氨基醯化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法

2023-11-03 19:59:52

專利名稱：氨基醯化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及氨基醯化水解酶法拆分混旋蛋氨酸(D，L-Met)製備左旋蛋氨酸(L-Met)1-2-氨基-4-(甲硫基)丁酸的方法，及氨基醯化水解酶的獲取。
胺基酸是構成生物體蛋白質的主要成份，是維持生命的基本物質，而L-蛋氨酸是人體八種必需氫基酸中的一種，對人體的健康起著重要作用。已被廣泛用於醫藥衛生的生化研究，以及胺基酸大輸液，食品添加劑，目用化妝品等領域。
混旋蛋氨酸對映異物體中，右型和左型二者除了在使平面偏振光發生不同方向相同角度偏轉這一點上的差異外，其它物理、化學性質一般條件下沒有差異，因此分離出右型體和左型體是十分困難的，傳統的化學拆分法，利用D溴代樟腦磺酸銨與混旋蛋氨酸衍生鹽的方法形成非對映體的鹽，利用其溶解度的差異，從而達到混旋蛋氨酸拆分的目的，該法要消耗大量的天然樟腦，使用大量的Br、硫碘酸、氯仿等腐蝕性強的化工原料，生產周期長、毒副作用大，而且天然樟腦短缺，生產成本高，因此工業法生產左旋蛋氨酸受到了極大的限制。
特許公報，昭41-22380，昭42-1534公開了氨基醯化水解酶法生產左旋蛋氨酸的工藝，採用米曲酶，用小麥麩-穀殼得到的種曲溶解後的水液外加[Co(H2O)6]3119mg/l，與0.17M濃度的乙醯混旋蛋氨酸底物在PH7.0、37℃下作用，以二乙胺乙基作載體，在填充有DEAE纖維的層析柱上，讓粗酶液流出通過，流出液減壓濃縮過濾得到晶體產品，濾液再用乙醇重結晶，此法優點效率較高，產率67％，菌體培養條件及成本低，酶可反覆使用，缺點酶底反應慢，需150小時以上，固化過程中酶失活較高，回收D-乙醯蛋氨酸工序複雜。
特許公報昭48-23915公開了一種氨基醯化水解酶法拆分DL-Met生產L-Met工藝，利用含產穀氨酸棒狀桿菌的培養液直接與濃度為0.006M乙醯混旋蛋氨酸底物反應，在PH6.8，溫度37℃下反應24小時，反應終止液加熱，冷卻離心除菌體雜蛋白，上清液經強酸性陽離子柱，流出液為D-乙醯蛋氨酸，柱子用水茚淨後，氨水洗脫、濃縮冷卻結晶得產品，該方法的優點是效率高，產率64％，單位時間產量相對較高，操作較易，直接使用菌體可省工序和載體，缺點純度不高，菌體培養成本高，要用肉汁、蛋白凍、葡萄糖培養基培養，回收D-乙醯蛋氨酸工序複雜。
本發明的目的是提供一種氨基醯化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸新方法，該方法所用的胺基酸醯化酶(E、C、3、5、1、14)具有高活性，易得，生產成本低。
本發明的原理是
僅L型醯化胺基酸水解本發明的氨基醯化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法步驟是(1)將乙醯混旋蛋氨酸加去離子水配兌成0.4-1.0mol/L的底物，用NaOH溶液調PH到2-9，優選PH3.8-8，過濾，按3000ml底物液加100-150ml CoCl225×10-4mol/L的溶液；(2)取氨基醯化水解酶，按17000-20000m/lM乙醯混旋蛋氨酸的比例加入到上述過濾所得底物中，在10-41℃，優選20-38℃，保持40-110小時，進行混旋蛋氨酸拆分，(3)折分液升溫到80-90°，加入活性炭脫色，過濾；(4)脫色過濾液在70-80℃濃縮到原液體積的1/20-1/30後冷卻；(5)冷卻液中加入CH3OH，其量為底物蛋氨酸重量的6-8倍，攪拌，於0-6℃下結晶3-6小時，離心分離，乾燥得產品左旋蛋氨酸。
上述所用的乙醯混旋蛋氨酸的配製按如下步驟進行(1)取1份重量的混旋蛋氨酸，加入到有2份重量冰醋酸的反應釜中，邊加入邊攪拌；(2)再往反應釜中滴加0.9份重量的醋酐，同時攪拌，待放熱反應完畢，此時可蒸餾回收醋酸；(3)冷卻，同時加入2份重量的水，放置冷卻≥20小時進行結晶；(4)結晶分離、洗滌、乾燥得m、p114-115℃乙醯混旋蛋氨酸原料。
上述所用的氨基醯化水解酶，即胺基酸醯化酶(E、C、3、5、1、14)是按下述方法製得的(1)取1份重量的新鮮動物內臟置於高速搗碎機中在0-6℃下磨成細漿，置於容器中；(2)往細漿中加入2-3份重量0.05-0.1M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液，在0-5℃下攪拌浸提30-40mln，(3)浸提液混合置於冷凍離心機中於轉速3000rpm，溫度0-5℃下離心沉降≥20mln，收得蛋白濃度為40-45mg/ml，酶活力為1860-3890u/ml上清液；(4)將所得上清液用0.05-0.1M濃度磷酸鈉鹽緩衝液調PH到3-8，然後再置於冷凍離心機中在轉速3000rpm，溫度0-5℃下離心沉降≥20mln，收集其上清液；(5)將(4)所得上清液用0.05-0.1M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液調PH到3-8，收得蛋白濃度為11-28mg/ml，酶活力1950-3380u/ml的上清液；
(6)往(5)所得上清液中按每份內臟重量的1/4-1/2重量加入(NH4)2SO4粉末，存於冰櫃中鹽折8-20小時；(7)鹽折液置於冷凍離心機中於轉速4000rpm，溫度0-5℃下離心沉降≥20mln，得鹽折沉降物；(8)鹽折沉降物用去離子水使其完全溶解，並裝入市售透析膜製成的袋中於0-5℃下透析≥12小時，經常更換去離子水，到檢查透析液中無SO42-離子時止；(9)鹽析所得透析酶液用濃度為0.05-0.1M的磷酸鈉鹽緩衝液配成蛋白濃度為8-10mg/ml，酶活力為23000-25000u/ml的酶液，置於冰櫃中備用。
所用濃度為0.05-0.1M的磷酸鈉鹽緩衝液為磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉溶液配製成的緩衝液。
本發明的優點是效率高、收率78％，酶來源廣，成本低；直接拆分，不需固化，產品與副產品分離回收工序簡單。不足的是酶只能使用一次。
實施例1 乙醯混旋蛋氨酸(D，L-N-AC-Met)的合成將150kg混旋蛋氨酸加入到有300kg冰醋酸的反應釜中，邊加邊攪拌至完全溶解，再滴加135kg醋酐，同時攪拌，因反應放熱，溫度上升，待放熱反應完畢(此時蒸餾回收水醋酸)，冷卻，同時加入300kg水，放置冷卻20小時以上結晶，離心分離、洗滌、乾燥得190kg產品，一般可得185.6-193.8kg乙醯混旋蛋氨酸產品，收率為90-94％，m、p114-115℃的乙醯混旋蛋氨酸產品貯存備用。
實施例2 氨基醯化水解酶的製取將1份(100-200g)新鮮動物內臟置高速搗碎機中磨成細漿，置於1000ml燒杯中，加入2-3倍細漿重量的0.05M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液，在0-5℃溫度下攪拌浸提30-40mln，然後將其混合液置於冷凍離心機中於轉速3000rpm、溫度0℃-5℃，離心沉降20mln、收集上清液320ml，取樣測得蛋白濃度41.4mg/ml，酶活力1860-3890u/ml，再將其上清液用0.05M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液調PH到3-8，然後再置於冷凍離心機中在轉速3000rpm、溫度0℃-5℃內離心沉降20mln，收集其上清液，再用上述緩衝液調PH到3-8，收集上清液195ml，取樣測蛋白濃度為11-28mg/ml，收集測得酶活力在1950-3380u/ml。
在所得195ml的上清液中加入化學純(NH4)2SO4粉末48g進行鹽析，存放於冰櫃中8小時以上。將鹽析液置於冷凍離心機中在轉速4000rpm，0-5℃溫度離心沉降20mln，得到鹽析沉降物188。然後將其裝入市售透析膜製成的透析袋中，放入去離子水中於0-5℃透析12-24小時，經常更換去離子水，檢查透析液無SO2-4離子時透析完畢，用0.06M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液配得酶液38ml，取樣測蛋白濃度9.48mg/ml，酶活力24400u/ml，將酶液置於冰櫃中備用。
實施例3氨基醯化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸生產例1。
取D、L-N-AC-Met(乙醯混旋蛋氨酸)100kg，加去離子水1000kg、NaOH2.5kg，過濾於拆分釜中，濾液PH-5.5，加入3500ml CoCl25×10-4mol/l溶液，取氨基醯化水解酶加入底物中，其加酶量為20000u/lM乙醯混旋蛋氨酸，在26-40℃拆分40-110小時，因拆分放熱使溫度升到80-90℃，加入1kg活性炭脫色，其脫色液在70-80℃濃縮到1/30體積，加入700kg CH3OH，攪拌，於0-6℃結晶3-6小時，離心分離母液、脫水、烘乾得左旋蛋氨酸產品35.90kg、收率99.2％(相對於混旋蛋氨酸的一次拆分理論收得量)。
實施例4氨基醯化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸生產例2。
取乙醯混旋蛋氨酸200kg，加去離子水2000kg、NaOH4.5kg，過濾於拆分釜中，濾液PH-4，加入7000ml CoCl25×10-4mol/l溶液，取氨基醯化水解酶加入底物中，其中酶量為17000u/lM乙醯混旋蛋氨酸，在26-40℃拆分40-110小時，因拆分反應放熱，使溫度升80-90℃，加入活性炭2kg脫色，其脫色液在70-80℃濃縮到原體積的1/20體積，加1500kg CH3OH，攪拌、於0-6℃溫度下結晶3-6小時，離心分離母液，脫水、烘乾得左旋蛋氨酸產品71.64kg，收率99.0％，(相對於混旋蛋氨酸的一次拆分理論收得量)。
權利要求
1.一種氨基醯化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法，其特徵步驟是(1)將乙醯混旋蛋氨酸加去離子水配兌成0.4-1.0mol/L的底物溶液，用NaOH溶液調PH到2-9，過濾於拆分釜中按每3000ml過濾底液加100-150ml CoCl25×10-4mol/L的溶液，(2)取氨基醯化水解酶按17000-20000u/M乙醯混旋蛋氨酸比例加入上述過濾液底物中，在10-41℃保溫40-110小時進行混旋蛋氨酸拆分，(3)拆分液升溫到80-90°加入活性炭脫色，過濾，(4)脫色過濾液在70-80℃濃縮到原液體積的1/20-1/30後冷卻，(5)加入CH3OH，其量為底物重量6-8倍，攪拌，於0-6℃下結晶3-6小時，離心分離，乾燥得產品。
2.如權利要求1所述的製取左旋蛋氨酸的方法，其特徵是底物溶液用NaOH溶液調PH到3.8-8。
3.如權利要求1所述的製取左旋蛋氨酸的方法，其特徵是過濾底物中加入氨基醯化水解酶後，在溫度20-38℃保溫40-110小時進行混旋蛋氨酸拆分。
4.權利要求1所用的乙醯混旋蛋氨酸的配製步驟如下(1)取1份重量的混旋蛋氨酸，加入到有2份重量冰醋酸的反應釜中，邊加入邊攪拌，(2)往(1)中滴加0.9份重量的醋酐，同時攪拌，待放熱反應完畢，(3)冷卻，同時加入2份重量的水，放置冷卻20小時以上進行結晶，(4)結晶分離、洗滌、乾燥得m、p114-115℃乙醯混旋蛋氨酸產品。
5.權利要求1所用的氨基醯化水解酶，其特徵是按如下步驟製得的，(1)取1份重量的新鮮動物內臟在0-6℃下磨成細漿，置於容器中，(2)向細漿中加入2-3份重量0.05-0.1M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液，在0-5℃下攪拌浸提30-40mln，(3)浸提液混合置於冷凍離心機中於轉速3000rpm，溫度0-5℃下離心沉降≥20mln，收得蛋白濃度為40-45mg/ml，酶活力為1860-3890u/ml上清液，(4)將(3)所得上清液用0.05-0.1M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液調PH到3-8，然後再置於冷凍離心機中在轉速3000rpm，溫度0-5℃下離心沉降≥20mln收集其上清液，(5)將(4)所得上清液用0.05-0.1M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液調PH到3-8，收得蛋白濃度為11-28mg/ml，酶活力1950-3380u/ml的上清液，(6)往(5)所得上清液中按每份內臟重量的1/4-1/2重量加入(NH4)2SO4粉末，存於冰櫃中鹽折8-20小時，(7)鹽折液置於冷凍離心機中於轉速4000rpm，溫度0-5℃下離心沉降≥20mln，得鹽折沉降物，(8)鹽折沉降物用去離子水溶解並裝入市售透析膜製成的袋中，於0-5℃下透析≥12小時，經常更換去離子水，檢查透析液中無SO4-2離子時止，(9)鹽析所得透析酶液用0.05-0.1M濃度的磷酸鈉鹽緩衝液配成蛋白濃度為8-10mg/ml，酶活力為23000-25000u/ml的酶液，置於冰櫃中備用。
6.如權利要求5中所述的氨基醯化水解酶的製取，其特徵是濃度為0.05-0.1M的磷酸鈉鹽緩衝液為磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉溶液配製成的緩衝液。
全文摘要
一種氨基醯化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法。該方法先將混旋蛋氨酸乙醯化製成乙醯混旋蛋氨酸備用,再採用具有高活性的動物內臟提取物胺基酸醯化酶做酶源,在10—41℃,保溫40—110小時,對混旋蛋氨酸進行拆分,然後用活性炭脫色、濃縮、冷卻、加入CH
文檔編號C12P13/12GK1196392SQ9811352
公開日1998年10月21日 申請日期1998年4月27日 優先權日1998年4月27日
發明者姚紹斌, 龔愛民, 徐新平, 汪大順, 高才元, 覃向陽, 劉平福, 姚祖平 申請人:湖北省八峰藥化股份有限公司