青蒲顆粒的檢測方法
2023-12-02 20:16:56 2
青蒲顆粒的檢測方法
【專利摘要】本發明提供了對青蒲顆粒或其中間體提取物中咖啡酸和秦皮乙素同時進行檢測的方法。本發明通過多次試驗研究，對同時測定兩種成分的HPLC色譜條件進行了篩選和探索，得到了一種能同時檢測青蒲顆粒或其中間體提取物中兩種成分的含量測定方法，在該色譜條件下，兩種成分色譜峰能夠順利分離，雜質峰無幹擾，且保留時間適宜，峰形良好，能夠達到順利測定兩種成分含量的目的，為製劑的質量研究奠定了基礎，也可為其他同時含有秦皮乙素和咖啡酸兩種成分製劑的定量研究提供借鑑方法。
【專利說明】青蒲顆粒的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及青蒲顆粒的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 獸醫臨床實踐證明，體溫反常是豬生理機能被擾亂的重要症狀之一，豬的正常體 溫為38?40°C，若連續地超過40°C以上，則為發熱，長時間的延續高熱，對機體損害大，首 先使機體分解代謝加速，營養物質耗費過多，消化機能錯亂，導致機體消瘦，抵擋力下降，又 能使中樞神經系統和血液循環系統發生損害，引起病豬精神沉鬱，以致昏迷，或心力衰竭等 嚴重後果。大量的現代研究表明，大量的中藥均具有清熱解毒，抗菌、抗病毒的作用，在治療 一些發熱性疾病具有自己獨特的優勢，青蒲顆粒是由紫花地丁、蒲公英等藥材製成的中獸 藥複方顆粒劑，具有清熱解毒，涼血消腫的功效，主要用於豬發熱病症的治療，對豬精神萎 靡、體溫升高、呼吸急促、口渴貪飲、食欲不振、尿液短黃、發熱持續不退、全身發紅等臨床病 症均具有很好的治療效果，治癒率達70%以上，具有很強的研究價值。
[0003] 蒲公英和紫花地丁均為青蒲顆粒處方中的主要藥材，咖啡酸為蒲公英的主要有效 成分之一，具有顯著的抗菌，抗病毒，中樞興奮，解毒，凝血等作用；秦皮乙素為紫花地丁主 要有效成分之一，具有明顯的抗炎、抑菌、鎮痛、抗氧化、抗腫瘤和免疫調節等作用，因此，本 顆粒劑選擇秦皮乙素和咖啡酸作為含量測定指標成分，採用高效液相色譜對顆粒劑中兩種 成分進行測定研究。
[0004] 本類製劑前期研究表明，分別採用紫花地丁藥材或蒲公英藥材的高效液相色譜含 量測定方法對青蒲顆粒中秦皮乙素和咖啡酸兩種成分同時進行測定時，兩種成分的色譜峰 均互相干擾，分離度差，雜質成分幹擾嚴重，峰面積差異大，含量測定較為困難。而當前文獻 中還報導了其他產品中秦皮乙素和咖啡酸的含量檢測方法，但這些方法多使用梯度洗脫， 其流動相程序較為複雜。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於提供一種採用等度洗脫條件對青蒲顆粒或其中間體提取物中 咖啡酸和秦皮乙素同時進行檢測的方法。
[0006] 具體地，本發明提供了對青蒲顆粒中咖啡酸和秦皮乙素同時進行檢測的方法，它 包括如下操作步驟：
[0007] (1)供試品溶液的製備：取青蒲顆粒研細後的粉末，精密稱定，以甲醇提取製備供 試品溶液；
[0008] (2)對照品溶液的製備：取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品，以甲醇為溶劑製備對 照品溶液；
[0009] (3)分別取供試品溶液和對照品溶液注入高效液相色譜儀中，以外標法計算青蒲 顆粒中咖啡酸和秦皮乙素含量即可；
[0010] 其中，青蒲顆粒由如下方法製備得到：
[0011] 取大青葉6?10重量份、蒲公英6?10重量份、紫花地丁 2?4重量份、甘草1? 2重量份；以上四味藥材，加水煎煮，合併水煎液，濃縮，加蔗糖粉和澱粉適量，混勻，製成顆 粒。
[0012] 本發明研究表明：
[0013] (1)採用Agilent-ODS (4· 6X 150mm，5 μ m)短色譜柱進行試驗時，由於色 譜柱長度限制，秦皮乙素與咖啡酸兩種成分根本無法分開；而採用島津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)長色譜柱進行試驗，秦皮乙素與咖啡酸兩種成分基本可分開，因 此，選擇島津 WondaCract 0DS-2(4.6X250mm，5ym)等長色譜柱。
[0014] (2)本發明雖然選定了較為適宜的色譜柱，但其分離效果仍人較差，存在雜質幹 擾，尚需進行進一步的試驗研究。研究發現，由於製劑中咖啡酸含量極低，樣品濃度低， 353nm波長條件下峰面積很小，且秦皮乙素吸收峰後有嚴重拖尾。為了兼顧使兩種成分的均 具有較好的吸收峰，最終選擇測定波長為326nm。
[0015] (3)在限定了色譜柱型號和波長以後，雖然能夠將秦皮乙素和咖啡酸分離，但分離 度依然較差。本發明發現，對柱溫進行調節後，能夠改善兩色譜峰的分離度：當柱溫條件為 25°C、30°C時兩色譜峰可達到基線分離，且與其它雜質成分分離較好，優於35°C。
[0016] 因此，綜合各方面因素，本發明最終擬定了如下色譜條件：
[0017] 色譜柱為迪馬 Diamonsil II (4. 6 X 250mm，5 μ m)或島津 WondaCract (?5-2(4.6Χ250πιπι，5μπι);以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液=20 :80為流動相；檢測波長為 326nm ;柱溫為 25-30°C。
[0018] 若為了更好地實現各成分的分離，可以優選柱溫為25°C。
[0019] 進一步地，步驟（1)中，提取方式為超聲。
[0020] 更進一步地，超聲功率200W，頻率32kHz，30分鐘。
[0021] 進一步地，步驟（1)中，粉末與甲醇的質量體積比為3:25g/ml。
[0022] 進一步地，青蒲顆粒的製備方法中，水煎的具體工藝為：加水煎煮二次，第一次加 18倍量水，第二次加15倍量水，每次煎煮1小時。
[0023] 進一步地，青蒲顆粒的製備方法中，水煎液濃縮至80°C測得相對密度為1. 30? 1. 35。
[0024] 進一步地，四味藥材的用量配比如下：大青葉8重量份、蒲公英8重量份、紫花地丁 3重量份、甘草1重量份。
[0025] 本發明還提供了對青蒲顆粒中間體提取物中咖啡酸和秦皮乙素同時進行檢測的 方法，它包括如下操作步驟：
[0026] (1)供試品溶液的製備：取青蒲顆粒中間體提取物，除去水份，精密稱定，以甲醇 提取製備供試品溶液；
[0027] (2)對照品溶液的製備：取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品，以甲醇為溶劑製備對 照品溶液；
[0028] (3)分別取供試品溶液和對照品溶液注入高效液相色譜儀中，以外標法計算青蒲 顆粒中咖啡酸和秦皮乙素含量即可，其中，色譜條件如下：
[0029] 色譜柱為迪馬 Diamonsil II (4. 6 X 250mm，5 μ m)或島津 WondaCract (?5-2(4.6Χ250πιπι，5μπι);以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液=20 :80為流動相；檢測波長為 326nm ;柱溫為 25°C ;
[0030] 其中，青蒲顆粒中間體提取物由如下方法製備得到：
[0031] 取大青葉6?10重量份、蒲公英6?10重量份、紫花地丁 2?4重量份、甘草1? 2重量份；以上四味藥材，加水煎煮，合併水煎液，即得青蒲顆粒中間體提取物。
[0032] 進一步地，青蒲顆粒中間體提取物製備過程中，水煎的具體工藝為：加水煎煮二 次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每次煎煮1小時。
[0033] 進一步地，四味藥材的用量配比如下：大青葉8重量份、蒲公英8重量份、紫花地丁 3重量份、甘草1重量份。
[0034] 本發明通過多次試驗研究，對同時測定兩種成分的HPLC色譜條件進行了篩選和 探索，得到了一種能同時檢測青蒲顆粒或其提取物中兩種成分的含量測定方法。雖然本發 明提供的色譜條件，不採用複雜的梯度洗脫程序，但是，通過特定檢測波長、柱溫、色譜柱型 號等參數，能夠將兩種成分色譜峰順利分離，雜質峰無幹擾，且保留時間適宜，峰形良好，能 夠達到順利測定兩種成分含量的目的，為製劑的質量研究奠定了基礎，也可為其他同時含 有秦皮乙素和咖啡酸兩種成分製劑的定量研究提供借鑑方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035] 圖1 :流動相為乙腈-0. 6 %冰醋酸水溶液（8:92);色譜柱為 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱溫 35?，波長 353nm
[0036] 圖2 :流動相為甲醇-0. 6 %冰醋酸水溶液（20:80);色譜柱為 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱溫 35?，波長 353nm
[0037] 圖3:流動相為乙腈-0.6%冰醋酸水溶液（8:92) ;色譜柱為島津1〇11(1&(^1(^ 0DS-2 (4· 6 X 250mm，5 μ m)，柱溫 35 °C，波長 353nm
[0038] 圖4 :流動相為甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80);色譜柱為島津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，柱溫 35 °C，波長 353nm
[0039] 圖5 :流動相為甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80);色譜柱為島津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，柱溫 35 °C，波長 326nm
[0040] 圖6島津WondaCract 0DS-2柱，甲醇-0· 6%冰醋酸水溶液（20:80)，柱溫30°C
[0041] 圖7島津1〇11(1&(^1(^005-2柱，甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20 :80)，柱溫251：
[0042] 圖8對照品圖譜
【具體實施方式】
[0043] 實施例1本發明青蒲顆粒的檢測方法
[0044] 本發明所述青蒲顆粒的製備方法如下：
[0045] 處方：大青葉8份蒲公英8份紫花地丁 3份甘草1份
[0046] 工藝：以上四味藥材，加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每 次煎煮1小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1. 30?1. 35 (80°C )，加蔗糖粉和澱 粉適量，混勻，製成顆粒，乾燥，即得。
[0047] 檢測方法如下：
[0048] 色譜條件與系統適用性實驗島津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250_，5 μ m);以甲 醇-0. 6 %冰醋酸水溶液（20 :80)為流動相；檢測波長為326nm ;柱溫為25°C。理論板數按 秦皮乙素峰計算應不低於3000。
[0049] 對照品溶液的製備取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇製成 每lml含秦皮乙素80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。
[0050] 供試品溶液的製備取青蒲顆粒研細後的粉末約3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精 密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻率32kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重 量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0051] 測定法分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀，測 定，即得。
[0052] 本品每lg含紫花地丁以秦皮乙素（C9H604)計，不得少0. 45mg，含蒲公英以咖啡酸 (C9H804)計，不得少 0.08mg。
[0053] 實施例2本發明青蒲顆粒的檢測方法
[0054] 本發明所述青蒲顆粒的製備方法如下：
[0055] 處方：大青葉10份蒲公英10份紫花地丁 2份甘草1. 5份
[0056] 工藝：以上四味藥材，加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每 次煎煮1小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1. 30?1. 35 (80°C )，加蔗糖粉和澱 粉適量，混勻，製成顆粒，乾燥，即得。
[0057] 檢測方法如下：
[0058] 色譜條件與系統適用性實驗島津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250_，5 μ m);以甲 醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80)為流動相；檢測波長為326nm ;柱溫為25°C。理論板數按 秦皮乙素峰計算應不低於3000。
[0059] 對照品溶液的製備取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇製成 每lml含秦皮乙素80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。
[0060] 供試品溶液的製備取青蒲顆粒研細後的粉末約3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精 密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻率32kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重 量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0061] 測定法分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各1〇μ 1，注入液相色譜儀，測 定，即得。
[0062] 本品每lg含紫花地丁以秦皮乙素（C9H604)計，不得少0. 45mg，含蒲公英以咖啡酸 (C9H804)計，不得少 0.08mg。
[0063] 實施例3本發明青蒲顆粒的檢測方法
[0064] 本發明所述青蒲顆粒的製備方法如下：
[0065] 處方：大青葉6份蒲公英6份紫花地丁 4份甘草2份
[0066] 工藝：以上四味藥材，加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每 次煎煮1小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1. 30?1. 35 (80°C )，加蔗糖粉和澱 粉適量，混勻，製成顆粒，乾燥，即得。
[0067] 檢測方法如下：
[0068] 色譜條件與系統適用性實驗島津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250_，5 μ m);以甲 醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80)為流動相；檢測波長為326nm ;柱溫為25°C。理論板數按 秦皮乙素峰計算應不低於3000。
[0069] 對照品溶液的製備取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇製成 每lml含秦皮乙素80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。
[0070] 供試品溶液的製備取青蒲顆粒研細後的粉末約3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精 密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻率32kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重 量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0071] 測定法分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀，測 定，即得。
[0072] 本品每lg含紫花地丁以秦皮乙素（C9H604)計，不得少0. 45mg，含蒲公英以咖啡酸 (C9H804)計，不得少 0.08mg。
[0073] 實施例4本發明青蒲顆粒中間體提取物的檢測方法
[0074] 本發明所述青蒲顆粒中間體提取物的製備方法如下：
[0075] 處方：大青葉8份蒲公英8份紫花地丁 3份甘草1份
[0076] 工藝：以上四味藥材，加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每 次煎煮1小時，合併煎液，即得青蒲顆粒中間體提取物。
[0077] 檢測方法如下：
[0078] 色譜條件與系統適用性實驗島津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250_，5 μ m);以甲 醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80)為流動相；檢測波長為326nm ;柱溫為25°C。理論板數按 秦皮乙素峰計算應不低於3000。
[0079] 對照品溶液的製備取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇製成 每lml含秦皮乙素80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。
[0080] 供試品溶液的製備取青蒲顆粒中間體提取物，濃縮，乾燥，取乾燥品研細後的粉 末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻 率32kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0081] 測定法分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各1〇μ 1，注入液相色譜儀，測 定，即得。
[0082] 實施例5本發明檢測方法的考察
[0083] 1儀器、試藥和對照品
[0084] 安捷倫1260infinity高效液相色譜儀（OpenLAB CDS色譜數據工作站）；KQ5200DE 超聲波清洗器；CPA22?型電子分析天平（十萬分之一）；
[0085] 青蒲顆粒、甲醇為色譜純（fisher公司），水為注射用水，其它試劑均為分析純（成 都化學試劑廠）。使用前所有試劑均經過0. 45 μ m微孔濾膜濾過。
[0086] 秦皮乙素對照品（由中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110741-200506)，咖啡 酸對照品（由中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110885-200102)，使用前在60°C下減壓 乾燥4小時。
[0087] 2色譜條件
[0088] 2. 1色譜柱和流動相的選擇
[0089] 採用甲醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20:80)、乙腈-0. 6%冰醋酸水溶液（8:92)作為流 動相，對 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)、島津 WondaCract 0DS-2 (4· 6 X 250mm，5 μ m)兩 種色譜柱的樣品成分分離情況進行了對比試驗。結果見圖1?圖4。
[0090] 圖1 :流動相為乙腈-0. 6 %冰醋酸水溶液（8:92);色譜柱為 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱溫 35?，波長 353nm。
[0091] 圖2 :流動相為甲醇-0. 6 %冰醋酸水溶液（20:80);色譜柱為 Agilent-ODS (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱溫 35?，波長 353nm。
[0092] 圖3:流動相為乙腈-0.6%冰醋酸水溶液（8:92) ;色譜柱為島津1〇11(1&(^1(^ 0DS-2 (4· 6 X 250mm，5 μ m)，柱溫 35°C，波長 353nm。
[0093] 圖4 :流動相為甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80);色譜柱為島津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，柱溫 35°C，波長 353nm。
[0094] 結果表明，米用Agilent_0DS(4. 6X 150mm，5 μ m)短色譜柱進行試驗時，由於 色譜柱長度限制，秦皮乙素與咖啡酸兩種成分根本無法分開；而採用島津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)長色譜柱進行試驗，秦皮乙素與咖啡酸兩種成分基本可分開，但 分離效果差，存在雜質幹擾，尚需進行進一步的試驗研究。
[0095] 同時，相比之下，甲醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80)作為流動相分離效果相對較 好，故最終選擇甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80)作為流動相。
[0096] 2. 2測定波長的選擇
[0097] 取秦皮乙素對照品，加甲醇製成每1ml約含0. 038mg的溶液，以甲醇作為空白，在 200?500nm波長掃描，在353nm處有最大吸收；另取咖啡酸對照品，加甲醇製成每lml約 含0· 015mg的溶液，以甲醇作為空白，在200?500nm波長掃描，在326nm處有最大吸收；同 時，對不同波長下（353nm和326nm)，樣品的分離和峰面積進行了對比試驗，結果見圖4、圖 5 〇
[0098] 圖5 :流動相為甲醇-0.6%冰醋酸水溶液（20:80);色譜柱為島津WondaCract 0DS-2 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，柱溫 35°C，波長 326nm。
[0099] 綜合考慮，由於製劑中咖啡酸含量極低，樣品濃度低，353nm波長條件下峰面積很 小，且秦皮乙素吸收峰後有嚴重拖尾。為了兼顧使兩種成分的均具有較好的吸收峰，最終選 擇測定波長為326nm。但秦皮乙素和咖啡酸的分離度依然較差，尚需對其他條件進一步研 究。
[0100] 2. 3柱溫條件的選擇
[0101] 採用甲醇-〇· 6 %冰醋酸水溶液（20 :80)為流動相，島津WondaCract 0DS-2(4. 6X250mm，5ym)色譜柱，分別於柱溫25°C、30°C下進行預試驗，結果如圖6、圖7。
[0102] 結果表明，當柱溫條件為25°C、30°C時兩色譜峰可達到基線分離，且與其它雜質成 分分離較好，綜合考慮，為保證分離效果和分析速度，最終選擇柱溫條件為25°C。
[0103] 2.4 小結：
[0104] 經研究確定色譜條件如下：色譜柱為島津WondaCract 0DS-2 (4· 6X 250mm，5 μ m); 檢測波長為326nm ;流動相為甲醇-0. 6%冰醋酸水溶液（20 :80);流速為1. Oml/min ;柱溫 為 25°C。
[0105] 3對照品溶液的製備
[0106] 取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每lml含秦皮乙素 80 μ g、咖啡酸16 μ g的混合溶液，即得。對照品圖譜見圖8。
[0107] 4供試品溶液製備方法研究
[0108] 根據待測成分秦皮乙素和咖啡酸易溶於甲醇的性質，選用甲醇作為溶劑進行提 取；本顆粒劑為藥材提取濃縮後制粒，因此，可採用超聲處理的方法進行研究。具體研究如 下。
[0109] 4. 1提取時間考察
[0110] 對超聲處理時間進行了研究，具體方法如下：取本品適量，研細後，取粉末三份，每 份約3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，分別超聲處理（功 率200W，頻率32kHz) 10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失 的重量，搖勻，濾過，取續濾液，分別作為供試品溶液。以上述色譜條件，分別精密吸取對照 品溶液及供試品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，記錄峰面積值，以每lg成品計算秦皮乙素和 咖啡酸含量。結果表明，兩種成分含量隨超聲提取時間增加而增加，當超聲處理20分鐘時 已接近提取完全，故選擇樣品粉末的超聲提取時間為20分鐘。
[0111] 4.2 小結：
[0112] 根據以上研究，確定供試品溶液的製備方法為：取本品研細後的粉末約3g，精 密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻率 32kHz) 20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
[0113] 5陰性幹擾試驗
[0114] 分別取按樣品製備工藝製備的缺蒲公英陰性樣品，缺紫花地丁陰性樣品，缺蒲公 英和紫花地丁雙陰性樣品，按供試品溶液製備方法製備供試品溶液，以上述色譜條件，分別 進樣。結果表明，在秦皮乙素和咖啡酸色譜圖相應位置，各陰性樣品均無幹擾峰出現，證明 本樣品含量測定方法專屬性較強。
[0115] 6線性範圍的考察
[0116] 精密稱取咖啡酸對照品20mg，置250ml容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，充分 溶解；另取秦皮乙素對照品20mg，置50ml容量瓶中，加上述咖啡酸對照品溶解並稀釋至刻 度；分別取該混合對照品溶液1. 25ml、2. 5ml、5ml、10ml、20. 0ml於25ml容量瓶中，甲醇定容 至刻度。得含秦皮乙素濃度分別為 〇· 〇2mg/ml、0. 04mg/ml、0. 08mg/ml、0. 16mg/ml、0. 32mg/ ml，含咖啡酸濃度分別為 0· 004mg/ml、0. 008mg/ml、0. 016mg/ml、0. 032mg/ml、0. 064mg/ml 的混合對照品溶液。分別吸取各濃度混合對照品溶液1〇μ 1，進樣，記錄峰面積值。
[0117] 以秦皮乙素峰面積值（Α)對對照品濃度（C)進行回歸，得秦皮乙素標準曲線方 程為：y = 29829. 884χ-10. 140, R2 = 0.9999。由方程可知，秦皮乙素進樣濃度在0.02mg/ ml-0. 32mg/ml之間，秦皮乙素進樣濃度和峰面積線性關係良好。
[0118] 以咖啡酸峰面積值㈧對對照品濃度（C)進行回歸，得咖啡酸標準曲線方程 為：y = 53817. 627X-10. 482, R2 = 0. 9999。由方程可知，咖啡酸進樣濃度在0. 004mg/ ml-〇. 064mg/ml之間，進樣濃度和峰面積線性關係良好。
[0119] 7精密度試驗
[0120] 精密吸取混合對照品溶液（秦皮乙素濃度：0· 080mg/ml、咖啡酸濃度：0· 016mg/ ml) 10 μ 1，按上述色譜條件，重複進樣6次，記錄色譜圖和峰面積值。結果表明，兩種成分峰 面積RSD〈1. 5%，說明儀器精密度良好。
[0121] 8穩定性試驗
[0122] 取本品研細後的粉末約3g，照供試品溶液的製備方法製備供試品溶液，另按照 對照品溶液製備方法製備混合對照品溶液。分別取混合對照品溶液（秦皮乙素濃度： 0· 081mg/ml、咖啡酸濃度：0· 016mg/ml)與供試品溶液，於製備後0h、2h、4h、6h、8h、10h分別 進樣，按上述色譜條件進行測定，每次進樣量10 μ 1，記錄色譜圖和峰面積值。
[0123] 結果表明，所測兩種成分對照品溶液及供試品溶液在10小時內穩定性良好。
[0124] 9重現性試驗
[0125] 取本品研細後的粉末6份，每份約3g，分別按供試品溶液的製備方法製備供試品 溶液，另按照對照品溶液製備方法製備混合對照品溶液。取混合對照品溶液和供試品溶液， 按上述色譜條件進行測定，每次進樣量1〇μ 1，記錄色譜圖和峰面積值，計算樣品中兩種成 分含量。
[0126] 結果表明，青蒲顆粒中秦皮乙素的平均含量為0. 615mg/g，RSD〈l. 5%，咖啡酸的平 均含量為〇. 134mg/g，RSD〈1. 5%，所考察方法的重現性良好。
[0127] 10加樣回收試驗
[0128] 取已知含量研細後的樣品粉末約1.5g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別 加入秦皮乙素對照品溶液（0. 178mg/ml)和咖啡酸對照品溶液（0.0344mg/ml)各5ml，精密 加甲醇15ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻率32kHz) 20分鐘，放冷，再稱定重 量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液；另按照對照品溶液制 備方法製備混合對照品溶液；取混合對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件進行測定， 分別進樣10 μ 1，記錄峰面積值和色譜圖，計算加樣回收率。
[0129] 表1加樣回收率試驗
[0130]
【權利要求】
1. 對青蒲顆粒中咖啡酸和秦皮乙素同時進行檢測的方法，其特徵在於：它包括如下操 作步驟： (1) 供試品溶液的製備：取青蒲顆粒研細後的粉末，精密稱定，以甲醇提取製備供試品 溶液； (2) 對照品溶液的製備：取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品，以甲醇為溶劑製備對照品 溶液； (3) 分別取供試品溶液和對照品溶液注入高效液相色譜儀中，以外標法計算青蒲顆粒 中咖啡酸和秦皮乙素含量即可，其中，色譜條件如下： 色譜柱為迪馬 Diamonsil II (4. 6 X 250mm，5 μ m)或島津 WondaCract (?5-2(4.6Χ250πιπι，5μπι);以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液=20 :80為流動相；檢測波長為 326nm ;柱溫為 25-30°C ; 其中，青蒲顆粒由如下方法製備得到：取大青葉6?10重量份、蒲公英6?10重量份、 紫花地丁 2?4重量份、甘草1?2重量份；以上四味藥材，加水煎煮，合併水煎液，濃縮，力口 蔗糖粉和澱粉適量，混勻，製成顆粒。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟（1)中，提取方式為超聲。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：超聲功率200W，頻率32kHz，30分鐘。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟⑴中，粉末與甲醇的質量體積比為 3:25g/ml。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：青蒲顆粒的製備方法中，水煎的具體工藝 為：加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每次煎煮1小時。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：青蒲顆粒的製備方法中，水煎液濃縮至 80°C測得相對密度為1. 30?1. 35。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：四味藥材的用量配比如下：大青葉8重量 份、蒲公英8重量份、紫花地丁 3重量份、甘草1重量份。
8. 對青蒲顆粒中間體提取物中咖啡酸和秦皮乙素同時進行檢測的方法，其特徵在於： 它包括如下操作步驟： (1) 供試品溶液的製備：取青蒲顆粒中間體提取物，除去水份，精密稱定，以甲醇提取 製備供試品溶液； (2) 對照品溶液的製備：取秦皮乙素對照品、咖啡酸對照品，以甲醇為溶劑製備對照品 溶液； (3) 分別取供試品溶液和對照品溶液注入高效液相色譜儀中，以外標法計算青蒲顆粒 中咖啡酸和秦皮乙素含量即可，其中，色譜條件如下： 色譜柱為迪馬 Diamonsil II (4. 6 X 250mm，5 μ m)或島津 WondaCract (?5-2(4.6Χ250πιπι，5μπι);以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液=20 :80為流動相；檢測波長為 326nm ;柱溫為 25°C ; 其中，青蒲顆粒中間體提取物由如下方法製備得到： 取大青葉6?10重量份、蒲公英6?10重量份、紫花地丁 2?4重量份、甘草1?2 重量份；以上四味藥材，加水煎煮，合併水煎液，即得青蒲顆粒中間體提取物。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於：青蒲顆粒中間體提取物製備過程中，水煎 的具體工藝為：加水煎煮二次，第一次加18倍量水，第二次加15倍量水，每次煎煮1小時。
10.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於：四味藥材的用量配比如下：大青葉8重 量份、蒲公英8重量份、紫花地丁 3重量份、甘草1重量份。
【文檔編號】G01N30/02GK104155383SQ201410427483
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月27日 優先權日:2014年8月27日
【發明者】吳學淵, 房春林 申請人:成都乾坤動物藥業有限公司