般間隔1、2、3、4、5、6、7、8至5、6、7、8、9、10、11、12周，包括其間所有範圍。期望間隔1～5年進行定期加強免疫維持抗體的保護性水平。在免疫過程之後可測定針對抗原的抗體，如美國專利3,791,932、4,174,384和3,949,064所述。1.運載體給定的組合物的免疫原性可能有所不同。因此往往有必要加強宿主的免疫系統，這可通過將肽或多肽偶聯至運載體來實現。示例性並優選的運載體為匙孔血藍蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作運載體。將多肽綴合到運載體蛋白的手段為本領域所熟知，包括戊二醛、間馬來醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯、碳二亞胺和雙重氮聯苯胺。2.佐劑可通過使用免疫應答的非特異性刺激劑(稱為佐劑)來增強多肽或肽組合物的免疫原性。合適的佐劑包括所有可接受的免疫刺激化合物，如細胞因子、毒素或合成組合物。多種佐劑可用於增強抗體針對SpA多肽變體或凝固酶或本文所述任何其他細菌蛋白質或組合的抗體應答。佐劑可(1)滯留體內的抗原使其緩慢釋放；(2)將參與免疫應答的細胞吸引到施用部位；(3)誘導免疫系統細胞的增殖或活化；或(4)促進抗原在對象整個身體中的擴散。佐劑包括但不限於水包油乳劑、油包水乳劑、礦物鹽、多核苷酸和天然物質。可使用的具體佐劑包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-幹擾素、GMCSP、BCG、鋁鹽(例如氫氧化鋁或其他鋁化合物)、MDP化合物(如thur-MDP和nor-MDP)、CGP(MTP-PE)、脂質A和單磷醯脂質A(MPL)。也可使用RIBI，其包含在2％角鯊烯/吐溫80乳劑中的三種從細菌中提取的組分——MPL、海藻糖二分枝酸酯(trehalosedimycolate，TDM)和細胞壁骨架(cellwallskeleton，CWS)。還可使用MHC抗原。其他佐劑或方法示例於美國專利6,814,971、5,084,269、6,656,462，每個均通過引用併入本文。對疫苗實現佐劑效應的多種方法包括使用製劑如氫氧化鋁或磷酸鋁(明礬)，通常以磷酸鹽緩衝液中約0.05％至約0.1％的溶液使用，其與以約0.25％溶液使用的合成多聚糖混合，通過以約70℃至約101℃的溫度分別熱處理30秒至2分鐘來聚集疫苗中的蛋白質。還可採用以下方法來產生佐劑效應：通過用胃蛋白酶處理的(Fab)白蛋白抗體的再次活化進行聚集；與細菌細胞(例如短小棒狀桿菌(C.parvum))、內毒素或革蘭氏陰性菌的脂多糖組分混合；在生理學可接受的油載劑(例如二縮甘露醇一油酸(AracelA))中乳化；或用作為封閉底物的20％全氟化碳溶液乳化。通常優選的佐劑的實例包括弗氏完全佐劑(包含滅活的結核分枝桿菌的免疫應答非特異性刺激物)、弗氏不完全佐劑和氫氧化鋁。在一些方面，優選將佐劑選擇為Th1或Th2型應答的優先誘導物。高水平Th1型細胞因子傾向於偏好誘導針對給定抗原的細胞介導之免疫應答，而高水平Th2型細胞因子則傾向於偏好誘導針對抗原的體液免疫應答。Th1和Th2型免疫應答的區別不是絕對的。實際上，一些人支持稱為Th1主導或Th2主導的免疫應答。但是，常常方便地以Mosmann和Coffman在鼠CD4+T細胞克隆中所述的形式定義細胞因子家族(Mosmann和Coffman，1989)。傳統上，Th1型應答與T淋巴細胞產生INF-γ和IL-2細胞因子有關。經常直接與Th1型免疫應答誘導相關的其他細胞因子(例如IL-12)不由T細胞產生。與之不同，Th2型應答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有關。除佐劑之外，還可能需要共施用生物應答調節劑(biologicresponsemodifier，BRM)來增強免疫應答。BRM已顯示能夠上調T細胞免疫或下調細胞活性抑制物。這些BRM包括但不局限於西咪替丁(CIM；1200mg/天)(Smith/Kline，PA)或低劑量的環磷醯胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)和細胞因子如γ-幹擾素、IL-2或IL-12，或編碼參與免疫輔助功能的蛋白質(如B-7)的基因。B.脂質組分和部分在某些實施方案中，本發明涉及包含一種或多種與核酸或多肽/肽結合的脂質的組合物。脂質是不溶於水且可用有機溶劑萃取的物質。本領域技術人員了解除了本文具體描述的那些之外的脂質化合物，並且其涵蓋在本發明的組合物和方法中。脂質組分和非脂質可以共價或非共價地彼此相連。脂質可以是天然脂質或合成脂質。但是，脂質通常是生物物質。生物脂質是本領域中公知的，包括例如中性脂、磷脂、磷酸甘油酯、類固醇、萜烯、溶血脂類、鞘糖脂、糖脂、硫酸酯、具有醚和酯連接的脂肪酸的脂類以及可聚合脂質，以及其組合。與脂質相結合的核酸分子或多肽/肽可分散在含有脂質的溶液中，溶於脂質中，被脂質乳化，與脂質混合，與脂質結合，與脂質共價鍵合，作為懸浮物包含在脂質中或者以其他方式與脂質相相應。本發明的脂質或脂質-痘病毒-相關組合物不限於任何特定結構。例如，它們還可簡單地散布於溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。在另一實例中，它們可以雙層結構存在、以膠團形式存在或者具有「散的(collapsed)」結構。在另一非限制性實例中，還考慮lipofectamine(GibcoBRL)-痘病毒或Superfect(Qiagen)-痘病毒複合物。在某些實施方案中，組合物可包含約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約31％、約32％、約33％、約34％、約35％、約36％、約37％、約38％、約39％、約40％、約41％、約42％、約43％、約44％、約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％、約51％、約52％、約53％、約54％、約55％、約56％、約57％、約58％、約59％、約60％、約61％、約62％、約63％、約64％、約65％、約66％、約67％、約68％、約69％、約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或其間任何範圍的特定脂質、脂質類型或者非脂質組分(例如佐劑、抗原、肽、多肽、糖、核酸或者本文公開的或本領域技術人員已知的其他物質)。在一個非限制性實例中，組合物可包含約10％至約20％的中性酯，以及約33％至約34％的腦苷脂和約1％的膽固醇。在另一非限制性實例中，脂質體可包含約4％至約12％的萜烯，其中約1％的膠團具體地是番茄紅素，剩餘約3％至約11％的脂質體包含其他萜烯；以及約10％至約35％的磷脂醯膽鹼，和約1％的非脂質組分。因此，設想本發明的組合物可包含任何組合或百分比範圍的任何脂質、脂質類型或其他組分。C.聯合治療本發明的組合物和相關方法(特別是向患者/對象施用分泌的毒性因子或表面蛋白包括SpA變體多肽或肽和/或其他細菌肽或蛋白質)也可與傳統治療的施用聯合使用。這些包括但不限於：抗生素的施用，例如鏈黴素、環丙沙星、強力黴素、慶大黴素、氯黴素、三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺甲惡唑、氨苄青黴素、四環素或多種抗生素組合。在一方面，設想多肽疫苗和/或治療與抗細菌治療聯合施用。或者，該治療也可以在其他試劑治療之後或之前間隔從幾分鐘到幾周進行。在分開施用其他試劑和/或蛋白或多核苷酸的實施方案中，通常應保證每次遞送之間的長時間間隔不會過期，從而試劑和抗原組合物仍然能夠對對象產生有利的聯合效果。在這些情況中，考慮可以在間隔約12-24小時或約6-12小時內施用兩種形式的治療。在一些情況下，可能期望顯著延長施用的時間，各次施用之間間隔幾天(2、3、4、5、6或7)到幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)。可採用不同組合，例如抗生素療法為「A」，作為免疫療法方案一部分給予的免疫原性分子如抗原為「B」：A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A向患者/對象施用本發明免疫原性組合物應遵從施用這些化合物的一般方案，考慮SpA組合物或其他本文所述組合物的毒性(如果有的話)。預計可根據需要重複治療周期。還涉及的是多種標準療法如水化療法(hydration)可與所述療法組合應用。D.一般藥物組合物在一些實施方案中，向對象施用藥物組合物。本發明的一些不同方面包括向對象施用有效量的組合物。在本發明的一些實施方案中，可向患者施用葡萄球菌抗原、Ess途徑成員(包括Esa或Esx類的多肽或肽)和/或分選酶底物成員，以保護其免受一種或多種葡萄球菌病原體的感染。或者，可將編碼一種或多種這種多肽或肽的表達載體給予患者作為預防性治療。此外，這些化合物可與抗生素或抗菌素聯用。這些組合物一般可溶解或分散在可藥用運載體或含水介質中。除了配製成腸胃外施用的化合物(如用於靜脈內注射或肌內注射的那些)，其他可藥用形式包括例如用於口服施用的片劑或其他固體；緩釋膠囊；以及目前所用的其他任何形式，包括霜劑、洗劑、漱口劑、吸入劑等。可將本發明的活性化合物配製成用於腸胃外施用，例如配製成用於靜脈內、肌內、皮下或腹膜內途徑的注射。根據本公開內容本領域技術人員會知道含有增加MHCI類分子表達的化合物的含水組合物。通常，這些組合物可以配製成可注射形式，既可以是液體溶液也可以是懸液；也可以配製成用於在注射前加入液體配製溶液或懸液的固體形式；製劑還可以被乳化。可在與表面活性劑(如羥丙基纖維素)適當混合的水中製備以游離鹼或可藥用鹽形式存在的活性化合物的溶液。也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在油中製備分散體系。在普通的儲藏和使用條件下，這些製劑含有防止微生物生長的防腐劑。適於注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散體系；製劑，包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的製劑；用於即時製備無菌注射溶液或分散體系的無菌粉末劑。在所有情況下，劑型必須是無菌的，而且必須達到可易於注射的流動程度。它還應當在加工和儲藏條件下是穩定的，而且應當免受微生物(如細菌和真菌)的汙染作用。可將蛋白質性組合物配製成中性或鹽形式。可藥用的鹽包括酸加成鹽(由蛋白質的游離氨基形成)和由無機酸(例如鹽酸或磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽。由游離羧基形成的鹽也可來自無機鹼(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機鹼(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)。運載體也可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物以及植物油。可通過例如使用包衣(如卵磷脂)，通過維持所需的粒徑(對於分散體系的情況)以及通過使用表面活性劑來保持適當的流動性。可通過多種抗細菌劑和抗真菌劑(例如對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)來實現對微生物作用的預防。在許多情況下，可優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可通過在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現對注射組合物的延長吸收。通過將所需量的活性化合物摻入具有上面所列舉的多種成分的合適溶劑中來製備無菌注射溶液，根據需要再進行過濾除菌。一般地，通過將多種無菌活性成分摻入無菌載劑(其含有基本分散介質和所需的其他上面所列舉的成分)來製備分散體系。對用於製備無菌注射液的無菌粉末劑而言，優選的製備方法為真空乾燥和冷凍乾燥技術，由預先經過濾除菌的溶液產生活性成分和所有其他期望成分的粉末劑。本發明組合物的施用通常可經由任何常見的途徑。這包括但不局限於口服、經鼻或含服施用。或者，可通過原位、皮內、皮下、肌內、腹膜內、鼻內或靜脈內注射來施用。在某些實施方案中，疫苗組合物可以是吸入的(例如美國專利6,651,655，其通過引用具體併入本文中)。這些組合物通常作為可藥用的組合物(含有生理學可接受的運載體、緩衝劑或其他賦形劑)來施用。本文使用的術語「可藥用」是指在正確醫學判斷範圍內適於接觸人體和動物組織並且沒有過度毒性、刺激性、變態反應或其他問題併發症且具有合理之益處/風險比的化合物、物質、組合物和/或劑型。術語「可藥用運載體」表示參與攜帶或轉運化學物質的可藥用的物質、組合物或介質，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。就水溶液的腸胃外施用而言，例如，必要時可適當地緩衝溶液，而且液體稀釋劑應首先用足量的鹽水或葡萄糖進行等滲處理。這些特定的水溶液特別適於靜脈內、肌內、皮下和腹膜內施用。在這一點上，根據本公開內容，可採用的無菌含水介質為本領域技術人員所知。例如，可將一個劑量溶於等滲NaCl溶液中，並且加入到皮下輸液中或注射到建議的輸注位點(參見例如，Remington’sPharmaceuticalSciences，1990)。根據對象的狀況，劑量有必要發生一些改變。不管怎樣，負責施用的人會決定個體對象的合適劑量。治療性或預防性組合物的有效量基於預期目標來確定。術語「單位劑量」或「劑量」是指適於對象中使用的物理上分離的單位，每個單位包含為產生上述與其施用(即適當途徑和方案)相關的預期應答而計算得出的組合物預定量。所要施用的量(根據治療次數和單位劑量)取決於期望的保護作用。組合物的精確劑量也取決於醫生的判斷，且為特定針對每個個體的。影響劑量的因素包括對象的身體和臨床狀態、施用途徑、治療的預期目標(減輕症狀還是治癒)以及特定組合物的效力、穩定性和毒性。製備後，將以與給藥劑型相匹配的方式、以有效治療或預防的量來施用溶液。可容易地以多種劑型(如上文所述的注射液類型)來施用製劑。E.體外、離體或體內施用本文所用的術語體外施用是指對從對象中取出的或在對象體外的細胞(包括但不局限於培養細胞)進行操作。術語離體施用是指將已在體外進行了操作的細胞隨後施用於對象。術語體內施用包括在對象體內進行的所有操作。在本發明的某些方面中，可通過體外、離體或體內施用組合物。在某些體外實施方案中，將自體B淋巴細胞細胞系與本發明的病毒載體一起孵育24～48小時，或與SpA變體和/或凝固酶和/或任何其他本文所述組合物一起孵育2小時。經轉導的細胞接著可用於體外分析，或用於離體施用。通過引用併入本文的美國專利4,690,915和5,199,942公開了離體操作血液單核細胞和骨髓細胞用於治療性應用的方法。F.抗體和被動免疫本發明的另一方面是製備用於預防或治療葡萄球菌感染之免疫球蛋白的方法，其包括用本發明的疫苗免疫接受者或供體以及從接受者或供體中分離免疫球蛋白或抗體的步驟。此方法製備的免疫球蛋白是本發明的另一方面。包含本發明免疫球蛋白和可藥用運載體的藥物組合物是本發明又一方面，其可用於製備治療或預防葡萄球菌疾病的藥物。治療或預防葡萄球菌感染的方法是本發明的另一個方面，其包括向患者施用有效量的本發明藥物製劑的步驟。用於產生多克隆抗體的接種物通常通過在生理耐受稀釋劑(例如鹽水或其他適於人使用的佐劑)中分散抗原組合物以形成水性組合物來製備。向哺乳動物施用免疫刺激量的接種物，然後使被接種的哺乳動物維持足以使得抗原組合物誘導出保護性抗體的時間。可通過公知技術(例如親和色譜)將抗體分離到期望的程度(Harlow和Lane，1988)。抗體可包括來自多種常用動物(例如山羊、靈長類動物、驢、豬、馬、豚鼠、大鼠或人)的抗血清製備物。根據本發明產生的免疫球蛋白可包括完整抗體、抗體片段或子片段。抗體可以是任何類型(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的完整免疫球蛋白、針對本發明兩種或更多種抗原具有雙特異性的嵌合抗體或雜合抗體。它們也可以是片段(例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等)，包括雜合片段。免疫球蛋白還包括天然、合成或經遺傳改造的蛋白質，其通過結合特異性抗原形成複合物而如抗體一樣起作用。本發明的疫苗可施用給接受者，其隨後作為應答於來自特異性疫苗之攻擊而產生的免疫球蛋白的來源。這樣治療的對象可捐贈血漿，從其中可通過常規血漿分級分離方法獲得超免疫球蛋白。可將超免疫球蛋白施用給另一個對象，以賦予針對葡萄球菌感染的抗性或者對其進行治療。本發明的超免疫球蛋白特別可用於治療或預防嬰兒、免疫缺陷個體的葡萄球菌疾病，或者在需要治療但沒有時間讓個體應答於疫苗接種而產生抗體的情況下用於治療或預防葡萄球菌疾病。本發明的另一個方面是包含兩種或多種單克隆抗體(或其片段；優選人的或人源化的)的藥物組合物，所述抗體與本發明至少2種免疫原性組合物成分具有反應性，所述藥物組合物可用於治療或預防革蘭氏陽性細菌(優選葡萄球菌，更優選金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)的感染。這些藥物組合物包含與本發明兩種或更多種抗原具有特異性的單克隆抗體(可以是任何類型的完整免疫球蛋白)、嵌合抗體或雜合抗體。它們也可以是片段(例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等)，包括雜合片段。製備單克隆抗體的方法是本領域公知的，可包括將脾細胞與骨髓瘤細胞的融合(Kohler和Milstein，1975；Harlow和Lane，1988)。或者，可通過篩選合適的噬菌體展示文庫獲得單克隆Fv片段(Vaughan等，1998)。單克隆抗體可以是通過已知方法人源化的或部分人源化的。VI.實施例給出以下實施例以舉例說明本發明的多個實施方案，但不意在以任何方式限制本發明。本領域技術人員會了解本發明很好地適於實現目的，以及獲得所提及的目標和優勢以及本文中固有的目的、目標和優勢。現有的實施例以及本文所述的方法是優選實施方案的代表，其為示例性的，並且不意在限制本發明的範圍。本領域技術人員會了解權利要求範圍所限定的在本發明宗旨之內涵蓋的變動及其他用途。實施例1非產毒蛋白A變體作為亞單位疫苗來預防金黃色葡萄球菌感染A.結果金黃色葡萄球菌感染的動物模型。通過靜脈內注射1x107CFU的金黃色葡萄球菌人臨床分離Newman株來感染BALB/c小鼠(Baba等，2007)。感染後6小時內，99.999％的葡萄球菌從血流內消失，通過血管系統進行分布。葡萄球菌迅速分布到外周組織，最初的3小時內在腎和其他外周器官組織的細菌負荷達到1x105CFUg-1。24小時內腎組織中葡萄球菌負荷增加了1.51ogCFU。感染48小時後，小鼠在多個器官發生彌散性膿腫，通過光學顯微鏡檢查蘇木精-伊紅染色的腎組織超薄切片可以觀察到。最初的膿腫直徑為524μM(±65μM)，病變標誌最初為多形核白細胞(PMN)內流，並且沒有攜帶可辨別的葡萄球菌團，大部分葡萄球菌團顯示位於PMN內。在感染第5天，膿腫大小增加並且包括葡萄球菌中心群，外周是嗜酸、無定形物質層和大的PMN層。組織病理學顯示在膿腫病變中心接近金黃色葡萄球菌病灶處有大量壞死的PMN，並覆蓋有健康的吞噬細胞。在膿腫病變周圍觀察到是一圈壞死的PMN，其緊鄰將健康腎組織與感染病變區隔開的嗜酸無定形物質。在第15天或36天，膿腫最終達到直徑≥1,524μM。在之後的時間段中，葡萄球菌負荷增加到104-106CFUg-1，生長的膿腫病變向器官包膜遷移。外周病變容易破裂，從而向腹腔或腹膜後間隙釋放壞死物質和葡萄球菌。這些事件造成菌血症以及第二波膿腫，最終促成致死性結果。為了對腎組織中的葡萄球菌負荷進行計算，處死動物，切下腎並將組織勻漿塗布到瓊脂培養基上形成菌落。在感染第5天，觀察到1x106CFUg-1腎組織的金黃色葡萄球菌Newman株。為了對膿腫形成進行定量，對腎進行目測檢視，對每個單獨的器官給出1或0的評分。最終總數除以腎總個數來計算表面膿腫百分比(表4)。另外，隨機選擇腎在福馬林中固定，包埋，超薄切片並用蘇木精-伊紅染色。對每個腎，用顯微鏡觀察相隔200μM的四個徑向切片。計算每個切片的病變數目，取平均值對腎中膿腫數進行定量。金黃色葡萄球菌Newman株在每個腎中造成4.364±0.889個膿腫，在20個腎中的14個上觀察到表面膿腫(70％)(表4)。用掃描電子顯微鏡檢查時發現，金黃色葡萄球菌Newman株位於膿腫中心緊密結合的菌苔中。葡萄球菌被無定形假包膜包圍，它將細菌與膿腫白細胞層分隔開。在這些葡萄球菌中心簇內沒有觀察到免疫細胞，但是偶爾有紅細胞處於細菌間。膿腫中心的細菌群(稱為葡萄球菌膿腫群(staphylococcalabscesscommunities，SAC))看起來是均一的並被電子密集的顆粒物質包被。金黃色葡萄球菌Newman株形成的感染病變的外觀動態和膿腫的形態學特性與在金黃色葡萄球菌USA300(LAC)感染的小鼠上觀察到的類似，USA300(LAC)是目前在美國流行的社區獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)克隆(Diep等，2006)。表4.小鼠中金黃色葡萄球菌Newman株膿腫形成的遺傳學要求a用每種攻擊菌株對15隻BALB/c小鼠的組感染後5天腎組織勻漿中葡萄球菌的負荷平均值，以log10CFUg-1計算。註明了平均值的標準誤(±SEM)。b使用Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。c以log10CFUg-1計算的細菌負荷的減少。d通過目測測量感染後5天腎組織中的膿腫形成(％陽性)e8-10隻動物的蘇木精-伊紅染色腎超薄切片的組織病理學；記錄每個腎中膿腫的平均數並再平均得到最終的平均值(±SEM)。f使用Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。金黃色葡萄球菌蛋白A(SpA)突變體無毒力且不能形成膿腫分選酶A是固定金黃色葡萄球菌Newman株莢膜中的19種表面蛋白的轉肽酶(Mazmanian等，1999；Mazmanian等，2000)。早期的工作發現，分選酶A在多個動物模型系統中是毒性因子，但是，該酶及其所錨定的表面蛋白在膿腫形成或持續中的作用還沒有被揭示(Jonsson等，2002；Weiss等，2004)。與野生型母體相比(Baba等，2007)，在第2、5或15天，等基因srtA變體(AsrtA)在目測或組織病理學檢查中均不能形成膿腫病變。在被strA突變體感染的小鼠中，在感染第5天從腎組織中僅能夠獲得1×104CFUg-1，相比野生型母體菌株減少了2.046log10CFUg-1(p＝6.73×10-6)。MRSA菌株USA300的srtA突變體也觀察到類似的缺陷(數據未顯示)。掃描電子顯微鏡顯示在其他方面均健康的腎組織中srtA突變體高度分散並且經常與白細胞結合。在感染後的第15天，srtA突變體被從腎組織中清除，相比野生型減少了≥3.51og10CFUg-1(表4)。因此，分選酶A錨定的表面蛋白使細菌能夠在宿主組織中形成膿腫病變和持續存在，其中葡萄球菌擴增成群落包埋在細胞外基質中，並且由無定形假包膜把周圍白細胞屏蔽。分選酶A將具有LPXTG基序分選信號的廣譜的蛋白錨定到細胞壁莢膜上，從而為很多毒性因子提供表面展示(Mazmanian等，2002)。為了鑑定葡萄球菌膿腫形成所需的表面蛋白，將bursaaurealis插入片段引入到編碼具有LPXTG基序蛋白的多肽的5′編碼序列中(Bae等，2004)，並且將這些突變轉導入金黃色葡萄球菌Newman株。蛋白A(spa)結構基因中的突變使感染小鼠腎組織中葡萄球菌負荷減少了1.004log10(p＝0.0144)。當通過組織病理學分析它們在腎組織中形成膿腫的能力時，我們觀察到spa突變體與野生型母體金黃色葡萄球菌Newman株相比不能形成膿腫(野生型金黃色葡萄球菌Newman株在每個腎中形成4.364±0.889個膿腫，相比於等基因spa突變體的0.375±0.374個病變；P＝0.0356)。蛋白A阻斷先天和獲得性免疫應答。研究發現，蛋白A是金黃色葡萄球菌感染髮病期間關鍵的毒性因子。早期工作證明蛋白A通過結合免疫球蛋白的Fc部分阻斷對葡萄球菌的細胞吞噬(Jensen1958；Uhlen等，1984)，通過vonWillebrand因子激活血小板聚集(Hartleib等，2000)，通過捕獲具有VH3的IgM的F(ab)2區發揮B細胞超抗原作用(Roben等，1995)，並且通過活化TNFR1可以引發葡萄球菌肺炎(Gomez等，2004)。由於蛋白A捕獲免疫球蛋白並顯示毒性特性這一事實，這種表面分子作為人疫苗的可能性還沒有經過仔細的研究。本發明人首次證明，不再能結合免疫球蛋白、vWF和TNFR-1從而去除了它們的產毒潛力的蛋白A變體能夠刺激針對金黃色葡萄球菌病提供保護的體液免疫應答。蛋白A表面展示和功能的分子基礎。蛋白A在細菌細胞質中以前體形式合成並通過其YSIRK信號肽在橫壁(即葡萄球菌的細胞分裂間隔)處分泌(圖1)(DeDent等，2007；DeDent等，2008)。在切割C末端LPXTG分選信號後，蛋白A通過分選酶A錨定到細菌肽聚糖交聯橋(crossbridge)上(Schneewind等，1995；Mazmanian等，1999；Mazmanian等，2000)。蛋白A是豐度最高的葡萄球菌表面蛋白；幾乎所有金黃色葡萄球菌菌株都表達該分子(Said-Salim等，2003；Cespedes等，2005；Kennedy等2008)。葡萄球菌每個分裂周期轉換其15-20％的細胞壁(Navarre和Schneewind，1999年)。鼠水解酶切割肽聚糖的聚糖鏈和細胞壁肽，從而釋放蛋白A及其所附的C末端細胞壁二糖四肽到細胞外基質中(Ton-That等，1999)。因此，通過生理學設計，蛋白A不僅錨定在細胞壁上並且在細菌表面展示，還在宿主感染時釋放到到周圍組織(Marraffini等，2006)。蛋白A捕獲細菌表面的免疫球蛋白，並且此生物化學活性使葡萄球菌能逃避宿主的先天和獲得性免疫應答(Jensen，1958；Goodyear等，2004)。有趣的是，蛋白A的區域X(Guss等，1984)是將IgG結合結構域連接到LPXTG分選信號/細胞壁錨定的重複結構域，其也許是葡萄球菌基因組中變異性最高的部分(Said-Salim，2003年；Schneewind等，1992)。蛋白A(SpA)的5個免疫球蛋白結合結合域的每個均由三螺旋束形成，並且被稱為E、D、A、B和C，它們顯示類似的結構和功能特性(Sjodahl，1977；Jansson等，1998)。含或者不含Fc和VH3(Fab)配體的結構域D的溶液結構和晶體結構已經解出，這些配體在不同的位點以非競爭性方式結合蛋白A(Graille等，2000)。在晶體結構複合物中，Fab通過由4個VH區β-股形成的表面與結構域D的螺旋II和螺旋域III相互作用(Graille2000)。結構域D的螺旋II的主軸與股的方向約成50°，結構域D的螺旋內部分最靠近C0股。Fab的相互作用位點遠離Ig輕鏈和重鏈的恆定區。相互作用涉及結構域D的下列殘基：螺旋II的Asp-36，螺旋II和螺旋III之間環的ASP-37和Gln-40，以及SpA-D的幾個其他殘基(Graille2000)。這兩個相互作用表面都主要由極性側鏈構成，參與相互作用的結構域D的三個負電荷殘基和在2A2Fab上的兩個正電荷殘基提供兩個分子間的整體靜電吸引。在Fab和結構域D之間鑑定的5個極性相互作用中，三個在側鏈之間。在Arg-H19和Asp-36之間形成鹽橋，在Tyr-H59和Asp-37以及Asn-H82a和Ser-33之間形成兩個氫鍵。由於Asp-36和Asp-37在蛋白A的所有五個IgG結合結構域中是保守的，選擇這些殘基進行突變。負責Fab結合的SpA-D位點在結構上與介導Fcγ結合的結構域表面是分開的。Fcγ與結構域D的相互作用主要涉及螺旋I的殘基，並且有較少螺旋II殘基參與(Gouda等，1992；Deisenhofer，1981)。除Gln-32(兩個複合物中的輕微接觸)外沒有介導Fcγ相互作用的殘基參與Fab結合。為了研究這些不同的Ig結合位點之間的空間關係，這些複合物中的SpA結構域被疊加來構建Fab、SpA-結構域D和Fcγ分子之間複合物的模型。在這個三重模型中，Fab和Fcγ在螺旋II的相反面形成「三明治」夾心，而沒有證據表明任一相互作用存在空間位阻。這些結果說明儘管體積小(即56-61個胺基酸)，但SpA結構域可以同時顯示兩種活性，這解釋了Fab與單個結構域的相互作用是非競爭性的實驗證據。SpA-D和Fcγ之間的相互作用殘基是Gln-9和Gln-10。與之不同，IgG的Fc部分對結構域D的佔據阻斷其與vWFA1的相互作用，並且也可能阻斷與TNFR1的相互作用(O′Seaghdha等，2006)。對IgGFc結合必不可少的殘基(F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、131和K35)突變對於vWFA1和TNFR1結合也是必需的(O′Seaghdha等，2006；Cedergren等，1993；Gomez等，2006)，而對於VH3相互作用必需的殘基(Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43、E47)對IgGFc、vWFA或TNFR1的結合活性沒有影響(Jansson等，1998；Graille等，2000)。蛋白A免疫球蛋白Fab結合活性靶向在表面表達VH3家族相關IgM的B細胞亞群，即這些分子作為VH3型B細胞受體發揮作用(Roben等，1995)。與SpA相互作用後，這些B細胞迅速增殖而後凋亡，導致優選和延長的先天樣B淋巴細胞(即邊緣區B細胞和濾泡B2細胞)缺失(Goodyear和Silverman，2004；Goodyear和Silverman，2003)。重要的是超過40％的循環B細胞被蛋白A相互作用靶定，VH3家族是賦予針對病原體的保護性體液應答的最大人B細胞受體家族(Goodyear和Silverman，2004年，Goodyear和Silverman，2003)。因此，蛋白A的作用類似於葡萄球菌超抗原(Roben等，1995)，儘管後一類的分子(例如SEB、TSST-1、TSST-2)與T細胞受體形成複合物，不適當地刺激宿主的免疫應答，從而引發葡萄球菌感染的特徵性疾病特徵(Roben等，1995；Tiedemann等，1995)。這些發現總體記錄了蛋白A在建立葡萄球菌感染和調節宿主免疫應答中的作用。蛋白A的非產毒變體。本發明人開發了非產毒的葡萄球菌蛋白A變體，並且使用此試劑首次試圖測量動物對蛋白A免疫的免疫應答。並且，本發明人研究了使用非產毒蛋白A變體免疫的動物是否可以產生針對葡萄球菌感染提高保護性免疫的免疫應答。為了幹擾蛋白A與IgGFc、vWFA1和TNFR1的結合活性，對穀氨醯胺(Q)殘基9和10[此處的編號來自於對SpA結構域D已建立的編號]進行了修飾，對兩個穀氨醯胺進行賴氨酸或甘氨酸替換，預期這些替換會破壞野生型蛋白A與其配體間形成的離子鍵。雙賴氨酸替換的增加的效果可能是這些帶正電荷的殘基組構成了與免疫球蛋白相斥的電荷。為了幹擾IgMFabVH3結合，本發明人選擇SpA-D的36和37位天冬氨酸(D)，其中每個都是蛋白A與B細胞受體結合所需要的。D36和D37均由丙氨酸替換。Q9，10K和D36，37A突變在重組分子SpA-DQ9，10K；D36，37A中進行了組合併檢查蛋白A的結合性質。簡言之，使用引物(GCTGCACATATGGCGCAACACGATGAAGCTCAAC[5′引物](SEQIDNO：35)和AGTGGATCCTTATGCTTTGTTAGCATCTGC[3′引物](SEQIDNO：36))PCR擴增金黃色葡萄球菌N315的蛋白A(spa)基因組序列，將其克隆到pET15b載體(pYSJ1，密碼子48-486)(Stranger-Jones，等，2006)，並將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中(Studier等，1990)。來自於pYSJ1的蛋白A產物具有融合N端His標籤36-265(MGSSHHHHHHSSGLVPRGS(SEQIDNO：37))的SpA殘基。IPTG誘導表達後，在Ni-NTA樹脂上通過親和層析純化帶有重組的N末端有His6標籤的SpA(Stranger-Jones等，2006)。使用一對特異性引物(AACATATGTTCAACAAAGATCAACAAAGC[5′引物](SEQIDNO：38)和AAGGATCCAGATTCGTTTAATTTTTTAGC[3′引物](SEQIDNO：39))PCR擴增SpA的結構域D(SpA-D)，亞克隆到pET15b載體中(pHAN1，spa密碼子212-261)，然後將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，以表達和純化重組的N末端有His6標籤的蛋白。為了在SpA-D編碼序列中產生突變，合成了兩對引物，(對於D到A替換：CTTCATTCAAAGTCTTAAAGCCGCCCCAAGCCAAAGCACTAAC[5′引物](SEQIDNO：40)和GTTAGTGCTTTGGCTTGGGGCGGCTTTAAGACTTTGAATGAAG[3′引物](SEQIDNO：41)；對於Q到K替換：CATATGTTCAACAAAGATAAAAAAAGCGCCTTCTATGAAATC[5′引物](SEQIDNO：42)和GATTTCATAGAAGGCGCTTTTTTTATCTTTGTTGAACATATG[3′引物](SEQIDNO：43)；對於Q到G替換：CATATGTTCAACAAAGATGGAGGAAGCGCCTTCTATGAAATC[5′引物](SEQIDNO：44)和GATTTCATAGAAGGCGCTTCCTCCATCTTTGTTGAACATATG′[3′引物](SEQIDNO：45)。引物用於快速變化(quick-change)誘變方案。誘變後，對每個重組蛋白的DNA序列進行驗證：SpA、SpA-D和SpA-DQ9，10G；D36，37A和SpA-DQ9，10K；D36，37A。所有蛋白都使用Ni-NTA色譜從重組大腸桿菌裂解物中純化，然後用PBS透析並在4℃保存。為了測量免疫球蛋白與蛋白A及其變體的結合，用柱緩衝液(50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5)將200μg純化的蛋白稀釋到1ml體積，然後上樣到預平衡的Ni-NTA柱(1ml柱床體積)。柱用10ml柱緩衝液清洗。200μg純化的人IgG稀釋到總體積1ml的柱緩衝液中，然後加入到每個已經加載了蛋白A和其變體的柱上。然後用5ml清洗緩衝液(10mM咪唑的柱緩衝液溶液)和5ml柱緩衝液清洗柱。蛋白質樣品用2ml洗脫緩衝液(550mM咪唑的柱緩衝液溶液)洗脫，收集級分，等份樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，然後用考馬斯亮藍染色。如圖3所示，在層析期間野生型蛋白A(SpA)和其SpA-結構域D均截留免疫球蛋白。相反，SpA-DQ9，10K；D36，37A變體沒有結合免疫球蛋白。為了對蛋白A及其變體與免疫球蛋白Fc部分和Fab的VH3結構域的結合進行定量，使用HRP綴合的人免疫球蛋白G[hIgG]、人IgG的Fc部分[hFc]和人IgG的F(ab)2部分[hF(ab)2]以及ELISA分析對結合到蛋白A及其變體上的相對量進行定量。圖4中的數據證明SpA和SpA-D結合hIgG和hFc，而SpA-DQ9，10G；D36，37A和SpA-DQ9，10K；D36，37A僅顯示背景結合活性。SpA結合類似量的hFc和hF(ab)2，但是相比全長SpA，SpA-D與hF(ab)2的結合減少。該結果表明，多個IgG結合結構域的存在可能協同增加了蛋白A結合B細胞受體的能力。當與SpA-D和hF(ab)2的結合力減少相比時，兩個變體中僅SpA-DQ9，10K；D36，37A顯示結合免疫球蛋白VH3結構域能力的顯著下降。為了檢查SpA-D及其變體的產毒特性，將純化的蛋白注射到小鼠體內，經過4小時後處死並取脾。器官組織勻漿後，去除包膜物質，B細胞用螢光CD19抗體染色。然後進行FACS分析對脾組織中B細胞豐度進行定量，觀察到SpA-D導致B細胞計數相比模擬(PBS)對照有5％的下降(圖5)。相反，SpA-DQ9，10K；D36，37沒有導致B細胞計數的下降，表明突變分子喪失了其刺激B細胞增殖和死亡的產毒特性(圖5)。總之，SpA-D殘基Q9、Q10、D36和D37的胺基酸替換破壞了蛋白A結構域在人類和動物組織內結合免疫球蛋白或發揮產毒功能的能力。非產毒蛋白A變體引發疫苗保護。為了測試蛋白A及其變體是否可以發揮疫苗抗原功能，將SpA、SpA-D，SpA-DQ9，10K；D36，37A和SpA-DQ9，10K；D36，37A用弗氏完全或不完全佐劑乳化，在第1天和第11天用50μg純化的蛋白免疫4周齡的BALB/c小鼠。通過在免疫程序之前(第0天)和之後(第21天)對動物取血來分析各組動物(n＝5)對免疫的體液免疫應答。表5表明，經免疫的小鼠僅產生針對野生型蛋白A或其SpA-D組件的溫和體液免疫應答，而用SpA-DQ9，10K；D36，37A或SpA-DQ9，10K；D36，37A免疫後產生的抗體量增加了4到5倍。用1×107CFU金黃色葡萄球菌Newman株靜脈內攻擊後，在第4天處死動物，取其腎並進行葡萄球菌負荷分析(通過將組織勻漿塗布到瓊脂平板上並對菌落形成單位(CFU)進行計數)和組織病理學分析。如所預期的，模擬(PBS)免疫的小鼠(n＝19)在腎組織中有6.461og10(±0.25)CFU，感染病變統計為每個器官(n＝10)3.7(±1.2)個膿腫(表5)。用SpA免疫動物導致在第5天減少2.51log10CFU(P＝0.0003)，每個器官為2.1(±1.2)個膿腫。後一數據表明，膿腫形成沒有顯著減少(P＝0.35)。用SpA-D免疫產生了類似的結果：第5天減少2.03log10CFU(P＝0.0001)，每個器官1.5(±0.8)個膿腫(P＝0.15)。相反，用SpA-DQ9，10K；D36，37A或SpA-DQ9，10G；D36，37A免疫產生增強的保護，在第4天分別減少了3.07l0g10和3.03l0g10CFU(兩組結果均有統計學顯著性P＜0.0001)。此外，用SpA-DQ9，10K；D36，37A和SpA-DQ9，10G；D36，37A兩者免疫對葡萄球菌膿腫形成均產生顯著的保護，每個器官僅發現0.5(±0.4)和0.8(±0.5)個感染病變(P＝0.02和P＝0.04)。因此，用非產毒的蛋白A變體免疫產生對蛋白A的增強的體液免疫應答，並且對葡萄球菌攻擊提供保護性免疫。這些數據表明，蛋白A是預防金黃色葡萄球菌疾病的人疫苗的理想候選物。這些令人興奮的結果對於人疫苗的設計有幾個啟示。首先，產生影響蛋白A的免疫球蛋白結合結構域(單獨或者兩個或多個結構域的組合)的能力的替換突變可以產生適於疫苗開發的非產毒的變體。看起來與蛋白A的結構非常類似的突變IgG結合結構域的組合很可能可以產生更好的體液免疫應答，如本文報導的單獨SpA結構域D。並且，蛋白A特異性抗體的可能的貢獻是，抗原結合位點與微生物表面的相互作用可能可以中和葡萄球菌通過Fc部分捕獲免疫球蛋白或通過VH3結合活性刺激B細胞受體的能力。表5非產毒蛋白A變體作為預防金黃色葡萄球菌病的疫苗抗原a18至20隻BALB/c小鼠的組感染後4天腎組織勻漿中葡萄球菌的負荷平均值，以log10CFUg-1計算。註明了平均值的標準誤(±SEM)。c使用Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。b以log10CFUg-1計算的細菌負荷的減少。d通過目測測量感染後4天腎組織中的膿腫形成(％陽性)e10隻動物的蘇木精-伊紅染色腎超薄切片的組織病理學；記錄每個腎中的膿腫數並平均得到最終平均值(±SEM)。f使用Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。SpA-D1和SpA-D2分別表示SpA-DQ9，10K；D36，37A和SpA-DQ9，10G；D36，37A。鼠膿腫、鼠致命感染和鼠肺炎模型中的疫苗保護。為研究金黃色葡萄球菌感染性疾病建立了三個動物模型。這些模型在此用於檢查蛋白A特異性抗體產生的保護性免疫的水平。鼠膿腫-將純化的蛋白通過肌內注射到BALB/c小鼠(24日齡雌性小鼠，每組8-10隻，CharlesRiverLaboratories，Wilmington，MA)後腿進行免疫(Chang等，2003；Schneewind等，1992)。在第0天(用弗氏完全佐劑1∶1乳化)和第11天(用弗氏不完全佐劑1∶1乳化)施用純化的SpA、SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A(50μg蛋白)。在第0、11和20天通過眼球後取血樣。通過ELISA檢測血清中具有SpA-D和SpA-DQ9，10K；D36，37A特異性結合活性的IgG的效價。免疫的動物在第21天通過眼球後注射100μl金黃色葡萄球菌Newman株或金黃色葡萄球菌USA300懸液(1×107cfu)進行攻擊。為此，金黃色葡萄球菌Newman株的過夜培養物以1∶100稀釋到新鮮胰蛋白腖大豆培養液中，在37℃生長3小時。將葡萄球菌離心，清洗兩次，並稀釋到PBS中使A600值為0.4(每ml1×108cfu)。稀釋液通過瓊脂鋪板和菌落形成進行試驗驗證。小鼠每千克體重腹腔內注射80-120mg開他敏和3-6mg甲苯噻嗪進行麻醉並通過眼球後注射進行感染。在攻擊後第5天或第15天，小鼠通過壓縮CO2吸入法進行安樂死。取腎在1％TritonX-100中勻漿。稀釋等份試樣並塗布瓊脂培養基進行cfu的三次測定。對於組織學檢查，腎組織在10％甲醛中室溫孵育24小時。組織用石蠟包埋，超薄切片，蘇木精-伊紅染色並用顯微鏡檢查。小鼠致命感染-將純化的SpA、SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A(50μg蛋白)通過肌內注射到BALB/c小鼠(24日齡的雌性小鼠，每組8-10隻，CharlesRiverLaboratories，Wilmington，MA)的後腿進行免疫。在第0天(用弗氏完全佐劑1∶1乳化)和第11天(用弗氏不完全佐劑1∶1乳化)施用疫苗。在笫0、11和20天通過眼球後取血收集血樣。通過ELISA檢測血清中具有SpA-D和SpA-DQ9，10K；D36，37A特異性結合活性的IgG效價。免疫的動物在笫21天通過眼球後注射100μl金黃色葡萄球菌Newman株或金黃色葡萄球菌USA300懸液(15×107CFU)進行攻擊(34)。為此，金黃色葡萄球菌Newman株的過夜培養物以1∶100稀釋到新鮮胰蛋白腖大豆培養液中，在37℃生長3小時。將葡萄球菌離心，清洗兩次，並稀釋到PBS中使A600值為0.4(每ml1×108CFU)並濃縮。稀釋液通過瓊脂鋪板和菌落形成進行試驗驗證。小鼠每千克體重腹腔內注射80-120mg開他敏和3-6mg甲苯噻嗪進行麻醉。免疫的動物在第21天通過腹腔內注射2×1010cfu金黃色葡萄球菌Newman株或3-10×109cfu的金黃色葡萄球菌臨床分離株進行攻擊。監測動物14天，並記錄致死疾病情況。鼠肺炎模型-金黃色葡萄球菌Newman株或USA300(LAC)在胰蛋白腖大豆培養液/瓊脂中37℃生長到OD660值達到0.5。50ml等份培養物離心、用PBS清洗並懸浮到750μlPBS中進行死亡率研究(每30μl體積含3-4×108CFU)，或懸浮到1，250μlPBS中(每30μl體積含2×108CFU)進行細菌負荷和組織病理學試驗(2，3)。對於肺部感染，7周齡C57BL/6J小鼠(TheJacksonLaboratory)麻醉後在左鼻孔內接種30μl金黃色葡萄球菌懸液。動物以仰臥體位置於籠中恢復並觀察14天。對於主動免疫，4周齡小鼠在第0天通過肌內途徑接受CFA中的20μgSpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A，然後在第10天用弗氏不完全佐劑(IFA)中的20μgSpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A加強免疫。動物在第21天用金黃色葡萄球菌攻擊。在免疫前以及第20天收集血清，評價特異性抗體的產生。對於被動免疫研究，7周齡小鼠在被攻擊前24小時腹腔內注射接受100μlNRS(正常兔血清)或SpA-D特異性的兔抗血清。為了評價肺炎的病理相關性，感染的動物通過強制CO2吸入處死，然後摘取雙側肺。右側肺勻漿進行肺部細菌負荷計數。左側肺置於1％福馬林中並用石蠟包埋，超薄切片，蘇木精-伊紅染色並用顯微鏡分析。兔抗體-純化的200μgSpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A用作免疫原產生兔抗血清。用CFA乳化200μg蛋白用於第0天注射，然後用IFA乳化200μg蛋白在第21天和第42天注射加強。通過ELISA測定兔抗效價。在SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A瓊脂糖凝膠上用親和層析兔血清獲得純化的抗體。通過A280吸光度測量洗脫的抗體的濃度，並通過ELISA測定特異性抗體效價。用SpA結構域D變體主動免疫。-為了測定疫苗效果，用純化的SpA-D或SpADQ9，10K；D36，37A主動免疫動物。作為對照，單獨用佐劑免疫動物。使用SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A作為抗原測定針對蛋白A製劑的抗體效價；注意SpA-DQ9，10K；D36，37A變體不能結合IgG的Fc或Fab部分。使用上述的感染疾病模型，測量任何細菌負荷的減少(鼠膿腫和肺炎)、葡萄球菌疾病的組織病理學證據(鼠膿腫和肺炎)和對致死疾病的保護(鼠致死攻擊和肺炎)。用針對SpA結構域D變體產生的親和純化的兔多克隆抗體進行被動免疫。為了測定蛋白A特異性兔抗體的保護性免疫，用5mg/kg純化的源自SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A的兔抗體被動免疫小鼠。使用固定化的SpA-D或SpA-DQ9，10K；D36，37A通過親和層析純化這兩種抗體製劑。作為對照，用rV10抗體(鼠疫保護性抗原，對葡萄球菌感染結果沒有影響)被動免疫動物。因為該變體不能結合IgG的Fc或Fab部分，使用SpA-DQ9，10K；D36，37A作為抗原測定針對所有蛋白A製劑的抗體效價。使用上述的感染疾病模型，測量細菌負荷的減少(鼠膿腫和肺炎)、葡萄球菌疾病的組織病理學證據(鼠膿腫和肺炎)和對致死疾病的保護(鼠致死攻擊和肺炎)。實施例2用於耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的非產毒蛋白A疫苗金黃色葡萄球菌的臨床分離株表達蛋白A(Shopsin等，1999)，其初級翻譯產物含有N末端信號肽(DeDent等，2008)、5個Ig-BD(稱為E、D、A、B和C)(Sjodahl，1977)、具有8殘基肽的可變重複序列的區域X(Guss等，1984)以及用於SpA細胞壁錨定的C末端分選信號(Schneewind等，1992；Schneewind等，1995)(圖6)。根據胺基酸同源性(Uhlen等，1984)，IgBD的三α-螺旋束結構(Deisenhofer等，1978；Deisenhofer等，1981)及其與FabVH3(Graille等，2000)或Fcγ(Gouda等，1998)的原子相互作用，選擇穀氨醯胺9和10以及天冬氨酸36和37，因為其分別對於SpA和抗體或B細胞受體的結合非常重要。將Gln9Lys、Gln10Lys、Asp36Ala和Asp37Ala替換引入結構域D產生SpA-DKKAA(圖6)。用親和層析分析分離的SpA-D或SpA-DKKAA結合人IgG的能力(圖6)。有多聚組氨酸標籤的SpA-D以及全長SpA將人IgG截留在Ni-NTA上，而SpA-DKKAA和陰性對照(SrtA)則不能(圖6)。對vonWillebrand因子(Hartleib等，2000)也觀察到類似的結果，vonWillebrand因子與腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)(Gomez等，2004)一起也可以通過穀氨醯胺9和10結合蛋白A(圖6)。人免疫球蛋白包括60-70％的VH3型IgG。本發明人區分了Ig的Fc結構域和B細胞受體活化，並測量了人Fcγ和F(ab)2片段的結合，兩者均結合全長SpA或SpA-D但是不結合SpA-DKKAA(圖6)。將SpA-D注射小鼠腹腔造成BALB/c小鼠脾組織中B細胞擴增，隨後發生CD19+淋巴細胞凋亡性破壞(GoodyearandSilverman，2003)(圖6)。注射SpA-DKKAA沒有觀察到B細胞超抗原活性，而注射SpA或SpA-D之後TUNEL染色的脾組織也沒有檢測到凋亡細胞增加(圖6)。6周齡未免疫BALB/c小鼠分別注射CFA乳化的50μg純化的SpA、SpA-D或SpA-DKKAA，並用IFA乳化的同樣抗原進行加強。本發明人觀察到與SpA-D促進經活化純系B細胞群的凋亡性破壞的假說符合，用非產毒變體免疫小鼠後產生的SpA-DKKAA特異性抗體效價與B細胞超抗原相比高10倍(Spa-D相比於SpA-DKKAAP＜0.0001，表6)。用全長SpA免疫產生的抗體效價比用SpA-D引發的抗體效價高(P＝0.0022)，這可能是由於SpA抗原的體積較大和其重複的結構域結構(表6)。但是，甚至SpA引發的抗體效價也低於SpA-DKKAA(P＝0.0003)，後者僅包括蛋白A(520個殘基，SEQIDNO：33)的50個胺基酸。免疫的小鼠通過靜脈內接種金黃色葡萄球菌Newman株接受攻擊，攻擊後4天屍檢檢查葡萄球菌在腎組織中形成膿腫的能力。在模擬免疫(PBS/佐劑)的小鼠勻漿的腎組織中，平均葡萄球菌負荷計為6.46log10CFUg-1(表6)。用SpA或SpA-D免疫小鼠導致葡萄球菌負荷降低，但是SpA-DKKAA免疫的小鼠表現的更明顯，腎組織中金黃色葡萄球菌Newman株負荷減少了3.07log10CFUg-1(P＜0.0001，表6)。通過組織病理學分析腎中膿腫形成(圖7)。模擬免疫的動物每個腎平均具有3.7(±1.2)個膿腫(表6)。用SpA-DKKAA免疫將平均膿腫數降低到0.5(±0.4)(P＝0.0204)，而用SpA或SpA-D免疫沒有造成膿腫病變數的顯著降低(表6)。SpA-DKKAA免疫的動物的病變大小較小，具有較少的PMN浸潤和特徵性缺少的葡萄球菌膿腫群(Cheng等，2009)(圖7)。用SpA或SpA-D免疫的動物中的膿腫相比模擬免疫的動物顯示同樣的總體病變結構(圖7)。本發明人檢查了SpA-DKKAA免疫是否能夠針對MRSA菌株保護小鼠，並選擇USA300LAC分離株用於攻擊動物(Diep等，2006)。這種高毒性的CA-MRSA菌株在美國迅速傳播，導致嚴重的人發病率和死亡率(Kennedy等，2008)。相比佐劑對照小鼠，SpA-DKKAA免疫的動物在感染的腎組織中細菌負荷降低了1.07log10CFUg-1。金黃色葡萄球菌USA300攻擊後，腎組織的組織病理學檢查發現膿腫的平均數從4.04(±0.8)下降到1.6(±0.6)(P＝0.02774)。相反，SpA或SpA-D免疫沒有導致細菌負荷或膿腫形成的顯著降低(表6)。兔用SpA-DKKAA免疫，並且用SpA-DKKAA親和柱純化特異性抗體，然後進行SDS-PAGE(圖8)。SpA-DKKAA特異性IgG用胃蛋白酶切割產生Fcγ和F(ab)2片段，後者用SpA-DKKAA柱層析純化(圖8)。人IgG或vWF與SpA或SpA-D的結合被SpA-DKKAA特異性F(ab)2幹擾，表明SpA-DKKAA產生的抗體中和蛋白A的B細胞超抗原功能以及其與Ig的相互作用(圖8)。為了進一步改進非產毒蛋白A的疫苗特性，本發明人生成了SpAKKAA，其包括所有5個IgBD，並在5個結構域中(E、D、A、B和C)每個均具有4個胺基酸替換-對應結構域D的Gln9Lys、Gln10Lys、Asp36Ala和Asp37Ala替換。通過親和層析純化多聚組氨酸標籤化的SpAKKAA，並用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析(圖9)。與全長SpA不同，SpAKKAA不結合人IgG、Fc和F(ab)2或vWF(圖9)。SpAKKAA不顯示B細胞超抗原活性，因為將該變體注射到BALB/c小鼠中沒有導致脾組織中CD19+B細胞耗盡(圖9)。SpAKKAA免疫產生比SpA-DKKAA免疫更高的特異性抗體效價，為小鼠提供更高的針對金黃色葡萄球菌USA300攻擊的保護(表6)。攻擊後4天，SpAKKAA接種的動物腎組織中葡萄球菌負荷降低了3.54log10CFUg-1(P＝0.0001)，並且還使膿腫病變數的更大的降低(P＝0.0109)(表6)。使用SpAKKAA免疫兔。對SpA-DKKAA或SpAKKAA特異的兔抗體存有固定化的相應抗原的基質上親和純化，並以5mgkg-1體重的濃度注射到BALB/c小鼠腹腔內(表7)。24小時後，測定血清中的特異性抗體效價，並且通過靜脈內接種金黃色葡萄球菌Newman株對動物進行攻擊。對於SpA-DKKAA(P＝0.0016)或SpAKKAA(P＝0.0005)特異性抗體，被動轉移降低了腎組織中葡萄球菌負荷。在組織病理學檢查中，兩種抗體均減少了被金黃色葡萄球菌Newman株攻擊的小鼠腎中膿腫病變的豐度(表7)。所有這些數據揭示用SpA-DKKAA或SpAKKAA免疫後的疫苗保護作用是由中和蛋白A的抗體賦予的。表6.用蛋白A疫苗免疫小鼠a每種免疫的15至20隻BALB/c小鼠的組感染後4天腎組織勻漿中葡萄球菌的負荷平均值，以log10CFUg-1計算。顯示了2組獨立且可重複的動物實驗的代表性結果。註明了平均值的標準誤(±SEM)。b使用未配對雙尾Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。c以log10CFUg-1計算的細菌負荷的減少。d在葡萄球菌感染前通過ELISA測量5個隨機選擇的血清IgG效價的平均值。e10隻動物的蘇木精-伊紅染色腎超薄切片的組織病理學；記錄每個腎中的膿腫平均數並再平均得到最終平均值(±SEM)。表7.用針對蛋白A的抗體被動免疫小鼠a在用1×107CFU的金黃色葡萄球菌Newman株靜脈內攻擊前24小時將親和純化的抗體以5mgkg-1的濃度注射到BALB/c小鼠腹腔中。b感染後4天沒種免疫的15隻BALB/c小鼠的組的腎組織勻漿中葡萄球菌的負荷平均值，以log10CFUg-1計算。顯示了2組獨立且可重複的動物實驗的代表性結果。註明了平均值的標準誤(±SEM)。c使用未配對雙尾Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。d以log10CFUg-1計算的細菌負荷的減少。e在葡萄球菌感染前通過ELISA測量5個隨機選擇的血清IgG滴度的平均值。f10隻動物的蘇木精-伊紅染色腎超薄切片的組織病理學；記錄每個腎中膿腫的平均數並再平均得到最終的平均值(±SEM)。葡萄球菌感染或SpAKKAA免疫後對蛋白A的免疫應答。用毒性金黃色葡萄球菌感染後，小鼠沒有產生針對同一菌株後續感染的保護性免疫(Burts等，2008)(圖10)。通過斑點印跡測定這些動物中SpA-DKKAA特異性IgG的平均豐度對於Newman株和USA300LAC株分別為0.20μgml-1(±0.04)和0.14μgml-1(±0.01)(圖9)。在SpAKKAA或SpA-DKKAA接種的動物中產生疾病保護(腎組織中葡萄球菌CFUg-1減少P.0.05log10)所需的蛋白A特異性IgG的最低濃度計算為4.05μgml-1(±0.88)。在成年健康人體志願者(n＝16)中SpA特異性IgG的平均血清濃度為0.21μgml-1(±0.02)。因此，小鼠或人的金黃色葡萄球菌感染與產生高水平的針對蛋白A之中和抗體的免疫應答無關，這可能由於該分子的B細胞超抗原特性。相反，人志願者中白喉毒素特異的IgG的平均血清濃度0.068μgml-1(±0.20)在抗白喉的保護性免疫範圍之內(Behring，1890；Lagergard等，1992)。金黃色葡萄球菌臨床分離株表達關鍵的毒性因子蛋白A，其B細胞超抗原活性和逃避調理細胞吞噬(opsono-phagocytic)清除的特性是葡萄球菌膿腫形成絕對需要的(Palmqvist等，2005；Cheng等，2009；SilvermanandGoodyear，2006)。因此認為蛋白A可以是致病必需的毒素，為了獲得保護性免疫必須中和其分子特性。通過產生不能通過Fcγ或VH3-Fab結構域結合Ig的非產毒變體，本發明人首次測量中和蛋白A的免疫應答與針對金黃色葡萄球菌感染的保護性免疫之間的聯繫。與很多甲氧西林敏感性菌株不同，CA-MRSA分離株USA300LAC的毒性明顯更高(Cheng等，2009)。例如用表面蛋白IsdB(Kuklin等，2006；Stranger-Jones等，2006)免疫實驗動物產生抗體能夠針對金黃色葡萄球菌Newman株提供保護(Stranger-Jones等，2009)，但是不能針對USA300菌株的攻擊。所使用的方法包括：菌株和培養。金黃色葡萄球菌Newman株和USA300株在37℃培養於胰蛋白腖大豆培養液(TSB)。大腸桿菌菌株DH5α和BL21(DE3)在37℃生長於添加100μgml-1氨苄青黴素的Luria-Bertani(LB)培養基。兔抗體。使用金黃色葡萄球菌Newman株模板DNA，用兩條引物gctgcacatatggcgcaacacgatgaagctcaac(SEQIDNO：35)和agtggatccttatgcttgagctttgttagcatctgc(SEQIDNO：36)使用PCR擴增SpA的編碼序列。用兩條引物aacatatgttcaacaaagatcaacaaagc(SEQIDNO：38)和aaggatccagattcgtttaattttttagc(SEQIDNO：39)PCR擴增SpA-D。SpA-DKKAA的序列用兩套引物進行誘變，catatgttcaacaaagataaaaaaagcgccttctatgaaatc(SEQIDNO：42)和gatttcatagaaggcgctttttttatctttgttgaacatatg(SEQIDNO：43)用於Q9K，Q10K，cttcattcaaagtcttaaagccgccccaagccaaagcactaac(SEQIDNO：40)和gttagtgctttggcttggggcggctttaagactttgaatgaag(SEQIDNO：41)用於D36A，D37A。在IntegratedDNATechnologies，Inc.合成SpAKKAA的序列。PCR產物克隆到pET-15b中產生N末端His6標籤化的重組蛋白。質粒轉化到BL21(DE3)中。轉化子的過夜培養物按1∶100稀釋到新鮮培養基中，並在37℃生長到OD6000.5，此時用1mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導培養物並繼續培養3個小時。離心沉澱細菌細胞，用柱緩衝液(50mMTris-HCI，pH7.5，150mMNaCl)懸浮，並用Frenchpressurecell在14,000psi下破碎細胞。在40,000×g超速離心去除裂解物的膜和不溶組分。可溶裂解物中的蛋白質用鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA，Qiagen)親和層析。蛋白質用含有連續遞增濃度的咪唑(100-500mM)的柱緩衝液洗脫。用二辛可寧酸(BCA)測定(ThermoScientific)測定蛋白濃度。對於抗體的產生，用弗氏完全佐劑(Difco)乳化的500μg蛋白通過囊膜注射免疫兔(6月齡紐西蘭白雌兔，CharlesRiverLaboratories)。對於加強免疫，蛋白用弗氏不完全佐劑乳化，並在初始免疫後24或48天注射。在第60天，對兔取血並回收血清。純化的抗原(5mg蛋白)共價連接到HiTrapNHS活化的HP柱(GEHealthcare)。用抗原基質在4℃親和層析10-20ml兔血清。結合後的基質用50倍柱體積的PBS清洗，用洗脫緩衝液(1M甘氨酸，pH2.5，0.5MNaCl)洗脫抗體，並立即用1MTris-HCl，pH8.5中和。純化的抗體在4℃用PBS透析過夜。F(ab)2片段。親和純化的抗體與3mg胃蛋白酶在37℃下混合30分鐘。用1MTris-HCI，pH8.5中止反應，用綴合特異性抗原的HiTrapNHS活化的HP柱親和純化F(ab)2片段。純化的抗體用PBS在4℃透析過夜，上樣到SDS-PAGE凝膠並通過考馬斯亮藍染色觀察。主動和被動免疫。用弗氏完全佐劑(Difco)乳化的50μg蛋白肌內注射免疫BALB/c小鼠(3周齡，雌性，CharlesRiverLaboratories)。對於加強免疫，蛋白用弗氏不完全佐劑乳化，並在初始免疫後11天注射。在免疫後第20天，對5隻小鼠取血獲得血清並用酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定特異性抗體效價。在經金黃色葡萄球菌攻擊前24小時，將PBS中的親和純化抗體以5mg/kg實驗動物重量的濃度注射到BALB/c小鼠(6周齡，雌性，CharlesRiverLaboratories)腹腔中。通過眼眶靜脈穿刺收集動物血液。通過肝素化微量紅細胞壓積毛細管(Fisher)移除血細胞並使用Z-凝膠血清分離微管(Z-gelserumseparationmicrotube，Sarstedt)收集並通過ELISA測量抗原特異性抗體效價。小鼠腎膿腫。金黃色葡萄球菌Newman株或USA300(LAC)株的過夜培養物按1∶100稀釋到新鮮TSB中並在37℃培養2小時。沉澱葡萄球菌，清洗並用PBS懸浮達到OD6000.4(～1×108CFUml-1)。在TSA上塗布等份樣品並計數形成菌落來對接種物進行定量。BALB/c小鼠(6周齡，雌性，CharlesRiverLaboratories)每千克體重腹腔內注射100mgml-開他敏和20mgml-1甲苯噻嗪進行麻醉。用1×107CFU金黃色葡萄球菌Newman株或5x106CFU金黃色葡萄球菌USA300株眼球後注射感染小鼠。在攻擊後第4天，用CO2吸入法處死小鼠。取兩腎，通過在PBS，1％TritonX-100中勻漿腎組織分析單個器官中葡萄球菌負荷。將勻漿的系列稀釋液塗布TSA並孵育進行菌落形成。剩餘的器官進行組織病理學檢查。簡言之，腎在室溫下用10％福馬林固定24小時。組織用石蠟包埋，超薄切片，蘇木精-伊紅染色並用光學顯微鏡檢查以對膿腫病變計數。所有的小鼠實驗都在芝加哥大學的生物安全委員會(IBC)和動物管理和使用委員會(IACUC)對實驗技術方案進行審查和批准之後，根據機構指導進行。蛋白A結合。對於人IgG結合，Ni-NTA親和柱用柱緩衝液中的200μg純化的蛋白(SpA、SpA-D、SpA-DKKAA和SrtA)預加載。清洗後，將200μg人IgG(Sigma)加載到柱上。從清洗和洗脫液中收集蛋白樣品，用SDS-PAGE凝膠電泳，然後考馬斯亮藍染色。用1μgml-1濃度的純化蛋白(SpA、SpAKKAA、SpA-D和SpA-DKKAA)的0.1M碳酸緩衝液(pH9.5)包被MaxiS0rpELISA板(NUNC)，在4℃下孵育過夜。然後用5％全乳封閉板，用系列稀釋的過氧化物酶綴合的人IgG、Fc或F(ab)2片段孵育一小時。清洗平板，並用OptEIAELISA試劑(BD)顯色。用1M磷酸中止反應，使用A450讀數計算半數最大效價和結合百分比。vonWillebrand因子(vWF)結合測定。純化的蛋白(SpA、SpAKKAA、SpAD和SpA-DKKAA)按照上文所述包被和封閉。平板與1μgml-1人vWF孵育2小時，然後清洗並用人IgG再封閉1小時。清洗後，平板用系列稀釋的過氧化物酶綴合的抗人vWF抗體孵育1小時。清洗平板，並用OptEIAELISA試劑(BD)顯色。用1M磷酸中止反應，使用A450讀數計算半數最大效價和結合百分比。對於抑制測定，平板與10μgml-1濃度的親和純化的SpADKKAA特異性的F(ab)2片段孵育1小時，然後進行配體結合測定。脾細胞凋亡。親和純化的蛋白(150μg的SpA、SpA-D、SpAKKAA和SpA-DKKAA)注射到BALB/c小鼠腹腔內(6周齡，雌性，CharlesRiverLaboratories)。注射4小時後，用CO2吸入法處死動物。取脾並勻漿。用細胞濾器去除細胞碎片，懸浮的細胞轉移到ACK裂解緩衝液中(0.15MNH4Cl，10mMKHCO3，0.1mMEDTA)以裂解紅細胞。離心沉澱白細胞，懸浮於PBS並在冰上用1∶250稀釋的R-PE綴合的抗CD19單克隆抗體(Invitrogen)染色，在黑暗處放置1小時。細胞用1％FBS清洗並用4％福馬林在4℃固定過夜。第二天，細胞用PBS稀釋並用流式細胞儀分析。剩餘的器官進行組織病理學檢查。簡言之，脾在室溫下用10％福馬林固定24小時。組織用石蠟包埋，超薄切片，用凋亡檢測試劑盒(Millipore)染色並用光學顯微鏡檢查。抗體定量。從曾被金黃色葡萄球菌Newman株或USA300株感染30天或者曾被SpA-DKKAA/SpAKKAA如上文所述免疫的健康人體志願者或BALB/c小鼠中收集血清。人/小鼠IgG(JacksonImmunologyLaboratory)、SpAKKAA和CRM197印跡到硝酸纖維素膜上。膜用5％全乳封閉，然後用人或小鼠血清孵育。通過OdysseTM紅外成像系統(Li-cor)使用IRDye700DX綴合的親和純化的抗人/小鼠IgG(Rockland)對信號強度定量。涉及使用人志願者的血的試驗的技術方案的審查、批准和執行均在芝加哥大學的審查委員會(IRB)的監管下進行。統計學分析。使用雙尾Student’st檢驗來分析腎膿腫、ELISA和B細胞超抗原數據的統計學顯著性。實施例3使用包含多種抗原的亞單位疫苗進行主動免疫BALB/c小鼠(n＝18-20)用PBS/佐劑模擬免疫或注射25μg的每種抗原(Combo1，ClfA+SdrD+FnBPB；Combo2，Combo1+SpAKKAA)。通過靜脈內接種1×107CFU金黃色葡萄球菌Newman株攻擊免疫小鼠。在攻擊後第4天(圖13A)和第18天(圖13B)檢查腎組織中的細菌負荷。用未配對雙尾Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。Combo1和Combo2顯示出在攻擊後第4天和18天細菌負荷顯著減少。基因疫苗學鑑定金黃色葡萄球菌的保護性抗原。由基因疫苗學鑑定的推定保護性抗原是具有C端LPXTG分選信號的分選酶A錨定表面蛋白。先前的工作評估了表面蛋白對鼠膿腫模型中的疾病發病和疫苗保護的作用。SdrD或clfA(而不是fnbpB或sasF)的突變降低了感染腎組織中的葡萄球菌負荷。當將純化的SdrD或ClfA(不是SasF或FnBPB)用作單一亞單位疫苗抗原時，其引發IgG免疫應答，使得葡萄球菌負荷顯著減少。FnBPB是FnBPA的同源物(60％序列同一性)並且已知兩種多肽結合纖連蛋白和纖維蛋白原。仍未評估兩種表面蛋白對疾病病原體的作用和保護性免疫的作用，這促進了將FnBPB與ClfA和SdrD包含於組合疫苗中(Combo1)。先前的工作鑑定了作為保護性抗原的非產毒蛋白A(SpAKKAA)，其引發針對SpA的Fcγ和FabVH3結合B細胞超抗原屬性的中和IgG應答。本發明人將SpAKKAA與ClfA、FnBPB和SdrD包含於抗原混合物中(Combo2)。用完全弗氏佐劑乳化的Combo1或2免疫動物並且用不完全弗氏佐劑乳化的相同抗原混合物加強免疫，產生特異性IgG應答。用金黃色葡萄球菌Newman株靜脈內攻擊後，觀察到在用野生型金黃色葡萄球菌Newman株攻擊後第四天，對於兩種疫苗，細菌負荷顯著減少(圖14，表8)。為了監測疫苗製劑防止葡萄球菌持久性的能力，在攻擊後18天還對免疫動物進行了分析(圖14，表8)。同樣，用Combo1或2免疫賦予了針對持久性金黃色葡萄球菌Newman株感染的保護。還評估了疫苗接種後抗體效價並且這些分析結果示於下表9中。表8.用抗原組合主動免疫防止葡萄球菌膿腫形成a每種免疫的20隻BALB/c小鼠的組感染後4天或18天腎組織勻漿中葡萄球菌的負荷平均值，以log10CFUg-1計算。Combo1由經親和純化的重組ClfA、SdrD和FnBPB構成。Combo2包含一種另外的抗原SpAKKAA。顯示了兩組獨立動物實驗的代表性數據。註明了平均值的標準誤(±SEM)。b使用未配對雙尾Student’st檢驗計算統計學顯著性並記錄P值；認為P值＜0.05有顯著性。c以log10CFUg-1計算的細菌負荷的減少。d蘇木精-伊紅染色腎超薄切片的組織病理學；記錄每個腎中的膿腫平均數並再平均得到最終平均值(±SEM)。表9.對葡萄球菌亞單位疫苗的體液免疫應答a在葡萄球菌感染前使用單種抗原通過ELISA測量5個隨機選擇的血清IgG效價的平均值(±SEM)。對抗葡萄球菌敗血症的疫苗保護。當病原體在血液中或心內組織中複製時，金黃色葡萄球菌感染的死亡率極大增加。本發明人進行了研究以確定combo1和2是否針對致死性金黃色葡萄球菌Newman株的攻擊對動物提供。所有的模擬免疫動物在四天內死於攻擊(圖15)。相比之下，Combo1免疫的小鼠展現出死亡時間延遲或在致死攻擊中存活(圖15)。經Combo2免疫的小鼠展現出進一步的保護性免疫增加和死亡時間延遲(圖15)。因此，針對ClfA、FnBPA、SdrD和SpA的抗體的組合產生對葡萄球菌膿腫形成和致死攻擊的顯著保護。細菌菌株和培養條件。在37℃在胰酶大豆瓊脂或培養液中培養葡萄球菌。在37℃在Luria瓊脂或培養液中培養大腸桿菌菌株DH5α和BL21(DE3)(Studier等，(1990)MethodsEnzymol.185，60-89)。氨苄青黴素(100μgml-1)、紅黴素(200μgml-1)和大觀黴素(200μgml-1)分別用於pET15b(Studier等，(1990)MethodsEnzymol.185，60-89)、轉座子突變體(Bae等，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101，12312-12317)和蛋白A突變體(Kim等，JExpMed207，1863-70)的選擇。突變形成。將來自Phoenix文庫的Bursaaurealis小轉座子插入物轉導入金黃色葡萄球菌Newman株。如之前所述通過等位基因替換使金黃色葡萄球菌Newman株染色體上的spa基因缺失。克隆和純化。使用金黃色葡萄球菌Newman株模板DNA對ClfA、SdrD和FnBPB的編碼序列進行PCR擴增(Stranger-Jones等，(2006)Proc.Nat.Acad.Sci.USA103，16942-16947)。將PCR產物克隆到pET15b中以表達具有N端His6-標籤融合物的重組蛋白質。之前描述了非產毒蛋白A的克隆(Kim等，JExpMed207，1863-70)。將質粒轉化到BL21(DE3)中。將轉化子的過夜培養物以1∶100稀釋到新鮮培養基中並在37℃生長至OD6000.5，此時用1mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導培養物並使其再生長三小時。細菌細胞經離心沉澱，懸於柱緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl)中，並用弗氏壓碎器(Frenchpressurecell)在14,000psi下破壞。通過在40,000×g下超速離心清除溶解產物的膜和不溶性組分。使可溶溶解產物中的蛋白質進行鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA，Qiagen)親和色譜。以包含濃度遞增的咪唑(100-500mM)的柱緩衝液洗脫蛋白質。通過二喹啉甲酸(bicinchonicacid，BCA)測定(ThermoScientific)測定蛋白質濃度。減毒活疫苗和腎膿腫模型。將金黃色葡萄球菌Newman株及其同基因突變體的過夜培養物以1∶100稀釋到新鮮TSB中並在37℃生長2小時。將葡萄球菌沉澱，清洗並以OD6000.4(～1×108CFUml-1)懸於PBS中。通過將樣品等分試樣塗布到TSA上並計算菌落形成來定量接種物。通過每千克體重經腹膜內注射100mgml-1氯胺酮和20mgml-1甲苯噻嗪使BALB/c小鼠(4周齡，雌性，CharlesRiverLaboratories)麻醉。通過眶後注射使小鼠感染100μl細菌懸液(1×107CFU)。在注射後第19天，用抗生素(水中氨苄青黴素(1mgml-1)和氯黴素(1mgml-1)的混合物)處理小鼠的組3天。在第26天，通過眶後注射100μl金黃色葡萄球菌Newman株(1×107CFU)來攻擊小鼠或使其流血以分析針對抗原基質組分的獲得性免疫應答。在初次感染後第18和30天通過CO2吸入處死動物。移出兩隻腎臟，並通過用PBS，0.1％TritonX-100勻漿化腎組織來分析右腎中的葡萄球菌負荷。將勻漿的系列稀釋液塗布到TSA或包含抗生素的TSA上並孵育以形成菌落。通過組織病理學檢查左腎。簡言之，在室溫下用10％福馬林固定腎臟24小時。將組織包埋到經蘇木精-伊紅染色的石蠟超薄切片中，然後通過光學顯微鏡觀察以對膿腫損傷進行計數。另外，通過心臟穿刺收集超免疫血清並針對抗原基質的組分進行分析。所有的小鼠實驗都根據遵循機構生物安全委員會(InstitutionalBiosafetyCommittee，IBC)和機構動物保健和使用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee，IACUC)評審和批准的實驗方案的機構指導進行。主動免疫。用完全弗氏佐劑(Difco)乳化的25μg蛋白質通過肌內注射來免疫BALB/c小鼠(3周齡，雌性，CharlesRiverLaboratories)。對於加強免疫，將蛋白質乳化在不完全弗氏佐劑中並在初次免疫後第11天注射。在免疫後第20天，對5隻小鼠進行取血以得到血清，以通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定特異性抗體效價。在第21天，用1×107CFU金黃色葡萄球菌Newman株攻擊所有小鼠。攻擊後第4天和18天，在屍檢過程中取出腎臟，並分析腎組織的葡萄球菌負荷或組織病理學。另外，通過心臟穿刺收集超免疫血清並針對葡萄球菌抗原基質進行分析。抗體定量。對於抗原基質，用2μg經Ni-NTA親和純化的重組His6標記的葡萄球菌蛋白質的收集物印跡硝基纖維素膜。通過OdysseTM對小鼠血清中的信號強度進行定量並使用抗His6抗體進行歸一化。統計學分析。使用雙尾Student’st檢驗來分析統計學顯著性。使用GraphpadPrism進行線性回歸分析。參考文獻下列參考文獻通過引用具體地併入本文中，從而使得它們提供示例性方法或其它細節，以補充本文所述內容。美國專利3,791,932美國專利3,949,064美國專利4,174,384美國專利4,338,298美國專利4,356,170美國專利4,367,110美國專利4,372,945美國專利4,452,901美國專利4,474,757美國專利4,554,101美國專利4,578,770美國專利4,596,792美國專利4,599,230美國專利4,599,231美國專利4,601,903美國專利4,608,251美國專利4,683,195美國專利4,683,202美國專利4,684,611美國專利4,690,915美國專利4,690,915美國專利4,748,018美國專利4,800,159美國專利4,879,236美國專利4,952,500美國專利5,084,269美國專利5,199,942美國專利5,221,605美國專利5,238,808美國專利5,302,523美國專利5,310,687美國專利5,322,783美國專利5,384,253美國專利5,464,765美國專利5,512,282美國專利5,512,282美國專利5,538,877美國專利5,538,880美國專利5,548,066美國專利5,550,318美國專利5,563,055美國專利5,580,859美國專利5,589,466美國專利5,591,616美國專利5,610,042美國專利5,620,896美國專利5,648,240美國專利5,656,610美國專利5,702,932美國專利5,736,524美國專利5,780,448美國專利5,789,215美國專利5,801,234美國專利5,840,846美國專利5,843,650美國專利5,846,709美國專利5,846,783美國專利5,849,497美國專利5,849,546美國專利5,849,547美國專利5,858,652美國專利5,866,366美國專利5,871,986美國專利5,916,776美國專利5,922,574美國專利5,925,565美國專利5,925,565美國專利5,928,905美國專利5,928,906美國專利5,932,451美國專利5,935,819美國專利5,935,825美國專利5,939,291美國專利5,942,391美國專利5,945,100美國專利5,958,895美國專利5,981,274美國專利5,994,624美國專利6,00,8341美國專利6,288,214美國專利6,294,177美國專利6,651,655美國專利6,656,462美國專利6,733,754美國專利6,756,361美國專利6,770,278美國專利6,793,923美國專利6,814,971美國專利6,936,258美國專利申請2002/0169288美國專利申請2003/0153022Abdallahetal.，Mol.Microbiol.，62，667-679，2006.Abdallahetal.，Nat.Rev.Microbiol.，5，883-891，2007.Albusetal.，Infect.Immun.，59：1008-1014，1991.An，J.Virol.，71(3)：2292-302，1997.Anavi，Sc.thesisfromthedepartmentofMolecularMicrobiologyandBiotechnologyoftheTel-AvivUniversity，Israel，1998.Andersenetal.，J.Immunol.，154，3359-3372，1995.Angeletal.，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