一種基於銀增強的甲羥孕酮的檢測方法
2023-11-03 12:36:37 1
專利名稱：一種基於銀增強的甲羥孕酮的檢測方法
技術領域：
一種基於銀增強的甲羥孕酮的檢測方法，屬於分析化學技術領域。
背景技術：
食品安全問題是關係國計民生的大問題。近年來，食品安全事件頻繁發生，對食品 安全檢測人員提出了更高的要求。ELISA以及金標試紙條的出現，一定程度上極大地解決了 食品安全快速現場檢測的需求。然而，隨著科技的進步，對於食品中超痕量的有毒有害物質 的檢驗，仍然沒有得到很好的解決。諸如液相色譜，氣相色譜能夠在一定程度上滿足超靈敏 檢測，但由於昂貴的價格及專業的操作要求，使得不能很好的滿足現場快速超靈敏檢測的 要求。納米技術的快速發展及在各個領域的廣泛運用產生了很多交叉學科的新技術。美 國的Mirkin等人利用金納米粒子的獨特的光學性質，建立了基於金納米粒子的比色分析 法。國內的樊春海等人利用金納米粒子的標記作用，建立了基於金納米粒子的電化學檢測 方法。美國哈佛醫學院建立了基於磁性納米粒子的核磁共振免疫分析方法，實現了高通量 超靈敏檢測。到目前，仍未見將納米技術與ELISA技術結合的檢測方法。本發明報導了將 納米標記技術與傳統的ELISA技術相結合的超靈敏檢測方法的建立。研究結果表明基於金 納米粒子標記及後續的銀沉積增強的研究，能夠很好地提高檢測靈敏度，從而為食品安全 檢測提供了行之有效的超靈敏檢測新方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種基於納米金標記及銀沉積增強的超靈敏食品安全檢測 方法。本發明的技術方案一種基於銀增強的甲羥孕酮的檢測方法，基於膠體金標記及 銀沉積增強檢測信號的超靈敏檢測方法，共分5個步驟(1)膠體金的製備，(2)抗體的膠 體金標記，(3)膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定，(4)建立標準曲線，(5)實現實際樣品 中甲羥孕酮MPA的檢測；
(1)膠體金的製備
向處理過的乾淨的三角燒瓶中加入50 mL質量濃度為0. 01%的氯金酸溶液，攪拌，加 熱至沸騰，保持5min ；—次性加入質量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，邊加熱保持沸騰邊 攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍黑色，至深藍黑色最後變成酒紅色，當顏色不再變化 後，繼續加熱沸騰15 min使反應充分完全；最後，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，加蒸 餾水定容到50mL，得膠體金溶液，4°C保藏備用；
利用Frens法製備18nm左右的膠體金，此法簡便，粒徑均勻；
(2)抗體的膠體金標記
用0. IM的1(20)3溶液調節膠體金溶液的pH值為9.0，然後向其中加入羊抗兔二抗抗體， 使羊抗兔二抗抗體的濃度為100 μ g/mL,並在室溫下反應4h後，離心並重新分散於0. OlMPH7. 4的PBS緩衝溶液中，得50 μ g/mL的金標羊抗兔二抗，4°C保存備用；
(3)膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定
用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C過夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包 被原；用含1% BSA的0. 01 M PBS封閉96孔板，在37°C孵育Ih，用PBST溶液洗板3次；向 96孔中加入不同濃度MPA的標準溶液或實際樣品溶液，加MPA的兔一抗，並在37°C孵育池； 用PBST溶液洗板5次後，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金標羊抗兔二抗，在37°C條件下 孵育池；用PBST溶液3次洗板之後，每孔加入100 μ L的銀還原體系反應30min，用PBST溶 液洗板5次後，向每孔加入200 μ L的濃硝酸，然後震蕩反應池，提取每孔的銀溶液後，用原 子吸收光譜進行定量分析；
所述銀還原體系由(a)質量濃度洲的明膠溶液6mL，(b)質量濃度5. 7%對苯二酚 3mL，(c) pH 3.5檸檬酸緩衝液lmL，和(d)質量濃度洲AgNO3溶液200 μ L四種溶液組 成的銀還原體系；
(4)建立標準曲線根據步驟(3)所述由原子吸收光譜測定的銀的濃度值，建立MPA的 濃度與銀的濃度值(吸光度值)之間的關係，建立標準曲線；
(5)實現實際樣品中MPA的檢測步驟(3)中的由實際樣品溶液所測得的銀的濃度值 (吸光度值)與標準曲線對照，確定實際樣品中MPA的濃度。本發明的有益效果本發明是在ELISA方法的基礎上，利用金標記二抗代替傳統 的酶標二抗，然後再利用銀沉積在金納米粒子的表面增強最後的檢測信號，將沉積在金納 米粒子表面的銀溶解後，通過原子吸收光譜實現溶液中銀含量的定量檢測，從而實現樣品 中有毒有害物質的超靈敏檢測。該方法在傳統的ELISA基礎上進行改進，基於快速超靈敏 等特點，在食品安全檢測等領域具有廣泛的應用潛力。
圖 1 15nm 金的 TEM 圖。圖2檢測標準曲線。
具體實施例方式實施例1
(1)膠體金的製備
向處理過的乾淨的三角燒瓶中加入50 mL濃度為0. 01%的氯金酸溶液，攪拌，加熱至沸 騰，保持5min，一次性加入1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色依 次變成淺藍黑色，至深藍黑色最後變成酒紅色，當顏色不再變化後，繼續加熱15 min使反應 充分完全。最後，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，定容到50mL，4°C保藏備用。用TEM進 行粒徑表徵。(2)抗體的膠體金標記
用0. IM的1(20)3溶液調節膠體金溶液的PH值為9.0，然後向其中加入羊抗兔二抗抗體， 使羊抗兔二抗抗體的濃度為100 μ g/mL,並在室溫下反應4h後，離心並重新分散於0. OlM PH7. 4的PBS緩衝溶液中，得50 μ g/mL的金標羊抗兔二抗，4°C保存備用；
(3)用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C過夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包被原。用含1% BSA的0. 01 M PBS封閉96孔板，在37°C孵育lh。用PBST溶液洗板3 次。向96孔中加入不同濃度MPA的標準溶液或實際樣品溶液，加MPA的兔一抗，並在37°C 孵育池。用PBST溶液洗板5次後，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金標羊抗兔二抗，在37°C 條件下孵育池。用PBST溶液洗板3次洗板之後，每孔加入100 μ L由(a) 2% (m/v)明 膠 6mL，(b) 5. 7% (m/v)對苯二酚 3mL，(c) pH 3. 5 檸檬酸緩衝液 lmL，和(d) 2% (m/v) AgNO3,溶液200 μ L這四種溶液組成的銀還原體系，反應30min。用PBST溶液洗板5次後， 向每孔加入200 μ L的濃硝酸，然後震蕩反應池，提取每孔的銀溶液後，用原子吸收光譜進 行定量分析。(4)根據原子吸收光譜測定的銀的濃度值，建立MPA的濃度與銀的濃度值(吸光度) 之間的關係，建立標準曲線。(5)用該方法實現實際樣品中MPA的檢測步驟(3)中的由實際樣品溶液所測得的 吸光度值與標準曲線對照，確定實際樣品中MPA的濃度。
權利要求
1. 一種基於銀增強的甲羥孕酮的檢測方法，其特徵在於基於膠體金標記及銀沉積增強 檢測信號的超靈敏檢測方法，共分5個步驟(1)膠體金的製備，(2)抗體的膠體金標記，(3) 膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定，(4)建立標準曲線，(5)實現實際樣品中甲羥孕酮MPA 的檢測；(1)膠體金的製備向處理過的乾淨的三角燒瓶中加入50 mL質量濃度為0. 01%的氯金酸溶液，攪拌，加 熱至沸騰，保持5min ；—次性加入質量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，邊加熱保持沸騰邊 攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍黑色，至深藍黑色最後變成酒紅色，當顏色不再變化 後，繼續加熱沸騰15 min使反應充分完全；最後，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，加蒸 餾水定容到50mL，得膠體金溶液，4°C保藏備用；(2)抗體的膠體金標記用0. IM的K2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值為9. 0，然後向其中加入羊抗兔二抗抗體， 使羊抗兔二抗抗體的濃度為100 μ g/mL,並在室溫下反應4h後，離心並重新分散於0. OlM PH7. 4的PBS緩衝溶液中，得50 μ g/mL的金標羊抗兔二抗，4°C保存備用；(3)膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C過夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包 被原；用含1% BSA的0. 01 M PBS封閉96孔板，在37°C孵育lh，用PBST溶液洗板3次；向 96孔中加入不同濃度MPA的標準溶液或實際樣品溶液，加MPA的兔一抗，並在37°C孵育池； 用PBST溶液洗板5次後，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金標羊抗兔二抗，在37°C條件下孵 育池；用PBST溶液3次洗板之後，每孔加入100 μ L的銀還原體系反應30min，用PBST溶液 洗板5次後，向每孔加入200 μ L的濃硝酸，然後震蕩反應池，提取每孔的銀溶液後，用原子 吸收光譜進行定量分析；所述銀還原體系由(a)質量濃度洲的明膠溶液6mL，(b)質量濃度5. 7%對苯二酚 3mL, (c) pH 3. 5檸檬酸緩衝液ImLjP (d)質量濃度m AgNO3溶液200 μ L四種溶液組成 的銀還原體系；(4)建立標準曲線根據步驟(3)所述由原子吸收光譜測定的銀的濃度值，建立MPA的 濃度與銀的濃度值之間的關係，建立標準曲線；(5)實現實際樣品中MPA的檢測步驟(3)中的由實際樣品溶液所測得的銀的濃度值與 標準曲線對照，確定實際樣品中MPA的濃度。
全文摘要
一種基於銀增強的甲羥孕酮的檢測方法，屬於分析化學技術領域。本發明為基於膠體金標記及銀沉積增強檢測信號的超靈敏檢測方法，共分5個步驟(1)膠體金的製備，(2)抗體的膠體金標記，(3)膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定，(4)建立標準曲線，(5)實現實際樣品中甲羥孕酮MPA的檢測。主要內容是在ELISA方法的基礎上，利用金標記二抗代替傳統的酶標二抗，然後再利用銀沉積在金納米粒子的表面增強最後的檢測信號，將沉積在金納米粒子表面的銀溶解後，通過原子吸收光譜實現溶液中銀含量的定量檢測，從而實現樣品中有毒有害物質的超靈敏檢測。該方法在傳統的ELISA基礎上進行改進，基於快速超靈敏等特點，在食品安全檢測等領域具有廣泛的應用潛力。
文檔編號G01N33/532GK102128931SQ201010597019
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月21日 優先權日2010年12月21日
發明者匡華, 孫鳳霞, 彭池方, 朱潁越, 王利兵, 胡擁明, 胥傳來, 陳偉 申請人:江南大學