用微生物方法對含氮雜環羧酸進行羥基化的製作方法

2023-10-31 19:56:42 2

專利名稱：用微生物方法對含氮雜環羧酸進行羥基化的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從相應的含氮雜環-羧酸來生產具有通式Ⅰ的羥基-含氮雜環-羧酸或它的可溶性鹽的新微生物方法以及該方法所用的適當微生物。
下面我們將闡明含氮雜環-羧酸的羥基化或非羥基化，以及它的可溶性鹽，例如鹼金屬鹽或銨鹽。
2-羥基-含氮雜環-羧酸是活性物質合成中的重要中間產物，例如在生產2-氯代煙酸可用2-羥基煙酸作為起始原料(US-PS4081451)，以及在製藥時作為重要的中間產物。(Ann.Pharm、Er.，1980，3803)，第243-252頁)。
迄今為止，還沒有用微生物來生產羥基-含氮雜環-羧酸的方法。
本發明的任務是提供一種生產在化學上難於接觸的2-羥基-含氮雜環-羧酸的簡單的、符合環境要求的微生物方法。
本發明的任務根據本發明權利要求1所述的方法和權利要求6所述的新的微生物來解決。
本發明的方法是這樣的把通式Ⅱ的含氮雜環-羧酸
作為基質，藉助於含有特定羥化酶的可利用6-甲基煙酸的微生物把該物經羥基化成式Ⅰ表示的羥基-含氮雜環-羧酸。在式Ⅱ中，R1、R2可以相同，也可不同，表示氫原子、滷原子或C1-C4烷基，X表示氮原子或CR3-官能團，其中R3表示氫或滷原子;式Ⅰ中R1、R2和X具有上述同樣的含義。
對「含特定羥基化酶應用於6-甲基煙酸的微生物」概念的理解如下用例如汙水過濾後的淤泥作培養基來把6-甲基煙酸生物物質接種物培養成能利用6-甲基煙酸的微生物，該微生物利用6-甲基煙酸作為唯一碳源、氮源和能源。這時用現有的技術方法來選擇微生物，把6-甲基煙酸完全分解，通過中間產物2-羥基-6-甲基煙酸得到含特定羥化酶的微生物，即該種微生物特定地能在酸官能團與氮原子之間的碳原子上羥基化。
原則上所有的微生物都適於本發明，按此規律例如可從汙水過濾下的汙泥或土壤樣品進行挑選菌種，本文本中對微生物不作規定，是本發明的一部分。
適當地，本方法中的微生物以及它的後代和突變體定名KilolCDSM6920。這在1992年10月2日德文「微生物和細胞培養有限公司彙編」(SammlungfiirMikroorganismenandZellkulturenGmbH)Mascheroderweg1bD-3300Braunschweig中有記載。
Ki101(DSM6920)的科學描寫;
細胞形狀極小的棍狀寬μm0.4-0.5
長μm1.0-1.5可流動性-Geisseln-革蘭氏反應-(陰性)3%KOH中溶化情況+氨基肽酶(Gerny)+孢子-氧化酶+過氧化氫酶+關於16SrRNA序分析的類型還未被確定。
採用6-甲基煙酸進行微生物的篩選和培養按照專業上常用的方法進行。
選種時的「篩選」(Screening)系根據微生物在需氧條件下合適地進行，較好地在「篩選」時，微生物是靜止培養的(不是搖瓶)。
在選種和培養時6-甲基煙酸的合適量為達1%重量，優選為0.5%重量。
選樣和培養合適地在5-9pH值，較好在6-8pH值下實施。
選樣和培養合適地在15-50℃，較好在25-40℃溫度下進行。
通常選樣和培養在礦物鹽介質中進行，較好的在具有表1所描述的組成的礦物鹽介質中進行。
適當微生物的光學密度在650nm(OD650)為0.5-100，可用專業常用的方法得到，或者可把作基體的含氮雜環-羧酸直接加入到微生物中，以測得適當轉化的組成(生物轉化)。
在細胞不生長的情況下用專業常用的方法來進行適當的生物轉化。
用作通式Ⅱ的基質物質可以是例如煙酸，吡嗪羧酸或它的滷化物或C1-C4-烷基衍生物。
滷代的煙酸或吡嗪酸衍生物中較好的是用6-氯代煙酸，5，6-二氯煙酸和5-氯吡嗪羧酸來進行羥基化。
較好的是用5-甲基吡嗪-羧酸羥基化來得到C1-C4-吡嗪羧酸衍生物。
為了生物轉化可連續或一次地加入基質，適當的基質的加入應使培養介質中的基質濃度不超過10%重量，較好的不超過7%重量。
生物轉化的介質可用技術上常用的，較好的，生物轉化應在-低摩爾磷酸-緩衝劑中進行。
通常生物轉化在微生物懸浮液中進行，650nm(OD650)的光學密度為0.5-100，較好為5-50。
該生物轉化適當地在15-50℃溫度，較好在25-35℃溫度，5-9pH值，較好在6.5-7.5pH值下進行。
在通常的反應持續5小時-3天以後，通式Ⅰ的羥化產品可用專業常用的方法，例如，通過酸化無細胞的上清液使之分離出來。
按本方法生產的通式Ⅰ的羥基含氮-雜環-羧酸，式Ⅰ中，當X表示氮原子時，R1和R2可相同或不同地表示氫原子，滷原子或C1-C4-烷基，例外的是當X表示CH-官能團，R1和R2表示一個滷原子時，R1、R2不能都是氫原子，這在本文中未作限制。
本發明中新穎化合物的較好代表是5，6-二氯-2-羥基煙酸、3-羥基-5-甲基吡嗪羧酸和3-羥基-5-氯吡嗪羧酸。
實施例1可利用6-甲基-煙酸的微生物的分離。
在300ml的錐形燒瓶中加入含1mmol 6-甲基煙酸(表1)的100ml礦物鹽培養基，並摻入10ml汙水過濾的淤泥，該淤泥來自瑞士Visp的隆薩公司生產的汙水處理設備，或摻入來自Visp的隆薩工廠的泥土試樣，在30℃靜置培養10天後，可用分光光度計來證明有2-羥基-6-甲基煙酸的沉澱。隨後在新鮮的礦物鹽介質中接種培養多次，然後把能生成2-羥基-6-甲基煙酸的細胞懸浮液從含1.6%(w/v)瓊脂培養基的同樣介質上劃線培養，接著，瓊脂培養碟在含4%O2和96%N2的氣氛中在30℃培養，把單細胞菌落逐個地移入液體介質並靜止培養，定名為Kilol(DSM6920)的菌族即在6-甲基煙酸-2-羥基-6-甲基煙酸上生長、形成。
實施例2將煙酸經微生物氧化成2-羥基煙酸在1l Fernbach-燒瓶中，向800ml礦物鹽培養基(表1)中的名稱為Kilol(DSM 6920)的微生物中加入8毫摩爾6-甲基煙酸，在一搖瓶機上、在30℃、保溫(每分鐘100轉下培養，接種量為達5%(v/v)，5天後OD650達到約0.5。隨後把收得的細胞用50毫摩爾磷酸鹽緩衝劑洗滌一次，接著把細胞再放於含200mg(1.38mmol)的煙酸-鈉鹽的20ml、50mM、pH為7.0的磷酸鹽緩衝劑中懸浮，OD650達20。在搖瓶機上、30℃下培養6小時後，藉助薄層色譜法證明不再有煙酸。然後離心分離生物物質並把上清液酸化至pH2.5，使2-羥基煙酸可沉澱下來。
藉助1H-NMR(DMSO)分析可證明有分離出來的產品中沒有汙染，被分離出來的2-羥基煙酸為140mg(1mmol)，產率對煙酸來說為72%。
表1礦物鹽介質儲存液NaH2PO4·2H2O 156.0g
NH4Cl 10.0gK2SO41.2g用KOH調節pH值到7.0蒸餾水500.0ml儲存液2:
對氨基苯甲酸8.0mgD-生物素2.0mg煙酸20.0mgD-泛酸鈣10.0mg鹽酸吡哆醛30.0mg二氯化硫胺20.0mg氰鈷胺素(維生素B12) 10.0mg蒸餾水100.0ml消毒過濾儲存液3HCl(37%)7.0mlFeCl2·4H2O 1.5gZnCl20.07gMnCl2·4H2O 0.1gH3BO30.006gCoCl2·6H2O 0.19gCuCl2·7H2O 0.002gNiCl2·6H2O 0.024gNa2MoO4·2H2O 0.036g
蒸餾水1000.0ml,121°壓力釜蒸煮,20分鐘。
儲存液4NaOH0.5gNa2SeO3·5H2O 0.003gNa2WO4·2H2O 0.004g蒸餾水1000.0ml,121°壓力釜蒸煮20分鐘。
儲存液5MgCl2·6H2O 40.0gCaCl2·2H2O 5.0g蒸餾水200.0ml,121°壓力釜蒸煮20分鐘。
6-甲基煙酸(500mM)6-甲基煙酸-鈉鹽80.0g蒸餾水1000.0ml,121°壓力釜蒸煮20分鐘。
生長培養基10mM6-甲基煙酸溶液125.0ml6-甲基煙酸20.0ml蒸餾水1000.0ml,121°壓力釜蒸煮20分鐘。
消毒後加入溶液20.5ml溶液31.0ml溶液41.0ml溶液50.5ml表2實施例3-7
實施例3-7按實施例2來實施，結果概括於表2。
實施例初始原料濃度 OD650時間產品產率(w/v)nm[h]36-氯代煙酸1%20166-氯-2-羥基-70%(分離)45,6-二氯煙1%20165,6二氯-2-羥20%(分析)酸鈉鹽基煙酸5吡嗪羧酸鈉0.3%5243-羥基吡嗪羧70%(分析)鹽酸65-甲基-吡0.3%5243-羥基-5-甲80%(分析)嗪羧酸鈉鹽基-吡嗪羧酸75-氯-吡嗪0.3%5243-羥基-5-氯-50%(分析)羧酸鈉鹽吡嗪羧酸實施例6分析的數據(3-羥基-5-甲基-吡嗪碳酸)1H-NMR(DMSO，400MHz)δ以ppm表示2，4，s;2，6，s;3，8，s;7，8，s。
13H-NMR(DMSO，100，5MHz)δ以ppm表示20，t;40，m;130，s;134，s;155，s，164，s;170，s。
實施例7的分析數據(3-羥基-5-氯-吡嗪羧酸)1H-NMR(D2O和二噁烷，400MHz)δ以ppm表示3，8，s;4，7，s;8，0，s。
13C-NMR(D2O和二噁烷100，5MHz)δ以ppm表示132，s;133，s;145，s;149，s，164，s;172，s。
權利要求
1.一種用微生物生產具有通式Ⅰ的羥基含氮雜環-羧酸或它的可溶性鹽的方法，
式Ⅰ中，R1和R2可相同或不同地表示氫原子、滷原子或C1-C4-烷基，X表示氮原子或CR3-官能基團，其中R3表示氫原子或滷原子，其特徵在於是在含特定羥化酶的利用6-甲基煙酸的微生物幫助下，把作為基質物質的通式Ⅱ的含氮雜環-羧酸或它的可溶性鹽轉化成式Ⅱ的產品，
式Ⅱ中，R1、R2和X具有上述的含義。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，把通式Ⅱ的含氮雜環-羧酸用作基質，
式中，R1和R2可相同或不同的表示氫原子、氯原子或甲基，X表示氮原子或CH-官能團。
3.如權利要求1和2的至少一項所述的方法，其特徵在於反應是與名稱為Kilol(DSM 6920)的微生物或它的後代和突變體進行。
4.如權利要求1-3的至少一項所述的方法，其特徵在於，在反應進行時，一次性或連續地加入基質物質，使在培養介質中的基質濃度不超過10%重量。
5.如權利要求1-4的至少一項所述的方法，其特徵在於，反應在15-50℃溫度、5-9pH值下進行。
6.一種微生物，是這樣被選出的，即利用6-甲基煙酸用作唯一的碳源、氮源或能源，以製成2-羥基-6-甲基煙酸。
7.如權利要求6所述的微生物，具有Kilol(DSM 6920)的名稱，以及它的後代和突變體。
8.一種通式為
的羥基含氮雜環-羧酸，式中X表示氮原子，R1和R2可相同或不同的表示氫原子、滷原子或C1-C4-烷基，有一例外，即當X表示CH-官能團，R1和R2表示一個氯原子時，R1及R2不能都是氫。
9.5，6-二氯-2-羥基煙酸。
10.3-羥基-5-甲基吡嗪羧酸。
11.3-羥基-5-氯吡嗪羧酸。
全文摘要
本發明涉及從相應的含氮雜環-羧酸生產具有通式I的羥基含氮雜環-羧酸或它的可溶性鹽的新微生物方法，以及與此方法相適應的新的微生物。
文檔編號C12P7/02GK1077748SQ9310266
公開日1993年10月27日 申請日期1993年3月3日 優先權日1992年3月4日
發明者安德烈亞斯·基內亞, 安德烈亞斯·切希, 安德烈亞斯·廷舍特, 克勞斯·海因策爾曼 申請人:瑞士隆薩股份公司