宮膜幹細胞的規模化生產工藝的製作方法

2023-12-03 08:43:16

宮膜幹細胞的規模化生產工藝的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種宮膜幹細胞規模化生產工藝，包括：（1）宮膜幹細胞的分離提取和原代培養；（2）宮膜幹細胞的培養擴增：（3）宮膜幹細胞的大規模培養：（4）宮膜幹細胞的檢測；（5）宮膜幹細胞的冷凍保存；（6）長期冷凍保存，定期進行復甦檢測。本發明由育齡期婦女的月經血中獲得宮膜幹細胞，利用體外培養擴增方法，短期內獲得較多數量富有功能活性的高質量宮膜幹細胞，經檢測合格後，長期冷凍保存在-196℃的環境中，為未來的臨床以及科研提供大量的宮膜幹細胞資源，具有極大的社會價值和意義。
【專利說明】宮膜幹細胞的規模化生產工藝
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫學工程領域，涉及幹細胞的培養擴增及長期保存方法，尤其涉及一種宮膜幹細胞的規模化生產工藝。
技術背景
[0002]眾所周知，幹細胞技術是當今生命科學中最熱門的技術之一，其研究內容幾乎涉及所有生物醫學領域，除了在細胞治療、組織/器官移植和基因治療中發揮重要作用外，在發育生物學和新藥開發等方面也產生重要影響。近幾年來幹細胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最權威的美國《science》雜誌連續2年將幹細胞和人類基因組計劃列為當年的十大科學突破，尤其是在1999年甚至將幹細胞研究列於第一位。幹細胞具有不可估量的醫學價值，引起全世界的廣泛關注和研究。
[0003]相較於骨髓幹細胞的難以獲得以及胚胎幹細胞的倫理問題、致畸性，子宮內膜幹細胞因其來源的廣泛，更強的自我更新和增殖能力，無倫理問題等優勢正在獲得越來越多的關注。研究證實，女性脫落的子宮內膜組織中分離得到的宮內膜幹細胞數量為骨髓來源的30倍，增殖能力為普通其他幹細胞的100倍，分化潛能也接近胚胎幹細胞。同時宮膜幹細胞取自女性廢棄的月經中，將這些幹細胞通過科學的方法儲存起來可實現變廢為寶。在女性及其家人未來的生命中，發生重大疾病或意外嚴重傷害時，利用事先儲存起來的幹細胞去恢復健康甚至挽救生命都是有可能的。
[0004]利用宮膜幹細胞有望治療包括糖尿病、帕金森症、退行性細胞或組織疾病等多種疾病，然而一次成功的治療需要約IO9個細胞，這意味著分離出的幹細胞必須在短時間內經過有效的體外擴增，獲得大量高質量的幹細胞，方能達到細胞治療的要求。傳統的二維平面擴增宮膜幹細胞較難在短 時間內得到足夠的細胞量，且經多次傳代造成幹細胞質量下降，而轉瓶和生物反應器培養可以獲得足夠多的細胞數目用於幹細胞治療。
[0005]傳統的貼壁依賴性細胞的培養採用靜止或者轉瓶等培養方法，操作複雜，耗費空間及人力。1967年，Van Wezel首次提出了「微載體系統」的概念，為貼壁依賴性細胞的高密度培養提供了思路，並創建了生物反應器微載體培養細胞工藝，使動物細胞培養進入高密度培養階段。微載體是指由交聯葡聚糖或者其他聚合物組成微珠，直徑一般在60-200 μ m之間，適用於貼壁依賴性細胞的生長。使用此類小球為細胞提供貼附面積，通過輕輕攪拌使載體懸浮於培養液中，細胞也成為了懸浮狀態，這種培養方式被稱為微載體培養技術。
[0006]由於微載體本身所佔體積和質量不大，但有很大的有效面積可供細胞附著，大大提高了生產效率。比如5mg Cytodex I表面積能達到30cm2/mL,而傳統的單層培養難以達到如此高的表面積/容積比。IL微載體培養生產的細胞相當於50個轉瓶所生產的細胞。這種培養方式對勞動力的需求也下降了許多:省卻了玻璃容器等的清洗和準備工作；細胞與培養液的分離簡單，一旦攪拌停止，3分鐘後細胞即能依靠其重力而沉降，無需進行離心操作，減少了複雜的操作步驟。而且，細胞生理活性培養參數等容易控制，汙染概率也大大降低。[0007]動物細胞體外大規模培養主要包括分批培養、灌注培養和補料分批培養模式。
[0008]分批培養模式，其特徵在於將牙髓幹細胞和培養液一次性裝入生物反應器內進行培養，細胞不斷生長，得到大量擴增，經過一段時間之後，將這個反應系統取出，消化得到高質量的牙髓幹細胞。
[0009]連續灌注式生物反應器是在細胞培養生物反應器系統中安裝細胞微載體截留裝置，將細胞種子和培養液一起加入反應器內進行培養。一方面新鮮培養液不斷加入反應器內；另一方面又將反應液連續不斷地取出，使反應條件處於一種恆定狀態。連續灌注式生物反應器可以對細胞的微環境進行更為精確的監測和控制，既省時省力，又減少了細胞發生汙染的機會，培養細胞的密度及質量可以得到很大提高。
[0010]補料分批培養是介於分批培養和連續培養之間的培養方法。在細胞培養過程中，隨著營養物質消耗，間歇或連續地添加營養成分或新鮮培養基，但不同時收穫培養液。
[0011]幹細胞臨床治療需要大量高活性的幹細胞，所以如何在體外短期內培養足夠數量的高質量的治療用細胞以及提供一個規模化、標準化、系統化的細胞儲存系統成為了學術界和產業界密切關注的焦點。
[0012]本發明針對現有作為種子細胞的宮膜幹細胞的快速獲取、擴增與長期保存困難等問題，目的在於尋找一種更為高效的培養擴增及長期保存方法，使宮膜幹細胞的製備達到規模化的程度。
[0013]發明概述
[0014]本發明公開了一種宮膜幹細胞規模化生產工藝方法。
[0015]本發明提供的宮膜幹細胞規模化生產工藝方法包括以下步驟: [0016](I)宮膜幹細胞的分離提取:月經血經密度梯度離心後，在含胎牛血清細胞培養液的培養器皿中，在37°C、5%C02條件下進行原代培養；
[0017](2)宮膜幹細胞的培養擴增:將步驟(1)獲得的原代細胞以0.5X IO6-L 5X IO6個細胞/cm2的密度接種於二維培養器皿中，加入新鮮細胞培養液，於37°C、5%C02條件下培養，3天換液；
[0018](3)宮膜幹細胞的大規模培養:將步驟(2)獲得的宮膜幹細胞接種在轉瓶或生物反應器中，調整溶解氧濃度、PH值、攪拌轉速和通氣量，根據取樣分析細胞計數、存活率、營養成分和代謝物的結果更換培養基，從而達到細胞的高密度大規模培養；
[0019](4)宮膜幹細胞的檢測:進行幹細胞特性、無菌性、支原體、衣原體檢測；
[0020](5)宮膜幹細胞的冷凍保存:將檢測合格的細胞凍存於管內，細胞的詳細信息掃描入數據管理系統，自動化系統根據液氮情況自動尋找空缺位置，將細胞凍存於相應的空格中；
[0021](6)根據需要，進行長期冷凍保存，並定期從凍存環境中取出細胞進行復甦檢測。
[0022]步驟(1)中，經血取自例假第二天，與無菌PBS混合均勻後於0-10°C運送至實驗室。用淋巴細胞分離液採用密度梯度離心的方法獲得單核細胞，無菌PBS衝洗3-4次，完全培養液(a -MEM+雙抗+兩性黴素+20%胎牛血清)吹打懸起，轉移至6孔板中，與37°C、5%C02培養箱內進行原代培養。
[0023]步驟(2)中，將步驟(1)培養的原代細胞(在長滿培養器皿底部80%_90%時)用胰酶溶液消化並吹打細胞，使細胞完全脫離原代培養器皿後接種於二維培養器皿，所述二維培養器皿選自細胞培養孔板、培養皿、T瓶等二維培養方式。
[0024]步驟(3)中，調節溶解氧濃度為40%-60%、pH值為6.8-7.2、攪拌轉速為80_120rpm。
[0025]步驟(3)中所述的轉瓶培養按以下過程進行:將微載體經預處理、轉瓶矽化、121°C高溫滅菌後，接種細胞，微載體加入量為3-20g/L，微載體的大小範圍為60-300μπι，接種密度為2Χ105-6Χ105個細胞/ml，轉瓶的大小範圍為25ml-500ml，轉速範圍50-75rpm/min,培養方式是分批培養。
[0026]步驟(3)中所述的生物反應器選自細胞培養生物反應器，包括攪拌式生物反應器、固定床生物反應器和WAVE生物反應器。
[0027]本發明的生產工藝中，微載體生物反應器按以下過程進行細胞培養:將微載體用PBS衝洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱內平衡水化過夜，高壓蒸汽滅菌後，接種宮膜幹細胞，微載體的加入量為3-20g/L，接種密度為IO5-1O6個細胞/mL，細胞擴增至密度為5X 106-5X 107 個細胞/mL。
[0028]本發明的生產工藝中，步驟(5)中輸入的細胞詳細信息包括供者姓名、細胞代數、細胞培養液成分和濃度、細胞接種密度、凍存液成分和凍存日期；所述冷凍保存包括將所獲得的宮膜幹細胞按I X IO7IX IO7個/ml細胞密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管，經過程序降溫後，將凍存管轉移至_196°C液氮中冷凍保存，所述凍存液組分及體積比為DMSO:胎牛血清:a -MEM培養液(1:2:7)。
[0029]發明詳述
[0030]本發明針對現有作為種子細胞的宮膜幹細胞的快速獲取、擴增與長期保存難等問題，尋找一種適用於規模化生產的宮膜幹細胞高效培養擴增及長期保存方法。
[0031 ] 下面詳細描述本發明的宮膜幹細胞規模化生產工藝。
[0032]一、宮膜幹細胞的分離提取
[0033]①準備含有青黴素、鏈黴素和兩性黴素的PBS或Hanks液4_10mL作為保存液?』②將取自月經第二天的月經血倒入保存液中，低溫環境(0_8°C )轉移到實驗室處理；③準備5-10mL淋巴細胞分離液，將等體積的樣品緩慢加到分離液上層，密度梯度離心，300-500g，20-40分鐘(加速度和減速度均設為1，溫度為10-30°C 離心結束後移去上清，小心取中間白膜層至另一潔淨離心管中，加3-5mLPBS或Hanks液吹打,衝洗，1000-1500rmp離心5-10分鐘，重複2-3次除菌；⑤獲得的單核細胞用ImL左右完全培養液(a -MEM+雙抗+兩性黴素+20%胎牛血清)吹打懸起；⑥細胞懸液接種至六孔板中，補加培養液至3mL，放入37 °C、5%C02培養箱中培養。
[0034]二、宮膜幹細胞的培養擴增
[0035]當原代細胞長滿器皿底80~90%時，用胰酶+0.05%EDTA消化並吹打細胞，使細胞完全脫離後，接種到二維培養器皿中，加入細胞培養液，在恆溫培養箱中培養擴增。
[0036]當採用二維培養器皿進行宮膜幹細胞培養擴增時，根據培養容器的底部表面積及原代細胞的數量，將原代細胞以0.5 X IO6-L 5 X IO6個細胞/cm2的密度接種於二維培養器皿中，加入a -MEM細胞培養液於37°C、5%C02條件下培養，3天換液。
[0037]二維培養器皿常見的有各種細胞培養孔板，培養皿、T瓶等。
[0038]三、宮膜幹細胞的大規模培養
[0039]採用轉瓶培養或生物反應器進行宮膜幹細胞的大規模培養，在培養過程中，應調整溶解氧濃度、pH值、攪拌轉速和通氣量，根據取樣分析細胞計數、存活率、營養成分和代謝物的結果更換培養基，從而達到細胞的高密度大規模培養。
[0040]反應器培養的一個主要問題就是溶氧限制，培養基中的氧氣的溶解度很低(7.6 μ g/ml)，典型密度2X 106/ml培養的細胞在不到Ih的時間內就會耗盡培養基中的氧氣，因此必須在培養周期內不斷向培養基中通入氧氣。通過控制空氣、氮氣、二氧化碳、氧氣的比例維持培養液中的溶解氧在一個合適的水平供細胞消耗。培養過程中通過攪拌一方面使細胞懸浮於培養基中，另一方面可以促進液體混合傳質，提高供氧能力。細胞代謝的副產物積累會影響培養液的PH值從而影響到細胞生長，所以需要通過分析培養基成分控制添加新鮮培養基的速率，以提供給細胞一個良好的營養環境。
[0041]轉瓶培養擴增的過程包括:將微載體經預處理、轉瓶矽化、121 °C高溫滅菌後，接種細胞，微載體加入量為3-20g/L，微載體的大小範圍為60-300 μ m，接種密度為2 X 105-6 X IO5個細胞/ml，轉瓶的大小範圍為25ml_500ml，轉速範圍50_75rpm/min，培養方式是分批培養。
[0042]生物反應器培養擴增的過程包括:①微載體的預處理:將微載體用PBS衝洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱內平衡水化過夜，高壓蒸汽滅菌；②將轉瓶或大量二維平皿擴增培養的宮膜幹細胞a -MEM細胞培養液製成細胞懸液，接種在微載體上，反應器的體積為3-10L，微載體的加入量為3-20g/L，接種密度為IO5-1O6個細胞/mL，細胞培養擴增至密度為5X 106-5X IO7個細胞/mL 用胰酶+0.0596EDTA收穫所擴增的宮膜幹細胞，進行後續檢測。
[0043]上述微載體包括溫度敏感性高分子材料，如聚N-異丙基丙烯醯胺，可以通過溫度降低引起高分子材料相變，細胞脫落並保留大量表面標誌物從而得到大量高質量高活性的細胞。
[0044]生物反應器培養擴增可以是一級生物反應器培養，也可以是多級培養。在一級生物反應器中細胞生長到 一定程度時，根據對細胞數量的要求可進行下一級細胞放大培養，即將微載體上的細胞完全消化之後作為種子細胞接種下一級生物反應器或者直接添加新的微載體進行球轉球放大培養。
[0045]生物反應器可選自攪拌式生物反應器、微載體生物反應器、氣升式生物反應器、固定床生物反應器、旋轉壁式生物反應器、膜式生物反應器、間歇式或連續灌注式生物反應器、波浪式(wave)生物反應器、一次性生物反應器及細胞工廠等，以及其他各種形式和基於各種原理的細胞體外大規模培養系統或裝置。
[0046]攪拌式生物反應器主要是通過攪拌器轉動來攪動培養液以增加傳質能力，確保細胞培養的氧濃度和營養物質的均一性，達到大規模培養細胞的目的，同時使培養液對細胞施加一定的剪應力。目前在醫學組織工程研究中最常用的是攪拌瓶反應器。其主要特點是採用磁力轉子攪動培養液，把幹細胞接種在磁力攪拌的培養液中，細胞在持續攪動的培養液中生長。攪拌式生物反應器的最大優點是，能培養各種類型的動物細胞，培養工藝容易放大，產品質量穩定，非常適合於工廠化生產。
[0047]微載體反應器將懸浮培養和攪拌培養兩種技術結合在一起，使球形微載體懸浮於攪拌的細胞培養液中，貼壁細胞在這些懸浮微球表面生長。由於微球有更大的表面積，因此物質轉運得以加強，在懸浮微球表面貼壁生長的細胞亦會受到剪切應力的刺激。微載體反應器既能像懸浮培養那樣獲得大量細胞，又滿足了哺乳動物細胞貼壁培養的要求，兼具懸浮培養和貼壁培養的優點，同時又運用了攪拌培養技術，給細胞施加流體應力刺激，有利於細胞的增殖、分化。目前使用的微載體有商業化的Cytodex 1/3、Cultispher G/S、Biosilon, Hillex和HyQSp here，以及人工自製的纖維素、陶瓷、殼聚糖、膠原、明膠、PCL、PLA, PLGA等都可以應用於牙髓幹細胞的培養擴增。
[0048]固定床生物反應器內部填充片狀載體，使細胞貼服生長，通過連續灌注新鮮培養液使細胞達到較高密度，培養過程中，細胞營養充足，代謝廢物能及時去除，為細胞生長提供一個良好的環境。使用的片狀載體包括NBS公司的聚酯纖維等一切可以利於細胞貼服生長的材料。
[0049]旋轉壁式生物反應器一般由水平放置的內、外同心圓筒組成，內筒由半透膜構成，外筒由非通透性的材料製成。培養液及培養物共處於兩個同軸的內、外圓筒之間，根據具體要求確定圓筒的旋轉方式。圓筒剛開始轉速較慢，隨著培養物體積的增大而動態地增加轉速，使旋轉產生的離心力剛好和細胞與微載體或支架複合物的重力平衡，無須固定支架即可使之懸浮於培養液中。因該系統無氣泡或攪拌器，故幾乎沒有破壞性的剪切力，使得大細胞團得以形成，細胞表型表達更充分。旋轉壁式生物反應器具有微重力環境、低剪切應力、高效的傳質過程及零頂空間.即整個生物反應器系統被培養基充滿等優點。
[0050]膜式生物反應器有一個起傳質作用的透析性膜。它的主要優點是:①細胞或組織留在反應器內，反應器連續灌流；②使用膜包埋技術，這對於易受到剪應力破壞的細胞是有利的。膜式生物反應器中膜件的結構形式很多，有平板式、螺旋卷繞式、管式及中空纖維式等，其中中空纖維式應用最多，因為它的表面積較大，能生產高密度的細胞。
[0051]採用以上生物反應器進行細胞培養的模式包括分批培養模式、間歇式培養模式和連續灌注式培養模式。
[0052]分批培養模式是將壓碎幹細胞和培養液一次性裝入生物反應器內進行培養，細胞不斷生長、大量擴增，經過一段時間之後，將這個反應系統取出，消化得到高質量的牙髓幹細胞。
[0053]間歇式培養模式採用間歇式生物反應器，在反應器中加入培養液，進行滅菌後，接入細胞株，在維持適合細胞生長和產物生成的條件下進行細胞培養，反應過程中除需要通入一定量的無菌空氣、消泡劑和酸鹼外，一般不再加入培養基和培養物，也不取出產物，只有等反應進行到一定程度後，才全部將培養液放出，進行後處理。
[0054]連續灌注式培養模式，在連續灌注式生物反應器系統中安裝細胞微載體截留裝置，將細胞種子和培養液一起加入反應器內進行培養。一方面新鮮培養液不斷加入反應器內，另一方面又將反應液連續不斷地取出，使反應條件處於一種恆定狀態。連續灌注式生物反應器可以對細胞的微環境進行更為精確的監測和控制，既省時省力，又減少了細胞發生汙染的機會，培養細胞的密度及質量可以得到很大提高。
[0055]一次性生物反應器是一次性使用的波浪袋生物反應器，用以替代傳統的不鏽鋼發酵罐。一次性反應器適用於各種類型的細胞培養。溫和的波浪式運動可以起到良好的供氧和混合的目的，同時，這種運動方式所產生的剪切力也很小，遠遠小於傳統罐體中用攪拌或者氣升式方法所產生的剪切力；能夠支持高密度大規模細胞培養，並且不會形成泡沫和剪切力的破壞作用。
[0056]四、宮膜幹細胞的檢測[0057]在宮膜幹細胞大規模培養過程中，需進行幹細胞表面抗原檢測，無菌性檢測，支原體，衣原體檢測等。所用的檢測方法包括流式細胞檢測、培養法檢測、PCR檢測等。
[0058]五、宮膜幹細胞的冷凍保存
[0059]細胞收穫之後，用培養液反覆吹打細胞，混勻，送入藥品非臨床研究質量管理規範標準實驗室進行無菌檢測、支原體檢測、病毒檢測、免疫表形檢測、細胞技術和活力測定、生物學效力檢測、細胞分化能力檢測，以確定其是否到達合格標準。經過檢測符合標準的牙髓幹細胞按IXIO7IxIO7個細胞/ml的密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管。
[0060]填寫細胞的詳細信息，包括供者姓名、細胞代數、細胞培養液成分和濃度、細胞接種密度、凍存液成分和凍存日期等，完整記錄每一樣本的真實冷凍狀況，凍存管上的信息感應部位對準掃描槍，將信息準確無誤地掃描入數據管理系統，完成細胞庫信息錄入和構建。
[0061]各凍存管經過程序降溫後，轉移至_196°C液氮中冷凍保存。系統根據液氮情況自動尋找空缺位置，將細胞凍存於相應的空格中。
[0062]凍存空間應符合國家相關文件規定，具有良好的衛生環境，包括潔淨區、通風、採光環境。
[0063]凍存期間定期從凍存環境中取出細胞進行檢測。定期檢測的內容包括細胞復甦、細胞活性檢測等。
[0064]本發明提供的宮膜幹細胞規模化生產工藝建立了宮膜幹細胞大量擴增方法，並建立了宮膜幹細胞的標準化、系統化凍存體系，建立了長期高質量儲存宮膜幹細胞的細胞庫，以便為臨床及科研提供足 夠高質量的幹細胞資源，成本低廉，應用前景廣闊。
[0065]本發明的宮膜幹細胞規模化生產工藝中尤其使用了生物反應器微載體培養技術大量培養幹細胞。與傳統的培養方法相比，本發明的方法具有以下優點:
[0066](I)微載體表面積/體積比大,單位體積培養細胞的產率高。較傳統的單層細胞培養面積大大增加，可以在短期內大量得到牙髓幹細胞；
[0067](2)微載體懸浮於培養基中，牙髓幹細胞生長環境均一，簡化了培養條件的監測和控制，同時培養基利用率高；
[0068](3)採樣重演性好，細胞最終收穫過程不複雜，勞動強度小，佔用空間小，操作簡便，所需人員少，工藝容易放大生產，可以保證細胞質量；
[0069](4)細胞培養系統符合最新的法規標準，安全性更好。
[0070]同時，本發明的宮膜幹細胞規模化生產工藝中尤其採用了標準化、系統化的宮膜幹細胞長期凍存方法。幹細胞通過體外大規模擴增後，按照標準化流程凍存，凍存空間具有良好的衛生環境，包括潔淨區，通風，採光環境，符合國家相關文件規定。同時，詳細記錄的細胞信息以備未來科研和臨床使用。
[0071]本發明的宮膜幹細胞規模化生產工藝不僅能大大增加宮膜幹細胞作為種子細胞的數量，而且能夠長期保持其生長與分化的能力，冷凍復甦後也能夠保持其幹細胞的基本特性，經過冷凍保存後能夠為未來的臨床以及科研提供大量的宮膜幹細胞資源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0072]圖1是本發明宮膜幹細胞規模化生產工藝的流程圖。【具體實施方式】
[0073]實施例1.宮膜幹細胞的分離提取
[0074]宮膜幹細胞的分離提取包括以下步驟:
[0075]1.準備保存液
[0076]15mL離心管內加入5_10mL無菌PBS,添加兩性黴素1_4 μ g/mL,青黴素80-100 μ g/ml，鏈黴素30-70μ g/ml，低溫環境(O-1(TC)下運輸至供者處。
[0077]2.收集月經血
[0078]將取自月經第二天的月經血倒入保存液中，低溫環境(0_8°C )轉移到實驗室處理
[0079]3.分離提取宮膜幹細胞
[0080](I)準備5-10mL淋巴細胞分離液，將等體積的樣品緩慢加到分離液上層，密度梯度離心，300-500g，20-40分鐘(加速度和減速度均設為1，溫度為10_30°C);
[0081](2)離心結束後移去上清，小心取中間白膜層至另一潔淨離心管中，加3_5mL PBS或Hanks液吹打，衝洗，1000-1500rmp離心5_10分鐘，重複2_3次除菌；
[0082](3)獲得的單核細胞用ImL左右完全培養液(a -MEM+雙抗+兩性黴素+20%胎牛血清)吹打懸起；
[0083](4)細胞懸液接種至六孔板中，補加培養液至3mL，放入37°C、5%C02培養箱中進行原代培養。
[0084]實施例2.宮膜幹細胞的平皿培養擴增
[0085]當細胞長滿平皿的80%時，棄去原培養液，用PBS洗滌2遍，加入覆蓋皿底量的
0.25%含有EDTA的胰蛋白酶，消化3-4min，期間不間斷用倒置顯微鏡觀察，見胞質回縮、細胞間隙增大、細胞變圓，立即加入與胰酶等體積的細胞培養基終止消化，用吸管反覆吹打貼壁細胞，將細胞吹打下來，1000r/min離心5min，再用細胞培養液重懸細胞，按照密度為5.0X IO5個細胞，接種到新的平皿中，加入新鮮細胞培養液於37°C、5%C02條件下培養，3天換液一次，得到2.0X IO6個細胞，細胞擴增3倍。
[0086]實施例3.宮膜幹細胞在含微載體的轉瓶中培養擴增
[0087]在本實施例中使用的是含有微載體的轉瓶培養擴增細胞，轉瓶工作體積為125ml，微載體為Cytodex-3。
[0088](I)轉瓶預處理:125ml轉瓶清洗乾淨，烘乾至完全乾燥，加入20ml矽化液(Sigmacote, Sigma)於轉瓶中，緩慢旋轉轉瓶使娃化液浸潤瓶壁，吸去娃化液後，將轉瓶置於通風處風乾12h，蒸餾水衝洗備用。
[0089](2)微載體預處理:本實施例中微載體密度為2g/L，由於培養體積為50ml，因此稱取0.1g放入Cytodex-3轉瓶中，加入20ml PBS浸泡3h，吸去後加入20ml新的PBS，121 °C高壓蒸汽滅菌20min，吸去PBS並加入20ml含15%胎牛血清的a -MEM培養液，37°C浸泡過夜。
[0090](3)宮膜幹細胞的接種:取4平皿生長至80%融合的宮膜幹細胞，0.25%胰酶-EDTA消化後，以15%胎牛血清的培養液終止消化，1000rpm離心5min，新鮮培養液重懸，以4X104個細胞/ml的密度接種在三維微載體上。將含有8 X IO6個細胞的懸液加入含有Cytodex-3的轉瓶中，再分別補足培養液至25ml，置於Wheaton磁力攪拌器上間歇攪拌，間歇攪拌條件為45rpm攪拌2min，停止13min，如此循環3h，37°C，5%C02。接種結束後，分別補入25ml培養液至50ml最終工作體積，轉速調整為55rpm，每2天更換2/3培養液直至培養結束。
[0091](4)宮膜幹細胞的獲取:停止轉瓶內的攪拌，棄去上清液，0.25%胰酶-EDTA消化後，以含15%胎牛血清的培養液終止消化，1000rpm離心5min，用新鮮培養液重懸，得到
5.8X IO5個細胞/ml密度的細胞。
[0092]實施例4.攪拌式生物反應器擴增培養宮膜幹細胞
[0093]在用平皿或轉瓶小規模培養擴增宮膜幹細胞達到足夠的細胞數量後，轉入攪拌式生物反應器進行擴增培養。
[0094](I)連接反應器氣路管、進液管、出液管等管路，121°C高壓溼熱滅菌40min，打入新鮮的細胞培養液，攪拌2天進行培養液檢菌；
[0095](2)微載體的水化過程:稱取15g微載體置一乾淨容器中，使用無Ca2+，Mg2+的PBS在室溫下水化過夜並不時溫和攪拌。棄去上清，加入新鮮的無Ca2+，Mg2+的PBS，溫和攪拌後洗滌2次，棄去洗滌的PBSjPA PBS，121 °C高壓溼熱滅菌20min ；
[0096](3)將預先水化、滅菌的微載體接種到3L培養液中；
[0097](4)挑選形態健康、生長良好的平皿生產細胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，按照6X IO5個/mL製成細胞懸液，半量接種至反應器中，調節反應器的溫度、培養液pH、溶氧等參數，使細胞生長於最適宜環境進行細胞培養，80rpm轉3min,靜置12min,如此重複12個循環，結束後接種剩餘細胞，以IOOrpm的轉速連續培養；
[0098](5)細胞接種第2天，根據細胞的生長匯合情況判斷是否進行灌注培養及灌注體積，一般灌注體積為反應器I個工作體積，之後可控制在l_2vvD ；
[0099](6)每天取樣觀察拍照，計算細胞數目。當細胞長滿微載體表面，數目達到約
3.5 X IO6個/mL,細胞擴增5倍，停止培養；
[0100](7)收集約20mL培養液進行無菌檢測；
[0101](8)通過反應器的微載體/細胞截留裝置將高壓液體排出，加入500mL PBS衝洗2-3次，將IOOmL胰酶/EDTA加入反應器，消化20min後加入等體積培養液終止消化；
[0102](9)吹打細胞與微載體的混合物，目測微載體沉降後吸出上清於離心管中，移出少量細胞懸液進行流式表面標誌物鑑定；
[0103](10)離心，棄上清，加入適當體積的凍存液，調整濃度為IO6個/mL，分別取ImL細胞懸液加入到凍存管內，做好標記；
[0104](11)程序降溫盒內加入25mL異丙醇，將凍存管放入其中，置於-80°C冰箱內過夜；
[0105](12)將凍存管取出放入液氮罐內凍存。
[0106]採用灌注模式進行培養，溶氧是細胞代謝中的重要參數，它可以影響細胞的產率，所以需要時常觀測調節溶氧量使其維持在50%，此過程可通過計算機有序定量地控制加入動物細胞培養罐內的空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳四種氣體的流量使其保持最佳的比例來實現。
[0107]反應器的溫度由計算機實時自動控制在37 ± 0.2 °C，pH控制在7.0-7.2。
[0108]攪拌式生物反應器擴增得到宮膜幹細胞3.5 X IO6個/mL，細胞擴增5倍。
[0109]實施例5、固定床式生物反應器培養擴增宮膜幹細胞
[0110]①米用美國BBA Fiberweb的Reemay公司(Old Hickory, TN, USA)生產的無紡布聚酯類纖維(Non Woven Polyester Fabric), N0.2214型,經表面處理並切割成直徑為6mm的圓形小片體。
[0111]②細胞生物反應器選擇的是購買自美國NBS公司的5L生物反應器CelligenPlus,工作體積3.5L，採用固定床籃式攪拌系統。在生物反應器中加入上述處理切割好的直徑為6mm的圓形聚酯切片作為細胞載體，並加入磷酸緩衝液，121°C滅菌30min。滅菌後，排空磷酸緩衝液，加入含15%胎牛血清的a -MEM培養液，並開始控制細胞生物反應器條件。
[0112]③挑選形態健康、生長良好的宮膜幹細胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，作為細胞生物反應器的種子細胞，以4Χ IO5個細胞/mL的密度接種到生物反應器中的無紡布/聚酯纖維圓形小片載體上，用細胞培養液進行擴增培養。其中聚酯纖維圓形小片載體的使用量為每升罐體積35g，所使用的細胞培養液為a-MEM培養基加15%胎牛血清。細胞生物反應器培養條件為酸鹼度(pH)值7.2，溫度37°C，溶氧濃度(DO)為空氣飽和的50%，攪拌速度80rpmo[0113]④每天通過生化分析儀檢測葡萄糖和乳酸含量等參數，接種後培養約8天，排空培養液，加入500mLPBS衝洗2_3次後，加入IOOmL胰酶/EDTA，消化20min，加入等體積培養液終止消化，收穫細胞5 X IO6個/mL，擴增倍數為14倍。
[0114]實施例6、WAVE生物反應器
[0115]①採用GE的WAVE Bioreactor系統，它由一個帶有一次性塑料細胞培養袋的搖動平臺組成，配備CO2氣體混合器(C02MIX20)或WAVEP0D?控制塔用於控制pH、溫度、氧氣和混合。將宮膜幹細胞置於Cellbag-2L的生物反應器中培養。
[0116]②微載體預處理:微載體Cytodex 3用不含Ca2+和Mg2+離子的PBS中洗滌3次後，121°C高壓滅菌15min，於4°C下無菌保存。微載體先用培養基洗滌並在接種前24h轉移到Cellbag中進行平衡。所使用的微載體Cytodex 3量為3g/l。
[0117]③挑選形態健康，生長良好的宮膜幹細胞用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，作為細胞生物反應器的種子細胞，以5X IO5個細胞/ml的密度接種到微載體上，用細胞培養液進行擴增培養。所使用的細胞培養液為a-MEM培養基加15%胎牛血清。細胞生物反應器培養條件為酸鹼度(pH)值7.2，溫度37°C，溶氧濃度(DO)為空氣飽和的50%。
[0118]④每天通過生化分析儀檢測葡萄糖和乳酸含量等參數，接種後培養約7天，排空培養液，加入500mLPBS衝洗2_3次後，加入IOOmL胰酶/EDTA，消化20min，加入等體積培養液終止消化，收穫細胞。可得4X IO6個/ml的細胞，擴增倍數為8倍。
【權利要求】
1.一種宮膜幹細胞規模化生產工藝，包括以下步驟: (1)宮膜幹細胞的分離提取:月經血經密度梯度離心後，在含胎牛血清細胞培養液的培養器皿中，在37°C、5%C02條件下進行原代培養； (2)宮膜幹細胞的培養擴增:將步驟(1)獲得的原代細胞以0.5X IO6-L 5X IO6個細胞/cm2的密度接種於二維培養器皿中，加入新鮮細胞培養液，於37°C、5%C02條件下培養，3天換液； (3)宮膜幹細胞的大規模培養:將步驟(2)獲得的宮膜幹細胞接種在轉瓶或生物反應器中，調整溶解氧濃度、PH值、攪拌轉速和通氣量，根據取樣分析細胞計數、存活率、營養成分和代謝物的結果更換培養基，從而達到細胞的高密度大規模培養； (4)宮膜幹細胞的檢測:進行幹細胞特性、無菌性、支原體、衣原體檢測； (5)宮膜幹細胞的冷凍保存:將檢測合格的細胞凍存於管內，細胞的詳細信息掃描入數據管理系統，自動化系統根據液氮情況自動尋找空缺位置，將細胞凍存於相應的空格中； (6)根據需要，進行長期冷凍保存，並定期從凍存環境中取出細胞進行復甦檢測。
2.如權利要求1所述的宮膜幹細胞規模化生產工藝，其中所述步驟(1)中月經血經密度梯度離心後用無菌PBS衝洗3-4次；所述細胞培養液包含a -MEM+雙抗+兩性黴素+20%胎牛血清。
3.如權利要求1所述的宮膜幹細胞規模化生產工藝，其中所述步驟(2)中的二維培養器皿選自細胞培養孔板、培養皿和T瓶。·
4.如權利要求1所述的宮膜幹細胞規模化生產工藝，其中所述步驟(3)中，調節溶解氧濃度為40%-60%、pH值為6.8-7.2、攪拌轉速為80_120rpm。
5.如權利要求1所述的宮膜幹細胞規模化生產工藝，其中所述步驟(3)中所述的轉瓶培養按以下過程進行:將微載體經預處理、轉瓶矽化、121°C高溫滅菌後，接種細胞，微載體加入量為3-20g/L，微載體的大小範圍為60-300 μ m,接種密度為2 X 105-6 X IO5個細胞/ml，轉瓶的大小範圍為25ml-500ml，轉速範圍50-75rpm/min，培養方式是分批培養。
6.如權利要求1所述的宮膜幹細胞規模化生產工藝，其中所述步驟(3)中所述的生物反應器選自細胞培養生物反應器包括攪拌式生物反應器、固定床生物反應器和WAVE生物反應器。
7.如權利要求6所述的宮膜幹細胞規模化生產工藝，其中所述微載體生物反應器按以下過程進行細胞培養:將微載體用PBS衝洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱內平衡水化過夜，高壓蒸汽滅菌後，接種宮膜幹細胞，微載體的加入量為3-20g/L，接種密度為IO5-1O6個細胞/mL，細胞擴增至密度為5X 106-5X IO7個細胞/mL。
8.如權利要求1所述的宮膜幹細胞規模化生產工藝，其中所述步驟(5)中輸入的細胞詳細信息包括供者姓名、細胞代數、細胞培養液成分和濃度、細胞接種密度、凍存液成分和凍存日期；所述冷凍保存包括將所獲得的宮膜幹細胞按IX IO7IX IO7個/ml細胞密度在凍存液中重懸，分裝入凍存管，經過程序降溫後，將凍存管轉移至-196°C液氮中冷凍保存，所述凍存液組分及體積比為DMSO:胎牛血清:a -MEM培養液=1:2:7。
9.如權利要求1所述的宮膜幹細胞規模化生產工藝，其中所述步驟(6)中的復甦檢測包括 CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD 59、CD81、CD105、CD166 及 HLAI 類中至少一個表面標誌物的檢 測。
【文檔編號】C12N5/074GK103849596SQ201210517322
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月5日 優先權日:2012年12月5日
【發明者】杜明明, 陳彥田, 齊瀚實 申請人:上海坤愛生物科技有限公司