反向dna晶片的製作方法
2023-11-04 06:35:07 1
專利名稱：反向dna晶片的製作方法
技術領域：
本發明反向DNA晶片涉及一種DNA晶片及其製備。可適用於大量樣品的檢測分析，可廣泛應用於大規模體檢、篩藥、組織分析、不同個體的比較分析、表達分析等。
背景技術：
DNA晶片是一種能夠快速、簡便而又能大規模檢測基因組DNA和蛋白質表達等基因信息的工具。這種DNA晶片是國際上於90年代中後期興起的尖端技術，它的研製與應用是將成千上萬個基因片斷作探針固定在小小的一片只有幾平方釐米玻璃片或矽片等載體上，通過這些探針與待檢測的樣品進行雜交，藉此來尋找、判斷樣品中基因情況。一般來說，基因晶片技術主要包括四個主要步驟晶片製備、樣品製備、雜交反應和信號檢測及結果分析。對於以核酸雜交為原理的檢測晶片螢光檢測法的主要過程為首先用螢光素標記的引物擴增(也可以有其它放大技術)靶序列或樣品(如果是表達譜基因晶片，還需從RNA逆轉錄為DNA，再進行擴增)，然後與晶片上的大量探針進行雜交，將未雜交的分子洗去(如果用實時螢光檢測可省去此步)這時，用落射螢光顯微鏡或其它螢光顯微裝置對片基進行掃描，採集每點螢光強度並對其進行分析比較。由於正常的沃森·克裡克(Watson-Crick)配對雙鏈要比具有錯配鹼基的雙鏈分子具有較高的熱力學穩定性。所以，如果探針與樣品分子在不同位點配對有差異則該位點螢光強度就會有所不同，而且螢光信號的強度還與樣品中靶分子的含量呈一定的線性關係，從而可以定量測定樣品中靶分子的含量。
上述檢測方法有一定的優點，但也存在很多困難與不便。第一，樣品製備方法單一，當前多數公司在螢光標記和雜交反應前都要對樣品進行一定程度的擴增，增加了錯配的機率，降低雜交效率，而且在基因擴增過程中不同基因會隨機地不平行擴增，使晶片雜交反應結果不穩定，重複性差。如果能不擴增，必然操作簡便，減少誤差。第二，探針的合成與固定比較複雜，特別是對於製作高密度的探針陣列。使用光導聚合技術每步產率不高(95％)，難於保證好的聚合效果。第三，目標分子的標記也是一個重要的限速步驟，如何簡化或繞過這一步現在仍然是個問題。第四，探針分子的GC含量、長度以及濃度等都會對雜交產生一定的影響，多個探針在同一條件下進行雜交而不出現假陰假陽，其雜交與洗脫條件往往極端苛刻。第五，這種方法可檢測的樣本數有局限，如果用於多樣品微陣列生物晶片，由於每個腔室只能檢測一個樣本，因此上述技術只適用於幾個至幾十個樣本的檢測。如果腔室過多，造成的後果，其一為腔室間距很小，操作較困難，容易造成交叉汙染；其二為腔室本身空間很小，會增加點樣的難度，減少可檢測的項目。因此，目前的技術尚不適用於大量樣品的檢測分析。第六，由於通常採用一種螢光標記，每一個點只能檢測一個指標，而生物晶片的目的就是要高度集成，因此，如果能突破一個點只檢測一個樣本、一個指標的現狀，則更能體現生物晶片的有效性。
發明內容
本發明目的在於設計一種反向DNA晶片、製備方法及其檢測方法，可以將一個樣品的多種成分的檢測集成於同一個點上，突破一個點檢測一個樣品、一種成分的束縛。
本發明目的可通過下述技術方案實現一種反向DNA晶片是將待測樣品點陣於固相載體上，樣品中的待測DNA或RNA通過化學鍵或者分子吸附連接於固相載體上而被固定。固相載體表面經過封閉後，加入標記了螢光的核酸探針，與固相生物分子進行雜交反應，洗去未結合的物質後，樣品點的螢光強度與樣品中待測成分的含量成一定正相關。見附圖1，反向DNA晶片原理圖。
其中所述點陣於固相載體上的待測樣品，可以是血清、體液、組織液、組織的細胞裂解液等，可以是從上述樣品中提取的DNA或RNA，或逆轉錄獲得的cDNA，也可以是上述DNA或RNA的擴增產物。探針為待測成分相應的DNA、RNA、cDNA或寡核苷酸。這樣的點樣方式，可以同時測大量的樣品，密度可以超過每平方釐米100個樣品，可以用於大量樣本的檢測分析，例如大規模體檢、篩藥、組織分析、不同個體的比較分析、表達分析等。
在上述技術方案基礎上，本發明用一種或多種螢光進行標記，每一種螢光標記一種核酸探針，根據需要可將多種螢光探針同時與樣品點進行雜交，最後用相應於不同螢光標記物的不同的激發波長和發射波長對晶片進行掃描，分別檢測到幾種螢光的成像，從而可以將一個樣品的多種成分的檢測集成於同一個點上，突破了一個點檢測一個樣品、一種成分的束縛。還可以在這幾個成分之間進行比較分析。所加入的螢光探針，亦可以選擇具有競爭性的幾種核酸探針，讓它們競爭性地與某種固相分子結合，以研究該待測標本中某種核酸分子的特性。
在上述技術方案基礎上，對於樣品中核酸含量比較低反應，可以採用信號多級放大系統提高檢測靈敏度，包括多級酶聯放大系統或生物素—親和素放大系統等。
本發明所述的固相載體是可以共價連接或者吸附樣品中核酸分子的材料，可以是表面帶有活化基團的玻璃片，也可以是醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、矽片、鋼片、陶瓷片、塑料片等。
反向基因晶片樣品的製備(1)採血清、取組織液，或將組織搗碎、裂解後，提取DNA或RNA。(2)用高速點樣機器人，根據樣品的數量和種類確定點陣的排列方式和點樣位置。(3)點樣針從多孔板取出樣品後直接高密度點陣於固相載體上。(4)室溫過夜或37℃溫育1小時，以固定樣品。(5)在載體表面加上封閉液，37℃溫育1小時。(6)用緩衝液充分洗滌並室溫乾燥。
探針的標記用不同的螢光染料標記不同的探針，除去未結合成分後，將幾種標記探針混合。
雜交反應在點好樣的晶片上滴加螢光標記探針混合液，37℃避光溫育10-16小時。洗淨並室溫晾乾。
結果的檢測反應結束後，利用專業的晶片掃描分析儀進行結果的判讀。具體為針對每一種螢光染料，採用相應的激發波長進行激發，並在相應的發射波長進行掃描。搜集數據，進行分析。
本發明優越性在於1，多樣品同時檢測。反向DNA晶片可以把大量的待測樣品點陣於固相載體之上，可以同時檢測大量的樣品，密度可以超過每平方釐米100個樣品，適用於大量樣本的檢測分析，例如大規模篩藥、比較分析等，使大量標本的檢測操作更簡單，更減少交叉汙染。
2，採用多種螢光標記，突破了一個點檢測一個樣品、一種成分的束縛。而且增加了檢測結果的應用範圍，可以應用於檢測多種成分，幾種成分的比較，也可以用來研究某種分子的特性。
3，更節省待測樣品的量，每個點需要樣品量達到納升級。
4，待測樣品不需擴增，不需標記，探針特別是高密度探針不再需要複雜的工藝固定在固相載體上，節省了大量時間，使檢測簡單迅速，操作方便，結果正確率更高。
5，可以根據需要增減檢測項目，調整探針數量多少，從而一方面降低檢測成本，另一方面使雜交及洗脫條件要求降低，易於掌握，使用更方便更靈活。
附圖1，反向DNA晶片原理圖，其中1—待測樣品DAN或RNA結合於固相載體上，2—加入螢光標記的核酸探針，3—探針與固相DAN/RNA雜交。
附圖2，用反向基因晶片同時進行兩種疾病的檢測檢測AFP結果圖。
附圖3，用反向基因晶片同時進行兩種疾病的檢測檢測為檢測CEA結果圖。
附圖4，用反向基因晶片進行人白細胞抗原(human leukocyteantigen，HLA)的A位點檢測掃描結果圖。
附圖5，用反向基因晶片進行人白細胞抗原(human leukocyteantigen，HLA)的B位點檢測掃描結果圖。
附圖6，用反向基因晶片進行人白細胞抗原(human leukocyteantigen，HLA)的DQ位點三項指標的檢測掃描結果圖。
具體實施方法本發明一種反向DNA晶片，是將待測樣品點陣於固相載體上，特點是樣品中的待測DNA或RNA通過化學鍵或者分子吸附連接固定於固相載體上，固相載體表面經過封閉後，加入標記了螢光的核酸探針，與固相生物分子進行雜交反應，洗去未結合的物質後，樣品點的螢光強度與樣品中待測成分的含量成一定正相關，其中，所述固相載體是可以共價連接或者吸附樣品中核酸分子的材料，是指表面帶有活化基團的玻璃片、醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、矽片、鋼片、陶瓷片、塑料片中的任一種。如圖1反向DNA晶片原理圖所示，其中，1—待測樣品DAN或RNA固定於固相載體上； 2—針對靶基因的寡核苷酸加入螢光標記的核酸探針；3—探針與固相DAN/RNA雜交結果。
反向基因晶片的點樣、製作技術(1)樣品的製備採血清、取組織液，或將組織搗碎、裂解後，提取DNA或RNA。(2)用高速點樣機器人，根據樣品的數量和種類確定點陣的排列方式和點樣位置。(3)點樣針從多孔板取出樣品後直接高密度點陣於固相載體上。(4)室溫過夜或37℃溫育1小時，以固定樣品。(5)在載體表面加上封閉液，37℃溫育1小時。(6)用緩衝液充分洗滌並室溫乾燥。
探針的標記用不同的螢光染料標記不同的探針，除去未結合成分後，將幾種標記探針混合。
雜交反應在點好樣的晶片上滴加螢光標記探針混合液，37℃避光溫育10-16小時。洗淨並室溫晾乾。
結果的檢測反應結束後，利用專業的晶片掃描分析儀進行結果的判讀。具體為針對每一種螢光染料，採用相應的激發波長進行激發，並在相應的發射波長進行掃描。搜集數據，進行分析。如圖2、圖3用反向基因晶片同時進行兩種疾病的檢測。同時用不同螢光標記的AFP、CEA探針檢測病人樣品mRNA中相應的靶序列。點樣陣列為4×4，其中A1、B1為陽性對照，C1、D1為陰性對照，其它為待測標本。圖2為檢測AFP結果，螢光的強弱代表樣品中AFP表達量的高低；圖3為檢測CEA結果，螢光的強弱代表樣品中CFA表達量的高低。
如圖4、圖5、圖6用反向基因晶片進行人白細胞抗原(humanleukocyte antigen，HLA)的A位點、B位點、DQ位點三項指標的檢測。點樣方式如上，待測樣品為病人樣品DNA，探針為相應位點的靶序列。圖4、圖5、圖6分別為A位點、B位點和DQ位點的檢測掃描結果。
權利要求
1，一種反向DNA晶片，是將待測樣品點陣於固相載體上，特徵在於樣品中的待測DNA或RNA通過化學鍵或者分子吸附連接固定於固相載體上，固相載體表面經過封閉後，加入標記了螢光的核酸探針，與固相生物分子進行雜交反應，洗去未結合的物質後，樣品點的螢光強度與樣品中待測成分的含量成一定正相關，其中，所述固相載體是可以共價連接或者吸附樣品中核酸分子的材料，是指表面帶有活化基團的玻璃片、醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、矽片、鋼片、陶瓷片、塑料片中的任一種。
2，根據權利要求1所述的反向DNA晶片，特徵在於所述點陣於固相載體上的待測樣品，可以是血清、體液、組織液、組織的細胞裂解液、上述樣品中提取的DNA或RNA、逆轉錄獲得的cDNA、或上述DNA或RNA的擴增產物，所述探針為待測成分相應的DNA、RNA、cDNA或寡核苷酸。
3，根據權利要求1、2所述的反向DNA晶片，特徵在於用一種或一種以上的螢光進行標記，每一種螢光標記一種核酸探針，可將多種螢光探針同時與樣品點進行雜交，最後用相應於不同螢光標記物的不同的激發波長和發射波長對晶片進行掃描，分別檢測到幾種螢光的成像。
4，根據權利要求3所述的反向DNA晶片，特徵在於所加入的螢光探針，可以選擇具有競爭性的幾種核酸探針，讓它們競爭性地與某種固相分子結合。
5，根據權利要求3所述的反向DNA晶片，特徵在於對於樣品中核酸含量比較低反應，可以採用信號多級放大系統提高檢測靈敏度，包括多級酶聯放大系統或生物素—親和素放大系統等。
6，反向DNA晶片的製備，特徵在於(1)樣品的製備採血清、取組織液，或將組織搗碎、裂解後，提取DNA或RNA；(2)用高速點樣機器人，根據樣品的數量和種類確定點陣的排列方式和點樣位置；(3)點樣針從多孔板取出樣品後直接高密度點陣於固相載體上；(4)室溫過夜或37℃溫育1小時，以固定樣品；(5)在載體表面加上封閉液，37℃溫育1小時；(6)用緩衝液充分洗滌並室溫乾燥。
7，根據權利要求6所述的反向DNA晶片的製備，特徵在於用不同的螢光染料標記不同的探針，除去未結合成分後，將幾種標記探針混合。
8，根據權利要求6、7所述的反向DNA晶片的製備，特徵在於在點好樣的晶片上滴加螢光標記探針混合液，37℃避光溫育10-16小時，洗淨並室溫晾乾。
9，反向DNA晶片的檢測方法，特徵在於利用專業的晶片掃描分析儀進行結果的判讀，針對每一種螢光染料，採用相應的激發波長進行激發，並在相應的發射波長進行掃描、搜集數據、進行分析。
全文摘要
本發明反向DNA晶片涉及一種DNA晶片及其製備,可適用於大量樣品的檢測分析,可廣泛應用於大規模體檢、篩藥、組織分析、不同個體的比較分析、表達分析等。反向DNA晶片是將待測樣品點陣於固相載體上,樣品中的待測DNA或RNA通過化學鍵或者分子吸附連接固定於固相載體上,固相載體表面經過封閉後,加入標記了螢光的核酸探針,與固相生物分子進行雜交反應,洗去未結合的物質後,樣品點的螢光強度與樣品中待測成分的含量成一定正相關,其中,所述固相載體是可以共價連接或者吸附樣品中核酸分子的材料,是指表面帶有活化基團的玻璃片、醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、矽片、鋼片、陶瓷片、塑料片中的任一種。
文檔編號C12Q1/68GK1338522SQ01126930
公開日2002年3月6日 申請日期2001年9月29日 優先權日2001年9月29日
發明者張濤, 李賓, 彭永濟, 鄧富橋, 葛海鵬, 任一萍 申請人:上海晶泰生物技術有限公司