一種鑑定植物乳桿菌的方法
2024-04-01 05:57:05
專利名稱：一種鑑定植物乳桿菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種鑑定方法。
背景技術：
植物乳桿菌U. /^^ter )是一種乳桿菌屬益生菌，植物乳桿菌可以產生有機酸、 細菌素、過氧化氫、雙乙醯等多種天然抑菌物質，具有維持腸道內菌群平衡，提高機體免疫 力，促進營養物質吸收等多種功能，尤其是植物乳桿菌產生的抑菌活性代謝產物細菌素，不 僅可以改善腸道生態，還可以用於食品與飼料的防腐。植物乳桿菌通常是在乳製品中分離 得到的，由於乳製品中微生物種類較多(主要包括植物乳桿菌、乾酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德 氏乳桿菌、乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌和嗜熱鏈球菌)，因此需要對分離得到的微生物種群 進行鑑定，以便將植物乳桿菌區分出來。植物乳桿菌現有的鑑定方法主要採用表型鑑定的 方法和基因測序的方法，表型鑑定的方法費時、費力，而且結果非常不穩定，基因測序的方 法一般都是針對菌株特定基因序列測定和比對，來實現菌株鑑別，但由於該方法需要昂貴 的儀器和專業技術人員，鑑定成本高、周期長，此外這些特定基因序列比較保守，區分力非 常有限。現有人還有針對特定的基因組來設計引物，通過引物來反應出所對應的微生物種 群,例如BOX-AIR，BOX-AIR的序列為5，-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3，，但是該引物是針對 細菌基因組中廣泛分布的短重複序列設計的，該引物可以反映出細菌種群的多樣性，可以 區分不同菌株，在很多細菌種群結構研究中應用比較廣泛，用該引物進行鑑定的方法，需要 用較低的退火溫度，對於模板、引物和儀器都要求非常高，會產生非常多的假陽性擴增，結 果不穩定；同時由於其通常會產生10條以上的條帶，給不同樣品比較帶來了不便，往往需 要專門的軟體來完成不同菌株的比較，需要建立專門的資料庫；此外，利用該引物進行鑑定 時，所需要的鑑定時間較長，一般需要5-7小時才能完成。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有植物乳桿菌的鑑定方法周期長、成本高的問題，而提供了一種鑑定植物乳桿菌的方法。本發明鑑定植物乳桿菌的方法按照以下步驟進行一、待鑑定的樣 品用DNA提取試劑盒提取得到的DNA，進行PCR擴增，PCR擴增的引物序列為 5，-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3，，PCR 反應體系 25 μ 1 是由 2. 5 μ 1 的 10 X PCRBuffer、 2. 5 μ 1 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2、2. 5μ 1 濃度為 10mmol/L 的 dNTPs、1. 8 μ 1 濃度為 IOpmol/ L的引物、2U的Taq聚合酶、1. 0 μ 1濃度為50ng/ul的DNA和餘量的蒸餾水組成，PCR反應 程序為95°C預變性5分鐘，30個循環，94°C變性30秒、59°C退火30秒、72°C延伸1分鐘， 72°C最終延伸5分鐘；二、步驟一擴增得到的PCR產物用電泳進行檢測，經電泳檢測只出現 一條條帶的待鑑定樣品為植物乳桿菌，實現了植物乳桿菌的鑑定。本發明通過對植物乳桿菌近似微生物(同屬菌種)、形態相近似微生物以及在環境中普遍存在的微生物進行大量的實驗證實，採用引物BOX-AIR在特定的退火溫度(59°C)進行PCR擴增只有植物乳桿菌能夠得到唯一一條條帶(2700bp)。本發明的方法採用BOX-AIR來鑑別植物乳桿菌，BOX-AIR是針對細菌基因組中廣 泛分布的短重複序列設計的，但是在本發明的方法中引物BOX-AIR是作為植物乳桿菌特異 性引物，採用特定的退火溫度(59°C)進行PCR擴增，使得該引物與植物乳桿菌的模板DNA進 行特異性結合，且經過電泳即可確定出待鑑定的樣品是否為植物乳桿菌。本發明的鑑定方法周期短，僅需要2個小時左右就完成了鑑定，而且鑑定結果中 目的條帶明顯，結果易於分析，通過電泳檢測後得到一條條帶(該條帶是一條2700個鹼基 的特異性條帶)，即可確定待鑑定的樣品為植物乳桿菌，如果沒有條帶或兩個以上條帶，則 可確定待鑑定的樣品不是植物乳桿菌。與現有的鑑定方法相比，本發明的鑑定方法不需要 特別複雜的儀器和數據處理，就可將植物乳桿菌區分出來，鑑定成本低。本發明利用引物 BOX-AIR實現了植物乳桿菌的鑑定。
圖1為植物乳桿菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖中「廣8」分別表示的 是廣8號菌株；圖2為乾酪乳桿菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖中「廣8」分別 表示的是廣8號菌株；圖3為嗜酸乳桿菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖中「廣8」 分別表示的是廣8號菌株；圖4為德氏乳桿菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖中 「廣8」分別表示的是廣8號菌株；圖5為乳酸乳球菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖， 圖中「廣8」分別表示的是廣8號菌株；圖6為腸膜明串珠菌經本實施方式進行鑑定所得到 電泳圖，圖中「廣8」分別表示的是廣8號菌株；圖7為嗜熱鏈球菌經本實施方式進行鑑定所 得到電泳圖，圖中「廣8」分別表示的是廣8號菌株；圖8為大腸桿菌經本實施方式進行鑑定 所得到電泳圖，圖中「廣8」分別表示的是廣8號菌株。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式鑑定植物乳桿菌的方法按照以下步驟進行一、 待鑑定的樣品用DNA提取試劑盒提取得到的DNA，進行PCR擴增，PCR擴增的引物序列為 5，-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3，，PCR 反應體系 25 μ 1 是由 2. 5 μ 1 的 10 X PCRBuffer、 2. 5 μ 1 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2、2. 5μ 1 濃度為 10mmol/L 的 dNTPs、1. 8 μ 1 濃度為 IOpmol/ L的引物、2U的Taq聚合酶、1. 0 μ 1濃度為50ng/ul的DNA和餘量的蒸餾水組成，PCR反應 程序為95°C預變性5分鐘，30個循環，94°C變性30秒、59°C退火30秒、72°C延伸1分鐘， 72°C最終延伸5分鐘；二、步驟一擴增得到的PCR產物用電泳進行檢測，經電泳檢測只出現 一條條帶的待鑑定樣品為植物乳桿菌，實現了植物乳桿菌的鑑定。本實施方式步驟一中DNA提取試劑盒可從市場上購買得到。本實施方式步驟三中經電泳檢測出現的不是一條條帶或者出現兩個以上條帶，即 可確定待鑑定的樣品不是植物乳桿菌。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中電泳檢測方法為10yL的PCR產物和IyL載樣緩衝液混勻後，採用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在IOOV恆定電壓條件下電泳30min，而後經EB染色後在紫外燈下觀察結果。其它步驟及參數 與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式鑑定植物乳桿菌的方法按照以下步驟進行一、 待鑑定的樣品用DNA提取試劑盒提取得到的DNA，進行PCR擴增，PCR擴增的引物序列為 5，-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3，，PCR 反應體系 25 μ 1 是由 2. 5 μ 1 的 10 X PCRBuffer、 2. 5 μ 1 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2、2. 5μ 1 濃度為 10mmol/L 的 dNTPs、1. 8 μ 1 濃度為 IOpmol/ L的引物、2U的Taq聚合酶、1. 0 μ 1濃度為50ng/ul的DNA和餘量的蒸餾水組成，PCR反應 程序為95°C預變性5分鐘，30個循環，94°C變性30秒，59°C退火30秒，72°C延伸1分鐘， 72°C最終延伸5分鐘；二、步驟一擴增得到的PCR產物用電泳進行檢測，經電泳檢測只出現 一條條帶，即可確定待鑑定的樣品為植物乳桿菌，經電泳檢測出現的不是一條條帶，即可確 定待鑑定的樣品不是植物乳桿菌；實現了植物乳桿菌的鑑定；其中電泳檢測方法為10μ L 的PCR產物和IyL載樣緩衝液混勻後，採用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在100V恆定電 壓條件下電泳30min，而後經EB染色後在紫外燈下觀察結果。本實施方式步驟一中DNA提取試劑盒從市場上購買得到。實驗8株植物乳桿菌、8株乾酪乳桿菌、8株嗜酸乳桿菌、8株德氏乳桿菌、8株乳 酸乳球菌、8株腸膜明串珠菌、8株嗜熱鏈球菌和8株大腸桿菌分別用本實施方式的方法進 行鑑定(植物乳桿菌通常是在乳製品中分離得到的，而乳製品中微生物種類較多，使得分離 出來的菌株，除了植物乳桿菌外，還有乾酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、乳酸乳球菌、 腸膜明串珠菌和嗜熱鏈球菌；大腸桿菌為生活中常見的一種微生物)。鑑定結果如圖所示， 其中，圖1為8株植物乳桿菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖2為8株乾酪乳桿菌 經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖3為8株嗜酸乳桿菌經本實施方式進行鑑定所得 到電泳圖，圖4為8株德氏乳桿菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖5為8株乳酸乳 球菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖6為8株腸膜明串珠菌經本實施方式進行鑑 定所得到電泳圖，圖7為8株嗜熱鏈球菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，圖8為8株 大腸桿菌經本實施方式進行鑑定所得到電泳圖，從圖1可以看出，這8株植物乳桿菌在2700 個鹼基處均出現一條明顯的擴增條帶，而從圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8可以看出， 乾酪乳桿菌、株嗜酸乳桿菌、株德氏乳桿菌、株乳酸乳球菌、株腸膜明串珠菌和株嗜熱鏈球 菌經本實施方式的方法均不產生任何條帶，而且在日常生活中常見得大腸桿菌經本實施方 式的方法也不產生任何條帶，由此可知，本實施方式的方法只對植物乳桿菌產生陽性條帶， 而對於嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌和嗜熱鏈球菌不能產生陽性條 帶，對於常見的大腸桿菌也不會產生陽性擴增，本實施方式的方法重複性好，準確度高。本實施方式的鑑定方法周期短，僅需要2個小時左右就完成了鑑定，而且鑑定結 果中目的條帶明顯，結果易於分析，通過電泳檢測後得到一條條帶(該條帶是一條2700個 鹼基的特異性條帶)，即可確定點鑑定的樣品為植物乳桿菌，如果不是一條條帶，則不是植 物乳桿菌。與現有的鑑定方法相比，本實施方式的鑑定方法不需要特別複雜的儀器和數據 處理，就可將植物乳桿菌區分出來，鑑定成本低。本實施方式利用引物BOX-AIR實現了植物 乳桿菌的鑑定。序列表
黑龍江省乳品工業技術開發中心
一種鑑定植物乳桿菌的方法
1
1 22 DNA 人工序列
PCR擴增的引物序列 1
ctacggcaag gcgacgctgacg 2權利要求
一種鑑定植物乳桿菌的方法，其特徵在於鑑定植物乳桿菌的方法按照以下步驟進行一、待鑑定的樣品用DNA 提取試劑盒提取得到的DNA，進行PCR擴增，PCR擴增的引物序列為5』-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3』，PCR反應體系25 μl是由2.5 μl的10×PCR Buffer、2.5 μl濃度為25 mmol/L的MgCl2、2.5 μl濃度為10 mmol/L的dNTPs、1.8 μl濃度為10 pmol/L的引物、2 U的 Taq聚合酶、1.0 μl濃度為50 ng/ul的 DNA和餘量的蒸餾水組成，PCR反應程序為95℃預變性5分鐘，30個循環，94℃變性30秒、59℃退火30秒、72℃延伸1分鐘，72℃最終延伸5分鐘；二、步驟一擴增得到的PCR產物用電泳進行檢測，經電泳檢測只出現一條條帶的待鑑定樣品為植物乳桿菌，實現了植物乳桿菌的鑑定。
2.根據權利要求1所述的一種鑑定植物乳桿菌的方法，其特徵在於步驟二中電泳檢測 方法為10yL的PCR產物和IyL載樣緩衝液混勻後，採用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測， 在100V恆定電壓條件下電泳30min，而後經EB染色後在紫外燈下觀察結果。
全文摘要
一種鑑定植物乳桿菌的方法，它涉及一種鑑定方法。本發明解決了現有植物乳桿菌的鑑定方法周期長、成本高的問題。方法一、用一條含有22個鹼基的引物，進行PCR擴增；二、電泳檢測，即實現了植物乳桿菌的鑑定。本發明的鑑定方法周期短，僅需要2個小時左右就完成了鑑定，與現有的鑑定方法相比，本發明的鑑定方法不需要特別複雜的儀器和數據處理，就可將植物乳桿菌區分出來，鑑定成本低。
文檔編號C12Q1/04GK101812521SQ20101014201
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月8日 優先權日2010年4月8日
發明者周豔秋, 姜毓君, 房玉國, 滿朝新, 王旻, 秦蘭霞, 胡博韜, 胡惠秩, 諸曉強, 遲濤, 韓琳琳 申請人:黑龍江省乳品工業技術開發中心