一種生物合成乙基香蘭素的方法

2023-12-02 16:14:26

專利名稱：一種生物合成乙基香蘭素的方法
技術領域：
本發明涉及一種こ基香蘭素的合成方法，特別是こ基香蘭素的生物合成方法。
背景技術：
こ基香蘭素的化學名稱為3-こ氧基-4-羥基苯甲醛，呈甜巧克カ香氣，具有強烈的香蘭素特有的芳香氣，香氣比香蘭素強3 4倍，且香氣更為爽快、幽雅，在調香中具有用量少、香氣足、不變色等優點，是重要的光譜型高檔香料，廣泛應用於食品、菸草、日用品中，也是重要的醫藥中間體。
目前，こ基香蘭素均為化學合成，主要以こ醛酸和鄰こ氧基苯酚為起始原料，經縮合、氧化和脫羧反應製得，但其中氧化反應結束時存在催化劑分離困難等問題。隨著消費者對化學合成產物的警惕性也日益増加，人們對天然產物興趣的逐漸增強。生物合成具有清潔性，安全性和天然性等優點。こ基香蘭素的天然來源尚無報導。

發明內容
針對上述情況，本發明的目的是提供ー種生物合成こ基香蘭素的方法。本發明提供ー種生物合成こ基香蘭素的方法，包括如下步驟將底物3-乙氧基-4-羥基苯こ醇酸經脫氫酶催化合成3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸，再將3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸經脫羧酶催化合成3-こ氧基-4-羥基苯甲醛，即こ基香蘭素。ー種生物合成こ基香蘭素的方法，以3-こ氧基-4-羥基苯こ醇酸為底物，具體包括如下步驟(I)將含有扁桃酸脫氫酶基因的工程菌pET30a_mdlB的大腸桿菌BL21 (DE3)接種於瓊脂斜面培養基，活化，將活化後的菌種轉接於含卡那黴素的LB種子培養基培養12h ；(2)以5%的接種量將種子培養液接種於含卡那黴素的LB發酵培養基，發酵，加入IPTG,使其終濃度為O. 2mM, 30°C誘導6h ；(3)離心收集發酵培養液中的菌體，除去上清液，用無菌水洗滌，懸浮於含O. 5%的3-こ氧基-4-羥基苯こ醇酸的磷酸鹽緩衝液(Na2HPO4 I. 12%, NaH2PO4 2. 14%, MgSO4
0.01 %，pH = 7)，發酵，即得含3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的溶液；將含有3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的發酵液離心，取上清液，調PH= 7，滅菌，待用；(4)將含有苯こ酮酸脫羧酶的惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)ATCC12633菌株，經瓊脂斜面培養基活化，轉接於pH = 7的含KH2PO4 2. O %、牛肉膏O. 3 %、蛋白腖
1.0%,NaCl O. 5%的種子培養基中，在30°C培養8h ；(5)將得到的種子培養液以50%的接種量接種於步驟(3)得到的含有3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的發酵上清液，發酵，得含こ基香蘭素的發酵液。所述的步驟(I)中活化條件為在37°C培養24h。所述的步驟(2)中發酵條件為在37°C培養2h。所述的步驟(3)中離心條件為以5000rpm離心25min ;
所述的步驟(3)中發酵條件為30°C，200rpm，發酵40h。所述的步驟(3)中磷酸鹽緩衝液含Na2HPO4 I. 12 %, NaH2PO4 2. 14 %,MgSO4O. 01%, pH = 6. 5。所述的步驟(5)中發酵條件為在30°C，200rpm，發酵24h。所述的步驟⑷中含有苯こ酮酸脫羧酶的惡臭假單胞桿菌(Pseudomonasputida)替換為含有苯こ酮酸脫羧酶基因的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 上述方法製得的こ基香蘭素的用途，所述的こ基香蘭素用於食品中呈甜巧克カ香氣。本發明的有益效果本發明採用含有mdlB基因片段，即可以編碼扁桃酸脫氫酶的重組大腸桿菌和含有mdlC基因片段保藏編號為ATCC12633的惡臭假單胞桿菌或銅綠假單胞桿菌，以3-こ氧基-4-羥基苯こ醇酸為底物，利用重組菌體內含有高活性的扁桃酸脫氫酶，將3-こ氧基-4-羥基苯こ醇酸催化脫氫，產生3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸，將惡臭假單胞菌接種於含有3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的發酵液，利用其體內的苯こ酮酸脫羧酶將3-こ氧基-4-羥基苯こ醇酮酸轉化為こ基香蘭素。本方法的優點在於反應條件溫和，環境汙染小，操作簡便，並且為こ基香蘭素的合成提供了一條全新的道路並提出了生物合成こ基香蘭素的概念。
具體實施例方式下面結合實施例，進ー步闡述本發明本發明使用的含有pET30a_mdlB的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株由南京理工大學環生院李大力課題組提供，惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida) ATCC12633購於美國菌種保藏中心，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)由本實驗室保藏。實施例I脫氫酶催化過程(I)種子培養將含pET30a_mdlB的大腸桿菌BL21 (DE3)接種於瓊脂斜面培養基，在37°C培養24h活化，將活化後的菌種轉接於含卡那黴素的LB種子培養基，培養12h後；(2)發酵培養以5%的接種量將種子培養夜接種於含卡那黴素LB的發酵培養基，在37°C發酵培養2h，加入IPTG，使其終濃度為0. 2mM，30°C誘導6h ；(3)發酵反應以5000rpm離心25min收集發酵培養液中的菌體，除去上清液，用無菌水洗滌兩次，懸浮於含0. 5%的3-こ氧基-4-羥基苯こ醇酸的磷酸鹽緩衝液(Na2HPO4I. 12%, NaH2PO4 2. 14%, MgSO4 0. 01%, pH = 7)，30°C，200rpm，發酵 40h，即得含 3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的溶液。將含有3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的發酵液離心，取上清液，調pH = 7，滅菌，待用。脫羧酶催化過程(I)將含有苯こ酮酸脫羧酶的惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)ATCC12633菌株，經瓊脂斜面培養基活化後，轉接於PH= 7的含KH2PO4 2.0%、牛肉膏0.3%、蛋白腖I. 0%,NaCl 0. 5%的種子培養基中，在30°C培養8h ；(2)將得到的種子培養液以50%的接種量接種於含有3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的發酵上清液，300C，200rpm,發酵24h，得含こ基香蘭素的發酵液。
實 施例2本實施例與實施例I的不同僅在於脫羧酶催化過程使用的含有苯こ酮酸脫羧酶菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。具體步驟如下脫氫酶催化過程(I)種子培養將含pET30a_mdlB的大腸桿菌BL21 (DE3)接種於瓊脂斜面培養基，在37°C培養24h活化，將活化後的菌種轉接於含卡那黴素的LB種子培養基，培養12h後；(2)發酵培養以5%的接種量將種子培養夜接種於含卡那黴素LB的發酵培養基，在37°C發酵培養2h，加入IPTG，使其終濃度為O. 2mM，30°C誘導6h ；(3)發酵反應以5000rpm離心25min收集發酵培養液中的菌體,除去上清液,用無菌水洗滌兩次，懸浮於含O. 5%的3-こ氧基-4-羥基苯こ醇酸的磷酸鹽緩衝液(Na2HPO4
I.12%, NaH2PO4 2. 14%, MgSO4 O. 01%, pH = 7)，30°C，200rpm，發酵 40h，即得含 3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的溶液。將含有3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的發酵液離心，取上清液，調pH = 7，滅菌，待用。脫羧酶催化過程(I)將含有苯こ酮酸脫羧酶的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),經瓊脂斜面培養基活化後，轉接於pH = 7的含KH2P042. 0%、牛肉膏0. 3%、蛋白腖1.0%、NaCl
0.5%的種子培養基中，在30°C培養8h ；(2)將得到的種子培養液以50%的接種量接種於含有3-こ氧基-4-羥基苯こ酮酸的發酵上清液，300C，200rpm,發酵24h，得含こ基香蘭素的發酵液。
權利要求
1.一種生物合成乙基香蘭素的方法，其特徵在於以3-乙氧基-4-羥基苯乙醇酸為底物，具體包括如下步驟 (1)將含有扁桃酸脫氫酶基因的工程菌pET30a-mdlB的大腸桿菌BL21(DE3)接種於瓊脂斜面培養基，活化，將活化後的菌種轉接於含卡那黴素的LB種子培養基培養12h ； (2)以5%的接種量將種子培養液接種於含卡那黴素的LB發酵培養基，發酵，加入IPTG,使其終濃度為0. 2mM, 30°C誘導6h ； (3)離心收集發酵培養液中的菌體，除去上清液，用無菌水洗滌，懸浮於含0.5 %的3-乙氧基-4-羥基苯乙醇酸的磷酸鹽緩衝液(Na2HPO4 I. 12%, NaH2PO4 2. 14%, MgSO40.01 %，pH = 7)，發酵，即得含3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的溶液；將含有3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的發酵液離心，取上清液，調PH= 7，滅菌，待用； (4)將含有苯乙酮酸脫羧酶的惡臭假單胞桿菌(Pseudomonasputida)ATCC12633,經瓊脂斜面培養基活化，轉接於pH = 7的含呵 042.0%、牛肉膏0.3%、蛋白腖1.0%、NaCl0.5%的種子培養基中，在30°C培養8h ； (5)將得到的種子培養液以50%的接種量接種於步驟(3)得到的含有3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的發酵上清液，發酵，得含乙基香蘭素的發酵液。
2.如權利要求I所述的生物合成乙基香蘭素的方法，所述的步驟(I)中活化條件為在37°C 培養 24h。
3.如權利要求I所述的生物合成乙基香蘭素的方法，所述的步驟(2)中發酵條件為在37°C 培養 2h。
4.如權利要求I所述的生物合成乙基香蘭素的方法，所述的步驟(3)中離心條件為以5000rpm 離心 25min。
5.如權利要求I所述的生物合成乙基香蘭素的方法，所述的步驟(3)中發酵條件為3(TC，200rpm，發酵 40h。
6.如權利要求I所述的生物合成乙基香蘭素的方法，所述的步驟(5)中發酵條件為在3(TC，200rpm，發酵 24h。
7.如權利要求I所述的生物合成乙基香蘭素的方法，所述的步驟(4)中的含有苯乙酮酸脫羧酶的惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)替換為含有苯乙酮酸脫羧酶基因的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
8.如權利要求1-7任一項所述的方法製得的乙基香蘭素的用途，其特徵在於，所述的乙基香蘭素用於食品中呈甜巧克力香氣。
全文摘要
本發明涉及一種生物合成乙基香蘭素的方法。將含扁桃酸脫氫酶基因的菌株，pET30a-mdlB質粒的大腸桿菌BL21(DE3)接入發酵培養基，加入誘導劑，添加3-乙氧基-4-羥基苯乙醇酸，發酵得含3-乙氧基-4-羥基苯乙酮酸的發酵液；將含苯乙酮酸脫羧酶基因的菌株，保藏編號為ATCC12633的惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)或者銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)接種於上述發酵上清液，發酵得含有乙基香蘭素的發酵液。本發明首次提出了用微生物發酵的方法合成乙基香蘭素的途徑，具有反應條件溫和，環境汙染小，操作簡便等優點，提供了一種新的合成乙基香蘭素的方法。
文檔編號C12R1/40GK102634544SQ201210105878
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者何文森, 馮驫, 張曉鳴, 李大力, 李靜靜, 潘曉霞, 賈承勝 申請人:江南大學