用「高聚物、鹽、水」兩相系統純化酶製劑的製作方法
2023-11-01 15:31:57
專利名稱:用「高聚物、鹽、水」兩相系統純化酶製劑的製作方法
本發明屬酶製劑的提純方法。
隨著酶製劑發酵工業的迅速發展，發酵產品的分離純化技術日顯迫切需要，將發酵所得酶製劑應用於食品加工業之前，必須先將粗酶製品中所含的不符合衛生要求、有使人不愉快氣味和色澤的種種雜質除去，方可應用。1977年前後，西德學者M.-R.Kula等人將水兩相系統應用於酶製劑工業生產過程。他們採用葡聚糖、聚乙二醇、水所構成的兩相系統，分離純化了克雷伯氏肺炎菌(Klebsie-lla pneumoniae)產生的異澱粉酶(普魯蘭酶)和1，4葡聚糖磷酸化酶，以及由大腸桿菌產生的三種氨基醯tRNA合成酶，並獲得專利權〔西德專利DE2616584(1977)〕，採用葡聚糖、聚乙二醇、水兩相系統，雖可對細胞、細胞器、病毒、蛋白質、核酸等生物大分子或顆粒進行分離純化，但由於葡聚糖的價格十分昂貴，不利於大規模工業生產上使用。
本發明的任務是給酶製劑大規模生產過程提供一種成本低廉、操作簡單、效率高而且安全的分離純化技術，使經過純化的產品可供食品加工業及其它方面應用。
本發明採用了價格低廉的、對人畜安全的高聚物、鹽、水構成的兩相系統，對酶製劑進行分離提純。具體做法是用聚乙二醇(簡稱PEG)、鹽、水構成的兩相系統，通過液、液萃取操作方法(見具體操作方法)，純化發酵生產的枯草桿菌α-澱粉酶，以及其它酶製劑(包括蛋白酶、脂肪酶等發酵生產的酶製劑)，使之能適用於食品加工工業。
枯草桿菌α-澱粉酶是工業發酵液噴乾粉，它內部含有大量雜質(包括培養基附隨物、細菌菌體、色素等)，並帶有不愉快的氣味。利用α-澱粉酶、雜質在水兩相系統中有不同的分配行為，可以將它們分離。首先令粗酶混懸液於〔10～30%(最好是20.5%)PEG/10～20%(最好是13.7%)(NH4)2SO4〕兩相系統中進行分相，分相後，90%以上的α-澱粉酶存在於上層相(PEG相)中;不溶性物質(如菌體、培養基附隨物)聚集於兩相界面;親水性色素則分布於下層相(硫酸銨相)。去除下層相後，加入適量磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4)緩衝液，構成10～30%(最好是13.7%)PEG/10～30%(最好是10%)磷酸鹽兩相系統，此時α-澱粉酶轉入新的下層相裡(即磷酸鹽相)，而其它雜質、色素則存留於上層PEG相中。去除上層相後，就可以獲α-澱粉酶溶於磷酸緩衝液中的液態製劑。這種液態α-澱粉酶製劑無色、無味。經透析除鹽、凍幹，便可製成粉狀製劑，可用於食品加工業，或供進一步精製的中間原料。
提純α-澱粉酶所用試劑有下列幾種
1.50%(每一百克溶液含PEG50克。以下均同)聚乙二醇(PEG6000)膠態溶液。
2.50%(每一百毫升溶液含硫酸銨50克。以下均同)硫酸銨(NH4)2SO4溶液。
3.25%(每一百毫升溶液含磷酸鹽25克，以下同)磷酸鹽〔Na2HPO4-NaH2PO4〕緩衝液，PH值為6.0。
4.12.5%(每一百毫升溶液中含酶製品12.5克)枯草桿菌α-澱粉酶粗酶混懸液。
具體操作方法如下1.取容積為125毫升帶刻度的液漏鬥，稱重加入50%PEG溶液10～30克(最好是20.5克)，終濃度為10～30%(最佳為20.5%)，用移液管加入50%(NH4)2SO4溶液10～20毫升(最好是13.7毫升)，終濃度為10～20%，(最好為13.7%)，12.5%粗酶液16.0毫升。系統總體積為50毫升(以上重量、體積均可按比例放大或縮小)。充分搖蕩均勻，靜置待分層清晰後，記錄上下相體積，各取出1毫升，進行酶活力及蛋白質濃度測定。
2.從分液漏鬥放出下層相。上層相仍留在分液漏鬥中，再加入25%磷酸鹽緩衝液35毫升，蒸餾水25毫升(以上重量、體積均可按比例放大，縮小)。充分搖勻，靜置分層記錄兩相體積。各取出1毫升，按Bernfeld法測α-澱粉酶活力及蛋白質濃度。在581-G型比色計中使用綠色濾光片追蹤黃色色素的分布動向。
3.分出下層相得α-澱粉酶精製品濃液中透析除鹽，凍幹即得成品。
在本項發明「高聚物、鹽、水」兩相系統中，所用高聚物聚乙二醇完全無毒，對人畜安全，是合格的食品填充劑。由於構成兩相系統的主要成份是水，因而有利於酶蛋白的穩定性;使用本系統所需設備簡單，操作方便，分離迅速，效率高，操作規模可以根據生產情況準確放大和縮小。且原材料成本低廉，適宜於大規模工業生產過程的使用。
權利要求
1.一種酶製劑的提純方法，其特徵是採用「高聚物、鹽、水」所構成的兩相系統對酶製劑進行分離提純。
2.根據權利要求
1所述的酶製劑提純方法，其特徵是可採用「聚乙二醇、鹽、水」兩相系統對枯草桿菌α-澱粉酶製劑進行分離提純。
3.一種如權利要求
1、2所述的酶製劑提純方法，其特徵是採用如下具體做法a.取50%的聚乙二醇溶液(每一百克溶液含聚乙二醇50克，以下同)10～30克，(終濃度為10～30%)，置於分液漏鬥中，加入50%硫酸銨(NH4)2SO4溶液(每一百毫升溶液含硫酸銨50克，以下同)10～20毫升，(終濃度為10～20%)、12.5%枯草桿菌α-澱粉粗酶液(每一百毫升溶液含酶製品12.5克，下同)16.0毫升，(以上重量、體積均可按比例放大、縮小)充分搖蕩均勻，靜置分層;b.從分液漏鬥放出下層相，上層相仍留在分液漏鬥中，另外加入25%磷酸鹽緩衝液(每一百毫升溶液含磷酸鹽25克)20～40毫升，蒸餾水25毫升，(以上重量體積均可按比例放大縮小)，充分蕩勻，靜置分層;c.分出下層相得α-澱粉酶精製品溶液，透析除鹽凍幹即得成品。
4.根據權利要求
3所述的酶製劑提純方法，其特徵是最佳做法如下a.取50%的聚乙二醇溶液20.5克，(終濃度為20.5%)，置於分液漏鬥中，再加入50%硫酸銨(NH4)2SO4溶液13.7毫升，(終濃度13.7%)，12.5%枯草桿菌α-澱粉粗酶液16毫升，(以上重量體積均可按比例放大縮小)，充分搖蕩均勻，靜置分層;b.從分液漏鬥放出下層相，上層仍留在分液漏鬥中，另外加入25%磷酸鹽緩衝液35毫升，蒸餾水25毫升，(以上重量體積均可按比例放大縮小)，充分搖勻，靜置分層;c.分出下層得α-澱粉酶精製品溶液，透析除鹽，凍幹即得成品。
專利摘要
本發明屬酶製劑的提純方法。
文檔編號C12N9/28GK86103207SQ86103207
公開日1987年11月18日 申請日期1986年5月5日
發明者林哲甫, 張維欽, 李玉玲 申請人:中山大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan