一種幹擾素的純化方法
2023-12-02 23:27:06 1
專利名稱：一種幹擾素的純化方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種幹擾素的純化方法。本發明在純化工藝中採用了反相填料的精細分離純化步驟。同現有技術相比較，可以大幅度的提高干擾素的純度、比活、穩定性。
背景技術：
幹擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制B肝病毒的複製；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，並增強抗病毒能力。幹擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。它們在同 種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。幹擾素根據抗原特異性和分鐘結構的不同，分為α、β、Y等型別，而在一特定的幹擾素型別內，再根據胺基酸序列或組成方面的差異，劃分出不同的亞型，比如=HuIFN (人幹擾素)α1、α2等。而在一特定的幹擾素亞型內，根據個別胺基酸的變異，以a、b、c在亞型後面進彳丁標記，比如HuIFNa -la, a -2a, α -2b等。HuIFNa已經可以通過基因重組生物工程技術進行量產。但其純化工藝經過多年研究始終難以解決其純度問題，比活下降明顯，如現有技術「重組人幹擾素_26的提取和純化」微生物學免疫學進展2004年第32卷第I期採用離子交換層析柱DEAEsepharose (FF)A 柱，柱形)(K30/50，以及 sephacryll00/50)(K 層析柱，S-100 填料，經過兩次層析得到，經過測定，其比活1. 2X108IU/mg，蛋白純度為95%。重組人a2b型幹擾素的純化與鑑定《生物工程學報》1994年第I期5頁61-65頁採用單克隆抗體親和層析一步純化法對大腸桿菌表達的重組人a2b型幹擾素進行了純化，然後利用凝膠過濾高壓液相層析、SDS 一聚丙烯醯胺凝膠電泳和N端2 5個胺基酸的序列測定等方法對純化產品進行了鑑定。表明一步純化的重組人a2b達到95%，其比活性為2. 54X 10 8 IU / mg。本發明經過對不同純化工藝的研究，篩選出一種純化方法，本發明採用的技術方案是在純化工藝中採用了陰離子柱層析，陽離子柱層析，反相填料柱層析三步分離純化步驟。包括步驟a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精製包涵體；c、對精製包涵體進行復性，獲得復性產物；d、對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、對陽離子柱層析產物進行精細分離，採用反相填料柱層析處理，得到重組人幹擾素。同現有技術相比較，採用本專利的反相填料精細分離，rhIFN電泳純度由90%提高到98%, HPLC純度由90%提高到98%，其比活由O. 9X 107IU/mg提高至Ij 3. 5X IO8IU/mg。_30°C條件下穩定性由原有的3個月提高到12個月。可見，採用本發明的重組人幹擾素的純化工藝，可以大幅度的提高rhIFN的純度、比活、穩定性。
發明內容
本發明提供一種幹擾素的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精製包涵體；C、對精製包涵體進行復性，獲得復性產物；d、對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、採用反相填料柱層析處理上步的陽離子柱層析產物，再經過脫鹽處理，得到幹 擾素。其中，所述幹擾素選自幹擾素α-la，幹擾素a _2a，幹擾素a _2b，優選的是幹擾素a -2b ο其中步驟a_c屬於現有技術，可以根據現有技術中的方法獲得。本發明所述的步驟d_f屬於純化步驟，屬於本發明的技術方案，其中，優選的技術方案如下陰離子柱層析(XK50/30層析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L PH8. 2 Tris-HCl緩衝液)，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min。平衡8_10倍柱床體積。樣品預處理將復性產物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl調其PH值為8. 2，然後用注射用水將其體積稀釋四倍，即為上樣液。上樣上樣時泵流速為8. 0-49. 9ml/min。上樣結束後用平衡液平衡2_4個柱床體積。洗脫使用預洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液)進行預洗，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min，洗脫2_4個柱床體積。然後將進液管換至洗脫液(20mmol/L pH7. 8NaH2P04-Na2HP04緩衝液、O.1MNaCL)中，開始目標峰洗脫，收集OD28tl大於O. 3洗脫峰。陽離子柱層析(XK50/30層析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L PH4. 5 HAc-NaAc緩衝液)，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床體積。上樣上樣液為上步得到的A280大於O. 3的洗脫液，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min，開始上樣。上樣結束後，換至平衡液中，平衡2-4個柱床體積，至記錄筆回至基線。用預脫液(20mmol/L PH4. 5HAc-NaAc緩衝液、O. 15 MNaCL緩衝液)進行預洗，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min,至雜質峰洗下為止。換至洗脫液(50mmol/L PH4. 5HAc-NaAc緩衝液、O. 2MNaCL緩衝液)進行洗脫目的峰，收集A280大於O. 3的洗脫峰。反相填料層析採用C18 高效液相色譜柱(WTARES PREPLC4000, WTARES C18 柱，25mm*100mm*3)，流動相A為6%乙腈，O. P/oTFA (三氟乙酸)，流動相B為30%乙腈，O. 1%TFA (三氟乙酸)，進行線性梯度洗脫，收集目標峰，採用旋轉蒸發或冷凍乾燥的方法去除乙腈和TFA，即為純化的rhIFN,取樣檢測。經取樣檢測，經反相填料層析分離純化的樣品其電泳純度與HPLC純度均大於98%，經測定其比活可達到3.5X108IU/mg。該樣品在_30°C條件下放置12個月，該樣品電泳純度和活性均無顯著性變化。穩定性可以保證12個月。其他質量控制項目均符合藥典要求。採用本發明的的生產工藝，可以大幅度的提高rhIFN的純度、比活、穩定性。本發明的工藝方法是經過篩選獲得的，篩選過程如下層析方式的選擇針對現有技術設計了 5種層析方式，用這5種方式對復性溶液進行純化，然後進行測定，實驗結果如下
權利要求
1.一種幹擾素的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精製包涵體；C、對精製包涵體進行復性，獲得復性產物；d、對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、採用反相填料柱層析處理上步的陽離子柱層析產物，再經過脫鹽處理，得到幹擾素。
2.根據權利要求1的純化方法，其中，所述幹擾素選自幹擾素α-la，幹擾素a-2a， 幹擾素a -2b ο
3.根據權利要求1的純化方法，其中，所述幹擾素是幹擾素a-2b。
4.根據權利要求1的純化方法，其中，所述對復性產物進行陰離子柱層析處理方法如下陰離子柱層析(XK50/30層析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L PH8. 2 Tris-HCl緩衝液)，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床體積，樣品預處理將復性產物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl調其PH值為8. 2，然後用注射用水將其體積稀釋四倍，即為上樣液，上樣上樣時泵流速為8. 0-49. 9ml/min，上樣結束後用平衡液平衡2_4個柱床體積，洗脫使用預洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液)進行預洗，調節泵流速為30.0-49.91111/1^11，洗脫2-4個柱床體積，然後將進液管換至洗脫液(20臟01/1 pH7. 8 NaH2P04-Na2HP04緩衝液、O.1MNaCL)中，開始目標峰洗脫，收集OD28tl大於O. 3洗脫峰。
5.根據權利要求1的純化方法，其中，所述對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，方法如下陽離子柱層析(XK50/30層析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L PH4. 5 HAc-NaAc緩衝液)，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/ min，平衡8_10倍柱床體積，上樣上樣液為上步得到的A280大於O. 3的洗脫液，調節泵流速為30. 0-49. 9ml/ min,開始上樣，上樣結束後，換至平衡液中，平衡2-4個柱床體積，至記錄筆回至基線，用預脫液(20mmol/L PH4. 5HAc-NaAc緩衝液、O. 15 MNaCL緩衝液)進行預洗，調節泵流速為 30. 0-49. 9ml/min,至雜質峰洗下為止,換至洗脫液(50mmol/L PH4. 5HAc-NaAc緩衝液、O. 2 MNaCL緩衝液)進行洗脫目的峰，收集A280大於O. 3的洗脫峰。
6.根據權利要求1的純化方法，其中，所述採用反相填料柱層析處理上步的陽離子柱層析產物，方法如下反相填料層析採用 C18 高效液相色譜柱(WTARES PREPLC4000, WTARES C18 柱，25mm*100mm*3)，流動相A為6%乙腈，O. 1%TFA(三氟乙酸)，流動相B為30%乙腈，O. 1%TFA(三氟乙酸)，進行線性梯度洗脫，收集目標峰，採用旋轉蒸發或冷凍乾燥的方法去除乙腈和TFA，即為純化的rhIFN。
全文摘要
本發明涉及一種幹擾素的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進行發酵培養；b、對發酵培養所得菌體進行包涵體的分離和洗滌，得到精製包涵體；c、對精製包涵體進行復性，獲得復性產物；d、對復性產物進行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產物；e、對陰離子柱層析產物進行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產物；f、採用反相填料柱層析處理上步的陽離子柱層析產物，再經過脫鹽處理，得到幹擾素。
文檔編號C07K1/18GK103014101SQ20121056982
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者段志強, 楊棟, 陳玉軍, 龐睿, 鄭立運, 王晴, 吳貴海, 趙鈺, 白宇, 張崇遠, 楊超 申請人:哈藥集團生物工程有限公司