一種鹿血蛋白多肽及應用的製作方法
2023-12-02 17:08:51
本發明涉及保健用品技術領域，尤其涉及一種鹿血蛋白多肽及應用。
背景技術：
鹿血是指鹿類動物如梅花鹿和馬鹿的茸血及膛血，研究表明，鹿血具有增強免疫、補血、延緩衰老、抗疲勞、提高性功能、益精、安神、促進代謝和創傷癒合等功能。多年來，我國對於鹿血資源的利用僅限於對原血液的利用和加工，其中大部分都是以鹿血酒的形式存在。而在某些發達國家，已經開始有利用動物血液酶解開發肽類試劑和藥物。因此，開發鹿血蛋白製品對鹿血資源開發具有重要的意義。
鹿血的化學成分複雜，理化測試表明，鮮鹿血水分含量為80％～81％，無機成分佔2％～4％，灰分佔3％～4％，有機成分16％～17％。其中主要是蛋白質及多種酶，蛋白質中富含19種胺基酸；另外還含多種脂類、游離脂肪酸、固醇、糖脂、磷脂、激素、嘌呤、維生素和多糖等，並含多種常量和有益微量元素。
鹿血蛋白肽是指在蛋白酶的作用下將鹿血中的蛋白質水解產生的多肽。多肽具有極強的活性和多樣性，可全面調節人體生理功能，增強人體生理活性；多肽不僅能提供人體生長發育所需的營養物質，而且具有特殊的生物學功能，比蛋白質更易人體吸收。
目前市面上的鹿血酒大部分採用鮮鹿血分散於高濃度酒中，在保存和運輸過程中，鹿血與酒體發生分離現象，對外觀和品質上都產生了極大的影響，造成了不必要的損失。
技術實現要素：
為了克服現有技術的不足，本發明的目的之一在於一種高寡肽比例的鹿血蛋白多肽。
本發明的目的之二在於提供該鹿血蛋白多肽的應用。
本發明的目的之一採用如下技術方案實現：
一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向新鮮鹿血中加入抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣離心，棄去血漿，收集血細胞；
超聲輔助溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入1-2倍體積的蒸餾水，用稀naoh調節ph為9-10，採用35-37℃超聲輔助溶血，離心，收集上清液；
微波輔助鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成8-10g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為6000-7000u/g血細胞，50-60℃微波輔助酶解，其中，加稀naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；
微波輔助木瓜蛋白酶酶解：加入稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為5000-6000u/g血細胞，50-60℃微波輔助進行酶解，將酶解液加熱至90-95℃滅活，離心，分離出上清液；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為50-60°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。
作為優選，抗凝步驟中，所述抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖的混合溶液，其中，檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖的重量比為(0.8-1):(0.3-0.6):1。
作為優選，分離血細胞步驟中，離心速率為3000-3500rpm，離心時間為10-15min。
作為優選，超聲輔助溶血步驟中，超聲功率為300-400w。
作為優選，微波輔助鹼酶酶解步驟中，微波頻率為1500-3000mhz，功率為5kw。
作為優選，微波輔助鹼酶酶解步驟中，稀naoh的濃度為0.5mol/l。
作為優選，微波輔助木瓜蛋白酶酶解步驟中，稀hcl的濃度為0.5mol/l。
作為優選，濃縮步驟中，所述過濾為微孔過濾。
作為優選，微孔過濾的孔徑為22μm。
本發明的目的之二採用如下技術方案實現：
上述的鹿血蛋白多肽在製備保健品上的應用。
相比現有技術，本發明的有益效果在於：
(1)本發明提供的鹿血蛋白多肽的分子具有較好的均一性，寡肽的佔比高，易於吸收；該鹿血蛋白多肽具有較好的抗疲勞和抗氧化活性，具有較好的功效；
(2)本發明提供的鹿血蛋白多肽用於製備養生酒之後具有較高的穩定性，不易產生沉澱或渾濁，在保健品領域具有較好的應用前景。
具體實施方式
下面，結合具體實施方式，對本發明做進一步描述，需要說明的是，在不相衝突的前提下，以下描述的各實施例之間或各技術特徵之間可以任意組合形成新的實施例。
以下具體實施方式中，如未特殊說明，所採用的試劑或材料均可通過市售或常規試驗手段的方式獲得。
本發明提供一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向新鮮鹿血中加入抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣離心，棄去血漿，收集血細胞；
本步驟中抗凝劑優選為所述抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖的混合溶液，其中，檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖的重量比為(0.8-1):(0.3-0.6):1，即該混合型抗凝劑能彌補單獨的抗凝劑造成體系ph值不穩定等缺陷；
超聲輔助溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入1-2倍體積的蒸餾水，用稀naoh調節ph為9-10，採用35-37℃超聲輔助溶血，離心，收集上清液；
採用超聲輔助，有效地提高血細胞的溶出速率；該ph值條件下，血細胞滲透壓增大，可以加速血細胞的破裂，較大地提高了血細胞的溶出速率，且不會引起細胞蛋白變性；
微波輔助鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成8-10g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為6000-7000u/g血細胞，50-60℃微波輔助酶解，其中，加稀naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；
微波輔助木瓜蛋白酶酶解：加入稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為5000-6000u/g血細胞，50-60℃微波輔助進行酶解，將酶解液加熱至90-95℃滅活，離心，分離出上清液；
在溶血後，依次進行鹼酶、木瓜蛋酶酶解，兩者結合協調性地完成血細胞蛋白的酶解；酶解過程，體系的ph值均呈現較好的穩定性，能有效減少因ph環境驟變影響蛋白或多肽變性的情況；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為50-60°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。
該鹿血蛋白多肽具有較高的寡肽比例，易於被身體吸收，同時用於配製保健飲品，具有較好的分散性和穩定性。該膏狀液具有較好的穩定性的流變性，可進一步噴霧乾燥或直接用於配製保健飲品。
實施例1
一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向1l新鮮鹿血中加入8g抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣以3300rpm離心12min，棄去血漿，收集血細胞；本步驟中，抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖按1:(0.3-0.6):1重量比混合；
超聲輔助溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入等體積的蒸餾水，用0.5mol/l的naoh調節ph為9-10，採用35-37℃超聲輔助溶血15min，超聲功率350w，以3300rpm離心12min，收集上清液；
微波輔助鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成9g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為6500u/g血細胞，55℃微波輔助酶解，其中，加0.5mol/l的naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
微波輔助木瓜蛋白酶酶解：向酶解液加入0.5mol/l的稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為5000-6000u/g血細胞，55℃微波輔助進行酶解，將酶解液加熱至95迅速降溫℃滅活，以3300rpm離心12min，分離出上清液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為60°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。以血細胞為基準計，收率為73.4％，寡肽比例為89.2％。
實施例1
一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向1l新鮮鹿血中加入8g抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣以3300rpm離心12min，棄去血漿，收集血細胞；本步驟中，抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖按1:0.4:1重量比混合；
超聲輔助溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入等體積的蒸餾水，用0.5mol/l的naoh調節ph為9-10，採用35-37℃超聲輔助溶血15min，超聲功率300w，以3300rpm離心12min，收集上清液；
微波輔助鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成9g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為6500u/g血細胞，55℃微波輔助酶解，其中，加0.5mol/l的naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
微波輔助木瓜蛋白酶酶解：向酶解液加入0.5mol/l的稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為5500u/g血細胞，55℃微波輔助進行酶解，將酶解液加熱至95迅速降溫℃滅活，以3300rpm離心12min，分離出上清液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為55°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。以血細胞為基準計，收率為73.4％，寡肽比例為89.2％。
實施例2
一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向1l新鮮鹿血中加入8g抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣以3300rpm離心12min，棄去血漿，收集血細胞；本步驟中，抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖按1:0.5:1重量比混合；
超聲輔助溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入等體積的蒸餾水，用0.5mol/l的naoh調節ph為9-10，採用35-37℃超聲輔助溶血15min，超聲功率400w，以3500rpm離心10min，收集上清液；
微波輔助鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成8g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為7000u/g血細胞，55℃微波輔助酶解，其中，加0.5mol/l的naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
微波輔助木瓜蛋白酶酶解：向酶解液加入0.5mol/l的稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為6000u/g血細胞，55℃微波輔助進行酶解，將酶解液加熱至95迅速降溫℃滅活，以3300rpm離心12min，分離出上清液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為60°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。以血細胞為基準計，收率為72.1％，寡肽比例為88.6％。
實施例3
一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向1l新鮮鹿血中加入8g抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣以3000rpm離心15min，棄去血漿，收集血細胞；本步驟中，抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖按1:0.55:1重量比混合；
超聲輔助溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入等體積的蒸餾水，用0.5mol/l的naoh調節ph為9-10，採用35-37℃超聲輔助溶血15min，超聲功率350w，以3500rpm離心10min，收集上清液；
微波輔助鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成8g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為6000u/g血細胞，55℃微波輔助酶解，其中，加0.5mol/l的naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
微波輔助木瓜蛋白酶酶解：向酶解液加入0.5mol/l的稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為5000u/g血細胞，55℃微波輔助進行酶解，將酶解液加熱至95迅速降溫℃滅活，以3300rpm離心12min，分離出上清液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為50°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。以血細胞為基準計，收率為74.4％，寡肽比例為89.7％。
對比例1：
一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向1l新鮮鹿血中加入8g抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣以3300rpm離心12min，棄去血漿，收集血細胞；本步驟中，抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖按1:0.4:1重量比混合；
溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入等體積的蒸餾水，用0.5mol/l的naoh調節ph為9-10，35-37℃溶血60min，以3300rpm離心12min，收集上清液；
微波輔助鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成9g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為6500u/g血細胞，55℃微波輔助酶解，其中，加0.5mol/l的naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
微波輔助木瓜蛋白酶酶解：向酶解液加入0.5mol/l的稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為5500u/g血細胞，55℃微波輔助進行酶解，將酶解液加熱至95迅速降溫℃滅活，以3300rpm離心12min，分離出上清液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為55°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。以血細胞為基準計，收率為61.8％，寡肽比例為87.4％。
對比例2：
一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向1l新鮮鹿血中加入8g抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣以3300rpm離心12min，棄去血漿，收集血細胞；本步驟中，抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖按1:0.4:1重量比混合；
超聲輔助溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入等體積的蒸餾水，用0.5mol/l的naoh調節ph為9-10，採用35-37℃超聲輔助溶血15min，超聲功率350w，以3300rpm離心12min，收集上清液；
鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成9g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為6500u/g血細胞，55℃酶解，其中，加0.5mol/l的naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；
微波輔助木瓜蛋白酶酶解：向酶解液加入0.5mol/l的稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為5500u/g血細胞，55℃微波輔助進行酶解，將酶解液加熱至95迅速降溫℃滅活，以3300rpm離心12min，分離出上清液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為55°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。以血細胞為基準計，收率為73.6％，寡肽比例為60.1％。
對比例3
一種鹿血蛋白多肽，其製備方法依次包括：
分離血細胞：向1l新鮮鹿血中加入8g抗凝劑，分散，得到抗凝血樣，將抗凝血樣以3300rpm離心12min，棄去血漿，收集血細胞；本步驟中，抗凝劑為檸檬酸、檸檬酸鈉與葡萄糖按1:(0.3-0.6):1重量比混合；
超聲輔助溶血：將血細胞用生理鹽水洗滌，加入等體積的蒸餾水，用0.5mol/l的naoh調節ph為9-10，採用35-37℃超聲輔助溶血15min，超聲功率350w，以3300rpm離心12min，收集上清液；
微波輔助鹼酶酶解：向上清液中加入蒸餾水稀釋成9g血細胞/l，加入鹼性蛋白酶，使酶濃度為6500u/g血細胞，55℃微波輔助酶解，其中，加0.5mol/l的naoh溶液使上清液的ph值保持9-10，得酶解液；微波頻率為2500mhz，功率為5kw；
木瓜蛋白酶酶解：向酶解液加入0.5mol/l的稀鹽酸使酶解液ph值為6-7，加入木瓜蛋白酶，使酶濃度為5000-6000u/g血細胞，55℃進行酶解，將酶解液加熱至95迅速降溫℃滅活，以3300rpm離心12min，分離出上清液；
濃縮：用22μm微孔膜將上清液過濾，減壓濃縮至brix為60°，即得鹿血蛋白多肽的膏狀液。以血細胞為基準計，收率為72.4％，寡肽比例為64.9％。
由實施例1-3與對比例1-3的比較可知，在溶血階段未採用超聲波輔助溶血，收率明顯降低；而在鹼酶酶解或木瓜蛋白酶酶解過和未採用微波輔助手段，雖然收率下降不明顯，但寡肽比例大大下降。
本發明提供的鹿血蛋白多肽，在免疫、抗氧化等方面具有顯著的功效，可直接添加於酒品中以製得保健飲品。
性能檢測與效果評價
1、抗氧化能力測定
將10μmol/l的trolox儲備液加磷酸鹽緩衝液稀釋成濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.6μmol/l的標準溶液，以磷酸鹽緩衝液為陰性對照，以螢光半衰時間為縱坐標，以trolox濃度為橫坐標，繪製標準曲線。
取1g的實施例1-3的鹿血蛋白多肽，加100ml的磷酸鹽緩衝液進行稀釋，混合均勻，以蒸餾水為空白對照，分別採用磷酸鹽緩衝液稀釋按10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍稀釋，將稀釋液進行測定，其結果如下表所示：
表1抗氧化能力測試結果
2、小鼠負重試驗
採用spf雄性小鼠，體重為18-22g，每試驗組10隻，共40隻，分別進行負重遊泳測定，實驗期間環境溫度為22-24℃，溼度50-54％。採用實施例1得到的鹿血蛋多肽，設定劑量為0.1g/kg.bw、0.2g/kg.bw、0.5g/kg.bw，以滅菌水為對照組，拌食餵養30天，進行負重遊泳試驗。
表2負重遊泳試驗
灌胃餵養30天後，各劑量組小鼠，相對於對照組小鼠的負重遊泳時間明顯延長。說明本申請提供的鹿血蛋白多肽具有提高機體抗疲勞作用。
3、穩定性試驗
將實施例1-3與對比例1-3的鹿血蛋白多肽以1:10的配比加至50°的白酒中，震蕩均勻至無肉眼可見沉澱，得到鹿血蛋白多肽的養生酒，取1l養生酒以3000rpm的速度離心5min，觀察養生酒的外觀以及是否有沉澱，若有，則測量沉澱體積，結果如下表所示：
表3穩定性試驗結果
如上表所示，該申請獲得的鹿血蛋白多肽具有較高的動力學穩定性，該蛋白多肽製備養生酒後不易變質，不易產生沉澱，品質較高。
上述實施方式僅為本發明的優選實施方式，不能以此來限定本發明保護的範圍，本領域的技術人員在本發明的基礎上所做的任何非實質性的變化及替換均屬於本發明所要求保護的範圍。