一種三維螢光的矯正方法

2023-12-02 10:23:41 1

專利名稱：一種三維螢光的矯正方法
技術領域：
本發明涉及一種三維螢光檢測矯正的方法，以及使用該方法的三維螢光檢測系統。
背景技術：
三維螢光光譜是20世紀80年代在螢光光譜分析的基礎上發展起來的一種新的 分析技術，獲取三維螢光數據的方法一般是在不同激發波長位置上連續掃描發射光譜，並 可利用各種繪圖軟體將其以等角三維螢光投影圖(Ex-Em-If)或等高線光譜(Ex-Em)等形 式圖像化表現。應用螢光光譜技術研究螢光類物質是基於其結構中含有大量帶有各種官 能團的芳香環結構以及未飽和脂肪鏈(物質之所以具有螢光是由於其結構中具有低能量
n — rT躍遷的芳香結構或共軛生色團)。相對紅外、核磁共振等研究方法，螢光光譜法研
究天然有機物結構特徵具有靈敏度高(10—9數量級)、選擇性好，不破壞樣品結構、需要的樣
品量少(只需少量低濃度，通常〈20mg/L的水樣)、樣品不需特殊分離、快速而簡便等優點， 被用於有機質或腐殖質結構和官能團的定性或定量描述，以及有機質的來源和水監測研究 中。 然而，在螢光檢測中，通常由於溶液的內過濾作用和自吸收現象，而導致所測得的 螢光減弱，使得螢光強度和峰型都發生變化。特別隨著樣品濃度的增加，溶液的內過濾作用 和自吸收現象嚴重，以至於螢光檢測出現較大偏差。大連工業大學的王雅娜，崔勵，徐同寬， 欒強等在"三維螢光光譜的應用研究"(分析試驗室，2008-5， V27增刊，第59-62頁) 一文 中就指出，在用三維螢光對羅丹明B檢測時，"可能因為高濃度時產生螢光自吸收及螢光熄 滅顯現，從而導致螢光譜的短波長光(藍光)的損失，導致螢光譜形的變化，即羅丹明B的 3DEEM譜形會受質量濃度影響" 溶液中若存在著能吸收激發或螢光物質發射光能的物質，就會使螢光減弱，這種
現象稱為"內濾光作用"。在溶液濃度較大時， 一部分螢光發射被自身吸收，產生所謂"自吸
收"現象而降低了溶液的螢光強度。 A = e lc
If = (pIa = (pI。(l-10-Elc) = (pIo(l-e-23dc)
螢光強度If正比於吸收的光量Ia與螢光量子產率(p，I。代表入射光強度，e是摩
爾吸光係數，1是樣品池的光程，c是樣品濃度。 e—23Elc = 1-2. 3 e lc_(2. 3 e lc)2/2 ! - (2. 3 e lc) 3/3 !-...... 當e lc《0. 05時，可省略第二項後各項，艮卩e—23Ele= 1-2. 3e lc
If = 2.3(pl。slc 當入射光強度I。與1 一定，可簡寫為If = Kc 即螢光強度與螢光物質的濃度成正比，但這種線性關係只有在極稀的溶液中，當
3e lc《0. 05時才成立，對於較濃的溶液，由於猝滅現象和自吸收等原因，使螢光強度與濃 度不呈線性關係。可見，不同的螢光物質具有不同的螢光特徵和出現特徵螢光的濃度範圍， 但是當濃度高的時候，就會出現內濾光(inner filtering.)和自吸收(reabsorbance)現 象，而導致螢光強度降低。因此在三維螢光光譜檢測時，有必要進行內過濾和自吸收矯正。

發明內容
針對上述現有的所存在的問題和不足，本發明的目的是提供一種三維螢光矯正方 法，該方法特別適用於待測樣品為高濃度溶液的三維螢光檢測技術。
所述方法包括 1.設定三維螢光測定條件，測定樣品的激發_發射矩陣光譜，得到光譜圖和激發 波長_發射波長_螢光強度的數據矩陣； 2.用矯正檢測儀測定樣品對各波長光的吸收情況，得到透射率(T)或吸光度 (A); 3.用三維螢光矩陣中各發射波長對應的螢光強度(If)除以矯正檢測儀所測的相 應波長的透光率(T)，對三維螢光數據進行矯正，即If/T，或用吸光度(A)進行矯正，矯正方 法為If/10—A。 其中，矯正檢測儀用於檢測樣品各波長光的透光率或吸光度，可用紫外/可見分 光光度儀。 進一步，本發明提供一種三維螢光檢測系統，該系統使用矯正檢測儀(紫外/可見 分光光度計)對三維螢光進行矯正。該檢測系統包括，螢光分光光度儀、矯正檢測儀兩個部 分。用螢光分光光度儀對樣品進行檢測後，用矯正檢測儀測定樣品對各波長光的吸收情況， 得到透射率(T)或吸光度(A)，然後用發射波長對應的各螢光強度除以該樣品相應波長的 透光率(T)(即If/T)，對三維螢光數據進行矯正，或用吸光度A矯正，矯正方法為If/10—A。 該系統可通過將三維螢光檢測儀和紫外/可見光檢測儀聯合使用實現。


圖1腐植酸樣品矯正前後三維螢光光譜圖；其中 un-5為濃度5mg/L矯正前光譜圖，co_5為濃度5mg/L矯正後光譜圖， 皿-10為濃度10mg/L矯正前光譜圖，co_10為濃度10mg/L矯正後光譜圖， un-50為濃度50mg/L矯正前光譜圖，co_50為濃度50mg/L矯正後光譜圖， un-100為濃度100mg/L矯正前光譜圖，co-100為濃度100mg/L矯正後光譜圖， 三維圖譜的三個坐標分別為，Em螢光發射波長、Ex激發波長、螢光強度。
具體實施例方式
本實驗所用化學試劑均為優級純或分析純。腐殖酸購於天津市津科精細化工研 究所。為使其固有的螢光特性不受影響，樣品使用前未加提純。使用0.01mol/LNaOH溶液 溶解，用milli-Q超純水(Millipore，18. 2MQcm)配製4種濃度(5mg/L， 10mg/L， 50mg/L， 100mg/L)的腐殖酸，用0. 01mol/LNaOH溶液或0. Olmol/LHCl溶液將pH值調節到6. 5，再用 GF/F玻璃纖維濾膜(預先於45(TC灼燒5min)過濾，測定螢光強度。本研究使用帶有lcm石英螢光樣品池的高靈敏度日立螢光分光光度計(HITACHI F-7000型，J即an)進行三維 螢光激發-發射矩陣光譜(3DEEM)測定。激發光源為150W氙弧燈，光電倍增管電壓(PMT 電壓)700V ;帶通(bandpass) :Ex = 5nm， Em = 5nm(激發和發射狹縫寬度分別為5nm和 10nm);響應時間自動；掃描速度12000nm/min ;掃描光譜進行儀器自動矯正，激發波長範 圍為Ex = 200-550nm(間隔5nm)，發射波長範圍為Em = 275-600nm(間隔5nm)，樣品測定 前保持溫度恆定(恆溫水浴2(TC 士rC)。所得的三維螢光譜圖以Excel格式輸出得到激 發波長-發射波長-螢光強度的數據矩陣。應用Origin軟體作三維螢光光譜圖，這樣得到 的光譜圖的螢光強度比真實的螢光強度要低，螢光峰位置也因為內濾光和自吸收而改變， 不是真實的位置。為矯正這一改變，可以用紫外檢測儀，檢測同濃度樣品對相應波長的光的 吸收情況，用透光率矯正螢光光譜，即檢測各樣品275-600nm的吸收光譜，以修正這樣的影 響。本實驗用U-3010分光光度計，lcm石英吸收池，1200nm/min速度，狹縫寬度5nm，間隔 5nm，對樣品進行275-600nm的波長掃描，檢測樣品對各波長光的吸收，得到與三維螢光各 發射波長相對應的樣品對光的透射率。用各發射波長對應的螢光強度比該樣品對應波長的 透光率(紫外檢測儀所測)，得到矯正後的矩陣，以此進行三維螢光的內濾光和自吸收的熒 光矯正。應用Origin軟體進行矯正前後3DEEM處理，做縱坐標為Ex = 200-550nm，橫坐標 為Em = 275-600nm的矯正前後三維螢光等高線圖，以供分析討論。
結果討論 圖1為4種濃度(5mg/L， 10mg/L， 50mg/L， 100mg/L)的腐殖酸矯正前後的三維螢光 光譜圖，un代表未矯正的三維螢光光譜圖，co代表已矯正的三維螢光光譜圖。由圖可見，未 矯正的螢光光譜隨著腐殖質濃度增大，螢光峰強度並沒增強還出現了減弱現象，螢光峰位 置向激發和發射長波方向移動，出現紅移，這主要是短波區域高吸收引起內吸收而使螢光 發射衰減所致。而在修正譜中隨著腐殖質濃度從5mg/L增大到100mg/L，螢光峰強度增強， 峰位置也沒有這樣的紅移現象。從矯正前後螢光光譜看，5mg/L的腐殖質矯正前後峰位置和 峰強度沒有大的區別，濃度越大矯正前後的螢光強度差別越大，峰位移越大。
權利要求
一種三維螢光檢測的矯正方法，所述方法包括A、設定三維螢光測定條件，測定樣品的激發-發射矩陣光譜，得到激發波長-發射波長-螢光強度的數據；B、用矯正檢測儀測定樣品對各波長光的吸收情況，得到透射率(T)或吸光度(A)；C、用三維螢光矩陣中各發射波長對應的螢光強度(If)除以矯正檢測儀所測的該樣品對應波長的透光率(T)，對三維螢光數據進行矯正，即If/T，或用吸光度(A)進行矯正，矯正方法為If/10-A；其中，矯正檢測儀用於檢測樣品對各波長光的透光率或吸光度，可用紫外/可見分光光度儀。
2. 如權利要求1所述矯正方法，步驟A、 C中所述數據為數據矩陣，根據步驟C矯正後 的矩陣數據得到的三維螢光光譜圖，能夠顯示真實的螢光峰位置和螢光強度。
3. —種三維螢光的檢測系統，該檢測系統包括螢光分光光度儀和矯正檢測儀兩個部 分，螢光分光光度儀檢測樣品的三維螢光，矯正檢測儀(紫外/可見分光光度計)對三維熒 光檢測數據進行矯正，即用紫外/可見分光光度計對樣品進行檢測，測定樣品對各波長光 的吸收情況，得到透射率(T)，再用三維螢光發射波長對應的各螢光強度除以該樣品對應波 長的透光率(T) (If/T)，進行矯正。
4. 如權利要求3所述檢測系統，可通過矯正檢測儀檢測待測樣品的吸光度(A)，再使用 If/10—A的矯正方法，對數據進行矯正。
全文摘要
本發明公開了一種三維螢光檢測矯正的方法，所述方法包括設定三維螢光測定條件，測定樣品的激發-發射矩陣光譜，得到光譜圖和激發波長-發射波長-螢光強度的數據矩陣；用校正檢測儀測定樣品對相應波長光的吸收情況，得到透射率(T)或吸光度(A)。用三維螢光矩陣中各發射波長對應的螢光強度(If)除以校正檢測儀所測的該樣品對應各波長的透光率(T)，對三維螢光數據進行校正，即If/T，或用吸光度(A)進行校正，校正方法為If/10-A。本校正方法特別適用於高濃度待測樣品的檢測。此外，本發明還公開了使用該方法的檢測系統。
文檔編號G01N21/64GK101706433SQ200910157790
公開日2010年5月12日 申請日期2009年7月27日 優先權日2009年7月27日
發明者劉俐, 曹雲者, 李發生, 顏增光 申請人:中國環境科學研究院