一種用於檢測乳腺癌狀態的生物標記物試劑的製作方法

2023-11-01 15:04:17 3

專利名稱：一種用於檢測乳腺癌狀態的生物標記物試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測乳腺癌狀態的生物標記物試劑。
背景技術：
乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，每年大約有30%以上的患者死於乳腺癌復發和轉移，乳腺癌轉移是導致乳腺癌治療失敗的主要原因之一，乳腺癌一旦發生轉移，即便手術治療，也將嚴重影響患者的生存質量，且1/3的乳腺癌患者有復發和轉移的危險，導致不良的預後以及高的病死率。乳腺癌的轉移是與其本身生物學特性以及宿主環境和基因變化等相關的，是一個多基因參與、多步驟完成的複雜過程，涉及腫瘤細胞自身生長優勢的獲得，細胞間黏附能力的降低，癌細胞對細胞外間質和基底膜的降解與破壞，細胞骨架重構引起細胞運動與遷移， 細胞因子誘導的癌細胞器官特異性定向歸巢，以及腫瘤血管和淋巴管生成，癌細胞逃逸凋亡和免疫殺傷等諸多因素，因此，在分子生物學水平，尋找和分析乳腺癌轉移的機制非常重要，了解乳腺癌轉移的自然規律，有助於選擇治療乳腺癌的最好方案。

發明內容
本發明的發明目的是提供一種用於檢測乳腺癌狀態的生物標記物試劑。為達到上述發明目的，本發明採用的技術方案是一種用於檢測乳腺癌狀態的生物標記物試劑，所述生物標記物試劑為人UHRFl基因。上述技術方案中，所述乳腺癌狀態包括乳腺癌細胞的轉移性能與遷移性能。上述技術方案中，當乳腺癌細胞的轉移性能或遷移性能增強時，即當乳腺癌細胞的轉移能力或遷移能力提高時，所述生物標記物試劑人UHRFl基因的表達量也增加。因此，本發明同時要求保護人UHRFl基因作為表徵乳腺癌細胞的轉移性能或遷移性能的生物標記物試劑的應用。由於上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
1.本發明所述生物標記物試劑UHRFl基因與乳腺癌的遠處轉移能力密切相關，利用 UHRFl基因作為預測乳腺癌遠處轉移能力的生物標誌物，與目前常規的病理分型判斷乳腺癌的轉移和預後相比，可以更加個體化、準確的預測乳腺癌的惡性程度。


圖1.實施例中UHRFl轉染後MDA-MB-231細胞UHRFl mRNA (A)和蛋白(B)表達情況；
圖2.實施例中UHRFl基因促進MDA-MB-231細胞遷移情況圖； 圖3.實施例中UHRFl基因促進MDA-MB-231細胞浸潤情況圖； 圖4.實施例中UHRFl與PTEN和maspin的相互作用情況圖； 圖5.實施例中細胞接種後的臟器轉移圖片。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述 實施例一
1. 1 材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231及MDA-MB-453購於美國細胞收藏中心 (ATCC)，並由本實驗室保存和培養；D-MEM培養基幹粉，小牛血清，胰酶粉末購自Gibco公司；標準蛋白質分子量、SDS-PAGE上樣緩衝液、RIPA蛋白裂解液、TE電泳緩衝液、IOX轉膜液、30%Acry-Bis、Tris-Hcl、過硫酸銨(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)購自江蘇碧雲天生物技術研究所；二甲基亞碸(DMS0)、瓊脂糖和Tween-20來自上海高科技生物工程有限公司；抗UHRFl、cyclin BUcyclin Dl等抗體購自美國Santa Cruzs生物技術公司。RNase A 禾Π 10 μ g/mL proteinase K 購自美國 Sigma Aldrich 公司。1.2 細胞培養MDA-MB-231及MDA-MB-453細胞培養於含10%小牛血清，穀氨酸胺及100萬U/L青黴素和鏈黴素的D-EME培養基。細胞置於5%C02，37°C培養箱內培養，每 2-3天傳代1次，取對數生長期細胞用於實驗。1.3細胞的轉染和克隆篩選
轉染前一天，將細胞用胰酶消化、計數，以合適的密度接種6孔板，置於(X)2培養箱中培養過夜，使轉染當日細胞融合度為70% 90%。在鋪板和轉染期間避免使用抗生素。轉染溶液配製質粒Lipofectamine2000用量比為1μ g/孔2. 5μ 1/孔。2 μ g/ 孔DNA加入100 μ 1/孔DMEM混勻，室溫靜置5min，備用；5 μ 1/孔Lipofectamine2000加入 100 μ 1/孔基礎DMEM混勻，室溫靜置5min，備用；
按照現有技術構建真核表達質粒PCDNA3-UHRF1，應用脂質體轉染的方法，將真核表達質粒pcDNA3-UHRFl分別轉染到人類乳腺癌MDA-MB-231細胞，同時轉染「空」的pcDNA3質粒作為陽性對照，RT-PCR電泳圖見圖1A。從圖中可以看出，UHRFl基因轉染可明顯增加 MDA-MB-231/UHRF1細胞中UHRFl mRNA的表達水平，而相應的母細胞和空質粒細胞中未見表達。Western blot電泳圖(圖1B)的結果顯示MDA-MB-231/UHRFl細胞中的UHRFl蛋白表達水平明顯高於相應的母細胞和轉染「空」質粒的細胞，同時，母細胞和轉染「空」質粒的細胞UHRFl蛋白表達水平未見明顯差異，上述結果表明，UHRFl基因已經成功轉染乳腺癌 MDA-MB-231 細胞。上述脂質體轉染的方法具體為將稀釋的DNA同稀釋的脂質體試劑混合，在室溫保溫30min後，加入800 μ 1/孔基礎DMEM，備用。用PBS及無抗生素的基礎DMEM洗滌細胞， 每孔加入Iml轉染混合液，5% CO2, 37° C培養5 h。證後，棄去含轉染試劑的培養液，加入新鮮的完全培養基，繼續培養後，72小時內完成實驗即為瞬時轉染；如果細胞繼續培養4 後，更換含G418的培養基，大約兩周後，篩選陽性穩定克隆，即為穩定轉染。1. 4細胞感染和克隆篩選293細胞在10%新生牛血清的完全D-MEM中培養。待細胞長至培養到大約70% 80%時，培養基更換為含體積分數為2. 5%新生牛血清的DMEM， 加入重組腺病毒粗提液，繼續培養觀察48 72小時，收集呈病態反應的293細胞，反覆凍融5次，每次凍融後振搖30秒，1 500 rpm離心20分鐘，棄細胞碎片，收集上清，經氯化銫密度梯度兩次離心濃縮腺病毒顆粒，經Hanks液透析後，加入體積分數為20%甘油，分裝後於-70°C凍存備用。
病毒滴度採用噬斑分析法結合細胞病變測定法來完成。接種293細胞。取待測病毒液作10倍比稀釋，取每一稀釋度的病毒液按0. 3ml/平皿(孔)量感染細胞，細胞上鋪0. 6% 的瓊脂糖凝膠。正常換液直至蝕斑出現。病毒滴度=蝕斑個數X稀釋度/0.3%X100%。 Ad5-LacZ 以 MOI 為 5，50，100，200 分別感染 MDA-MB-231 和 MDA-MB-453 細胞，4 小時後用培養液洗滌去除游離病毒，於37°C、0. 05 CO2培養M小時，體積分數為2. 5%戊二醛固定15分鐘，再以含10 mmoi r1 MgCl2的生理鹽水洗2遍，X_gal染色48小時後計數藍染細胞。計算藍色細胞百分率。按將近百分之百(或以上的)腫瘤細胞被感染的強度感染乳腺癌細胞。1.5體外劃痕實驗採用體外劃痕方法測定細胞遷移能力，該方法具體為取對數生長期細胞，按1 X 106/ml接種於6孔培養板，培養至細胞完全飽和，經無血清DMEM同步化24h後，用無菌的Tip頭在各培養板細胞生長單層的相同位置，劃垂直或平行直線，人為造成幾條「傷口」，PBS洗3次，細緻地去除被移液管尖破壞而脫落的細胞，拍照(此時作為劃痕後0時刻)，每板接種三種細胞，每種細胞設2個復孔，然後用含10%小牛血清的DMEM培養液刺激劃痕後的細胞，劃痕後24h或48h，PBS衝洗細胞3次，在顯微鏡下觀察劃痕寬度， 拍照記錄。應用上述體外細胞劃痕實驗方法檢測UHRFl基因對乳腺癌細胞體外遷移能力的影響，UHRFl轉染MDA-MB-231細胞後的劃痕實驗結果參見圖2，可見在劃痕後48小時， MDA-MB-231/UHRF1細胞已經浸潤擴散覆蓋了劃痕間隙，而MDA-MB-231和MDA-MB-231/Neo 細胞仍可看到明顯的劃痕間隙，以上實驗結果說明UHRFl基因的高表達可以促進乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移，同時，「空」質粒pcDNA 3轉染並不影響乳腺癌細胞的遷移能力；也就是說，乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移能力提高時，UHRFl基因的表達量也增高。1. 6 Boyden小室實驗採用帶有一個聚碳酸酯膜05 X 80毫米，8微米孔徑)的 48孔Boyden小室測定細胞浸潤能力。Boyden小室下室為含20%胎牛血清的培養液，中間隔以預鋪了人工基底膜膠的硝化纖維膜，將細胞常規消化、計數、用不含血清的DMEM培養基稀釋細胞後，調整細胞濃度為5 X 106/ml，將2 X IO5個細胞加入Boyden小室的上室，細胞置於37°C、5%0)2飽和溼度培養8小時後，小心除去未穿過膜的在膜上層的細胞，將穿過膜的附著在膜下層的細胞用甲醇固定，PBS衝洗，Gimsa染色。染色深的為穿過膜並附著在膜下層的細胞。在顯微鏡下觀察並拍照。應用上述體外Boyden小室方法，觀察UHRFl基因對乳腺癌細胞MDA_MB_231轉移能力的影響。結果如圖3A所示，使用Sum人工基底膜，8小時之後，計數穿過膜並附著在膜下層的細胞數量，在MDA-MB-231/UHRF1細胞組比MDA-MB-231/Neo組高出7 9倍(p<0. 01)， 這表明，UHRFl的高表達，可以增強乳腺癌細胞MDA-MB-231的浸潤能力；也就說是，乳腺癌細胞MDA-MB-231的浸潤能力時，UHRFl的表達量增加。我們按照步驟1.4採用腺病毒表達系統Ad5-UHRF1感染兩種乳腺癌細胞 MDA-MB-231和MDA-MB-453，感染後他(A)或24h (B)，採用Boyden小室法完成細胞轉移能力的測定，並在IOOX目鏡下計數穿透纖維膜並附著在膜下層的細胞數量，正像總結在圖:3B 中的數據，Ad5-UHRF1感染的細胞，其轉移能力明顯提高(p<0. 05)，在感染後的他或Mh， 觀察到的結果都是如此，並且，感染時間越長，穿過膜的細胞數越多；而對照Ad5感染並未影響細胞的轉移能力，這也進一步證實了提高細胞的 /^表達水平，確實可以增加細胞的轉移。
具體地，採用Ad5-UHRF1分別感染乳腺癌細胞MDA_MB_231和MDA-MB-435後，在 Boyden小室接種相同數量的細胞，8小時後，穿過小室的細胞數分別為72和69個，而Ad5感染組細胞穿過膜的數量分別為12個和17個。作用M小時後，Ad5-UHRF1感染的MDA-MB-231 細胞和MDA-MB-435細胞，穿過膜的數量增加到362個和388個，而Ad5感染組細胞穿過膜的數量雖然也增加到了 69和78個，但仍然少於Ad5-UHRF1感染組細胞。1. 7 Western-blot法收集細胞並轉至於1. 5 ml的Eppendorf管中離心(2500 轉/分)5分鐘，棄上清，並加入100 μ 1 IP裂解液，置於冰上2小時。4°C離心5分鐘0，500 轉/分鐘)，轉移上清液至新的Eppendorf管，並採用分光光度計檢測樣品蛋白含量。加入蛋白上樣緩衝液(5X)混勻，置於恆溫混勻器上，100°C 5分鐘，蛋白電泳後轉至醋酸纖維膜上。膜採用封閉液(5%脫脂奶粉，1 X T-BST緩衝液)封閉1 h。洗滌，並分別加入一抗α-Actin，UHRFl，Cyclin BLCyclin Dl,經封閉液處理的醋酸纖維膜室溫撫育1小時。 T-BST緩衝液洗膜3次，加入二抗(1:1000稀釋)撫育1小時。T-BST緩衝液洗膜3次，最後加ECL發光劑，顯影、定影，膠片洗滌和乾燥後，掃描分析。採用上述Wfestern Blot法測定Ad5_UHRFl (50或100 Μ. 0. I兩濃度)感染後， 對細胞轉移密切相關的PTEN和maspin蛋白的表達水平影響。結果如圖4A所示，50或100 Μ. 0. I濃度的Ad5-UHRF1感染MDA-MB-231細胞後，均可明顯提高 /^的表達水平，但並不影響細胞中內源性PTEN和maspin的蛋白表達。我們採用pcDNA3-PTEN或pcDNA3_maspin轉染細胞，提高細胞中/7TEV和aaspi/ 的表達水平，更進一步了解/T^V和fflaspi/ M UHRFl調節細胞轉移能力的影響。Ad5-UHRF1 (50 或 100 Μ. 0. I 兩濃度)感染細胞後 48h 收樣，採用 Western Blot 法檢測蛋白表達水平(每道加樣200 μ g)。採用脂質體介導的方法，細胞轉染pcDNA-PTEN或pCDNA3-mapSin表達質粒後Mh， 完成Ad5或Ad5-UHRF1感染，細胞感染後Mh，利用Boyden小室法測定細胞的轉移能力，並在100X目鏡下計數穿透纖維膜並附著在膜下層的細胞數量。正如圖4B 所示，細胞轉染 pcDNA3-PTEN 或 pcDNA3_maspin 後，PTENimaspin 的蛋白表達水平明顯增加；與單純的 /7/基因轉染相比，pcDNA3-PTEN或pcDNA3-maspin轉染本身可以降低細胞的轉移能力；如果將UHRFl和pcDNA3-PTEN或pcDNA3-maspin聯合轉染，細胞的轉移能力也較單純UHRFl轉染有所降低(p<0. 05)，即PTEN或maspin的高水平表達可以降低UHRFl對細胞轉移的調節能力。1. 8乳腺癌轉移模型建立取對數生長期MDA-MB-231/Neo細胞、MDA-MB-231/ UHRFl細胞，經0. 25%胰蛋白酶消化，離心去上清，而後用基礎培養液離心洗滌2次，計數細胞數，調整細胞濃度為IX IO6個/mL，將細胞重懸於無菌PBS溶液。取裸鼠12隻，每種細胞種6隻在嚴格無菌條件下，在裸鼠腋下接種細胞懸液0.18 ml。裸鼠腫瘤接種後，連續置恆溫05° C 士 2° C)、恆溼05% 50%)、無菌淨化屏障系統內飼養，定期觀察裸鼠精神、飲食和排便。在腫瘤接種後大約25 觀天，在麻醉條件下採用拉頸拖白法處死裸鼠，並仔細地檢查移植瘤的大體形態，生長，腫瘤附近區域轉移和遠處轉移情況。原位腫瘤周圍淋巴結， 肝臟，腎上腺和兩個肺將被切除和用甲醛加以固定。肺將被檢查並記錄肺表面腫瘤結形成情況。淋巴結，肝臟，腎上腺和肺(如果肺表面腫瘤結不可看見的話)將被埋置在石蠟裡， 切開成4um截面，並且H&E染色以微觀觀察腫瘤轉移。所有免疫組化染色抗體現在都從商業來源購買到。觀天實驗結束後，解剖動物，取出腫瘤組織，觀察腫瘤大小和臟器轉移情況， MDA-MB-231/Neo細胞組僅發現2隻有轉移，MDA-MB-231/UHRF1組6隻均有轉移。肉眼觀典型的轉移為兩肺、肝臟分布多個大小不等的粟粒狀結節。結果見表1和圖5。表1 MDA-MB-231細胞轉移模型結果
TTiViViViViViVi'mNNNNNNNNNWiViViViViViViVmwm^綜上所述，本發明為臨床預測乳腺癌的浸潤和遷移能力提供了一種新的生物標記物，有助於臨床腫瘤病人全身治療前，對腫瘤的遠處浸潤和遷移能力進行評估，從而制定更具個性化的治療方案，以提高患者的治療療效及生存質量。注本實施例中統計學處理均按照以下方法處理所有實驗均重複3-5次，取平均值，結果用f 士 S表示。所有數據分析採用SAS 8.0統計軟體，應用方差分析，卡方檢驗，/7 < 0.05認為差異有統計學意義。
權利要求
1.一種用於檢測乳腺癌狀態的生物標記物試劑，所述生物標記物試劑為人UHRFl基因。
2.人UHRFl基因作為表徵乳腺癌細胞的轉移性能或遷移性能的生物標記物試劑的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測乳腺癌狀態的生物標記物試劑，所述生物標記物試劑為人UHRF1基因。本發明所述生物標記物試劑UHRF1基因與乳腺癌的遠處轉移能力密切相關，利用UHRF1基因作為預測乳腺癌遠處轉移能力的生物標誌物，與目前常規的病理分型判斷乳腺癌的轉移和預後相比，可以更加個體化、準確的預測乳腺癌的惡性程度。
文檔編號G01N33/574GK102305747SQ201110140279
公開日2012年1月4日 申請日期2011年5月27日 優先權日2011年5月27日
發明者李新莉, 樊賽軍 申請人:蘇州大學