雙鏈鎖核酸組合物的製作方法

2023-12-04 02:30:26 1

專利名稱：雙鏈鎖核酸組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域和免疫刺激劑。更具體地，本發明涉及雙鏈 鎖核酸組合物。所述核酸可包括dsRNA。
背景技術：
先天免疫系統既具有針對入侵病原體的第一道防線的作用，又有對 適應性免疫應答的支持作用。Toll樣受體(toll-like receptor, TLR)是對 先天和適應性免疫應答的起始都具有關鍵作用的一類受體。TLR各自
應答於不同的傳染原標記，例如，TLR4特異性應答於脂多糖，TLR9 偏好性地應答於曱基化的核酸(如含有CpG基序的核酸)，而dsRNA 是TLR3的優選激動劑。
雙鏈RN A (dsRN A)是病毒感染的一種常見的複製中間體。當宿主中 發生病毒複製或者宿主暴露於病毒複製模擬物(如polyIC雙鏈RNA) 時，TLR3起始非特異性先天免疫應答。TLR3的刺激導致NF-kB的激 活及其後炎性細胞因子(包括幹擾素)的產生，所述細胞因子進而通過 刺激I類和II類MHC的表達提高來增強適應性免疫應答。
dsRNA的免疫刺激特性對癌症療法的開發具有意義。polyIC作為佐劑 並與治療劑組合使用的用途是眾所周知的。此外，polyIC dsRNA已與其 他製劑組合來提高穩定性。美國專利4,346,538描述了 polyIC複合物 ("polyICLC")以及所述組合物的製備和使用方法，所述組合物中含有相對 高分子量的polyl:C、分子量範圍在13-35 kDa的聚L-賴氨酸(一種多聚 陽離子的多肽)和羧甲基纖維素。還曾提出用polyICLC作為治療劑來治 療一些癌症和病毒性疾病(如HIV或伊波拉病毒)以及多發性硬化症(美 國專利7>開2006/0223742 )。還證明了另一些dsRNA也具有作為癌症治療劑的潛力。例如，已描述 dsRNA與淋巴因子的組合在作為治療黑素瘤的治療劑時具有協同效應(EP 0281380)。還描述了 TLR3激動劑(包括polyIC和polyAU)用於癌症治 療的改進方法(US 2006/0110746)。
Zhu等(J. Translational Medicine 2007 5:10 doi:10.1186/1479-5876國5國 10)描述了 polyICLC (肌內施用)和特異性腫瘤免疫原(與IFA組合於 皮下施用)的組合為患CNS神經膠質瘤的小鼠的一種有效治療方法。
一些PolyI:C組合物已用於治療慢性疲勞症候群、與抗病毒劑組合用 於治療HIV感染變體(Thompson等，Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1996 Jul; 15(7):580-7; Gillespie等，In Vivo. 1994 May-Jun; 8(3):375-81; Strayer 等，Clin Infect Dis 1994 Jan;18 Suppl l:S88-95)。
還鑑定出另 一些特異性寡核苷酸基序具有免疫刺激效應，例如CpG 二 核普酸。DNA中一些未曱基化的CpG基序是TLR9的激動劑，已建議作 為癌症療法(Krieg AM. 2007 J. Clin Invest 117:1184-94)。 US 7，148，191描述 了一種與小(6_20個胺基酸)抗原組合〗吏用的抗原性組合物，所述抗原組 合物包含多聚陽離子的多肽以及含有肌苷和胞嘧啶的核酸。WO 01/93905 描述了不含CpG基序的免疫刺激性寡脫氧核苷酸，提到了副作用(如高 系統性的TNF-a)以及缺乏特異性。
治療性的核酸(包含RNA)可被其刺激引發的免疫應答所降解，所述 降解過程是先天病毒防禦應答的一部分。US 6,194,388 (及其中的參考文 獻)指出，將核酸組合物中的核糖核苷換成脫氧核糖核苷不能有效提高穩 定性，因為特定形式的核糖看來是免疫激活所必需的。提高劑量也不能規 避穩定性問題，因為毒性是劑量依賴性的。
期望得到穩定性改良的佐劑，該佐劑適合與至少一種治療劑(例如但 不僅限於病毒性免疫原)組合共同施用，並能夠增強病毒性免疫原的免疫 刺激活性。
發明概述
本發明涉及免疫刺激劑，並提供雙鏈鎖核酸(locked nucleic acid， LNA) 組合物。所述核酸可包括dsRNA。
9本發明的另 一 目標是提供一種改進的包含dsRNA的化合物。
本發明還提供下式的化合物
formula see original document page 10
式n
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果n-O則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果p一則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q;U壬意核苷；
畫m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB苷、肌苷類似物核苷、腺噤呤或腺嘌呤類似物核苷；
-0^0&嘧啶、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
畫其中V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸 (LNA)單體。
本發明還提供一種如上文定義的化合物，其中B為肌苷，D為胞嘧啶。
本發明涉及一種組合物，所述組合物包含如上文定義的化合物、多 聚陽離子多肽(如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸)和羧甲基纖維素。
本發明還提供包含任何上文所定義化合物和免疫原(如HspE7 )的 組合物。本發明還提供下式的化合物
I I I
Rk3-Zn- (Dm》-Qp—Rk4
式IIa
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，^Ht是如果n-0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果p一則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q可以獨立地為通過核苷間連接基團連接的任意核糖核 苷，其中V能與Z成鍵，W能與Q成鍵；
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB苷、肌苷類似物核苷、腺噤呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
國kp k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數;
-R可以獨立地是通過核普間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在。例如，在一些實施方案中，第一鏈的5，R核糖核 苷能夠與第二鏈的3，R核糖核苷成鍵；此外，
-其中V、 S、 D、 Z、 Q、 R和W中的一個或多個包含一個或多個 LNA單體。
式IIa代表一種雙鏈RNA分子，該分子具有5，、 3'的突出鹼基或者 同時具有5'和3'的突出鹼基，還具有互補核苷成鍵(用單橫線代表)的第一鏈Rk-Vn-(Sm)-Wp-Rk和第二鏈Rk-Zn-(D加)-Qp-Rk。第 一鏈以5，到3'
方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到
右顯示為3'到5，)表示。
本發明還涉及治療受試者中的癌症、與細菌性或病毒性病原體相關
的疾病或病症的方法，該方法包括對該受試者施用下式的化合物
Vn-(Sm)-Wp
Zn-(DJ-Qp
式n
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果n-0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，a是如果p一則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
畫V、 W、 Z和Q;C任意核苷；
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S^J/L苷或肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-DAJJ&苷或胞嘧啶類似物核苷、尿苷或尿苷類似物核苷；
-其中V、 W、 S、 Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸 (LNA)單體。
本發明還涉及上文的方法，其中S是肌苷、D是胞嘧啶。此外，所 述化合物可以與免疫原(如HspE7) —起施用。
根據本發明的另一方面，提供增強受試者中針對免疫原之免疫應答的方法，該方法包括對該受試者施用含有免疫原和dsRNA(含有LNA) 的組合物。免疫原可以是滅活的完整生物體、蛋白質、肽、融合蛋白、 融合肽、重組蛋白或重組肽。免疫原可以是HspE7。含有LNA的dsRNA 實例包括但不限於本發明的式II-VII。
本發明含有dsRNA的分子中包含一個或多個LNA。這些含LNA 的dsRNA表現出穩定性提高的特性，同時保留了 dsRNA的活性。LNA 能與單鏈和雙鏈核酸形成核苷鹼基特異性雙鏈體和三鏈體。這些複合物
表現出比由普通核酸形成的相應複合物更高的熱穩定性。 本發明還提供下式的化合物
V"Sm)-Wp
式IVa
其中
畫n是從0到10的任意整數，或其間的任意lt值，^Ht是如果n-0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
國p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，^是如果p-0則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V和W是任意核普、核糖核香、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖 核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；
國m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-SB苷、肌苷類似物核苷、腺噪呤或腺噪呤類似物核苷；
-其中V、 S和W中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA)單體。
本發明還提供下式的組合物Qp-(Dm)-Zn
式r/b
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，a是如果n-0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，條件是如果p=0則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-Z和Q^1任意核苷、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖
核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-D是胞嘧啶、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧啶、或尿嘧啶類似物核苷；
-其中Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA)單體。
本發明還提供製備下式化合物的方法
vn-(sm)-wp
I I I
Zn-(Dm)-Qp 丄.
式II
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，^Ht是如果n,則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的4壬意整數，或其間的任意^t值，M是如果p=0則
14n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10; 國V、 W、 Z和Q是任意核苷；
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB苷或肌苷類似物核苷、腺噪呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞苷或胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬類似物核苷；
■其中V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個LNA 單體，所述方法包括
將符合式Vn-(SJ-Wp化合物的第一寡聚體和符合式Qp-(Dm)-Zn化合物
的第二寡聚體以約0.5-1.0到約1.0-0.5的摩爾比混合，並使所述第一和第 二寡聚體退火形成雙^核酸。
本發明提供一種下式的化合物
Rk廣V"Sm)國Wp-Rk2
式IVc
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果i^0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，^H^是如果p^則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖
核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-S是肌苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
國&和k2可獨立地是0到10的任意整數，或者其間的任意整數；
-R可以獨立地為通過核香間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在。例如，在一些實施方案中，第一鏈的5，R核糖核 苷能夠與第二鏈的3，R核糖核苷成鍵，其中V、 S、 R和W中的一個或多 個包含一個或多個鎖核酸(LNA)單體。
本發明提供下式的化合物
Rk4_ Qp-(Dm)- Z -Rw
式IVd
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，*是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，條件是如果p峋則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-Z和Q;1任意核苷、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖
核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-D是胞嘧咬、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧啶、或尿嘧咬類似物核苷；
-k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或者其間的任意整數；■ R可以獨立地為通過核普間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核 普，或者R可以不存在。在一些實施方案中，例如，第一鏈的5'R核糖核 苷能夠與第二鏈的3，R核糖核苷成鍵，其中R、 Z、 D和Q中的一個或多 個包含一個或多個鎖核酸(LNA)單體。
本發明提供製備下式化合物的方法
formula see original document page 17
式na
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，條件是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果p^則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q^1任意核苷；
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
國SB苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷； -D是胞嘧啶、胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷； 國kp k2、 h和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數; -R可以獨立地為通過核苷間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核
苷，或者R可以不存在，所述方法包括將符合式Rk-Vn-(Sn)-Wp-Rk化合物
的第一寡聚體和符合式Rk-Qp-(Dm)-Zn-Rk化合物的第二寡聚體以約0.5-1.0 到約1.0-0.5的摩爾比混合，並使所述第一和第二寡聚體退火形成雙鏈核 酸。本發明提供下式的化合物:
Via:
VIb:
Vic:
VW:
I I I
Rk3一 (Qm) — (FlnA
R)a「 (D卞(E，
Rk3— (Sm) - (FlnA
Rkl- ( Sm) - (ELNA
Rk廣(Dm) - (FLNA
Rkl— {Dm)' - (E， R)c3— (Sm) — (Flna
I I —(Sm)—Rk4
- (Sm) -R)c2
I I
一 (ru —Rk3
(Sm)-Rk2
I I
(Dm>—Rk4
- (Dm) -Rk2
一 (Sm) _Rk4
其中
-ELNA是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一個或多個是LNA;
-F^A是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一個或多個是LNA;
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
S^IJ/L普、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷;-D是胞嘧啶、胞嘧啶類似物核普、尿嘧咬或尿嘧咬類似物核苷； -、、k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數; -R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷。 本發明還提供下式中任一個的化合物
Vila: VIIb: VIIc: VIId: Vile: VIIf:
vng:
VIIh:
其中
國ELNA是CpG或CpG基序， C、 G中的一個或多個是LNA;
Rk3-(Sm)-(ELNA) Rk2畫(DmHFLN八) Rk3-(Dra)-(E,) Rk廣(Sm)-(FLNA) (ELNA)國(Sm)-Rk3 (FLNA)-(Dm)隱Rkl (ELNA)-(Dm)-Rk2 (FLNA)漏(Sm)- Rkl
其中組成該CpG或CpG基序的核普、
國FLNA是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一個或多個是LNA;
畫m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
19-SB苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺噪呤類似物核苷； -D是胞嘧啶、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數; -R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷。 才艮據本發明的一些方面， 國Elna是SEQ ID NO: 23， -F脆是SEQIDNO: 24。 本發明還提供下式中任一個的化合物
Vie:
Rki「 (Sm)|-Gl，-Tlna-Cujiji-Glna-Tlnjl-Tlna- (Dm) _Rk2
Rk3— (Dm) —ClnA-Alna一Glna-Cljja一Alna-AlnA- (Sm) -Rk4
VIf:
VIg:
Rki「 (^m)i-G，-T，-Cl，-Gl，-T，-TLNA- (Sm) _Rjc2 R)o- (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Al;na- (Dm) -Rk4
Rki- (Sm) -Glna濕Tlna-Clna-Glna-Tlna-T乙na- (Sm) -Rk2 Rk3- (Dm) -Clna-Alna-Glua—Clna-Alna-Alna- (Dm) —Rfc4
Vlh:
Rki"* (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Gl，-Tlna-Tlna- -R，
其中
20-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S^J/L苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞嘧咬、胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
-&、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數;
-R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷。
本發明還提供下式中任一個的化合物
VIi: Rki- (Sm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Ti^a-Tlna- (Dm) -Rk2
VIj: Rk3-(Dm)-C惑A跳G
VIk: Rki- (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Sro) -Rk2
Wl: Rio-《Sm)-CLNA Alna Glna Clna Alna ALNA_ (Dm)-Rk4
VIhlK Rkl- (Sm) -Glna-TW-Clna-Glna-Tlna-TW- (Sra) -Rk2
VIn : Rk3-(Dm)-Clna Alna Glna CLNA Alna Alna-(Dm) -Rk4
VIo: R)ci- (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Dm) -R乂2
Wp: Rk3-(Sm)-Clna Alna Glna Clna Alna Alna_ (Sm)-Rk4
其中
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、
2126、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-SB苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
-ki、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數;
-R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷。
本發明提供製備下式化合物的方法(A)
Vie:formula see original document page 22
其中
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-S^J/L苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺噪呤類似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
畫lq、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數;
-R可以獨立地為通過核香間連接相連的任意核糖核普。
所述方法包括
將符合式VIi化合物的第一寡聚體和符合式VIj化合物的第二寡聚體以從約0.5:1.0到約1.0:0.5的摩爾比混合，並使所述第一和第二寡聚體退 火形成雙鏈核酸。
VIlS Rki- (Sm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlma-Tlna- (Dm) -Rjc2
VIj: Rk3- (Dm) ,Clna Alna Glna Clna Alna Alna- (Sm) -Rk4,
本發明提供製備下式化合物的方法(B) VIf:
Rki— (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Gijja_Tlna_Tlna- (Sm) -Rk2
II III I I II I Rk3- (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clkta-Alna-Alna- (Dm) -Rk4
其中
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S^J/L苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞嘧咬、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
-b、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地為通過核香間連接相連的任意核糖核苷
所述方法包括
將符合式VIk化合物的第 一寡聚體和符合式VII化合物的第二寡聚 體以從約0.5:1.0到約1.0:0.5的摩爾比混合，並使所述第一和第二寡聚 體退火形成雙鏈核酸。
VIk: Rki- (Dm》-Gl腿-Tlna-C區-Glna-IW-Txjja- (Sm)醒Rk2VII: Rk3_ (Sm) -Clna Alna Glna ClnA AlnA Alna_ (Dm) -Rk4
本發明提供製備下式化合物的方法(c)
VIg:
Rki- (Sm) -Glna-Tlna一Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Sm) -Rk2
III I IIIII I
Ric3- (Dm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Dm) -R"
其中
國m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-sAJ^苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷； -D是胞嘧咬、胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷； -&、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數； -R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷 所述方法包括
將符合式Vim化合物的第一寡聚體和符合式VIii化合物的第二寡 聚體以從約0.5:1.0到約1.0:0.5的摩爾比混合，並使所述第一和第二寡
Vim : Rki- (Sm) -Glna-Tlna-Clna-Glna_Tlna-Tlna- (Sm) -R)c2
VIn : Rio- (Dm) -Clna Alna Glna Clna Alna Alna- (Dm) -Rk4
本發明提供製備下式化合物的方法(D)VIh:
formula see original document page 25其中
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB苷、肌苷類似物核苷、腺噤呤或腺噪呤類似物核苷；
-D是胞嘧咬、胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苦；
■ k可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷
所述方法包括
將符合式VIo化合物的第 一寡聚體和符合式VIp化合物的第二寡聚 體以從約0.5:1.0到約1.0:0.5的摩爾比混合，並使所述第一和第二寡聚 體退火形成雙鏈核酸。
VIo: Rki- (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna- (Dm) -Rk2
VIp: Rk3- (Sm) -Clna Alna Glna Clna Alna Alna- ( Sm) -Rk4
本發明還提供下式的化合物
formula see original document page 25
式nia
本發明還提供製備式IIIa化合物的方法，該方法包括將各為SEQ IDNO:l和SEQ ID NO:2的寡聚體相組合，並使所述寡聚體退火以提供式 Ilia的雙鏈化合物。
本發明還提供下式的化合物
C- Auja - C *T- AT^na - AC ijja 一 C 一 C 一 C 一 C 一 C 一 C — C 一 C -
式Va
Glna- I-I-I一工-工一工-I-工-工一工-工-I-工-工 - 工一G- tlna一GmA- a- t^^- a- tl a區-c論-u-a-t腿一a-c識-c-c-c-c一c-c—c-c-c-c-c-oc—c-c—c跳
式Vb
Tlna- Guja-I-I-工-I-I-I-I-I-I-工-I-I-工-I-工-G — TjjstA-GLUA-A-TujA-Au C—T -A—Tua—A- Clha- C陽C-C陽C一C-C-C-C-C一C一C-C-C-C一C一Cuja-Alka
式Vc
本發明還提供製備式Va、 Vb和Vc的化合物的方法，該方法包括 將SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、 或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的寡聚體相組合，並使所述寡聚體退 火以分別提供式Va、 Vb和Vc的雙鏈核酸化合物。
(Ii5)-G-Tlna-Glna-A-Tlna_A-Tlna-Glna (Ci5)-Clna-A陽Tlna-A-Tlna-C陽Alna-Clna
(SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 4)
Glna-(I，5)-G-Tlna-Glna-A-Tlna-A-Tlna Clna-(Cis)- Clna曙A-Tlna-A-U-Clna-Alna
(SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6)
Tlna-Glna-(Ii5)-Tlna隱Tlna-A-Tlna-Alna Alna-Clna-(Ci5)-Clna-A- Tlna-A- Tlna-Clna
(SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8)
G
T
A
A
G
G
Ic
—c
Ic
-1c
-1c
-— c
--c本發明還提供具有3，未配對末端的雙鏈寡聚體。本發明還提供製備 具有3'未配對末端的雙鏈寡聚體的方法，該方法包括將SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:IO、或SEQ ID NO:ll和SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:ll和SEQ ID NO:25的寡聚體相組合，所述寡聚體可被組合併退火 以分別提供式為Vd和Ve的雙鏈核酸化合物。
Glna-Glna-(I)15-(A)i5(SEQ ID NO:9)
(C)15-Clna-Cu ja-(U)15(SEQ ID NO:10)
Glna-Glna-(I)io-(A)io(SEQ ID NO:11)
(U) io-Clna-Clna-(C) i o(SEQ ID NO:12)
(C)io-Clna-Clna-(U)io(SEQ ID NO:25)
本發明還提供含有CpG基序的雙鏈寡聚體。本發明還提供製備雙 鏈寡聚體的方法，該方法包括將SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、或 SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、 或SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的寡聚體相組合，並使所述寡聚體退火以分別提供式VIg、 VIh、 VIi、 VIj和VIk的dsRNA化合物。
Glna-Glna-(I)i5- Glna-Tlna-Cixa-Glna-Tlna-Tlna-(I)i5- Gu^-Glna (SEQ ID NO: 13) Clna—Clna—(C)，5— Alna陽Alna-Clna墨Glna-Alna-Clna-(C)i5-Clna-Clna (SEQ ID NO: 14) Glna-G諷-①15- Glna-Tlna-Clna-Guma-Tlna-Tlna- (SEQ ID NO: 15)
Alna-Alna-Clna-Gusja-Alna-Cusa-(C)15-Clna-Clna (SEQ ID NO: 16)
(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna (SEQ ID NO: 17)
(C)15- A函-Alna-C歐G歐A歐Cu^a (SEQ ID NO: 18)
27Glna-(I)i5- Glna-Tlna-ClnA-Glna-Tlna-Tlna-
(SEQ ID NO: 19)
(SEQ ID NO: 20)
(SEQ ID NO: 21)
Glna-Clna-(C)i5- Alna-Alna-Q^a-Glna-Alna-Clna
(SEQ ID NO: 22)
如前述的本發明化合物包含具有一個或多個LNA的CpG基序。這 些含LNA的核酸表現出穩定性提高的特性，同時保留了 CpG相關的活 性。LNA能與單鏈和雙鏈核酸形成核苷鹼基特異性雙鏈體和三鏈體。 這些複合物表現出比由普通核酸形成的相應複合物更高的熱穩定性。
根據本發明的一些方面，在式VIa至式VId、式VIIa至式VIIh、 或式Villa至式VIIIh中任一個所定義的化合物中，
-E通是SEQIDNO: 23,
-F函是SEQIDNO: 24。
根據本發明的一些方面，在式II、式IIa至式IIe、式IVa至式IVd、 式Via至式VId、式Vie至式VIh、式Vli至式VIp、式Vila至式VIIh、 式Villa至式VIIIh中任一個所定義的化合物中，在上述定義的化合物 中S是肌苷、D是胞嘧啶。
根據本發明的一些方面，在上述式II、式IIa至式IIe、式III、式 IIIa至式IIId、式IVa至式IVd、式Va至式Vc、式VIa至式VId、式 Vie至式VIh、式Vli至式VIp、式Vila至式VIIh、式Villa至式VIIIh 中任一個所定義的化合物中還可含有多聚陽離子多肽(包括聚賴氨酸、 聚精氨酸、聚鳥氨酸)。
本發明還提供包含上述定義化合物(式II、式IIa至式IIe、式III、 式IIIa至式IIId、式IVa至式IVd、式Va至式Vc、式Via至式VId、 式VIe至式VIh、式VIi至式VIp、式Vila至式VIIh、式Villa至式 VIIIh)和免疫原(例如HspE7)的組合物。本發明還提供治療受試者 的方法，該方法包括對該受試者施用藥用可接受劑量的所述組合物。根據本發明的另一方面，提供增強受試者對免疫原的免疫應答的方 法，該方法包括對受試者施用含有免疫原和上述定義化合物的組合物，
所述化合物定義為式II、式IIa至IIe、式III、式IIIa至式IIId、式IVa 至式IVd、式Va至式Vc、式VIa至式VId、式Vie至式VIh、式VIi 至式VIp、式VIIa至式VIIh、式Villa至式VIIIh的任一個。免疫原 可以是滅活的完整生物體、蛋白質、肽、融合蛋白、融合肽、重組蛋白 或重組肽。免疫原可以是HspE7。
根據本發明的另一方面，提供了化合物，該化合物包含含有l至 500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷與胞嘧咬核糖核苷之組合以及1至10個鎖 核酸殘基的第一單鏈核苷酸多聚體；和含有1至500個肌苷、胞嘧啶或 者肌苷與胞嘧啶核糖核苷之組合以及1至10個鎖核酸殘基的第二單鏈 核苷酸多聚體；其中第一單鏈核苷酸多聚體和第二單鏈核苷酸多聚體通
核酸殘基的雙^區。
本發明還提供一種化合物，該化合物包含含有1至500個肌苷、 胞嘧咬或者肌苷與胞嘧咬核糖核苷之組合以及SEQ ID NO: 23核酸序 列的第一單鏈核苷酸多聚體；和含有1至500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷 與胞嘧咬核糖核苷之組合以及SEQ ID NO: 24核酸序列的第二單鏈核 苷酸多聚體；其中第一單鏈核苷酸多聚體和第二單鏈核苷酸多聚體通過
酸殘基的雙:區。
本發明還提供佐劑或佐劑組合物，所述佐劑或佐劑組合物包含含 有1至500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷和胞嘧咬核糖核苷之組合以及SEQ ID NO: 23核酸序列的第一單鏈核普酸多聚體；和含有1至500個肌苷、 胞嘧啶或者肌苷和胞嘧咬核糖核苷之組合以及SEQ ID NO: 24核酸序 列的第二單鏈核苷酸多聚體；其中第 一單鏈核苷酸多聚體和第二單鏈核 苷酸多聚體通過氫鍵鍵合而形成雙鏈核酸，該雙鏈核酸包含雙鏈polyIC 區和含有鎖核酸殘基的雙鏈區。
本發明還提供佐劑或佐劑組合物，所述佐劑或佐劑組合物包含含 有1至500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷與胞嘧啶核糖核苷之組合以及1至 10個鎖核酸殘基的第一單鏈核苷酸多聚體；和含有1至500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷與胞嘧咬核糖核苷之組合以及1至10個鎖核酸殘基的第 二單鏈核苷酸多聚體；其中第一單鏈核苷酸多聚體和第二單鏈核苷酸多 聚體通過氫鍵鍵合而形成雙鏈核酸，該雙鏈核酸包含雙鏈poiyIC區和 含有鎖核酸殘基的雙鏈區。
本發明還提供具有針對TLR3和TLR9受體的雙受體激動劑活性的 佐劑或佐劑組合物，所述佐劑或佐劑組合物包含含有1至500個肌苷、 胞嘧咬或者肌苷和胞嘧咬核糖核苷之組合以及SEQ ID NO: 23核酸序 列的第一單鏈核苷酸多聚體；和含有1至500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷 和胞嘧咬核糖核苷之組合以及SEQ ID NO: 24核酸序列的第二單鏈核 苷酸多聚體；其中第一單鏈核苷酸多聚體和第二單鏈核苷酸多聚體通過
酸殘基的雙^區。
本發明概述未必描述了本發明的所有特徵。在仔細閱讀下文對本發 明具體實施方案的描述之後，本發明的其他方面和特徵對本領域普通技
術人員來說將是很明顯的。 附圖簡述
在下文參考附圖進行的描述中，本發明的上述特徵和其他特徵會更 加顯而易見，在附圖中
圖l顯示，根據本發明的一個實施方案，式Vd和Ve的雙鏈核酸化 合物。
圖2顯示，根據本發明的一個實施方案，式VIg至VIk的雙鏈核酸。
圖3顯示，根據本發明的一個實施方案，含有polyA和polyU區的 雙鏈核酸。
發明詳述
本發明涉及免疫刺激劑，並提供雙鏈鎖核酸(LNA)組合物。所述 核酸可包括dsRNA。
說明書中所用實施例(包括術語實例)僅用於說明，並不旨在限制
30本發明實施方案的範圍和意義。
本發明提供含有polyl和polyC或者polyA和polyU寡核苷酸多聚體的組合物，其中每個寡核苷酸多聚體中含有至少一個鎖核酸(LNA)殘基。所述dsRNA可包含大致等摩爾量的polyl和polyC寡核苷酸多聚體(polyl:C )，或者大致等摩爾量的polyA和polyll寡核苷酸多聚體(polyA:U )。
本發明還提供包含成對寡核苷酸多聚體的組合物，所述寡核苷酸多聚體各自含有I (肌普)和C (胞嘧啶)核苷的混合物，其中所述寡核苷酸多聚體對中的I和C核苷排列成使得該寡核苷酸多聚體對能雜交形成雙鏈分子。
本發明還提供含有polyl和polyC或者polyA和polyU寡核苷酸多聚體的組合物，其中每個寡核苷酸多聚體中含有至少一個CpG基序和至少一個鎖核酸(LNA)殘基。所述CpG基序可包含至少一個LNA殘基。所述dsRNA可包含大致等摩爾量的polyl和polyC寡核苷酸多聚體(polyl:C)，或者大致等摩爾量的polyA和polyU寡核苷酸多聚體(polyA:U )。
本發明還提供含有寡核苷酸多聚體的組合物，所述寡核苷酸多聚體含有至少一個CpG基序和至少一個LNA殘基，以及I與C殘基的組合或A與U殘基的組合。所述寡核苷酸多聚體可以雜交形成雙鏈分子，例如雙鏈RNA (dsRNA)。例如，包含CpG基序和一個或多個LNA的dsRNA可以是含有一個或多個LNA的polyl:C化合物。所述dsRNA可能含有大致等摩爾量的polyl和polyC寡核苷酸多聚體(polyl:C)，或者大致等摩爾量的polyA和polyU寡核苷酸多聚體(polyA:U )。在另一個實施例中，寡核苷酸多聚體可包含含有一個或多個LNA的CpG基序以及I與C核普的混合物或A與U核苷的混合物，其中該對中每一寡核苷酸中的CpG基序以及I和C核苷排列成雜交而形成雙鏈分子。
含有至少一個CpG基序和一個或多個LNA的本發明dsRNA可以用於多種目的，例如但不僅限於用作佐劑或免疫刺激劑或治療劑。例如，含有至少一個CpG基序和一個或多個LNA的dsRNA可以是含一個或多個LNA的polyl:C化合物。免疫刺激劑是起始免疫應答或在起始免疫應答中提供催化作用的化合物或組合物。所述免疫應答可以完全是先天(或非適應性)免疫應答，如誘導細胞因子(例如幹擾素、白細胞介素、集落刺激因子等)的產生和分泌，所述細胞因子繼而刺激巨噬細胞遷移，非特異性消化外來免疫原並呈遞能為適應性免疫系統所識別的免疫原。或者，所述免疫應答可以是適應性免疫應答，其對特定免疫原(如由巨噬細胞(也稱作抗原呈遞細胞)所呈遞的免疫原)的存在產生應答。
無數詞修飾的名詞均包含單數及複數的含義。
佐劑是一種免疫刺激劑，其本身不具有特異性免疫原性作用，而是刺激免疫系統提高或增強對特異性免疫原或免疫原組的應答。免疫原誘導先天或適應性免疫系統應答的能力被稱為免疫原的"生物活性"。佐劑可以介導、增強或刺激免疫原的生物活性。在一些實例中，缺少佐劑時免疫原可能只有極低或可忽略的生物活性。
免疫原的生物活性可以通過本領域所熟知的任何測定方法來測定。
例如，對抗原特異性CD8+ T淋巴細胞的誘導可以通過使用ELISPOT測定法(Asai等2000 Clin. Diag. Lab Immunol 7:145-154)來定量。其他形式的ELISPOT測定法可用於其他細胞因子，參看如Kalyzhny等2005.Methods Mol Biol 302:15-31; Ott等J. Immunol. Methods. 2004 Feb15;285(2):223畫35; Forsthuber等Science, 271: 1728- 1730。可用於監測針對免疫原之應答的其他T細胞測定方法包括胞內細胞因子流式細胞術、增殖測定法、抗體微陣列等。參看如Nagorsen等2004. Expert OpinBiol Ther 4:1677-84,或Handbook of Experimental Immunology,第I-IV巻，D. M. Weir和C. C. Blackwell編輯，1986， Blackwell ScientificPublications。幹擾素a和p可以用幹擾素ELISA試劑盒(Kim等2004.Nature Biotechnology 22:321-325)來定量。多重測定法例如基於珠子的系統(Luminex、 Panomics等)能夠同時定量多種細胞因子。細胞因子的實例包括IL-la、 IL-ip、 IL-2、 IL畫4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL畫8、 IL-9、IL-IO、 IL-12(p70)、 IL-13、 IL-15、 IL-17、 IL-18、腦a、 IF邪、IFNy、GM-CSF、 TNFa、 G-CSF、 MIP-la、 MlP-lp、 MCP畫1、 EOTAXIN、RANTES、 FGF-basic、 VEGF等。為明確起見，術語"細胞因子"包括替代性術語如淋巴因子、白細胞介素、趨化因子。
32術語"受試者"和"患者"可替換使用。"受試者"是指動物或哺乳動物，包括但不僅限於小鼠、大鼠、狗、貓、豬或靈長類(包括但不僅限於猴、猩猩或人)。受試者可以之前未接觸過特定免疫原或免疫原組的，或者受試者可以之前接觸過特定免疫原或免疫原組。之前的接觸
可由以下原因所致以特定免疫原或免疫原組有意進行的免疫、接觸含有特定免疫原或免疫原組的傳染原、或對第一免疫原或免疫原組的交叉反應性接觸(引發對第二免疫原或免疫原組的免疫應答)。所述第二免疫原或免疫原組可以與第 一免疫原或免疫原組相似、相同或不同。
本文所用的術語"LNA修飾的寡核苷酸"包括以一個或多個LNA單體全部或部分修飾的任意寡核苷酸。因此，LNA修飾的寡核苷酸可以完全由LNA單體組成，或者LNA修飾的寡核苷酸可以包含一個LNA單體。
術語"DNA單體"是指與含氮鹼基鍵合的脫氧核糖，而術語"RNA單體"是指與含氮鹼基鍵合的核糖。可構成本發明多種實施方案的組合物的DNA單體實例包括但不僅限於脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞普、脫氧肌香等。可構成本發明多種實施方案的組合物的RNA單體實例包括但不僅限於腺苷、鳥苷、5-曱基尿苷、尿苷、胞苷、肌苷等。根據本發明多種實施方案的其他DNA或RNA單體可含有本領域已知的其他含氮鹼基。
本文所用術語"LNA單體"一般指具有如US 6,268,4卯、US 6,794,499和US 7,034,133 (均通過參考併入本文)描述的2，-4'環狀連接的核苷。與未修飾的寡核苷酸相比，雙環核苷(見下文)可對寡核苷酸提供構象上的限制，並提供多種雜交或穩定模式。
術語"核苷"是指通過糖環上的1號碳原子與含氮鹼基鍵合的核糖或脫氧核糖。含氮鹼基的實例包括噪呤(如腺嘌呤、鳥噪呤、6-硫鳥噪呤、次黃嘌呤和黃噤呤)和嘧啶(如胞嘧啶、胸腺嗜啶和尿嘧啶)。噤呤核苷的實例包括腺苷(A )、鳥苷(G )、肌苷(I )、 2，-0-甲基肌苷、2，-0-甲基腺苷、2'-0-甲基鳥嘌呤、2-氯脫氧腺苷、7-滷代-7-脫氮腺苷、7-卣代-7-脫氮-鳥噤呤、7-丙炔基-7-脫氮-腺苷、7-丙炔基-7-脫氮-鳥嘌呤、2-氨基-腺苷、7-脫氮肌苷、7-硫代-7,9-雙脫氮肌苷、間型黴素B、 8-氮雜肌苷、9-脫氮肌苷、別嘌呤醇核苷、8-溴肌苷、8-氯肌苷、7-脫氮-2-脫氧-黃苷、7-脫氮-8-氮雜腺苷、7-脫氮-8-氮雜鳥苷、7-脫氮-8-氮雜脫氧腺苷、7-脫氮-8-氮雜脫氧鳥苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、7-脫氮脫氧腺苷、7-脫氮脫氧鳥苷、8-氨基腺苷、8-氨基脫氧腺苷、8-氨基鳥苷、8-氨基脫氧鳥苷、3-脫氮脫氧腺苷、3-脫氮腺苷、6-巰脫氧鳥苷、N6-異戊烯基腺苷、l-曱基腺苷、1-甲基假尿苷、l-甲基鳥苷、l-曱基肌苷、2，2-二曱基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、2-甲硫基N6-異戊烯基腺苷、N-((9-P-D-呋喃核糖基-2-甲基巰嘌呤-6-基)氨甲醯基)蘇氨酸、N-((9-p-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-曱基氨甲醯基)蘇氨酸、N-((9-P-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲醯基)蘇氨酸、wybutosine、wybutoxosine 等，以及在 Freier 等 1997(Nucleic Acids Res.25:4429-4443，通過參考併入本文)中描述的其他噤呤核苷。
嘧啶核苷的實例包括脫氧尿苷(dU)、尿苷(U)、胞苷(C)、脫氧胞苷(dC)、胸苷(T)、脫氧胸苷(dT)、 5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、2'-0-甲基尿苷、2'-0-甲基胞苷、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基-乙氧基-甲基尿嘧啶、5-丙炔基脫氧尿苷、假異胞苷、5-氮雜胞苷、5-(l-丙炔基)胞苷、2，-脫氧假尿苷、4-硫代脫氧胸苷、4-疏代脫氧尿苷、4-乙醯胞香、5-(羧基羥曱基)尿苷)2'-0-曱基胞苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2'-0-甲基假尿苷、3-甲基胞苷、5-曱基胞苷、5-甲氨基曱基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-胸苷、5-甲氧基羧基甲基-2-胸苷、5-甲氧基羧基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、假尿苷、2-硫代胸苷、5-甲基-2-胸苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、2'-0-曱基-5-甲基尿苷、2'-0-甲基尿普、3-(3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷等，以及在Frder等1997(Nucleic Acids Res. 25:4429-4443)中公開的其他取代嘧啶。
噪呤或嘧啶核苷還包括用標準方法進行的寡核苷酸合成中所用的亞磷醯胺衍生物。
術語核苷還包括式(I)的雙環核苷類似物，在例如US 6268490 (通過參考併入本文)中描述-B可以是任意含氮鹼基，例如嘧咬或嘌呤核酸鹼基，或其類似物。
-X和Y可以相同或不同，也可以是任意核苷間連接基團。
這種雙環核普類似物也可稱作"鎖核酸單體"或"鎖核苷單體"或"LNA單體"或"LNA殘基"。含有LNA單體之核酸多聚體的合成和聚合方法描述於例如WO 99/14226、 WO 00/56746、 WO 00/56748、 WO01/25248、 WO01481卯、WO 02/28875、 WO 03/006475、 WO 03/09547、WO 2004/083430、 US 6，268，4卯、US 6,794,499、 US 7,034,133 (均通過參考併入本文)。
核苷類似物的其他實例(如WO 01/048190 (其通過參考併入本文)所公開的實例)包括非LNA雙環核苷，例如但不僅限於
-含有額外的C-3',C-5，-乙氧橋(ethanobridge)的雙環[3丄0核苷；
國含有額外的C畫1,，C誦6，畫或C畫6'，C畫4，甲氧橋(me他ano bridge)的X5L^環[3.1.0核苷；
-含有額外的C-2'，C國3，-二氧戊環(dioxalane)的雙環[3,3.0和[4.3.0核苷，所述二氧戊環以含有未修飾核苷的二聚體形式合成，其中額外的環是取代天然磷酸二酯鍵的核苷間連接的一部分；所述二聚體包含具有C-2',C-3'-甲醇橋的雙環[3.1.0核苷，上述曱醇橋是醯胺和磺醯胺型核苷間連接的一部分；
■通過formacetal核苷間連接摻入三鏈體中間的雙環[3.3.0葡萄糖衍生核苷類似物；
-由兩個五元環和一個三元環構成骨架的三環DNA;
35-1，5-失水己糖醇核酸；以及
-具有額外的C-2，,C-3，-連接的六元環和五元環的雙環[3,3.0和[4.3.0核普。
"核苷"還包括具有取代核糖(雙環或其他方式)的核苷。取代核糖的實例描述於例如Freier等1997(Nucleic Acids Res. 25:4429-4443)中，所述文獻通過參考併入本文。
"核普酸"是指具有通過糖環上5號碳鍵合的核苷間連接基團的核普。例如，在天然核酸中，寡核苷酸"骨架"是指通過相鄰糖分子的5號和3號碳共價鍵合的交替的核糖/磷酸鏈，該鏈由多個核苷酸聚合而成。此聚合過程可包括本領域所知的化學合成方法。參看，如Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, M. J. Gait編輯,1984，IRL Press, Oxford中的Gait第1-22頁、Atkinson等第35-81頁、Sproat等第83-115頁和Wu等第135-151頁，或Molecular Cloning: aLaboratory Manual第三版.Sambrook和Russell. CSHL Press, ColdSpring Harbour, New York (均通過參考併入本文)。
聚合過程也可以是酶促的。LNA核苷三磷酸也可以用作本發明一些實施方案的核酸化合物或組合物的酶促聚合底物。LNA核苷可在PCR反應或引物延伸測定中由聚合酶(如DNA或RNA聚合酶)摻入延伸的核酸多聚體中。合適聚合酶的實例包括但不僅限於PhusionTM高保真DNA聚合酶(Finnzymes )或9°NmTM DNA聚合酶。酶促摻入LNA核普的方法描述於例如Veedu RN等2007. Nucleic Acids Symposium51:29-30、 Veedu RN等2007. ChemBioChem 8:4卯-492和Veedu等2007.Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 26: 1207- 1210;均通過參考併入本文。
核苷間連接基團是指能夠作為寡核苷酸骨架的一部分連接兩個核苷的基團。核苷間連接基團的實例描述於Praseuth等(Biochimica etBiophysica Acta 1489:181-206，通過參考併入本文)，包括褲酸二酯(P04-)、硫代磷酸酯(P03s-)、氨基磷酸酯(N3'-P5') (P03NH)和甲基磷酸酯(P03CH3)、肽鍵("PNA")等。術語"核苷酸多聚體"、"寡核苷酸"、"寡核苷酸多聚體"、"寡核苷 酸"、"核酸"、"寡聚體"或"核酸多聚體"可互換使用，是指含有至少
兩個核苷酸的多聚體。核苷酸多聚體可包含單一種類的DNA單體、RNA 單體，或可包含任意組合的兩種或多種DNA單體、RNA單體。核酸可 以是單鏈或雙鏈，例如，雙鏈核酸分子可包含通過互補鹼基配對而雜交 的兩條單鏈核酸。
寡核苷酸"polyl"主要包含肌苷、肌苷類似物核苷或其組合。肌苷 類似物核普包括如7-脫氮肌苷、2，-0-甲基肌苷、7-硫代-7，9-雙脫氮肌苷、 間型黴素B、 8-氮雜肌苷、9-脫氮肌苷、別嘌呤醇核苷、8-溴肌苷、8-氯肌苷等。
寡核普酸"polyC"主要包含胞苷、胞苷類似物核苷或其組合。胞 苷類似物核苷包括如5-甲基胞苷、2'-0-甲基胞苷、5-(l-丙基)胞苷等。
寡核苷酸"polyA"主要包含腺苷、腺苷類似物核苷或其組合。腺 苷類似物核苷包括如2-氨基腺苷、2'-0-曱基腺苷、2-氨基-脫氧腺苷、 7-脫氮-2'-腺普、7-脫氮-2，-脫氧腺苷等。
寡核苷酸"polyU"主要包含尿苷、尿苷類似物核苷或其組合。尿 普類似物核苷包括如脫氧尿苷(dU)、胞苷(C)、脫氧胞苷(dC)、胸苷(T)、 脫氧胸苷(dT)、 5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、2，-0-曱基尿苷、5-碘尿嘧啶、 5-甲氧基-乙氧基-甲基尿嘧啶、5-丙炔基脫氧尿苷等。
"CpG基序"或"CpG元件"或"CpG位點"是指核酸中含有與 鳥苷相鄰的胞苷的核苷酸基序。核苷C和G被以常規5'-3，核苷鍵連接 它們的磷酸酯隔開。CpG基序一般可描述為XnCpGXn,其中X是任意 核苷，n是從l到約500的任意數字或其間的任意數值，例如，從約l到 約300或其間的任意數值，從約1到約250或其間的任意數值，從約l到 約200或其間的任意數值，從約1到約150或其間的任意數值，1、 5、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、卯、100、 125、 150、 175、 200、 225、 250、 275、 300、 325、 250、 275、 400、 425、 250、 475、 500或其間的任意數值。 如本文所描述，優選CpG基序中一個或多個核苷、C、 G是LNA。
雙鏈核酸(包括dsRNA )分子中的鏈通過氫鍵(也稱作"Watson-Crick"威基配對)以有序方式相互作用。也可通過非常規的氬鍵(包括Hoogsteen 威基配對)發生改變的威基配對。在一些熱力學、離子或pH條件下可能 出現三螺旋，尤其是對於核糖核酸而言。上述或其他改變的氬鍵或威基配 對為本領域所知，並可見於例如Lehninger - Principles of Biochemistry第 三版(Nelson和Cox編輯.Worth Publishers, New York;通過參考併入本文)。
在合適溫度、離子和pH *下，本發明多個實施方案的polyl和polyC 或者polyA和polyU寡核苷酸可通過"Watson-Crick"氳鍵形成雙鏈複合 體。本領域技術人員能夠了解適於形成上述複合體的具體溫度、離子和pH 條件為本領域技術人員所知，獲知上述條件的方法、計算、技術等的實施 例可見於例如Freier(1997, Nucleic Acids Res. 25:4429-4443;通過參考併入 本文)。這種雙鏈複合物的形成也可稱作"雜交"。
根據本發明多個實施方案的^^有至少一個LNA的雙鏈RNA( dsRNA) 分子一:^描述為式II:
V"Sm)-Wp
式II表示具有第一鏈Vn-(SJ-Wp和第二鏈Zn-(Dm)-Qp的雙鏈RNA 分子，互補核苷之間的鍵以單橫線表示。第一鏈以5，到3'方向(從左到 右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3， 到5')表示。
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，#^是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果p^則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q是任意核苷、核糖核普、脫氧核糖核苷、核普類似物、
核糖核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；-m可以是從1到500或10到50的任意整數，或其間的任意整數， 包括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S B苷或肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞嘧咬或胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
一其中V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸 (LNA)單體。
根據本發明多個實施方案的含有至少一個LNA並且還含有R的雙 鏈RNA (dsRNA)分子一般描述為式IIa:
R『Vn- (Sra) _Wp-Rk2 Rk3-Zn- (Dm) -Qp-Rk4
式na
式IIa表示具有5'、 3'或者同時具有5'和3'突出威基、並具有第一鏈 Ria-Vn-(Sm)-Wp-Ru2和第二鏈Rk3-Zn-(Dm)-Qp-Rk4的雙鏈RNA分子，互補 核普之間的鍵以單橫線表示。第一鏈以5'到3'方向(從左到右)表示， 而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3，到5，)表示。
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，*是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，條件是如果p=0則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q可以獨立地為通過核苷間連接基團連接的任意核糖核 苷，其中V能與Z成鍵，W能與Q成鍵；
-m可以是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括 5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100; -S ;U/L苷或肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D AJife嗜咬或胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬類似物核苷； 誦ki、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地是通過核苷間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在。在一些實施方案中，例如，第一鏈的5，R核糖核
苷能夠與第二鏈的3，R核糖核苷成鍵；並且，
-其中R、 V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個LNA 單體。
含有polyl:C的核酸
本發明還提供式II (其中S和D是I和C )的dsRNA化合物(式
lib ):
Vn-(Im)-Wp I I I
Zn-(Cm)-Qp
式IIb
式lib表示具有第一鏈Vn-(Im)-Wp和第二鏈Zn-(Cm)-Qp的雙鏈RNA 分子，互補核苷之間的鍵以單橫線表示。第一鏈以5，到3'方向(從左到 右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3， 到5，)表示。
國n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，糾是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
國p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，4Hf是如果p^則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
40-V、 W、 Z和Q可以獨立地為通過核苷間連接基團連接的任意核苷， 其中V能與Z成鍵，W能與Q成鍵；
-m可以是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括 5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-1是肌苷或任意肌苷類似物核苷，其通過核苷間連接基團連接到V、 W和相應的肌苷或肌苷類似物核普；
-C是胞嗜咬或任意胞嘧啶類似物核苷，其通過核苷間連接基團連接 到v、 w和相應的胞苷或任意胞苷類似物核苷；並且，
-其中V、 I、 W、 Z、 C和Q中的一個或多個包含一個或多個LNA 單體。
本發明的另一些dsRNA分子包括式II (其中S和D是I和C,並 含有R的化合物)，其定義如下(式IIc):
Rki-Vn- (Im) —Wp-Rk2
I I I
Rk3-Zn- (Cm) -Qp—Rk4
式IIc
式IIc表示具有5，、 3，或者同時具有5，和3'突出M、並具有第一鏈 Rk-Vn-(Im)-Wp-Rk和第二鏈Rk-Zn-(Cm)-Qp-Rk的雙鏈RNA分子，互補核苷 之間的鍵以單橫線表示。第一鏈以5，到3'方向(從左到右)表示，而第 二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3，到5，)表示。
畫n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，糾是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從o到io的任意整數，或其間的任意數值，a是如果p^則
n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
- V、 W、 Z和Q可以獨立地為通過核苷間連接基團連接的任意核糖核苷，其中V能與Z成鍵，W能與Q成鍵；
-m可以是1到500或10到50的任意整數，或其間的任意整數，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-1可以是肌苷或任意肌苷類似物核苷，其通過核苷間連接基團連接到 V、 W和相應的肌苷或肌苷類似物核苷；
-C可以是胞嗜咬或任意胞嘧啶類似物核糖核苷，其通過核苷間連接 基團連接到V、 w和相應的胞苷或任意胞苷類似物；
國ka、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地是通過核苷間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在。在一些實施方案中，例如，第一鏈的5，R核糖核 苷能夠與第二鏈的3'R核糖核苷成鍵；此外，
■其中R、 V、 I、 W、 Z、 C和Q中的一個或多個包含一個或多個LNA 單體。
^^有至少一個LNA的雙鏈RNA (dsRNA)分子包括式II (其中S 和D是A和U)的化合物，其定義如下(式IId): —般也描述為式IId:
formula see original document page 42
式lid
式IId表示具有第 一鏈Vn-(Am)-Wp和第二鏈Zn-(Um)-Qp的雙鏈RNA 分子，互補核苷之間的鍵以單橫線表示。第一鏈以5，到3'方向(從左到 右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3， 到5')表示。
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，#^是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，^ff是如果p^則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
隱V、 W、 Z和Q可以獨立地為通過核苷間連接基團連接的任意核苷， 其中V能與Z成鍵，W能與Q成鍵；
-m可以是1到500或10到50的任意整數，或其間的任意整數，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或綱j
-A可以是腺普或任意腺普類似物核苷，其通過核苷間連接基團連接到 V、 W和相應的腺苷或腺苷類似物；
-U可以l泉嘧咬或任意尿嘧啶類似物核苷，其通過核苷間連接基團 連接到V、 W和相應的尿苷或任意尿苷類似物；並且，
-其中R、 V、 A、 W、 Z、 U和Q中的一個或多個包含一個或多個 LNA單體。
本發明的另一些dsRNA分子包括式II (其中S和D是A和U，並 含有R)的化合物，其定義如下(式lie):其中該dsRNA的至少一個核 苷是LNAformula see original document page 43
式IIe
式lle表示具有5'、 3，或者同時具有5'和3'突出^、並具有第一鏈
RkrVn-(L)-Wp-Rk2和第二鏈Rk4-Zn-(Cm)-Qp-Rk3的雙鏈RNA分子，互補核
苷之間的鍵以單橫線表示。第一鏈以5'到3'方向(從左到右)表示，而 第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3'到5，)表示。
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果n一則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，4Ht是如果p-0則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V、 W、 Z和Q可以獨立地為通過核苷間連接基團連接的任意核苷， 其中V能與Z成鍵，W能與Q成鍵；
-m可以是1到500或10到50的任意整數，或其間的任意整數，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或,
-A可以是腺苷或任意腺苷類似物核苷，其通過核苷間連接基團連接到 V、 W和相應的腺苷或腺苷類似物；
-U可以是尿嘧咬或任意尿嘧咬類似物核苷，其通過核苷間連接基團 連接到V、 W和相應的尿苷或任意尿苷類似物；並且，
畫kp k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地是通過核普間連接基團連接到相應核苷的任意核苷， 或者R可以不存在。在一些實施方案中，例如，第一鏈的5'R核苷能夠與 第二鏈的3'R核苷成鍵；此外，
-其中R、 V、 A、 W、 Z、 U和Q中的一個或多個包含一個或多個 LNA單體。
根據式II、 IIa、 IIb、 IIc、 IId、 lie的化合物可在R、 V、 W、 Z、 Q中的一個或多個中包含一個或多個LNA分子。例如， 一個或多個LNA 分子可以位於式II、 IIa、 IIb、 IIc、 1Id或IIe的5，端的V、 Q或者V和Q 中， 一個或多個LNA分子可以位於式II、 IIa、 IIb、 IIc、 IId或lie的3， 端的Z、 W或者Z和W中，或者一個或多個LNA分子可以位於式II、 IIa、 IIb、 IIc、 1Id或IIe的5，和3，端的V、 W、 Z、 Q或其組合中。
本發明還提供根據式II、 IIa、 IIb、 IIc、 IId或IIe的化合物，其中 V和W是LNA核苷(分別為Vlna、 Wlna ), Z和Q是LNA核苷(分別 為Z^a、 QLNA), IAJ化苷，C^IJ&苷，n和p為2， m如上述定義，可以 是從1到500或其間的任意數值(例如m是從約10到約50或其間的任意數值，例如m是約l、 2、 5、 7、 10、 12、 14、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 32、 35、 40、 45、 50、 60、 70、 80、卯、100或其間的任意數值，例如m可以是18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25),其間的核普間連接基團是磷酸二酯。這種化合物的非限制性實例 表示為式III:
Vlna-Vlna-(Ihi)-Wlna-Wlna
zlna-zlna-(Cm)-qlna-qlna
式in
本發明dsRNA的非限制性實例也可以表示為式IIIa、 IIIb、 IIIc或 IIId中的任一個，其中G是鳥嘌呤核苷、C是胞嘧咬核苷、m是22:
Glna-Glna-(!22)-Glna-Glna
Clna-Clna-(C22)-Clna-Clna
Glna"Glna-(I22)-Clna陽Clna Clna-Clna-(C22)-Glna-Glna
Qj^a-Clna-(I22)-Clna-Clna Glna-Glna-(C22)-Glna-Glna
Clna-Clna-(!22)-Glna-Glna Glna-Glna-(C22)-Clna-Clna
式UIa
式nib
式nic
式nid
根據本發明多個實施方案的含有至少一個LNA的單鏈核酸分子或 單鏈RNA (ssRNA)分子一般描述為式IVa:
Vn-(Sm)-Wp
式IVa式IVa表示具有Vn-(SJ-Wp構造(從左到右以5'到3'方向表示) 的單鏈核酸分子
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，條件是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，條件是如果p=0則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V和W是任意核普、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖
核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整數，或其間的任意整數，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S是肌苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；此外，
-其中V、 S和W中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA)單體。
根據本發明多個實施方案的含有至少一個LNA的單鏈核酸分子或 單鏈RNA (ssRNA)分子一般描述為式IVb:
Q"Dm)-Zn
式IVb
式IVb表示具有第一鏈Qp-(Dm)-Zn (從左到右以5，到3'方向表示) 的單鏈RNA分子。
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，糾是如果n一則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;誦p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果p-0則 ii-l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖
核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；
-m是從1到500的任意整數，或其間的任一數值；
-D是胞嘧咬或胞嗜咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬類似物核苷；並
且，
-其中Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA)單體。
在本發明的一些實施方案中，組合物可能以不同摩爾比含有式IVa 或式IVb或者同時含有式IVa和式IVb的單鏈RNA分子。例如，在一些 實施方案中，式IVa和式IVb的單鏈RNA分子可以大致約等摩爾比相組 合。式IVa和式IVb的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單鏈 RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVa的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式IVb的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式IVa或式IVb的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單 鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVb的單鏈RNA分子可以約10。/。、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式IVa的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式IVa或式IVb的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單 鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
根據本發明多個實施方案的含有至少一個LNA的單鏈核酸分子或 單鏈RNA (ssRNA)分子一般描述為式IVc:Rkl-Vn-(Sm)-Wp-Rk2
式IVc
式IVc表示具有R!d-Vn-(SnO-Wp-Rk2構造(從左到右以5，到3'方向
表示)的單鏈RNA分子。 其中
誦n是從O到IO的任意整數，或其間的任意數值，糾是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，^Hf是如果p一則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖
核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整數，或其間的任意整數，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100)
-S;U/L苷或肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-&和k2可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地是通過核苷間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核 普，或者R可以不存在。在一些實施方案中，例如，第一鏈的5'R核糖核 苷能夠與第二鏈的3'R核糖核苷成鍵，並且；
-其中V、 S、 R和W中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA) 單體。
根據本發明多個實施方案的含有至少一個LNA的單^^酸分子或 單鏈RNA (ssRNA)分子一般描述為式IVd:Rk3- Qp畫(Dm)- Zn -Rk4
式IVd
式IVd表示具有Rk3-Qp-(DJ-Zn-Rk4構造(從左到右以5'到3'方向 表示)的單鏈RNA分子
其中
-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，*是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果p=0則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;
-Z和Q是任意核香、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖
核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整數，或其間的任意整數，包 括5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100)
-D是胞嘧咬或胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬類似物核苷；
-k3和b可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地是通過核苷間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核
苷，或者R可以不存在。在一些實施方案中，例如，第一鏈的5'R核糖核 苷能夠與第二鏈的3'R核糖核苷成鍵；此外，
-其中R、 Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA) 單體。
在本發明的一些實施方案中，組合物可以以不同摩爾比含有式IVc 或式IVd或者式IVc和式IVd的單鏈RNA分子。例如，在一些實施方案 中，式IVc和式IVd的單鏈RNA分子可以以大致等摩爾比相組合。式IVc 和式IVd的 一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，根據式IVc的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/。的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或lO倍的倍數過量與式IVd的單鏈RNA分子組合 到組合物中。式IVc或式IVd的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互 補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVd的單鏈RNA分子可以約10。/0、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/。的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式IVc的單鏈RNA分子組合到組合 物中。根據式IVc或式IVd的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補 的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
本發明單鏈核酸的非限制性實例可以表示為式IVe、 IVf、 IVg、 IVh、 IVi或IVj中的任一個(從左到右以5'到3'方向表示)，其中I是2'-0-甲基 肌苷，C是2'-0-甲基胞苷，G是2'-0-甲基鳥苷，T是2，-0'曱基胸苷，A 是2'-0-甲基腺苷，U是2'-0-甲基尿苷，Tj^a是帶有LNA核糖的胸苷， G^a是帶有LNA核糖的鳥苷，d^a是帶有LNA核糖的胞苷，A^a是一 個LNA核糖的腺普，m為15:式IVe 式IVf
Glna_(Ii5)_G-Tlna-Glna-A-Tlna-A-Tlna
式IVg 式IVh
Tlna-Glna-GisKTlna-Tlna-A-Tlna-Alna
式IVi
alna-c[^a*(Ci5)-clna-A- Tlna-A Tuvu-Q^a
式iyj
在本發明的一些實施方案中，組合物可以以不同摩爾比含有式IVe 或式IVf或者式IVe和式IVf的單鏈RNA分子。例如，在一些實施方案中， 式IVe和式IVf的單鏈RNA分子可以以大致等摩爾比相組合。式IVe和 式IVf的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補的單鏈RNA分子雜交 形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVe的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式IVf的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式IVe或式IVf的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單 鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVf的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式IVe的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式IVe或式IVf的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單 鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在本發明的一些實施方案中，組合物可能以不同摩爾比含有根據式IVg或式IVh或者式IVg和式IVh的單鏈RNA分子。例如，在一些實施 方案中，式IVg和式IVh的單鏈RNA分子可以以大致等摩爾比相組合。 式IVg和式IVh的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補的單鏈RNA 分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVg的單鏈RNA分子可以約10。/。、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式IVh的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式IVg或式IVh的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單 鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVh的單鏈RNA分子可以約10。/。、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式IVg的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式IVg或式IVh的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單 鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在本發明的一些實施方案中，組合物可能以不同摩爾比含有根據式 IVi或式IVj或者式IVi和式IVj的單鏈RNA分子。例如，在一些實施方 案中，式IVi和式IVj的單鏈RNA分子可以以大致等摩爾比相組合。式 IVi和式IVj的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單鏈RNA分 子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVi的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或lO倍的倍數過量與式IVj的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式IVi或式IVj的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單鏈 RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式IVj的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式IVi的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式IVi或式IVj的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補的單鏈 RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。在一些實施方案中，單鏈核酸對(如式IVe和IVf、式IVg和IVh 或者式IVi和IVj)可在一定熱力學、離子或pH條件下雜交和/或串聯。
含有CpG基序的核酸
根據本發明多個實施方案的含有CpG基序的雙鏈核酸分子(其中 CpG基序含有至少一個LNA) —般描述為式VIa-VId:
Rk廣(Sm) - (ELNA) - (Dm) -Rk2 I I I I I
Rk3_ (Dm) - (FLNA) - (Sm) _Rk4
式VIa
式Via表示具有第一鏈Rkl- (Sm) - (ELNA) - (Dm) - Rk2和第二鏈R^-(Dm) - (FLNA) - (Sm) - Rk4的雙鏈核酸分子，互補核苷雜交的鍵以單橫線表 示。第一鏈以5'到3'方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向 平行的方向(從左到右顯示為3，到5，)表示。
Rkl- (Dm) - (ElnA) 一 (Sm) -Rk2
I I I I I
Rk3_ (Sm) _ (FlnA) _ (Dm) -Rk4
式Mb
式VIb表示具有第一鏈Rkl- (Dm) - (ELNA)國(Sm)國Ru2和第二鏈 (Sm) - ( FLNA) - (Dra) - Rk4的雙鏈核酸分子，互補核苷雜交的鍵以單橫線表 示。第一鏈以5，到3'方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向 平行的方向(從左到右顯示為3，到5，)表示。
Rk廣(Sm) - (ELNA) - (Sm) -Rk2
II I I I
Rio- (Dm) - (FLNA) - (Dm) -Rk4
式Vic
式VIc表示具有第一鏈Rk廣(Sm)國(ELNA) - (Sm) - Rk2和第二鏈R^ (Dm) - ( FLNA) - (Dm) - Rk4的雙鏈核酸分子，互補核苷雜交的鍵以單橫線表 示。第一鏈以5'到3'方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向 平行的方向(從左到右顯示為3'到5，)表示。formula see original document page 54
式VId
式VId表示具有第一鏈Rkl- (Dm)畫(ELNA)畫(Dm) - Rk2和第二鏈Rk3-(Sm) - ( FLNA) - (Sm) - Rk4的雙鏈核酸分子，互補核苷雜交的鍵以單橫線表示。第一鏈以5，到3'方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3'到5')表示。
對式VIa-VId中的每一個而言
國ELNA是CpG或CpG基序，C、 G中的一個或多個是LNA;
國FLNA是CpG或CpG基序，C、 G中的一個或多個是LNA;
其中組成該CpG或CpG差^序的核普、其中組成該CpG或CpG基序的核苷、
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-S是肌苷或肌苷類似物核苷、腺噪呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞嘧咬或胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬類似物核香；
-&、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷。
在不應認為以任何方式進行限制的一些本發明實施方案中，CpG基序可以包含LNA核苷的兩條六聚體序列
Elna = 5' - Glna Tlna Clna Glna T lna TLNA - 3'(SEQ ID NO: 23);和Flna = 5' - ALna ALna ClnaGlna ALna CLna ■ 3'(SEQ ID NO: 24)。這些序列的非限制性實例一般描述為式Vie到VIh:formula see original document page 55式VIe
式Vie表示具有第一鏈VIi和第二鏈VIj的雙鏈核酸分子，互補核苷雜交的鍵以單橫線表示。
VIi:Rki- (Sm) -GLNA-TLNA-CLNA-Glna-Tlna-T^na- (Dm) -Rk2
VIj:Rjc3- (Dm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alna- (Sm) -Rk4
第一鏈以5'到3'方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3'到5')表示。
Rk:l- (Dm) -GluA-Tlna-ClnA-Glna-Tlna-TLNA- (Sm) -Rk2
I I I I I I I I I I
Rk3- (Sm) _Clna_Alna_Glna-Clna_Alna-Alna_ (Dm) -Rk4
式VIf
式VIf表示具有第一鏈VIk和第二鏈VII的雙鏈核酸分子，互補核苷雜交的鍵以單橫線表示。
VIk: Rki- (Dm) -Glna_Tlna-Clna-Glna-TLNA_TLNA_ (Sm) _Rk2
VII:Rk3- (Sm) -CLNA-Alna_Glna_Clna-Alna_Alna_ (Dm) -Rk4
第一鏈以5，到3'方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3，到5')表示。
formula see original document page 55式VIg
式VIg表示具有第一鏈Vim和第二鏈VIn的雙鏈核酸分子，互補核苷雜交的鍵以單橫線表示。
Vim: Rkl- (Sm) -GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA- (Sm) -Rk2VIll: Rk3- (Dm) _Clna_Alna-Glna_Clna-Alna-Alna- (Dm) -Rk4
第一鏈以5，到3'方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3，到5，)表示。
Rki— (Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glwa-Tlna-Tlna- (Dm) -Rk2
I I I I I I I I I IRfc3- (Sm) -Clna-Alna-Glna-Clna-Alna-Alwa- (Sm) -Rk4
式VIh
式VIh表示具有第一鏈VIo和第二鏈VIp的雙鏈核酸分子，互補核
苷雜交的鍵以單橫線表示。
VIo: Rk廣(Dm) -Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlma-TLNA_ (Dm) -Rk2
VIp: Rk3- (Sm) _Clna_Alna-Glna_Clna_Alna_Alna_ (Sm) -Rk4'
第一鏈以5'到3'方向(從左到右)表示，而第二鏈以與第一鏈反向平行的方向(從左到右顯示為3'到5，)表示。
對式VIe-VIh和VIi-VIp中的每一個而言
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、 90或100;
-SB普、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-DAJ!fc嘧啶、胞嗜咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
-kr k2、 &和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷。
在本發明的一些實施方案中，含有至少一個CpG基序(其含有至少一個LNA核苷)的雙鏈核酸可以含有未配對的核苷，形成"粘末端"，並可形成串聯體。式VIIa-VIIh (下文以5'到3'方向顯示，從左到右)表示根據序列互補性雜交而形成雙鏈核酸(如上述式VIa-VIh所述)的單鏈核酸。才艮據本發明的一些實施方案，含有"粘末端"的雙鏈核酸也可稱作串聯多聚體的單體。下文顯示式VIIa-VIIh，其後為含有式VIIa-VIIh的核酸組合的實例。
式VIla
式VIIb
>式VHc
式VIW
丫式VIIe
(flna)-(Dm)-Rlt2式VUf
式VHg
(FlnaHSib)陽Rk2式VIlh
對式VIIa-VIIh中的每一個而言
-Elna是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、C、 G中的一個或多個是LNA;
-FtNA是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、C、 G中的一個或多個是LNA;
-m是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括5、10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-S;U^苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞嗜啶、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；國kp k2、 ks和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地為通過核普間連接相連的任意核糖核苷。
在本發明的一些實施方案中，組合物中可以含有式VIIa-VIIh中一種或多種核酸的單鏈RNA分子，或者以多種摩爾比含有式VIIa-VIIh中至少兩種或更多種核酸的組合。例如，在一些實施方案中，式Vila和式VIIb的單鏈RNA分子可以以大致等摩爾比相組合。式VIIc、式VIId、式VIIe、式VIIf、式VIIg或式VIIh的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一條互補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式Vila的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍數過量與式VIIb的單鏈RNA分子組合到組合物中。式Vila或式VIIb的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另 一些實施方案中，式VIIc的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯°/。的摩爾過量或以約2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIId的單鏈RNA分子組合到組合物中。式VIIc或式VIId的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VIIe的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIIf的單鏈RNA分子組合到組合物中。式VIIe或式VIIf的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VIIg的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIIh的單鏈RNA分子組合到組合物中。式VIIg或式VIIh的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VIIg的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIId的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式VIIg或式VIId的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的 單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式Vila的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIIf的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式Vila或式VIIf的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的單 鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式Vile的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/。的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIIb的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式VIIe或式VIIb的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的 單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VIIc的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIIh的單鏈RNA分子組合到組合 物中。式VIIc或式VIIh的一些或所有單鏈RNA分子可以與另一互補的 單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
示例性鹼基配對排列圖示如下。本發明多個實施方案中雙鏈核酸的 其他配對和排列對本領域的技術人員而言是很明顯的。對圖示如下的每個 示例性配對方式而言，根據本領域的常M左到右，第一鏈以5'到3'方向 提供，第二鏈以3，到5，方向提供。
59Rk3- (Sm) - (E lna)
(F咖)—(DJ
式Vila式VIIb
Rm- (DJ - {E LNA)
I
(F - (Sm) -Riu
(E跳》-(Sm>-R3kRki- (DJ _ (F LNA)
Rkl - (Sm ) _ (F lna )
式VIIa-VIIh的替代性配對方式，其中kmfO:
Rk3- (Sm) — (E ujA)
(F LNA) - (Dm) —Rk2
Rk3- (DTO) - (E LNA)
(F LNA) - (STO) —Rki
(E lna) _ (Sm) —Rk3
(E LNA) — (Dm) -Rk2
Rkl— (Sm) - (F lna)
式VIIc式VIW
式Vile式VIff
式VIIg
式vnh
式Vila式VIIb
式VIIc式VIId
式Vile式VIIf
式VIIg
式vini
上述單體可以串聯形成更長的或環狀的雙鏈核酸多聚體。
在本發明一些實施方案中，式VIIa-VIIh的單鏈核酸分子可鹼基配對，以形成平末端的雙鏈核酸分子。示例性威基配對排列圖示如下。formula see original document page 61
在上述實例中，k"3，4是從l到10的(非零)整數，R可以是如前
述定義的任意核苷或核4組，其中第一和第二鏈中的各至少一個核苷形成
氫鍵>5^配對。
在一些實施方案中，單鏈核酸對(如式VIIa和VIIb、或式VIIc和VIId、或式Vile和VIIf、或式VIIg和VIIh、或式VIIg和VIId、或式VIIa和VIIf、或式VIIe和VIIb、或式VIIc和VIIh)在一定熱力學、離子或pH^Ht下可發生串聯。
在本發明的一些實施方案中，含有至少一個CpG基序(其含有至少一個LNA核苷)的雙鏈核酸可含有未配對的核苷，形成"粘末端"，還可以形成串聯體。式VIIIa-VIIIh (以5'到3'方向如下表示，從左到右)表示根據序列互補性雜交而形成雙鏈核酸(例如上述式VIa-VIh所述)的單鏈核酸，如上述式VIIa-VIIh所述。根據本發明的一些實施方案，含有"粘末端"的雙鏈核酸也可稱作串聯多聚體的單體。式VIIIa-VIIIh如下表示，其後為含有式VIIIa-VIIIh的核酸組合的實施例。(Sm)- Rki— (Elna)式Villa
(Dm)- Rk2墨(FlnA)式vnib
(Dm)- RkT(Eu4A)式vine
(Sm)- Rk4- (FlNA)式Vllld
(elna)畫Rk廣(Sm)式VIIIe
(FlNA) -Rk2 (Dm)式vim
(ELNA) -Rk2-(Dm)式VIIIg
(Flna)-Rk2 -(Sm)式vmh
對於式Villa-VIIIh中的每一個
畫ELNA是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一個或多個是LNA;
誦FLNA是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一個或多個是LNA;
-m可以是從1到500或10-50的任意整數，或其間的任意整數，包括 5、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 60、 70、 80、卯或100;
-SB苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；
-lq、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；
-R可以獨立地為通過核普間連接相連的任意核糖核苷。
在本發明的一些實施方案中，組合物可含有式VIIIa-VIIIh中一種或
62多種核酸的單鏈RNA分子，或者以多種摩爾比含有式Villa-VIIIh中至少 兩種或更多種以上核酸的組合。例如，在一些實施方案中，式Villa和式 VIIIb的單鏈RNA分子可以以大致等摩爾比相組合。式VIIIc、式VIIId、 式VIIIe、式VIIIf、式VIIIg或式VIIIh的一些或所有單鏈RNA分子可 以與另 一條互補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜 交。
在另一些實施方案中，式Villa的單鏈RNA分子可以約10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍數過量與式VIIIb的單鏈RNA分子組合到組 合物中。式Villa或式VIIIb的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補 的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另 一些實施方案中，式VIIIc的單鏈RNA分子可以約10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIIId的單鏈RNA分子組合到組 合物中。式VIIIc或式VIIId的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補 的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VIIIe的單鏈RNA分子可以約10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍數過量與式VIIIf的單鏈RNA分子組合到組 合物中。式VIIIe或式VIIK的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補 的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VIIIg的單鏈RNA分子可以約10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90。/。的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍數過量與式VIIIh的單鏈RNA分子組合到組 合物中。式VIIIg或式VIIIh的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補 的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VHIg的單鏈RNA分子可以約10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70o/o、 80%、卯％的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍的倍數過量與式VIIId的單鏈RNA分子組合到組 合物中。式VIIIg或式VIIId的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式Villa的單鏈RNA分子可以約10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍數過量與式VIIIf的單鏈RNA分子組合到組 合物中。式VIIIa或式VIIIf的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補 的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VIIIe的單鏈RNA分子可以約10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍數過量與式Vlllb的單鏈RNA分子組合到組 合物中。式VIIIe或式VIIIb的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補 的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
在另一些實施方案中，式VIIIc的單鏈RNA分子可以約10%、20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%的摩爾過量或以約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或IO倍的倍數過量與式VIIIh的單鏈RNA分子組合到組 合物中。式VIIIc或式VIIIh的一些或所有單鏈RNA分子可以與另 一互補 的單鏈RNA分子雜交形成雙鏈RNA分子，或者可以不雜交。
示例性威基配對排列圖示如下。根據本發明多個實施方案的雙鏈核 酸的其他配對和排列對本領域的技術人員而言是很明顯的。對圖示如下的 每個示例性配對方式，根據本領域的常皿左到右，第一鏈以5，到3'方向 提供，第二鏈以3，到5'方向提供。
64formula see original document page 65式Villa-VIIIh的替代性配對方式formula see original document page 65
這些單體可串聯形成更長的或環狀的雙鏈核酸多聚體。
在本發明一些實施方案中，式VIIIa-VIIIh的單鏈核酸分子可鹼基配 對形成平末端的雙鏈核酸分子。示例性威基配對排列圖示如下。< Sro) -Rm一 (E uja)
II !
(Dm) -Ria- (F lwa)
(F LNA) -Rk2- (DJ
(Dm) -Rk3- (E LWA) I I I
式VHIg 式VHId
式VHIa
式vinf
式VIIIe
式vinb 式vine
式VHIh
說明書第59/73頁
在上述實例中，k^，3，4可為0到10的整數，R可以是如前述定義的 任意核苷或核苷組。在k;於0的一些實施方案中，第一和第二鏈中各至 少一個核苷R形成氬鍵鹼基配對。
在一些實施方案中，單li核酸對(如式Villa和VIIIb、或式VIIIc 和VIIId、或式VIIIe和VIIIf、或式VIIIg和VIIIh、或式VIIIg和VIIId、 或式Villa和VIIIf、或式VIIIe和VIIIb、或式VIIIc和VIIIh)在一定熱 力學、離子或pH^Hf下可發生串聯。
根據本發明多個實施方案的佐劑或佐劑組合物包含本文所述的 一個 或多個核酸種類。所述核酸種類可以是單鏈或雙鏈。佐劑或佐劑組合物中 可存在單鏈與雙鏈種類的組合。
佐劑或佐劑組合物可以是TLR3或TLR9的選擇性激動劑。在本發 明一些實施方案中，佐劑或佐劑組合物是TLR3和TLR9兩者的激動劑。 含有TLR3和TLR9 二者的雙鏈核酸的實例包括含有兩個或多個式 VIIa-h、或式VIIIa-h、或式VIIa-h和式VIIIa-h的核酸。
根據本發明一些實施方案的雙鏈核酸(如包括含兩個或多個式 VIIa-h、或式VIIIa-h的核酸)可包含於佐劑或佐劑組合物中，以提供具 有TLR3和TLR9兩者之激動劑活性的佐劑或佐劑組合物。TLR3和TLR9兩者的激動劑活性可以由單個雙鏈核酸種類4^供。
可使用IP-10測定來評估佐劑組合物提供TLR-3激動劑活性的能力。 由於TLR-3激動劑的刺激，人HT29細胞向培養上清液中分泌IP-IO。培 養上清液中的IP-10可以通過例如ELISA來定量。作為另一個實例，由於 TLR-3激動劑的刺激，外周血單核細胞(PBMC)向上清液中分泌細胞因子。 所分泌的細胞因子，例如幹擾素-a、 -p和/或-y可以通過例如ELISA來定 量。作為另一個實例，可以評估免疫效應細胞(如樹突細胞)的成熟。
還可使用體外測定方法來評估佐劑組合物提供TLR9激動劑活性的 能力。例如，雙鏈核B合物的活性可通過B細胞增殖測定或者巨噬細胞 或樹突細胞的細胞因子產生來評估。上述測定的實例描述於例如Jiang W 等2006. Methods Mol Med 127:55-70。
根據本發明多個實施方案的組合物(包括佐劑組合物)可以以約 0.1ug/kg到約20mg/kg核酸(根據受試者的體重)或其間任意量的劑量施 用，例如，每毫升約lug到約2000ug核酸或其間的任意量，約10ug到約 1000ug核酸或其間的任意量，約30ug到約1000ug核酸或其間的任意量。 例如，可使用約O.l、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0、 10.0、 15.0、 20.0、 25.0、 30.0、 35.0、 40.0、 50.0、 60.0、 70.0、 80.0、 90.0、 100、 120、 140、 160180、 200、 250、 500、 750、 1000、 1500、 2000、 5000、 10000、 20000 ug核酸的劑量。
本文中使用的佐劑"有效量"是指與免疫原(所述免疫原證實具有 生物活性)共同施用時具有免疫刺激效應所需的佐劑量。免疫原可以以約 0.1ug/ml到約20mg/ml或其間任意量或者lug/ml到約2000ug/ml或其間 任意量存在。佐劑可以以約0.1ug/ml到約20mg/ml或其間任意量或者 lug/ml到約2000ug/ml或其間任意量存在。免疫原可以是滅活的完整生 物體、蛋白質、肽、融合蛋白、融合肽、重組蛋白或重組肽。免疫原可 以是HspE7。
根據本發明多個實施方案的佐劑可以與多種可藥用賦形劑中的任一 種配製在一起，通常配製在含水介質中，如注射用水、乳酸;M^液、等滲 生理鹽水等)中。可藥用賦形劑包括如鹽、緩衝劑、抗氧化劑、#劑、 張度劑、冷凍保護劑、凍幹保護劑、助懸劑、乳化劑、抗微生物劑、防腐 劑、螯合劑、粘合劑、表面活性劑、潤溼劑、非水栽體如不揮髮油或者用於持續和控制釋放的聚合物。參看如Berge等(1977. J. Pharm Sci. 66:1-19)、或Remington- The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition. Gennaro等編輯.Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia (所述文獻都 通過參考併入本文)。
賦形劑也可以是羧曱基纖維素或多聚陽離子多聚體。多聚陽離子多 聚體的實例包括但不僅限於聚L-賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸或者主要 含陽性胺基酸的多肽。這些賦形劑的分子量、濃度和製備方法可見於例 如US 4,349,538 (通過參考併入本文)。
包含本發明多個實施方案之佐劑的組合物可以通過多種途徑中的任 一種施用，所述途徑包括例如皮下注射、J^M內注射、肌內注射、靜脈注 射、表皮或透皮給藥、黏膜給藥、經口、經鼻、直腸或陰道給藥。參看， 例如Remington畫The Science and Practice of Pharmacy,第二十一版 Gennaro等編輯Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia。可根據施用 途徑來選擇或修飾載體配方。
根據本發明多個實施方案的組合物可以以單位劑量形式或者適於在 使用時配製和稀釋的大量形式4C供。
根據本發明多個實施方案的組合物可以以單劑量或者按時間施用的 多劑量施用於受試者。給藥方案可取決於例如受試者的狀況、年齡、性別、 體重、施用途徑、配方或一般健康狀況。用於人受試者的給藥方案可以通 過測定受試者中的吸收、分布、代謝、排洩和毒性來計算，或者可以通過 對實驗動物(例如兔或鼠)的測定來外推。劑量和治療方案的優化討論於 例如Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics第 十一版.2006. LL Brunton編輯.McGraw國Hill， New York,或Remington-The Science and Practice of Pharmacy,第二十一版.Gennaro等編輯. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia.
在本發明的上下文中，本文使用的術語"治療"、"處理"、"治療用 途"或"治療方案"可以互換使用，意在涵蓋本發明組合物的預防、緩解 和治療模式，並包括權利要求所述組合物的任何及所有以下用途，其用於 治療由基於炎症的病狀、癌症、感染性疾病、變態反應、過免^^應或其 他待治療疾病或紊亂所引起的疾病狀態、病症、症狀、體徵或紊亂，或用
68於預防、阻礙、延遲或逆轉上述疾病相關的症狀、體徵、病症或紊亂。因 此，本發明涵蓋對不期望的疾病狀態、症狀、病症、體徵或紊亂(與基於 炎症的病狀或其他疾病或紊亂相關)或者受益於積i體免疫應答刺激的其他 疾病或病症進行的任何預防、改善、緩和、逆轉或完全消除。治療可包括 以單獨或與免疫原組合施用有效量的本文所述組合物。
根據本發明多個實施方案的組合物還可包含一種或多種免疫原，例 如病毒或細菌("病原體")免疫原。免疫原可以由滅活的完整生物體("滅 活疫苗")製備，或者可由病原體的特異性蛋白質、肽或其他結構製備。或 者，免疫原可以是融合蛋白，該融合蛋白含有來自病原體的完整或部分蛋 白質或肽，其與另一非病原體蛋白質或肽(例如"組氨酸標籤"或其他可 用於純化該免疫原的部分)相融合。特異性蛋白質或肽可以用分子生物學 技術或方法("重組"蛋白質或肽)生產。重組分子生物學中的常用技術
和方法描述於例如Molecular Cloning: a Laboratory Manual第三版. Sambrook和Russell. CSHL Press, Cold Spring Harbour, New York; Current Protocols in Molecular Biology, 2007 Ausubel等編輯.Wiley InterScience, New York; Current Protocols in Immunology, 2006 Coligan et al editors. Wiley InterScience, New York。
免疫原的實例包括但不僅限於包含熱激蛋白、來自細菌、真菌或病 毒病原體之抗原的蛋白質，或者包含來自細菌、真菌或病毒病原體之抗原 的熱激蛋白融合蛋白(例如但不僅限於HspE7， WO 99/07860， US 7,157,089， 二者都通過參考併入本文)。細菌、真菌或病毒病原體的實例包 括但不僅限於如下疾病的致病因子乳頭狀瘤、生殖器疣、流行性感冒、 A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、巨細 胞病毒、EB病毒、AIDS、 AIDS相關複合體、水痘、普通感冒、巨細胞 病毒感染、科羅拉多壁蝨熱-登革熱、伊波拉出血熱、手足口病、肝炎、單 純皰滲、帶狀皰滲、HPV、流行性感冒(流感)、拉沙熱、麻滲、馬爾堡 出血熱、感染性單核細胞增多症、腮腺炎、脊MA質炎、進行性多灶性腦 白質病、狂犬病、風療、SARS、天花(痘症)、病毒性腦炎、病毒性腸胃炎、 病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅病、黃熱病、炭疽、細菌性腦膜炎、 肉毒中毒、普魯氏菌病、彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流行性斑療傷 寒病、、淋病、膿皰病、軍團桿菌病、麻瘋病、細螺旋體病、李斯特菌病、 萊姆病、類鼻疽、MRSA感染、諾卡菌病、百日咳、鼠疫、大葉性肺炎、
69鸚鷸熱、Q熱、落基山斑滲熱(RMSF)、沙門氏菌病、猩紅熱、志賀氏菌 病、梅毒、破傷風、沙眼、結核病、野兔病、傷寒症、斑滲傷寒症、M 感染、麴黴病、蛙糞黴病、念珠菌病、隱球菌病、球孢子菌病、腳縳、癬 菌病、組織胞漿菌病、真菌血症、副球孢子菌病、肺孢子蟲性肺炎等。重 組免疫原可以用重組表達系統(例如細菌、酵母、杆狀病毒、哺乳動物細 胞或植物表達系統)來表達。
在本發明一些實施方案中，根據本發明多個實施方案的組合物可用 於治療與細菌或病毒病原體相關的疾病或紊亂。與細菌或病毒病原體相關 的疾病或紊亂包括但不僅限於細菌或病毒病原體的活躍性或潛伏性感染、 與細菌或病毒病原體的活躍性或潛伏性感染一起發生或之後發生的自身 免疫應答、與細菌或病毒病原體的活躍性或潛伏性感染一起義生或之後發 生的副作用。
在本發明一些實施方案中，免疫原可以是腫瘤抗原或者癌症相關抗原。
術語"癌症"有許多種定義。梠》據American Cancer Society,癌症 是特徵在於異常細胞失控生長(並有時擴散)的一組疾病。儘管經常被稱 作單個疾病，但實際上它包含了多於200種不同疾病。癌的生長能殺死(當 上述細胞阻止生命必需器官的正常功能時)機體或在整個機體中傳播，損 傷基本系統。本發明的組合物可用於治療動物或受試者中易感贅生物的方 法中，所述方法包括對有此需要的動物或受試者施用有效量的本發明化合 物或組合物。
本發明化合物可作為其有效治療劑的不同類型癌症的非限制性實例 包括癌，如中樞神經系統贅生物，包括多形性成膠質細胞瘤、星形細胞 瘤、少突神經膠質細胞瘤、室管膜和脈絡叢腫瘤、松果體瘤、神經元瘤、 成神經管細胞瘤、神經鞘瘤、腦膜瘤和髄膜肉瘤；眼部贅生物，包括基底 細胞瘤、鱗狀細胞瘤、黑素瘤、橫紋肌肉瘤和視網膜神經M瘤；內分泌 腺贅生物，包括垂體贅生物、曱狀腺贅生物、腎上腺贅生物、神經內分泌 系統贅生物、胃腸胰內分泌系統贅生物和生殖腺贅生物；頭頸部贅生物， 包括頭頸癌、口腔及咽喉部贅生物和牙原性腫瘤；胸部贅生物，包括大細 胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤和胸腔原始生 殖細胞瘤；消化道贅生物，包括食道、胃、肝、膽嚢、外分泌胰腺、小腸、闌尾和腹膜的贅生物、結直腸腺癌和肛門贅生物；泌尿生殖道贅生物，包 括腎細胞癌、骨盆、輸尿管、膀胱、尿道、前列腺、陰莖、睪丸的贅生物; 以及女性生殖器官，包括外陰和陰道、宮頸的贅生物、子宮內膜癌、卵巢 癌、婦科肉瘤和乳腺贅生物；皮膚贅生物，包括基底細胞癌、鱗狀細胞癌、 皮膚纖維肉瘤、Merkd細胞瘤和惡性黑素癌；骨骼和軟組織贅生物，包括 骨源性肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤因氏肉瘤、原始神經外 胚葉瘤和血管肉瘤；造血系統贅生物，包括骨骼增生異常症候群、急性髓 細胞樣白血病、慢性粒細胞性白血病、急性淋巴細胞性白血病、HTLV-1 和5、 T細胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞性白血病、 霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和肥大細胞白血病；以及兒童贅生物，包括急 性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、成神經細胞瘤、骨瘤、橫紋 肌肉瘤、淋巴瘤、腎瘤等。
在本發明一些實施方案中，免疫原可以是變應原。變應原是當受試 者暴露於該變應原時誘導受試者中的變態反應的物質。在吸入變應原引發 的變應性和哮喘病症中觀察到的慢性炎症很大程度上是由於嗜酸性粒細 胞的局部組織滲透和組織對變應原的高反應性所導致的。可以通過4吏用皮 質類固醇和/或支氣管擴張劑來減輕炎症，但這些不能治療根源原因。如 WO 99/07860討論的，變應原特異性T淋巴細胞選擇性富集於高反應組織， 這一敏感性可能取決於童年或嬰兒期的早期抗原接觸。
在對^V免疫原的個體免疫應答中的特異性Thl及Th2樣記憶細胞 的選擇發生在從氣道引出的局部淋巴結中。這種選擇可以由抗原特異性 CD4+和CD8+ T細胞所產生的多種細胞因子來調節。這種T細胞選擇過 程可被傳染原所影響呼吸道黏膜的感染可以動員和激活局部組織(肺泡) 巨噬細胞，所述巨噬細胞移動到該局部淋巴結並分泌Th2抑制性細胞因子
(如IL-12和a-幹擾素)。此外，它們可通過激活自然殺傷細胞而提高周 圍環境中的Y-幹擾素水平。淨結果是產生CTL (主要是CD8+細胞)。y-幹擾素抑制Th2細胞的產生，因而抑制IL-4和IL-5、體液(IgE )和細胞
(嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)變態反應的關鍵性細胞因子 的產生(Anderson, G P.和Coyle, A. J., Trends Pharmacol. Sci， 15:324-332 (1995); Stam, W. B., van Oosterhout, A. J. and Nijkamp， F. P" Life Sci, 53: 1921-1934 (1993))。在哺乳動物中，應激蛋白已經顯示誘導體液和細胞免疫應答。當與 應激蛋白混合、化學綴合或融合的可溶性抗原施用於哺乳動物時，細胞介
導的溶細胞免疫應#顯著增強。這些應答主要是由於CD8+ T細胞所致。 因此，對CD4+細胞針對抗原自身以及針對與混合或偶聯應激蛋白之抗原 的應答進行的比較給出了預測的模式與應激蛋白混合或連接的可溶性抗 原產生高比例的CTL (主要為CD8+ T細胞)，這是前述刺激Thl途徑的 一種度量，因為這些CTL由於對Thl型抗原特異性T細胞的誘導而產生。 這些Thl細胞產生抑制Th2細胞的Y-幹擾素。因此，Th2細胞因子IL-4 和IL-5不再能支持IgE和嗜酸性粒細胞的產生。IgE效價降低時，肥大細 胞和嗜鹼性粒細胞的直接抗原性刺激會下降。此外，IL-5產生的減少將 導致嗜酸性粒細胞產生、分化和激活的減少。這種模式會導致相關組織炎 症的減少，並導致高>^應(哮喘)時間減少。
因此，施用混合物可以影響特應性患者中Thl與Th2的比值，恢復 更為正常的平衡並導致變應性或哮喘反應降低，所述混合物中含有與以下 製劑相組合的已知變應性抗原(變應原)或應激蛋白或組合物(其含有與 應激蛋白化學連接或融合的變應原)式II和IIa-e、式III和IIIa-d、式 IVa-j，以及式IVa-j、式Va到Vc、式Via到VIh、式VIj到VIo、式Vila 到VIIh、式VIIIa到VIIIh中至少兩種的多種摩爾比的組合。
因此，本發明提供TLR3激動劑或TLR9激動劑或者作為TLR3和 TLR9雙激動劑的組合物，以及含有TLR3激動劑或TLR9激動劑或者作 為TLR3和TLR9雙激動劑的組合物的佐劑或佐劑組合物。
在本發明一些實施方案中，免疫原包括HspE7。生產HspE7融合蛋 白的方法描述於WO 99/07860和US 60/803,606，所述兩個文獻都通過參 考併入本文。
序列
對於SEQIDNO: 1的序列，殘基G1、 G2、 G25和G26是LNA殘 基；3到24位^是肌苷核糖核苷酸。
對於SEQIDNO:2的序列，殘基C1、 C2、 C25和C26是LNA殘基；殘基C3到C24是核糖核普酸。
對於SEQIDNO:3的序列，瓶基T17、 G18、 T20、 T22和G23是 LNA殘基；1到15位^是肌苷核糖核苷酸；殘基G16、 A19和A21可
對於SEQIDNO:4的序列，殘基C16、 T18、 T20、 A22和C23是 LNA殘基；殘基Cl到C15是核糖核苷酸；殘基A17、 A19和C21可以是
對於SEQ ID NO: 5的序列，殘基G1、 T18、 T19、 T21和T23是 LNA殘基；1到17位殘基B苷核糖核苷酸；殘基G17、 A20和A22可 以是核糖核苷酸或脫氧核糖核普酸。
對於SEQ ID NO: 6的序列，殘基Cl、 C17、 T19、 C22和C23是 LNA殘基；殘基C2到C16是核糖核苷酸；殘基A18、 A20和U21可以是 核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。
對於SEQIDNO: 7的序列，殘基Tl、 T2、 T18、 T19、 T21和A22 是LNA殘基；3到17位殘基是肌苷核糖核苷酸；殘基A19和A21可以是 核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。
對於SEQIDNO:8的序列，殘基A1、 C2、 C18、 T20、 T22和C23 是LNA殘基；殘基C3到C17是核糖核苷酸；戎基A19和A21可以是核
對於SEQ ID NO: 9的序列，殘基Gl和G2是LNA殘基；2到17 位^lS^O/L苷核糖核苷酸，A18到A32是核糖核苷酸。
對於SEQIDNO:10的序列，殘基C16和C17是LNA殘基；^ Cl到C15、 U18到U32是核糖核苷酸。
對於SEQIDNO:ll的序列，殘基Gl和G2是LNA殘基；3到12 位殘基4J^苷核糖核苷酸，A13到A22是核糖核苷酸。
對於SEQIDNO: 12的序列，殘基Cll和C12是LNA殘基；殘基 Ul到U10和C13到C22是核糖核苷酸。
73對於SEQIDNO: 13的序列，殘基G1、 G2、 G18、 T19、 C20、 G21、 Tll、 T23、 G39和G40是LNA殘基；3到17位和24到38位殘基^J/L苷 核糖核苷酸。
對於SEQIDNO:14的序列，殘基C1、 C2、 A18、 A19、 C20、 G21、 A22、 C23、 C39、 C40和C23是LNA殘基；殘基C3到C17、 C24到C38 是核糖核苷酸。
對於SEQIDNO: 15的序列，殘基G1、 G2、 G18、 T19、 C20、 G21、 T22和T23是LNA殘基；3到17位^^普核糖核苷酸。
對於SEQIDNO: 16的序列，^t^Al、 A2、 C3、 G4、 A5、 C6、 C22和C23是LNA殘基；殘基C7到C21是核糖核普酸。
對於SEQIDNO:17的序列，殘基G16、 T17、 C18、 G19、 T20和 T21是LNA殘基；1到15位殘基是肌苷核糖核苷酸。
對於SEQIDNO:18的序列，殘基A16、 A17、 C18、 G19、 A20和 C21是LNA殘基；殘基Cl到C15是核糖核苷酸。
對於SEQ ID NO: 19的序列，殘基G1、 G17、 T18、 C19、 G20、 T21和T22是LNA殘基；2到16位^J^是肌香核糖核苷酸。
對於SEQ ID NO: 20的序列，殘基Cl、 A17、 A18、 C19、 G20、 A21和C22是LNA殘基；殘基C2到C16是核糖核香酸。
對於SEQIDNO: 21的序列，殘基Cl、 G2、 G18、 T19、 C20、 G21、 T22和T23是LNA殘基；3到17位殘基;U/L苷核糖核苷酸。
對於SEQIDNO: 22的序列，殘基Gl、 C2、 A18、 A19、 C20、 G21、 A22和C23是LNA殘基；瓶基C3到C17是核糖核香酸。
對於SEQIDNO:23的序列，全部六個殘基都是LNA殘基。
對於SEQ ID NO: 24的序列，全部六個殘基都是LNA殘基。
對於SEQ ID NO: 25的序列，殘基C2和C3是LNA殘基；殘基Cl 到CIO和U13到U23是核糖核苷酸。對於SEQ ID NO: 26的序列，殘基Gl和G2是鎖核酸殘基；C3、 G4、 T5、 C6、 G7、 T8、 T9、 A10、 T26、 G27、 T28、 C29、 G30、 T31、 T32、 G33 ;Ut氧核糖核香酸；All到A25是核糖核苷酸。
對於SEQ ID NO: 27的序列，Ul到U15的殘基是核糖核苷酸；殘 基T16、 A17、 A18、 C19、 G20、 A21、 C22、 G23、 C26、 A27、 A28、 C29、 G30、 A31、 C32和A33 M氧核糖核普酸；C24和C25是鎖核酸殘基。
與單字母>5^名稱(A、 C、 G、 T、 U、 I)組合的"LNA"下標表 示相關核苷^A含有前述2'-4'的鎖核酸殘基。
實施例1:製備雙鏈寡聚體GCLNA-polyIC-GCLNA
按照生產商的方案(Glen Research, Sterling VA )，使用2'-OMe-I-CE 亞磷醯胺、2，-OMe-C-CE亞鱗醯胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亞磷醯胺和 dmf-G-LNA-CE亞磷醯胺根據標準技術合成SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的寡聚體。
G歐Glna-(I22)-G隱Glna (SEQ ID NO:l)
和
Clna國Clna-(C22)畫Clna-Clna (SEQ ID NO:2).
將各等摩爾量的第一和第二寡聚體相組合，並使其退火產生dsRNA 化合物GCLNA-polyIC-GCLNA，表示為式Ilia:
Glna-Glna-(I22)-Glna-Glna Clna-Clna-(C22)-Clna-Clna
式IIIa
實施例2:製備具有未配對3，端的雙鏈寡聚體
可以按照生產商的方案(Glen Research, Sterling VA)，使用5畫Me-Bz畫C-LNA畫CE亞磷醯胺、Bz誦A-LNA陽CE亞磷醯胺、dmf- G畫LNA-CE 亞褲醯胺、T-LNA-CE亞磷醯胺、2'-OMe小CE亞磷酖胺、2，-OMe-C-CE 亞褲醯胺、2，-OMe-A-CE亞罅醯胺、2，-OMe-G>CE亞磷醯胺和 2'-OMe-U-CE亞褲酖胺根據標準技術合成SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8的寡聚體。
(1,5)-G-T^a-Glna-A-Tlna-A-Tlna-Glna (SEQ ID NO: 3)
(Cis)-Clna-A- T歐A-Tlna-C-A歐Clna (SEQ ID NO: 4)
Glna-Q^-G-Tlna-Glna-A-Ti^a-A-Tlna (SEQ ID NO: 5)
ClnA-(C15)- C歐A-Tlna-A-U-C歐Alna (SEQ ID NO: 6)
Tlna-Glna-(I5)-T歐T歐A-T歐Alna (SEQ ID NO: 7)
Alna-Clna^CW-Clna-A- Ti^A-A- TlnA-Ci^a (SEQ ID NO: 8)
可將各等摩爾SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4或者SEQ ID NO: 5 和SEQ ID NO: 6或者SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8相組合，並使其退 火產生雙鏈核酸化合物，分別表示為式Va、 Vb、 Vc:
工—工一I一工一 I墨工-1 - -工-工-工-1-I-I^GTLjmGLNA-ATmA-A-Tu^-C賜-A區-CTlha-AT織-AC區-OC-C-C-C-C-c-c-c-c-c-c-c-c-c
式Va
Glna一工一I一工一I墨工一 工一工一I一工—工一工匿工一工—I —I—G—*TIina—Glna—A—Tlha—A_-T:jia Alna-Clna-U-A-T區-A-C咖- C-C-C-OC-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C咖
式Vb
Tlma- Guja一工- 工- 工-工-工-工-工-工-I-工-工-工-工-工-工-G - Tuu、-GrjiA-A-Tlwa墨A腿 C-T濕-A-T皿-A- C咖-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C膨A識
式Vc實施例3:製備具有未配對3，端的雙鏈寡聚體
可以按照生產商的方案(Glen Research, Sterling VA)， 4吏用 5-Me畫Bz-C-LNA-CE亞罅醯胺、Bz-A-LNA-CE亞褲醯胺、dmf國G-LNA-CE 亞褲醯胺、T-LNA國CE亞罅醯胺、2，國OMe-I國CE亞褲酖胺、2，-OMe國C畫CE 亞褲醯胺、2'-OMe-A-CE亞磷醯胺、2，-OMe-G>CE亞磷醯胺和 2'-OMe隱U-CE亞磷酖胺才艮據標準技術合成SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的寡聚體。
Gln a-GlN a-(I) 15醫(A) 15 (C) 15-ClNA-ClNA-(U) 15
Glna-Glna-(I)io誦(A)io
(U)io-Clna-Clna-(C)io
(C)io-Clna-Clna-(U)io
(SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 25)
可將各等摩爾SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10或者SEQ ID NO: 11 和SEQ ID NO: 12或者SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 25相組合，並使其 退火產生雙鏈核酸化合物，分別表示為式Vd和Ve (

圖1 )。
實施例4:與免疫原組合的dsRNA的體外生物活性
可對根據US 60/803,606 (通過參考併入本文)的方法生產的含有 HspE7的組合物以及根據上述實施例1生產的GCLNA-polyIC-GCLNA測 試其體外生物活性。
可在GCLNA-polyIC-GCLNA存在下測定HspE7誘導E7特異性 CD8+ T淋巴細胞(作為示例性抗病毒治療途徑)能力的增強。可對初次 接受實驗的C57B1/6小鼠皮下注射單獨的HspE7或者HspE7加 GCLNA-polyIC-GCLNA。 一段時間(例如5天)之後，從小鼠中摘除脾 髒並通過ELISPOT測定E7特異性脾細胞的數目，例如用E7特異性I類
77MHC結合肽E749-57 (RAHYNIVTF; Dalton Chemical Laboratories )或 對照肽HBCAg93國100 (MGLKFRQL; Dalton Chemical Laboratories )作 為記憶抗原。
實施例5:與免疫原組合的dsRNA的體內生物活性
可對根據PCT公開WO 2007/137427 (通過參考併入本文)的方法 生產的含有HspE7的組合物以及根據上述實施例1生產的 GCLNA-polyIC-GCLNA測試其體內生物活性。
在癌症治療的一個示例性方法中，首先在初次接受實驗的C57B1/6 小鼠中建立TC-1腫瘤。將6 x 104個TC-1腫瘤細胞注射入鼠的側腹部。 在第七天時，可對帶有TC-1腫瘤的小鼠在後頸部皮下注射稀釋劑、單獨 的純化HspE7，或者與不同劑量GCLNA-polyIC-GCLNA混合的純化 HspE7分級劑量。在額外的時間(如42天)對小鼠的腫瘤生長進行, ——在此實施例中，在肺瘤^V時間之後49天無腫瘤的小鼠可認為是無肺 瘤的。
實施例6:制名^^有CpG基序的雙鏈寡聚體
按照生產商的方案(Glen Research, Sterling VA),使用2'-OMe-I-CE 亞磷醯胺、2'-OMe-C-CE亞磷醯胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亞砩醯胺和 dmf-G-LNA-CE亞磷醯胺根據標準技術合成SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22的寡 聚體。
7813)
Clna-Clna_(C)i5- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna-(C)i5-Clna-Clna(SEQ ID NO:14)
Glna_Glna-(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-(SEQ ID NO:15)
Alna-Alna_Clna-Glna-Alna-Clna-(C)i5-Clna-Clna(SEQ ID NO:16)
(I)i5- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna(SEQ ID NO:17)
(C)is- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna(SEQ ID NO:18)
Gln八-(I) 15- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna-(SEQ ID NO:19)
Clna-(C) 15- Alna_Alna-Clna-Glna_Alna-Clna(SEQ ID NO:20)
Clna-Gln八-(I)is- Glna-Tlna-Clna-Glna-Tlna-Tlna(SEQ ID NO:21)
Glna-Clna-(C) 15- Alna-Alna-Clna-Glna-Alna-Clna(SEQ ID NO:22)
將各等摩爾的SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14、或者SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16、或者SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18、或者SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20、或者SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22相 組合，並使其退火產生式VIg、 VIh、 VIi、 VIj和VIk (圖2)的dsRNA 化合物。
實施例7:制^^有CpG和poly A:U基序的雙鏈寡聚體
按照生產商的方案(Eurogentec North America K吏用2，-OMe-A-CE 亞褲醯胺、2'-OMe-U-CE亞褲醯胺、DMT-dA-亞鱗醯胺、DMT-dC-罅醯 胺、DMT-dG-亞褲醯胺、DMT-dT-褲醯胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亞褲醯胺 和dmf-G-LNA-CE亞磷醯胺才艮據標準技術合成才艮據SEQ ID NO: 26和 SEQ ID NO: 27的寡聚體。GLNA-GLNA-dC國dG-dT-dC-dG-dT-dT-dA-(rA),5-dT-dG-(iT-dC-dG-dT誦dT-dG (SEQ ID NO: 26)
(rU)15-dT-dA-dA-dC-dG-dA-dC-dG-CuvfA-CL^A-dC-dA-dA-dC-dG-dA-dC-dA (SEQ ID NO: 27)
可將各等摩爾的SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27相組合，並使其 退火產生在任一末端具有一段未配對核苷的雙鏈核酸化合物(示於圖3)。 所述未配對核普可允許進行混合物的串聯。
所有引文均通過參考併入本文。
已通過實施例描述了一個或多個目前優選的實施方案。對本領域技 術人員而言很明顯的是，可以對本發明進^i午多變更和修改，而不脫離在 權利要求中定義的本發明範圍。
權利要求
1.下式的化合物式IIa其中-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，條件是如果n＝0則p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，條件是如果p＝0則n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；-V、Z、Q和W是任意核苷、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖核苷類似物或脫氧核糖核苷類似物；-m是從1到500的任意整數，或其間的任意數值；-S是肌苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；-D是胞嘧啶、胞嘧啶類似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶類似物核苷；-k1、k2、k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；-R可以獨立地為通過核苷間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在；並且-其中V、S、D、Z、Q、R和W中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA)單體。
2. 下式的化合物R"-Vn墨(Sm)-Wp-Rk2式IVc其中-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，4Ht是如果n-0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果p^則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-V和W是任意核苷、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖 核普類似物或脫氧核糖核苷類似物；-m是從l到500的任意整數，或其間的任意數值；-S是肌苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；-&和k2可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；-R可以獨立地為通過核香間連接基團連接到相應核普的任意核糖核 苷，或者R可以不存在；並且-其中V、 S、 R和W中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA) 單體。
3. 下式的化合物formula see original document page 3式IVd其中-n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，^是如果11=0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是從0到10的任意整數，或其間的任意lt值，4Hf是如果p=0則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脫氧核糖核苷、核苷類似物、核糖 核普類似物或脫氧核糖核香類似物；-m是從l到500的任意整數，或其間的任意數值；-D是胞嘧啶、胞嗜咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；-k3和b可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；-R可以獨立地為通過核苷間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在，在一些實施方案中，例如，第一鏈的5'R核糖核 苷能夠與第二鏈的 3，R核糖核苷成鍵，並且；-其中R、 Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個鎖核酸(LNA) 單體。
4. 製備下式化合物的方法，formula see original document page 4Rk3-Zn- (DJ -Qp隱Rk4式IIa其中國n是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，糾是如果n-0則 p=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;-p是從0到10的任意整數，或其間的任意數值，M是如果p^則 n=l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10;國V、 W、 Z和Q^K壬意核苷；畫m是從1到500的任意整數；-SB苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；-D是胞嘧啶、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧咬類似物核苷；-b、 k2、 k3和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數；-R可以獨立地為通過核苷間連接基團連接到相應核苷的任意核糖核 苷，或者R可以不存在，在一些實施方案中，例如，第一鏈的5'R核糖核 苷能夠與第二鏈的3'R核糖核苷成鍵，並且；-其中V、 S、 W、 Z、 D和Q中的一個或多個包含一個或多個LNA 單體，所述方法包括以約0.5-1.0到約1.0-0.5的摩爾比將根據權利要求2之化合物的寡聚 體與根據權利要求3之化合物的寡聚體相混合，並使所述第一和第二寡聚 體退火形成雙鏈化合物。
5. 權利要求l-3中任一項的化合物，其中S是肌苷且D是胞嘧啶。
6. 含有權利要求5的化合物、聚L-賴氨酸和羧甲基纖維素的組合 物。
7. 含有權利要求5的化合物和免疫原的組合物。
8. 下式的化合物，Rki- (Sm) - (Elna) - (Dm) -，2Rk3- (Dm) — (Flna) - (Sm) -Rk4式ViaRkl- (Dm) - (Elna) - (Sm) _R)c2 Rk3- (Sm) — (Flna) — (DJ -Rk4式VIbRk廣(Sm) - (Elna) - (Sm) -Rk2Rk3- (Dm) - (Flna) - (Dm) -Rk4式Vic或Rki- (Dm) — (Elna) 一 (Dm) -Rk2 II I I IRk3一 (Sm) - (Flna) 一 (Sm) -R]c4 ,式VId其中國Elna是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、C、 G中的一個或多個是LNA;畫FLNA是CpG或CpG基序，其中組成該CpG或CpG基序的核苷、 C、 G中的一個或多個是LNA;-m是從l到500的任意整數，或其間的任意數值；-SA^L苷、肌苷類似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤類似物核苷；-0^0&嘧啶、胞嘧咬類似物核苷、尿嘧咬或尿嘧啶類似物核苷；-kp k2、 b和k4可獨立地是0到10的任意整數，或其間的任意整數;-R可以獨立地為通過核苷間連接相連的任意核糖核苷。
9. 根據權利要求8的式VIa、 VIb、 VIc或VId的化合物，其中S 是肌苷且D是胞嘧啶。
10. 含有權利要求9的化合物和免疫原的組合物。
11. 一種化合物，其包含第一單鏈核苷酸多聚體，其包含1到500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷 與胞嗜咬核糖核苷的組合，以及l到IO個鎖核酸殘基；和第二單鏈核普酸多聚體，其包含1到500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷 與胞嘧啶核糖核香的組合，以及1到10個鎖核酸殘基；含有鎖核酸殘基的雙鏈區。
12. —種化合物，其包含第一單鏈核普酸多聚體，其包含1到500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷 與胞嘧咬核糖核苷的組合，以及根據SEQ ID NO: 23的核酸序列；第二單鏈核苷酸多聚體，其由1到500個肌苷、胞嘧啶或者肌苷與 胞嘧咬核糖核苷的組合，以及才艮據SEQ ID NO: 24的核酸序列；其中所述第 一單鏈核苷酸多聚體與所述第二專過氫^含有鎖核酸殘基的雙鏈區區以及
13. 含有權利要求ll之化合物的佐劑組合物。
14. 含有權利要求12之化合物的佐劑組合物。
15.含有權利要求12之化合物的TLR3和TLR9激動劑
全文摘要
提供了免疫刺激劑，包括具有一個或多個鎖核酸(LNA)核苷的核酸。所述核酸還可包含CpG基序。該核酸可以是雙鏈的，並可包含dsRNA。
文檔編號C07H21/00GK101687900SQ200880014144
公開日2010年3月31日 申請日期2008年3月7日 優先權日2007年3月7日
發明者彼得·埃姆蒂奇 申請人:恩文塔生物製藥公司