抗真菌植物及其構建方法

2023-12-01 01:21:31 1

專利名稱：抗真菌植物及其構建方法
技術領域：
本發明涉及抗真菌植物和構建這類植物的方法。更具體地說，本發明涉及已經轉移了編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列的抗真菌植物，還涉及構建這類植物的方法。
背景技術：
已知植物在對病原體感染應答時，合成並積累一抗生劑稱為植物抗毒素(M.Yoshikawa(1978)Nature 257546)。發現一些植物病原體有誘導它們進行這種抵抗反應的物質(N.T.Keen(1975)Science 18774)，稱作「激發劑」。據信從用病原體感染植物到合成和積累植物抗毒素的生化過程如下當病原體的菌絲體侵犯植物細胞時，植物細胞中的葡聚糖酶工作以切割病原體菌絲體壁表面的多糖，因而釋放一激發劑。如果該激發劑與該植物細胞的受體結合，則產生一個在信號傳導中起作用的第二信使。該信號傳導物質加入該植物細胞核中，並激活編碼植物抗毒素合成酶的基因轉錄以誘導合成植物抗毒素。同時，抑制植物抗毒素降解。結果，植物抗毒素有效地在該植物細胞中積累。
在大豆抗性中起重要作用的一種植物抗毒素稱為glyceollion，其結構已被確定(M.Yoshikawa等，(1978)Physiol.Plant.Pathol.1273)。大豆的激發劑有一特徵結構；它有β-1，6連接的不同長度的葡聚糖做為主鏈，從其上伸出β-1，3連接的葡聚糖側鏈[J.K.Sharp等，(1984)J.Biol.Chem.25911321；M.Yoshikawa(1990)Plant Cell Technology 1.2695]。據信對得自大豆致病性黴菌真菌大雄疫黴glycinea種型的葡聚糖激發劑有特異性的受體是一蛋白質，該蛋白質在該抗生劑glyceollin的的合成和積累中起重要作用。已經公開了對該激發劑有特異性的激發劑受體的純化方法[E.G.Cosio等，(1990)FEBS 264235；E.G.Cosio等，(1992)Eur.J.Biochem.2041115，T.Frey等(1993)Phytochemistry 32543]和該激發劑受體的部分胺基酸序列(Kakitani等，日本未審查專利公開No.6-321995)。然而，尚未知編碼該葡聚糖激發劑受體的任何基因。如果發現編碼激發劑受體的基因，將有可能通過將該基因整合入植物的染色體中並在該植物中表達該激發劑受體創造對致病性真菌有抗性的植物。因此，可以預期改進農產品生產率。
本發明的一個目的是提供其中轉移了編碼葡聚糖激發劑受體基因的植物。
本發明的另一個目的是提供創造其中轉移了編碼葡聚糖激發劑受體基因的植物的方法。
本發明說明書做為對上述課題的解決進行深入廣泛研究的結果，本發明人已經成功地從大豆cDNA文庫中克隆了葡聚糖激發劑受體基因，將該基因轉移到菸草植株中並在該植株中表達該基因。因此，本發明已經完成。本發明提供創造抗致病性真菌的植物的方法，包括將編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列整合入植物染色體並在該植物中表達該葡聚糖激發劑受體。本發明也提供對致病性真菌有抗性的植物，其特徵在於已將編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列轉移至該植物中，並在該植物中表達該葡聚糖激發劑受體。
附圖簡述

圖1展示三個純化步驟的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳圖案。
圖2展示質粒pER23-1和質粒pER23-2的圖譜。
圖3展示構建質粒pKV1-ER23的程序。
圖4展示在向培養大豆細胞加入激發劑後胞內Ca2+濃度的瞬時增加。
圖5展示在向已轉化的培養菸草細胞加入激發劑後胞內Ca2+濃度的瞬時增加。
圖6展示在大腸桿菌中表達的全長或部分長度ER的激發劑結合活性。
圖7展示用抗激發劑結合域的抗體抑制激發劑與大豆子葉膜部分中的激發劑結合蛋白的結合。
圖8展示用抗激發劑結合域的抗體抑制激發劑誘導的植物抗毒素在大豆子葉中的積累。
圖9展示轉化菸草植株對芝麻疫黴的抗性。
圖10提供照片展示轉化菸草植株對立枯絲核菌的抗性。
圖11展示轉化菸草植株對立枯絲核菌的抗性。
圖12展示在用芝麻疫黴的遊動孢子的接種試驗中轉化菸草植株對芝麻疫黴的抗性。
圖13展示質粒pPG1的結構。
圖14展示穀胱甘肽-S-轉移酶/菜豆葡聚糖酶融合蛋白的葡聚糖酶活性測定結果。
實施本發明的推薦實施方案葡聚糖激發劑受體是參與植物抗毒素產生的蛋白質，它做為得自葡聚糖(真菌細胞壁的組分)的葡聚糖激發劑的受體而起作用。它的功能是給微粒體和核以信號，以增加細胞中植物抗毒素的含量；該功能是通過與葡聚糖激發劑結合而實現，後者是當病原體例如疫黴屬的微生物已侵入植物組織時，由植物細胞中的β-1，3-葡聚糖酶切割病原體菌絲體壁的一部分產生的。做為葡聚糖激發劑受體的具體實例，本發明人已發現具有大致如SEQ ID NO1所示胺基酸序列的一個葡聚糖激發劑受體(日本專利申請6-136100號)。「大致如SEQ ID NO1所示胺基酸序列」包括SEQ ID NO1所示的胺基酸序列，其中可以有一個或多個胺基酸的缺失、置換或加入，只要它們保持葡聚糖激發劑受體的功能。
可以通過例如部分修改的Cosio法(E.J.B(1992)2041115)製備葡聚糖激發劑受體。簡言之，將大豆最好是green homer變種的根、葉和莖勻漿，從所得漿液中收集膜部分，用離子交換層析純化並用以激發劑做為配體的親和層析進一步純化。在親和層析中使用的配體最好得自大雄疫黴glycinea種型小種1(ATCC34566)，因為它與green homer不親和(即對該病原體有抗性)。
可以下述方法確定由此製備的該葡聚糖激發劑受體的胺基酸序列通過電印跡將該純化的葡聚糖激發劑受體轉移至PVDF膜(Millipore Co.)並用賴氨醯內肽酶(AP-I)消化。從該PVDF膜上回收片段化的肽，並用反相HPLC(μ-Bondasphere 5μC8)分步分離。用氣相蛋白測序儀(Applied Biosystems Co.)分析峰部分。
葡聚糖激發劑受體可以用於闡明植物對真菌的抵抗機制和開發能夠誘導抗真菌性的激發劑衍生物，它可以用做生產抗葡聚糖激發劑受體抗體的抗原。
編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列最好具有至少一個鄰近3』端的終止密碼子。
更具體地說，可以使用包含編碼葡聚糖激發劑受體的核苷酸序列的DNA分子，而該葡聚糖激發劑受體具有大致如SEQ ID NO1所示的胺基酸序列。「包含編碼葡聚糖激發劑受體的核苷酸序列的DNA分子」包括所有簡併異構體。名詞「簡併異構體」指以不同簡併密碼子編碼同一多肽的DNA分子。如果以具有SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA分子為例，則一個DNA分子中的任何胺基酸的密碼子例如編碼Asn的AAC變為簡併密碼子AAT，則該DNA分子稱為簡併異構體。這類簡併異構體的實例包括含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA分子。可以使用導入質粒pER23-1、含有編碼葡聚糖激發劑受體的核苷酸序列的DNA序列。用質粒pER23-1轉化的大腸桿菌DH5αEKB633已於1994年6月15日以登記號FERM BP-4699保藏於工業科學和技術局的國立生物科學和人類技術研究所(1-3，Higashi 1chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，JAPAN)。
編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列可以可選地與朝向5』端的上遊部分的一個轉譯框架一起與起始甲硫氨酸的ATG密碼子結合，並且也可以與做為在朝向5』端的上遊部分和朝向3』端的下遊部分內的非轉譯區的具有適當長度的其他DNA分子結合。
編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列通常可以以質粒或噬菌體DNA分子的組分部分的形式存在，或以導入微生物(具體地說，包括大腸桿菌和農桿菌的細菌)的質粒、噬菌體或基因組DNA分子、噬菌體顆粒或植物的組分部分的形式存在。
為在植物中穩定地表達編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列，可以以適當的組合將一啟動子、一編碼起始密碼子(ATG)的DNA分子和一終止子加入這些DNA序列中。該啟動子的實例包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞單位編碼基因的啟動子(Fluhr等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA(1986) 832358)、產生花椰菜花葉病毒19S-RNA的啟動子(Guilley等，Cell(1982)30763)、產生花椰菜花葉病毒35S-RNA的啟動子(Odell等，Nature(1985)313810)等等。該終止子的實例包括藍曙紅合酶基因的終止子(Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)、章魚鹼合酶的終止子(Gielen等，EMBO J.(1984)3835)等等。
編碼葡聚糖激發劑受體的DNA分子可以用以下方法得到，該方法包括的步驟為按照常規核酸合成方法化學合成該DNA分子的至少一部分，並通過常規方法例如免疫學方法或雜交法，用該合成DNA分子做為探針從適當的cDNA文庫中獲得所需DNA分子。上述方法中所用的一些質粒、各種限制性酶、T4 DNA連接酶和其它酶都有市售。按照分子克隆(J.Sambrook等，CSH實驗室(1989)、CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，John Wiley Sons(1987))和其他描述的方法，進行DNA克隆、質粒構建、宿主轉染、轉染子培養、從培養物中回收DNA分子和其它步驟。
更具體地說，可以如下得到編碼葡聚糖激發劑受體的DNA分子從葡聚糖激發劑受體的胺基酸序列中選擇兩種部分胺基酸序列。製備可以編碼所選部分序列的C末端的由所有鹼基組合組成的引物和可以編碼所選部分序列的N末端的由所有鹼基組合組成的引物。使用適當大豆cDNA文庫做為模板，用這些合成引物做為混合引物進行兩個PCR。接著，挑出預期擴增的給定長度的兩個擴增片段(這些片段對應於編碼上述兩個部分胺基酸序列的DNA分子)並測定其核苷酸序列。在該測定的核苷酸序列的基礎上，合成具有位於葡聚糖激發劑受體C末端一側的胺基酸部分序列的C末端編碼核苷酸序列的引物和具有位於葡聚糖激發劑受體N末端一側的胺基酸部分序列的N末端編碼核苷酸序列的引物。使用這兩個合成引物以上述大豆cDNA文庫DNA分子做為模板進行PCR。使用所得的擴增片段做為探針與前述大豆cDNA文庫雜交，由此產生含有編碼該葡聚糖激發劑受體的核苷酸序列的DNA分子。
可以用任何已知方法，例如，Maxam-Gilbert法(Methods Enzymol.，65499，1980)、使用M13噬菌體的雙脫氧核苷酸鏈終止法(J.Messing等，Gene，19269，1982)等等，對得到的含有編碼該葡聚糖激發劑受體的核苷酸序列的DNA分子測序。
由於對葡聚糖激發劑的各種研究的結果提示葡聚糖激發劑受體在植物中對真菌的抗性起重要作用，如果將編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列按照常規方法導入沒有葡聚糖激發劑受體的植物細胞(特別是高等植物細胞)並在其中表達，那麼預期這些DNA序列可以賦予植物真菌抗性。已經提出可以感染植物的真菌一般都有抑制劑，因此獲得抑制植物抗真菌性的能力。預期通過導入和表達編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列，使得葡聚糖激發劑受體工作，或通過修飾該DNA分子或調控其表達水平，可以開發對真菌具有抗性的新植物。
另外，如果將編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列與諸如賦予植物抗真菌性的葡聚糖酶基因的真菌抗性增強基因或特徵一起，導入植物細胞特別是高等植物細胞並在其中表達，預期賦予植物的真菌抗性會高於導入葡聚糖酶基因時的抗性。編碼葡聚糖酶的DNA序列的具體實例包括一包含具有大致如SEQ ID NO3或34所示胺基酸序列的葡聚糖酶的編碼核苷酸序列的DNA。「包含葡聚糖酶的編碼核苷酸序列的DNA」應包括所有簡併異構體。做為這種簡併異構體的具體實例，可以提出包含SEQ ID NO4或33所示核苷酸序列的DNA。
可以構建用於導入編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列的載體，使得該葡聚糖激發劑受體可以在植物中穩定表達。更具體地說，可以以適當的組合，將一啟動子、一編碼起始密碼子(ATG)的DNA分子和一終止子加入編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列中。該啟動子的實例包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞單位編碼基因的啟動子(Fluhr等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)832358)、藍曙紅合酶基因啟動子(Langridge等，Plant Cell Rep(1985)4355)、產生花椰菜花葉病毒19S-RNA的啟動子(Guilley等，Cell(1982)30763)、產生花椰菜花葉病毒35S-RNA的啟動子(Odell等，Nature(1985)313810)等等。該終止子的實例包括藍曙紅合酶基因的終止子(Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)和章魚鹼合酶的終止子(Gielen等，EMBO J.(1984)3835)。
可以用任何通常已知方法，例如在「Plant genetic transformationand gene expression；a laboratory manual」(J.Draper，等編輯，BlackwellScientific Publications，1988)中描述的方法，將編碼葡聚糖激發劑受體的DNA分子導入植物細胞中。這些方法的實例包括，諸如使用病毒或農桿菌的生物學方法和物理化學的方法，諸如電穿孔、聚乙二醇法、微注射、粒子槍法、葡聚糖法等等。
當欲轉化的植物是雙子葉植物時，一般優選使用農桿菌的方法。當欲轉化的植物是單子葉植物或對農桿菌感染不敏感的雙子葉植物時，最好用諸如電穿孔的物理/化學方法。做為將要轉移目的DNA的植物材料，適當的材料可以根據轉移方法等等選自葉、莖、根、塊莖、原生質體、愈傷組織、花粉、種子胚、苗原基等。
當欲將目的DNA轉移至培養植物細胞時，一般以原生質體做為材料，並用諸如電穿孔、聚乙二醇法等的物理/化學方法向其中轉移該DNA。另一方面，當欲將目的DNA轉移至植物組織時，使用葉、莖、根、塊莖、愈傷組織、花粉、種子胚、苗原基等等做為材料；最好使用葉或莖。通過使用病毒或農桿菌的生物學方法或諸如粒子槍、微注射等等的物理/化學方法將該DNA轉移至這種植物組織中；最好採用使用農桿菌的生物學方法。
為了由已轉移了編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列的這類植物組織或植物細胞再生植株，假如它們得自自菸草，則可以在諸如無激素MS培養基的培養基中培養這些轉化植株或細胞。可以將得到的生根的苗轉移至土壤中以得到成長的植株。
做為可以通過用上述方法轉移編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列並表達該葡聚糖激發劑受體而被賦予或增強抗致病性真菌的植物，可以提出對在細胞壁中含有葡聚糖的致病性真菌敏感的植物。這些植物的具體實例包括(但不限於)茄科植物和豆科植物。更具體地說，這些植物包括(但不限於)菸草、大豆、馬鈴薯、水稻、菊屬和石竹屬植物。
作為致病性真菌，本發明包括含那些在細胞壁中含有葡聚糖的致病性真菌。該致病性真菌的特定實例包括(但不限於)疫黴屬、絲核菌屬、Pyricularia屬、柄鏽菌屬、鐮孢屬、單孢鏽菌屬和葡萄孢屬。更具體地說，該致病性真菌包括(但不限於)芝麻疫黴、立枯絲核菌、Pyricularia oryza、堀柄鏽菌、尖鐮孢、石竹單孢鏽菌和灰葡萄孢。
按照本發明，轉移至植物中的編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列可以通過種子遺傳至後代。因此，該轉移的DNA序列也存在於那些由本發明植物的花粉或子房形成的種子中，並且該遺傳性狀可以傳遞給子代。因此，可以通過種子繁殖其中已轉移了編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列的本發明植物，而不喪失其對致病性真菌的抗性。也可以通過採用植物組織培養的大規模繁殖方法或通過諸如插條、壓條、嫁接、分株等常規技術繁殖本發明的植物，而不喪失其對致病性真菌的抗性。
可以用以下試驗方法檢測一轉化植物是否具有抗真菌性。
通過將真菌菌絲體直接接種到植物中並觀察病痕的擴大，可以檢測對疫黴屬真菌的抗性。或者，通過接種該真菌的遊動孢子並觀察病痕的形成和擴大可以檢測該抗性。
通過將培養真菌細胞和土壤混合，在該土壤中播種或栽植植株並觀察立枯病現象，可以檢測對土壤真菌的抗性。
現在參考下列實施例可以更加詳細地解釋本發明，這些實施例決不限制本發明的範圍。在下列實施例中，葡聚糖激發劑受體縮寫為「ER」。實施例1大豆根葡聚糖激發劑受體的純化1)測定ER的葡聚糖激發劑結合活性按照Jong-Joo Cheong(The Plant Cell(1991)3127)的方法，合成一激發劑(平均分子量10,000)和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.)的複合物。用氯胺T給該激發劑-酪胺複合物標記碘。
將樣品(蛋白量＜500μg)懸浮於500μl的檢測緩衝液(50mMTris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mM MgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)並在0℃保溫2小時。將7.0nM的碘標記激發劑-酪胺複合物(70Ci/mmol，摩爾數的計算基於假設該激發劑的分子量是10,000，這也適用於以下描述)加入該懸浮液中，將該混合物在4℃保溫2小時。將該反應溶液通過用0.3％聚乙烯亞胺水溶液處理至少1小時的WhatmanGF/B過濾。殘留物用5ml冰冷緩衝液(10mM Tris-HCl pH 7.0，1MNaCl，10mM MgCl2)洗滌三次。用γ計數器測定濾膜上保留的放射性活性(讀數A)。為消除非特異性結合的影響，同樣進行上述程序，但將17μM的該激發劑加入同一樣品中，將該混合物懸浮於該檢測緩衝液中，將該懸浮液在0℃保溫2小時。將所得的讀數從讀數A中減去，得到激發劑特異性結合的讀數(Δcpm)。將得到的讀數(Δcpm)除以計數的總數，然後乘以試驗中使用的激發劑的總量，以計算激發劑結合蛋白的量(以摩爾計)。
用上述方法檢查ER的純度。2)大豆根ER的純化將大豆(Glycinemax栽培品種Green Homer)種子(Takayama SeedCo.)在蛭石中培養一周，然後溶液培養15天以收穫根(約40kg，溼重)。將收穫的根儲存於-80℃直至將其用於ER純化。將1.2L冰冷緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.0，、30mM MgCl2、2mM二硫蘇糖醇、2.5mM焦亞硫酸鉀和1mM PMSF)加入根(2kg，溼重)，用韋林氏攪切器將該混合物勻漿2分鐘。
將得到的漿液通過Miracloth(Calbiochem Co.)過濾，將濾液於4℃、9,000rpm離心15分鐘。將上清液於4℃、37,000rpm超離心20分鐘。將沉澱懸浮於160ml冰冷緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mM MgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)以得到膜部分。將兩性電解質去汙劑ZW3-12(Boehringer Co.)加入該膜部分中，使最終濃度為0.25％，以加溶膜部分的ER，將該混合物於8℃攪拌30分鐘。將得到的混合物於4℃、37,000rpm超離心20分鐘，以收集含有加溶ER(可溶部分)的上清液。將該可溶部分(165ml)對2升緩衝液(50mMTris-HCl pH 8.0，0.2％ZW3-12，4℃)透析四次。將5ml Protrap(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)加入該樣品中，將該混合物於8℃攪拌30分鐘以除去樣品中的蛋白酶並穩定ER。將得到的混合物於4℃、2,800rpm離心2分鐘以收集上清液。將得到的上清液(160ml)用超濾膜YM-10(Amicon Co.)濃縮至約50ml，將濃縮液對A緩衝液(50mMTris-HCl pH8.0、0.1M蔗糖、5mM MgCl2、1mM PMSF、5mMEDTA和0.2％ZW3-12，4℃)透析。
將透析液上Q-Sepharose HP 26/10柱(Pharmacia Co.)，用0-1MNaCl線性梯度洗脫ER(Q-Sepharose活性部分，8ml)。在NaCl濃度約0.45M時，ER被洗脫。用A緩衝液將Q-Sepharose活性部分稀釋三倍，將該稀釋部分上Mono Q 10/10柱(Pharmacia Co.)。用0-1M NaCl線性梯度洗脫ER(Mono Q活性部分)。在NaCl濃度約0.25M時，ER被洗脫。
按下述，用以激發劑為配體的親和層析凝膠純化ER按照具有某些修改的N.T.Keen方法(Plant Physiol.(1983)71460，Plant Physiol.(1983)71466)製備激發劑。簡言之，用酵母裂解酶100T(KIRIN BREWERY CO.，LTD.)處理致病性大雄疫黴glycinea種型小種1(ATCC34566)的菌絲體壁以釋放激發劑。處理後，通過裝在柱中的CM-纖維素吸附除去酵母裂解酶100T。將得到的透過部分用凝膠滲透層析G-75(Pharmacia Co.)純化以收集平均分子量為10,000Da的激發劑部分。用M.Yoshikawa的方法(Nature(1978)257546)測定收集部分的glyceollin誘導激發劑活性。將8μg激發劑加入大豆子葉，導致在培養24小時後誘導約550μg glyceollin。
為消除凝膠載體上的非特異性吸附，收集Mono Q活性部分並與約33mg麥芽糖偶聯玻璃凝膠(床體積約100μl)於8℃攪拌1小時。離心(1,000rpm，4℃，2分鐘)沉澱該凝膠以收集上清液(麥芽糖偶聯玻璃凝膠透過部分)。按照A.M.Jeffrey等的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1975)62608)製備麥芽糖偶聯玻璃凝膠。簡言之，將120mg麥芽糖和6g Glass Aminopropyl(Sigma Co.)懸浮於36ml H2O中，將該懸浮液於室溫攪拌過夜。向得到的懸浮液中加入36ml乙醇。之後立即將硼氫化鈉(864mg)的乙醇(72ml)溶液加入該混合物。將得到的混合物超聲處理2分鐘並在室溫攪拌5小時。將水(288ml)加入該反應混合物中，用冰冷卻得到的混合物並用乙酸調至pH 5.6。用約1.8升水洗滌該凝膠以除去游離的麥芽糖。通過J.H.Roe的方法(J.Biol.Chem.(1955)212335)，用蒽酮試劑定量測定洗滌溶液中含有的麥芽糖。從洗滌溶液中的麥芽糖含量估算凝膠偶聯的麥芽糖量。結果，發現60mg的麥芽糖偶聯到6g Glass Aminopropyl上。
將約17mg的激發劑偶聯玻璃凝膠(床體積約50μl)加入8ml的麥芽糖偶聯玻璃凝膠通過部分，將該混合物於8℃溫和攪拌過夜。離心(1,000rpm，4℃，2分鐘)收集該凝膠並用二倍床體積的A緩衝液洗滌二次。另外用四倍床體積的0.1％SDS洗滌該凝膠三次以收集凝膠偶聯的ER(激發劑偶聯玻璃凝膠洗脫部分)。按照A.M.Jeffrey等的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1975)62608)製備激發劑偶聯玻璃凝膠。簡言之，將激發劑(37mg)和Glass Aminopropyl(490mg)懸浮於6ml H2O中，並於室溫攪拌過夜。向該懸浮液中加入乙醇(6ml)，之後立即加入硼氫化鈉(144mg)的乙醇(72ml)溶液。將該混合物超聲處理2分鐘並在室溫攪拌5小時。將48ml水加入得到的混合物中。用冰冷卻該混合物並用乙酸調至pH5.6。用蒽酮試劑定量測定游離激發劑。從洗滌溶液中的游離激發劑含量估算凝膠偶聯的激發劑量。結果，發現34mg的激發劑被偶聯至490mg Glass Aminopropyl。
上述純化步驟中的蛋白量和ER量概述於表1中。
表1.純化步驟中蛋白量和ER量(溼重40kg的大豆根用作原材料)蛋白(mg) ER(pmol)膜部分 1790030可溶部分 2000 214Q-Sepharose活性部分190 205Mono Q活性部分 49 233麥芽糖偶聯玻璃凝膠 45 220通過部分激發劑偶聯玻璃凝膠 0.004*45洗脫部分*根據SDS-PAGE後銀染獲得的條帶強度估算。
將Mono Q活性部分、麥芽糖偶聯玻璃凝膠透過部分和激發劑偶聯玻璃凝膠洗脫部分在一電泳梯度凝膠SDS-PAGE板10/20(DaiichKagaku Yakuhin Co.)上電泳並進行銀染(Daiich Kagaku Yakuhin Co.)。電泳圖示於圖1。在圖1中，泳道1是Mono Q活性部分，泳道2；麥芽糖偶聯玻璃凝膠通過部分，泳道3；激發劑偶聯玻璃凝膠洗脫部分。圖1展示在約70,000 Da分子量處檢測到ER條帶。
通過使用125I標記的光親和性試劑SASD(Pierce Co.)和該激發劑的複合體，給分子量約70,000的該蛋白質進行125I標記。用western印跡法將膜部分的SDS-PAGE條帶轉移至PVDF膜上，並同與測定PVDF膜上ER的激發劑結合活性使用的相同的125I標記激發劑一起保溫，使得分子量約70,000 Da的該蛋白質被125I標記。這些事實顯示分子量約70,000 Da的該蛋白質有激發劑結合活性。
通過上述方法從溼重約40kg的大豆根純化約4μg ER。3)ER片段化肽的分析用蛋白酶消化將ER片段化為肽。通過Iwamatsu的方法(AkihiroIwamatsu，Seikagaku(1991)63139，A.Iwamatsu，Electrophoresis(1992)13142)確定該片段化肽的胺基酸序列。將用上述方法純化的ER溶液用Centricon-30(Amicon Co.)濃縮至約100μl並進行10-20％聚丙烯醯胺SDS電泳。將得到的蛋白條帶用電泳吸印裝置(Sartrius Co.)轉移至PVDF膜(Millipore Co.)。用0.1％Ponceau S(Sigma Co.)/1％乙酸對轉移至PVDF膜上的條帶染色。將分子量70,000 Da處的主帶切出並用0.5mM NaOH脫色。該帶被還原性E-羧甲基化。以酶∶底物(mol∶mol)為1∶100的比例將賴氨醯內肽酶(AP-1)加入得到的條帶中，將該混合物於30℃反應16小時。將得到的片段化肽上μ-Bondasphere 5μC8-300(2.1×150mm，Waters)柱，該柱用98％溶劑A和2％溶劑B平衡，以0.25ml/分鐘的流速用2-50％溶劑B線性梯度洗脫30分鐘(溶劑A0.05％TFA溶液，溶劑B含0.02％TFA的2-丙醇∶乙腈＝7∶3(v/v))。以在214nm的吸收值檢測洗脫肽，手動收集每個峰部分。用氣相蛋白測序儀(Applied Biosystems的470A型)分析得到的峰部分。做為得到的所有峰部分的分析結果，清楚地確定了該片段化肽的下列胺基酸序列。#1Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Asn Ile Ser Pro Gln(N-末端)(SEQID NO5)#5Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Ser(SEQ ID NO6)#6Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp(SEQ ID NO7)#7Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile Lys(混合序列)(SEQ ID NO8)實施例2大豆ER基因的克隆1)製備大豆mRNA將大豆(Glycinemax栽培品種Green Homer)種子(Takayama SeedCo.)在蛭石中培養一周，然後溶液培養15天以收穫根(約40kg，溼重)。將一部分收穫的根儲存於-80℃直至使用。按照Ishida的方法(CellTechnology Laboratory Manipulation Manual，Kodansha Scientific)得到總RNA。簡言之，將儲存的根(28.5g，溼重)在研缽上邊研磨邊加液氮。向得到的粉末中加入保持於65℃的35.6ml GTC溶液，將該混合物用韋林氏攪切器勻漿。將得到的懸浮液於室溫、6,000rpm離心15分鐘以收集40ml的上清液。將該上清液輕輕地鋪於離心管中的銫墊層溶液上，於25℃、35,000rpm離心20小時。將得到的沉澱溶於9ml的TE/0.2％SDS中。進行兩次酚/氯仿抽提後，通過乙醇沉澱回收總RNA(4.37mg)。
按照該手冊，得到的總RNA(2.2mg)用oligotex dt30(Japan RocheCo.)純化，然後得到68μg純化的poly(A)+RNA。2)製備大豆cDNA文庫按照該手冊，用cDNA合成藥盒(Pharmacia Co.)由5μg的該poly(A)+RNA合成cDNA分子。用T4連接酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)將這些合成cDNA片段與λ噬菌體載體λgt10(Stratagene Co.)連接。使用Gigapack(Stratagene Co.)將一DNA混合物包入噬菌體顆粒中，以製備約1.5×106pfu.的大豆cDNA文庫。將該文庫擴增至160ml1.6×1011pfu/ml的大豆cDNA文庫。
按下述製備該cDNA文庫內的總DNA向500μl的噬菌體溶液(1.6×1011pfu/ml)中加入等量的氯仿/異戊醇(24∶1)。將該混合物振蕩30秒並離心收集水層。將該水層再次用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提。向得到的水層中加入5μl 3M乙酸鈉溶液(pH 5.4)和125μl乙醇，並將該混合物離心以收集沉澱。將沉澱用70％乙醇溶液洗滌並溶於含有1μg/ml RNase A(Sigma Co.)的10mM Tris-HCl溶液(pH8)。將該溶液用作PCR的模板。3)通過PCR擴增和克隆大豆ER cDNA片段在實施例1得到的片段化肽胺基酸序列的基礎上(#5和#6)，用自動核酸合成儀(Applied Biosystems Co.的394型)合成下列四種寡聚脫氧核苷酸(混合引物U5、U7、U10和U12)引物U5 5′-AARAGYATHGAYGGNGA-3′(SEQ ID NO9)引物U7 5′-WRTCNCCNACNAC-3′(SEQ ID NO10)引物U10 5′-GTNAAYAARATNCARAC-3′(SEQ ID NO11)引物U12 5′-ARRTTNAGRAARTCYTC-3′(SEQ ID NO12)(RA/G，YC/T，WA/T，HA/C/T，NA/G/T/C)將0.5μg的cDNA文庫中的總DNA溶於79μl蒸餾水。將或者引物U5和U7的組合或者引物U10和U12的組合(每種100pmol)與0.5μl Taq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)一起加入8μl含2.5mM dNTP的10μl 10×PCR緩衝液中(TAKARA SHUZO CO.，LTD.的Taq DNA聚合酶附帶的)使最終量為100μl。用Gene Amp PCRSystem 9600(Perkin-Elmer Co.)進行50個循環的PCR反應1)94℃×30秒變性，2)47℃×30秒復性和3)72℃×1分鐘延伸。反應後，將15μl的反應溶液在15％聚丙烯醯胺凝膠上電泳。將該凝膠用0.5μg/ml溴化乙錠溶液染色10分鐘。在紫外燈下觀察並切出顯示預期擴增的40bp和47bp的特異性擴增片段的條帶。將該凝膠切片用槊料棒研磨並用洗脫緩衝液(0.5M乙酸銨、10mM乙酸鎂、1mM EDTA和1％SDS)洗脫過夜以收集含DNA的溶液。
用pT7Blue T-Vector藥盒(Novagene Co.)將收集的DNA片段克隆入質粒pT7Blue(R)。用螢光自動DNA測序儀(Applied Biosystems Co.的373A型)對得到的質粒p#5-1、2和p#6-1、2、3、4、5、6、7、8和9測序。結果顯示除了引物之外，得到的擴增DNA片段也編碼片段化肽#5和#6的胺基酸序列。
在該DNA測序的基礎上，用自動核酸合成儀合成下列兩種寡聚脫氧核苷酸(混合引物U18和U19)。引物 U18 5′-AAGTAYAAGCCRCAAGCCTATTCA-3′(SEQ ID NO13)引物 U19 5′-ATCGCCRACAACMCCAA-3′(SEQ ID NO14)(Y和R按上述定義，MA/C)將0.5μg cDNA文庫內的總DNA溶於79μl蒸餾水。將引物U18和U19的組合(每種100pmol)與0.5μl Taq DNA聚合酶一起加入8μl含2.5mM dNTP的10μl 10×PCR緩衝液中，使最終量為100μl。進行40個循環的PCR反應1)94℃×30秒變性，2)52℃×30秒復性和3)72℃×1分鐘延伸。反應後，將15μl的反應溶液在1％瓊脂糖凝膠上電泳。
將該凝膠用0 5μg/ml溴化乙錠溶液染色15分鐘。在紫外燈下觀察並切出顯示約540bp的特異性擴增片段的條帶。將該凝膠切片用Gene Clean II(Bio101 Co.)處理以收集含DNA的溶液。
用pT7Blue T-Vector藥盒將收集的DNA片段克隆進入質粒pT7Blue(R)。用螢光測序儀對得到的質粒p#5-#6測序。結果顯示該擴增DNA片段由539bp組成，並且不僅編碼兩邊片段化肽#5和#6的胺基酸序列，而且編碼該擴增部分的肽#7。4)通過雜交篩選和克隆文庫將其中克隆了ER cDNA片段的質粒#5-#6用限制性酶BamHI和PstI消化。回收約540bp的DNA片段並將其用做探針。按照手冊用Megaprime DNA標記系統(Amersham Co.)將該回收DNA片段用[α-32P]dCTP標記，並將該反應溶液用於雜交實驗。
將該cDNA文庫的噬菌體用大腸桿菌C600 hfl(Invitrogen Co.)感染，並接種至約15cm直徑平板上的含有10mg/ml MgCl2的L培養基，以形成總共約1×106個噬菌斑。將這些噬菌斑印跡至尼龍膜(Hybond-N；Amersham Co.)。該膜與32P-dCTP標記的ER cDNA片段反應，用放射自顯影檢測到的陽性噬菌體用同樣方法重新篩選，得到約30個具不同信號強度的噬菌體克隆。選擇具有最長的插入DNA片段的克隆λER23。
用LambdaSorb(Promega Co.)從雜交實驗中分離的陽性克隆λER23溶液中純化λ噬菌體的DNA分子。將10微升10xEcoRI酶切緩衝液(限制性酶EcoRI 10U)加入5μg的該DNA溶液，使總量為100μl，將該混合物在37℃反應過夜。將該反應溶液在1％瓊脂糖凝膠上電泳。切出約2.3kb的條帶並用Gene Clean II(Bio101 Co.)處理以收集含DNA的溶液。用限制性酶EcoRI酶切載體pBluescriptII KS-(0.02μg)(Stratagene Co.)。
在這兩種DNA溶液混合後，加入2μl的10x連接酶緩衝液和0.2μl的T4 DNA連接酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD)，使總量為20μl。將該混合物在16℃反應4小時，並將該反應混合物溶液用於轉化大腸桿菌DH5α(Gibco BRL Co.)。用25ml含有50μg/ml氨苄青黴素、40μg/ml IPTG和40μg/ml X-gal的L培養基製備2％瓊脂平板培養基。將該轉化的大腸桿菌接種至該瓊脂平板培養基並在37℃生長過夜。從形成的菌落裡挑選白色的菌落，並在3ml含有50μg/ml氨苄青黴素的L培養基中於37℃培養8小時。用鹼法從這些細菌細胞中回收質粒並用該限制性酶確定它們是否是克隆了所需片段的克隆，由此產生與載體取向相反的質粒pER23-1和pER23-2(5225 bp)。質粒pER23-1和pER23-2的圖譜示於圖2。5)測定ER編碼克隆的核苷酸序列使用螢光測序儀從兩個方向測定質粒pER23-1和pER23-2的DNA核苷酸序列1)使用用適當限制性酶消化的質粒pER23-1和pER23-2，2)使用在有關已測定核苷酸序列的信息的基礎上合成的適當的引物，或3)用限制性酶KpnI和XhoI酶切pER23-1，用限制性酶KpnI和ClaI酶切pER23-2，然後使用千序列缺失藥盒(kilosequence deletionkit)(TAKARA SHUZO CO.，LTD)製備具有間隔約200-300bp的缺失的質粒。該DNA核苷酸序列示於序列表的SEQ ID NO2。結果顯示該DNA片段含有編碼667個胺基酸的2001bp的開放讀框，後者起始於對應於用胺基酸測序儀測開發解讀框架序的N末端序列(片段化肽#1)的核苷酸序列。該胺基酸序列示於序列表的SEQ ID NO1。從得到的DNA核苷酸序列推斷的胺基酸序列與先前測定的大豆ER的胺基酸序列一致。
另外，使用核酸和胺基酸序列資料庫(EntrezNCBI)、用核酸和胺基酸序列分析軟體包(MacVectorKodak Co.)檢索高度同源的胺基酸序列。然而，沒有發現與此已知序列高度同源的胺基酸序列。因此，很清楚，該製備的ER是一新蛋白質。實施例3大豆ER在菸草植株中的表達1)構建植物表達質粒pKV1-ER23如圖3所示，按下述從含有花椰菜花葉病毒35S啟動子的質粒pCaP35J(J.Yamaya等，(1988)Mol.Gen.Genet.211520)製備用於本實施例的植物表達載體pKV1用限制性酶BamHI徹底消化質粒pCaP35J以切除存在於該35S啟動子上遊的多克隆位點。用PvuII部分消化後，用Klenow片段(TAKARA SHUZO CO.，LTD)處理以產生平端。通過連接將得到的質粒DNA環化並導入大腸桿菌DH5α。從得到的克隆中選擇所需質粒。將選擇的質粒用限制性酶PstI消化，以插入存在於該35S啟動子下遊的多克隆位點。用Klenow片段處理以產生平端。將得到的質粒DNA用HindIII消化。用自動核酸合成儀合成下列合成接頭DNA，將其退火併與HindIII消化的質粒連接。將得到的質粒DNA導入大腸桿菌DH5α。從得到的克隆中選擇所需質粒pCaP35Y(2837bp)。5′-GGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA-3′(SEQ ID NO15)5′-CCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGA-3′(SEQ IDNO16)為將藍曙紅合酶終止子導入該pCaP35Y，用SacI和EcoRI消化質粒pBI121(Clontech Co.)，將該SacI-EcoRI片段用Klenow片段處理以產生平端；然後，將得到的pBI121片段與在其35S啟動子下遊的HindIII位點產生平端的質粒pCaP35Y連接。將得到的質粒DNA導入大腸桿菌DH5α。從得到的克隆中選擇所需質粒。為將卡那黴素抗性盒導入該選擇的質粒，將後者用PvuII消化並與pLGVneo1103的片段(約1620bp)(R.Hain等，(1985)Mol.Gen.Genet.199161)連接，該片段通過以下步驟得到在章魚鹼合酶終止子下遊的PvuII位點切割，用Ba131(TAKARA SHUZO CO，LTD)處理以產生缺失，在藍曙紅合酶啟動子上遊EcoRI位點切割，並在這兩端都產生平端。將得到的質粒DNA導入大腸桿菌DH5α。從得到的克隆中選擇所需質粒或植物表達載體pKV1(4828bp)。
將製備的pKV1在獨特的位點用限制性酶BamHI和SalI消化，並連接含有ER基因的片段(即pER23-1的BamHI-SalI片段，約2.3kbp)。將得到的質粒DNA導入大腸桿菌DH5α。從得到的克隆中選擇所需ER表達質粒pKV1-ER23(約7.1kbp)。2)ER在培養菸草細胞中的瞬時表達通過部分修改的Watanabe的方法(Y.Watanabe(1987)FEBS 21965)，用電穿孔將ER基因導入培養菸草細胞，以瞬時表達ER。用鹼法純化質粒pKV1-ER23的DNA分子。通過Hirai等的方法(Plant CellCultivation Manual，Gakkai Shuppan Center，1982)得到培養菸草細胞，以用於ER瞬時表達。菸草種子(變種Bright Yellow，由東京大學的Hirofumi Uchimiya教授提供)用1％次氯酸鈉溶液滅菌，然後發芽。將剛發芽的菸草幼生組織移植至菸草培養瓊脂培養基(MS培養基(FlowLaboratories Co.)，補加了2 ppm 2，4-二氯苯氧乙酸、3％蔗糖和8％瓊脂)，以在三周後誘導愈傷組織。將約1g的愈傷組織塊懸浮於50ml菸草培養培養基(MS培養基(Flow Laboratories Co.)，補加了2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸、3％蔗糖)以製備培養細胞。培養這些菸草細胞直至它們進入對數生長期。離心收集這些培養細胞(600rpm，3分鐘)，並懸浮於一溶液中，該溶液含有1％纖維素酶Onozuka(Yakult Co.)、1％Dricelase(Kyowa Hakko Co.，Ltd)、0.1％Pectriase(Seishin Seiyaku Co.)和0.4 M D-甘露醇(Wako Pure Chemicals Co.，Ltd.)並用HCl調至pH5.7。於30℃反應90分鐘以製備原生質體。於4℃用0.4 MD-甘露醇通過三次離心洗滌該反應溶液以除去酶液。電穿孔的操作包括將1×106細胞懸浮於0.8ml的電穿孔溶液中(70mM KCl、5mM MES和0.3M甘露醇)、將該懸浮液與10μg的pKV1-ER23 DNA分子混合以及用基因脈衝發生器(Biorad Co.)於125μF和300V在一電穿孔池(BioradCo，電極距離0.4cm)中處理該混合物。處理後，用巴斯德吸管收集該溶液並置於冰上30分鐘。在30℃反應5分鐘，並將該反應溶液重懸浮於原生質體培養基(MS培養基(Flow Laboratories Co.)，補加了0.2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸、1％蔗糖和0.4M甘露醇並調至pH 5.7)。將細胞於25℃黑暗靜置過夜並離心(8,000rpm，3分鐘)收集。將60微升的懸浮緩衝液(25mM Tris-HCl pH 7.0、30mM MgCl2、2mM二硫蘇糖醇、2.5mM焦亞硫酸鉀和1mM PMSF)加入細胞中，在渦旋器上攪拌該混合物3分鐘。將得到的樣品儲存於-80℃，直至進行激發劑結合實驗。
對於對照，重複進行上述程序，但是將pKV1的DNA分子而不是pKV1-ER23的DNA分子導入菸草細胞。3)ER在菸草懸浮培養細胞中的穩定表達按下述，從能夠瞬時表達ER的培養菸草細胞選擇能夠恆定保留ER基因的轉化培養菸草細胞將在製備能夠瞬時表達ER的培養菸草細胞中得到的原生質體懸浮於含有1％瓊脂糖的原生質體培養基(MS培養基(Flow LaboratoriesCo.)，補加了0.2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸、1％蔗糖和0.4M甘露醇並調至pH 5.7)。在瓊脂糖固化之前，用滴液吸液管將該懸浮液滴至一平板上，藉此原生質體被固定在珠狀固體培養基中。瓊脂糖固化後，將無瓊脂糖原生質體培養基加至該平板，由此將原生質體固定瓊脂培養基浸入該液體培養基中。原生質體黑暗培養一周後，加入卡那黴素，使最終濃度為100μg/ml並繼續進行培養。將從生長的群落中選擇的轉化子轉移至含有卡那黴素的液體培養基並進行培養。
得到兩個穩定轉化pKV1-ER23的培養菸草細胞克隆(I1和I6)和兩個穩定轉化pKV1的培養菸草細胞克隆(C2-1和C2-4)。4)激發劑結合活性實驗按照下述測定激發劑結合活性按照Jong-Joo Cheong(The Plant Cell(1991)3127)的方法，合成一激發劑和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.)的複合物。用氯胺T給該激發劑-酪胺複合物標記碘。將得到的樣品(蛋白量＜500μg)懸浮於500μl的檢測緩衝液(50mM Tris-HCl pH 7.4、0.1M蔗糖、5mMMgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)並在0℃保溫2小時。將100nM(70 Ci/mmol)碘標記的激發劑-酪胺複合物加入該懸浮液中，將該混合物在4℃保溫2小時。將該反應溶液通過Whatman GF/B(用0.3％聚乙烯亞胺水溶液處理至少1小時)過濾，並用5ml冰冷緩衝液(10mMTris-HCl pH7.0、1M NaCl、10mM MgCl2)洗滌三次。用γ計數器測定濾膜上保留的放射性活性(讀數A)。為消除非特異性結合的影響，同樣進行上述程序，但將17μM的該激發劑加入同一樣品中，將該混合物懸浮於該檢測緩衝液中，將該懸浮液在0℃保溫2小時。將所得的讀數從讀數A中減去，得到激發劑特異性結合的讀數(Δcpm)。將得到的讀數(Δcpm)除以計數的總數，然後乘以試驗中使用的激發劑的總量，以計算激發劑結合蛋白的量(以摩爾計)。
結果，在用pKV1-ER23 DNA分子轉化的菸草細胞中觀察到對激發劑的特異性結合，而在導入pKV1 DNA分子的對照菸草細胞中沒有觀察到對激發劑的特異性結合(表2)。該事實表明，上述得到的基因編碼具有激發劑結合活性的蛋白質。表2.培養菸草細胞的激發劑結合活性部分轉化DNA 結合活性(fmol/mg)瞬時表達 pKV1 ＜0pKV1-ER23 90.5穩定表達C2-1pKV1 ＜0C2-4pKV1 ＜0I1pKV1-ER23 150I6pKV1-ER23 1965)通過加入葡聚糖激發劑在轉化菸草培養細胞中胞內Ca2+濃度的瞬時增加植物通過特異性受體識別該激發劑，然後促進積累植物抗毒素或誘導超敏反應以防止真菌侵犯。已經報導對一些植物而言，在這類抗性反應的早期鈣離子向細胞內的流入是重要的(U.Conrath等，(1991)FEBS LETTERS 279141，M.N.Zook等(1987)Plant Physiol.84520，F.Kurosaki等(1987)Phytochemistry 261919；C.L.Preisig和R.A.Moreau(1994)Phytochemistry 36857)。有報告建議鈣離子流入細胞觸發大豆中植物抗毒素積累的啟動，而本發明人正是用大豆得到ER(M.R.Stab和J.Ebel(1987)Archi.Biochem.Biophys.257416)。因此，如果通過將該ER基因導入無ER菸草培養細胞製備轉化培養菸草細胞以表達ER，丙醛如果通過加入葡聚糖激發劑改變胞內鈣離子濃度，預期這種改變將在除了大豆之外的植物(例如菸草)中觸發由該葡聚糖激發劑引起的抗性反應，由此使得它們對以葡聚糖做為菌絲體壁組分的種類繁多的真菌顯示抗性。
測定了通過加入該激發劑的轉化培養菸草細胞的胞內Ca2+濃度的變化。
在該實驗中，使用通過卡那黴素選擇得到的轉化培養菸草細胞(I6)和含有質粒的培養菸草細胞(C2-4)。
按下述，用Ca2+測量的螢光螯合劑(Fura-2)的乙酸基甲基衍生物(Fura-2 AM)測定培養細胞的胞內Ca2+濃度通過離心(600rpm，30秒)從約2ml該轉化菸草細胞培養物(相當於靜置10分鐘後的約250μl的細胞體積)收穫細胞並除去上清液。向細胞中加入2ml菸草培養的培養基並溫和攪拌該混合物，離心(600rpm，30秒)除去上清液。重複同樣的操作以洗滌該培養細胞。將洗滌過的培養細胞均勻地懸浮於2ml的該培養基中。向1ml該培養細胞在培養基中的懸浮液中加入1ml的該培養基和4μl的1mM Fura-2 AM(最終濃度2μM，Dojin Chemical Co.)，將該混合物黑暗培養30分鐘並偶爾進行攪拌。接著，通過離心(600rpm，30秒)用2ml的該培養基洗滌這些細胞二次，以消除未滲入該細胞的游離Fura-2 AM。將該洗滌的培養細胞均勻地懸浮於2ml的該培養基中，將該懸浮液(2ml)轉移至螢光測定池。在胞內酯酶的水解作用下，滲入的Fura-2 AM應變為Fura-2。在335nm激發光下，於505nm的螢光波長測定Fura-2與胞內Ca2+結合產生的螢光，同時攪拌培養細胞以確保培養細胞不沉澱。通過測定向培養細胞加入50μl葡聚糖激發劑(1mg/ml)或去離子水後特定時間間隔式的螢光強度，檢測胞內Ca2+濃度的變化。對於對照，按照上述同樣方法檢測含有質粒的培養菸草細胞的胞內Ca2+濃度變化。對於另一個對照，按照上述同樣方法檢測培養大豆細胞的胞內Ca2+濃度變化，只是用以下配方的大豆細胞培養基洗滌該培養細胞。NaH2PO4·H2O 75mg/ml、KH2PO4170mg/ml，KNO32,200mg/ml、NH4NO3600mg/ml、(NH4)2SO467mg/ml、MgSO4·7H2O 310mg/ml、CaCl2·2H2O 295mg/ml、FeSO4·7H2O 28mg/ml、EDTA·Na237.3mg/ml、KI 0.75mg/ml、MnSO4·4H2O 10.0mg/ml、H3BO33.0mg/ml、ZnSO4·7H2O 2mg/ml、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/ml、CuSO4·5H2O 0.025mg/ml、CoCl2·6H2O 0.025mg/ml、肌醇100mg/ml、煙酸1.0mg/ml、鹽酸吡哆醇1.0mg/ml、鹽酸硫胺素10.0mg/ml、葡萄糖5g/ml、蔗糖25g/ml、木糖250mg/ml、丙酮酸鈉5.0mg/ml、檸檬酸10.0mg/ml、蘋果酸10.0mg/ml、延胡索酸10.0mg/ml、N-Z-胺500.0mg/ml、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/ml和玉米素(Zeatine)核苷0.1mg/ml，用KOH調至pH5.7。
做為該實驗的結果，加入該激發劑3分鐘後，在培養大豆細胞中觀察到螢光強度約7％的瞬時增加，而在加入去離子水後則未觀察到這種變化(圖4)。該結果提示在該實驗中可以觀察到該ER與該葡聚糖激發劑結合引起Ca2+瞬時流入細胞的現象，由此支持鈣離子在培養大豆細胞中的激發劑引起的抗性反應中起重要作用的報導。在轉化培養菸草細胞中，加入該激發劑3分鐘後，觀察到螢光強度約10％的瞬時增加，而在加入去離子水後則未觀察到這種變化。
在含有質粒的培養菸草細胞中，加入該激發劑後，沒有觀察到任何在這些轉化培養菸草細胞中發生的螢光強度的變化(圖5)。
這些結果表明，通過導入得自大豆的葡聚糖激發劑受體基因以表達ER，除大豆之外的不與該葡聚糖激發劑反應的植物(例如菸草)獲得了該反應性。儘管尚未完全闡明每種植物的該信號傳導途徑，預期通過導入現在的ER基因以表達ER，除菸草之外的植物將獲得與該葡聚糖激發劑的反應性(即胞內Ca2+濃度的瞬時增加)，由此使得可以開發對以葡聚糖做為菌絲體壁組分的種類繁多的真菌具有抗性的植物。實施例4在大腸桿菌中表達大豆ER並測定激發劑結合域1)在大腸桿菌中表達激發劑結合域用蛋白融合和純化系統(New England Biolabs Co.)製備該大豆ER的部分片段與麥芽糖結合蛋白(MBP)的融合蛋白以在大腸桿菌中表達該大豆ER的部分片段。以pER23-1做為模板進行PCR以製備不同長度的DNA片段。設計引物，以通過在編碼圖6所示大豆ER的全長部分和片段的DNA分子外的5』側加入一BamHI位點、在3』側加入一SalI位點，產生克隆入質粒pMAL-c2(New England Biolabs Co.)的該MBP融合蛋白。用自動核酸合成儀(Applied Biosystems Co.的394型)合成這些引物。下列引物用於該DNA鏈的擴增。引物U35 5′-ATGGATCCATGGTTAACATCCAAACC-3′(SEQ ID NO17)；引物U36 5′-ATGGATCCGAATATAACTGGGAGAAG-3′(SEQ ID NO18)；引物U37 5′-ATGGATCCCCAGCATGGGGTAGGAAG-3′(SEQ ID NO19)；引物U38 5′-TAGTCGACTACTTCTCCCAGTTATATTC-3′(SEQ ID NO20)；引物U39 5′-TAGTCGACTACTTCCTACCCCATGCTGG-3′(SEQ ID NO21)；引物U40 5′-TAGTCGACTATTCATCACTTCTGCTATG-3′(SEQ ID NO22)；引物U41 5′-ATGGATCCGCCCCACAAGGTCCCAAA-3′(SEQ ID NO23)；和引物U42 5′-ATGGATCCAATGACTCCAACACCAAG-3′(SEQ ID NO24)將pER23-1的DNA分子(0.01μg)溶於79μl蒸餾水。將或者引物U5和U7的組合或者引物U10和U12的組合(每種100pmol)與0.5μlTaq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)一起加入8μl含2.5mMdNTP的10μl 10×PCR緩衝液中(TAKARA SHUZO CO.，LTD.的TaqDNA聚合酶附帶的)使最終量為100μl。用Gene Amp PCR系統9600(Perkin-Elmer Co.)進行30個循環的PCR反應1)94℃×30秒變性，2)55℃×30秒復性和3)72℃×1分鐘延伸。反應後，15μl的反應溶液用限制性酶BamHI和SalI消化，並在1％瓊脂糖凝膠上電泳。
將該凝膠用0.5μg/ml溴化乙錠溶液染色15分鐘。在紫外燈下觀察並切出顯示預期特異性擴增的條帶。將該凝膠切片用Gene CleanII(Bio101 Co.)處理，以收集含DNA的溶液。將收集的DNA片段克隆入質粒pMAL-c2的BamHI-SalI位點，並將該克隆導入大腸桿菌DH5α。2)從大腸桿菌製備可溶蛋白部分將導入這些質粒的大腸桿菌細胞在表達培養基[10g/l胰蛋白腖(Gibco Co.)、5g/l酵母膏(Gibco Co)、5g/l NaCl、2g/l葡萄糖和100μg/ml氨苄青黴素]上預培養。將預培養溶液(0.4ml)加入40ml該表達培養基中，並於37℃振蕩培養直至OD600達到0.55。將異丙基硫代半乳糖苷加入該培養溶液中，使最終濃度為0.3mM，再繼續進行該振蕩培養4小時以誘導表達。通過離心收集該大腸桿菌，並用洗滌緩衝液(20mM Tris-HCl，pH7.4、200mM NaCl和1mM EDTA)洗滌這些大腸桿菌細胞。對細胞超聲處理共2分鐘(15秒×8)。向超聲處理過的細胞中加入ZW3-12使最終濃度為0.25％，並將該混合物於4℃保溫30分鐘。離心(10,000rpm，5分鐘)收集上清液，以得到大腸桿菌可溶蛋白部分。通過免疫印跡技術，用抗麥芽糖結合蛋白抗體(New EnglandBiolabs Co.)證實該融合蛋白的表達。3)激發劑結合實驗按下述測定激發劑結合活性按照Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)，合成一激發劑和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.)的複合物。用氯胺T給該激發劑-酪胺複合物標記碘。將得到的樣品(蛋白量＜800μg)懸浮於500μl的檢測緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mM MgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)並在0℃保溫2小時。將100nM(70 Ci/mmol)該碘標記的激發劑-酪胺複合物加入該懸浮液中，將該混合物在4℃保溫2小時。將該反應溶液通過Whatman GF/B(用0.3％聚乙烯亞胺水溶液處理至少1小時的)過濾，並用5ml冰冷緩衝液(10mM Tris-HCl pH 7.0、1M NaCl、10mM MgCl2)洗滌三次。用γ計數器測定濾膜上保留的放射性活性(讀數A)。為消除非特異性結合的影響，同樣進行上述程序，但將17μM的該激發劑加入同一樣品中，將該混合物懸浮於該檢測緩衝液中，將該懸浮液在0℃保溫2小時。將所得的讀數從讀數A中減去，得到激發劑特異性結合的讀數(Δcpm)。將得到的讀數(Δcpm)除以計數的總數，然後乘以試驗中使用的激發劑的總量，以計算該激發劑結合蛋白的量(以摩爾計)。
結果，在用編碼該ER的DNA分子轉化的大腸桿菌中觀察到與激發劑的特異性結合(圖6)。因此，證實了該得到的基因編碼具有激發劑結合活性的蛋白質，並且表明在SEQ ID NO1的239-442胺基酸序列中有一激發劑結合域。實施例5用抗激發劑結合域抗體抑制大豆子葉膜部分中葡聚糖激發劑與激發劑結合蛋白的結合以及抑制大豆子葉中植物抗毒素的積累1)在大腸桿菌中表達激發劑結合域用蛋白融合和純化系統(New England Biolabs Co.)製備來自該ER的激發劑結合域與麥芽糖結合蛋白(MBP)的融合蛋白，以在大腸桿菌中大量表達該激發劑結合域。進行PCR以產生編碼該激發劑結合域的DNA分子。用自動核酸合成儀(Applied Biosystems Co.的394型)合成下列引物引物U36 5′-ATGGATCCGAATATAACTGGGAGAAG-3′(SEQ ID NO25)；和引物U39 5′-TAGTCGACTACTTCCTACCCCATGCTGG-3′(SEQ ID NO26)將pER23-1的DNA分子(0.01μg)溶於79μl蒸餾水。將或者引物U5和U7的組合或者引物U10和U12的組合(每種100pmol)與0.5μlTaq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)一起加入8μl含2.5mMdNTP的10μl 10×PCR緩衝液中(TAKARA SHUZO CO.，LTD.的TaqDNA聚合酶附帶的)使最終量為100μl。用Gene Amp PCR系統9600(Perkin-Elmer Co.)進行30個循環的PCR反應1)94℃×30秒變性，2)55℃×30秒復性和3)72℃×1分鐘延伸。反應後，將15μl的反應溶液用限制性酶BamHI和SalI消化，並在1％瓊脂糖凝膠上電泳。
將該凝膠用0.5μg/ml溴化乙錠溶液染色15分鐘。在紫外燈下觀察並切出顯示特異性擴增的條帶。將該凝膠切片用Gene CleanII(Bio101 Co.)處理，以收集含DNA的溶液。將收集的DNA片段克隆入質粒pMAL-c2的BamHI-SalI位點，並將該克隆導入大腸桿菌DH5α。2)在大腸桿菌中表達的該融合蛋白的純化和抗體的製備將用質粒轉化的大腸桿菌細胞在表達培養基(10g/l胰蛋白腖(Gibco Co.)、5g/l酵母膏(Gibco Co.)、5g/l NaCl、2g/l葡萄糖和100μg/ml氨苄青黴素)上預培養過夜。將預培養溶液(150ml)加入1.5L該表達培養基中，並在Sakaguchi燒瓶中於37℃振蕩培養，直至OD600達到0.55。將異丙基硫代半乳糖苷加入該培養溶液中，使最終濃度為0.3mM，再繼續進行該振蕩培養4小時以誘導表達。通過離心收集該大腸桿菌，並用洗滌緩衝液(20mM Tris-HCl，pH7.4、200mM NaCl和1mM EDTA)洗滌大腸桿菌細胞。對細胞超聲處理共2分鐘(15秒×8)。離心得到可溶蛋白部分。用直鏈澱粉樹脂從該部分純化MBP融合蛋白。用因子Xa切割MBP結合域和激發劑結合域，通過凝膠過濾柱層析純化該激發劑結合域。用E.Harlow和D.Lane的方法(Antibody(1988)Cold Spring Harbor Co，第53-137頁)，二次將該純化蛋白注射至小鼠腹腔進行免疫。通過ELISA法證實效價增加後，得到腹水並用50％飽和硫酸銨沉澱和用蛋白A Sepharose(Pharmacia Co.)處理，以產生純化的抗體。在用蛋白A Sepharose處理時，用0.1M磷酸鈉(pH 8.0)將該抗體結合到蛋白A Sepharose上，並用0.1M檸檬酸(pH 3.5)洗脫。已通過免疫印跡證實該得到的抗體僅識別大豆的該ER蛋白。3)製備大豆子葉膜部分按下述製備大豆子葉膜部分向在土壤中培養9天的大豆子葉(溼重36g)中，加入47ml的冰冷緩衝液(25mM Tris-HCl pH 7.0、30mM MgCl2、2mM二硫蘇糖醇、2.5mM焦亞硫酸鉀和1mM PMSF)，用韋林氏攪切器將該混合物勻漿，然後通過離心分級分離形成子葉膜部分的沉澱；該程序與實施例1的第2)節描述的製備大豆根膜部分的程序相同。將該子葉膜部分懸浮於冰冷緩衝液(10mM Tris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mMMgCl2、1mM PMSF、5mM EDTA)並儲存於-80℃。4)葡聚糖激發劑與大豆子葉膜部分激發劑結合蛋白結合的抑制的測定按下述測定激發劑結合活性按照Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)，合成一激發劑和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD.)的複合物。用氯胺T給該激發劑-酪胺複合物標記碘。將大豆子葉膜部分(100μl，820μg)懸浮於500μl的檢測緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.4、0.1M蔗糖、5mMMgCl2、1mM PMSF和5mM EDTA)並在0℃保溫2小時。將714ng(143nM；70Ci/mmol)該碘標記的激發劑-酪胺複合物加入該懸浮液中，將該混合物在4℃保溫2小時。將該反應溶液通過WhatmanGF/B(用0.3％聚乙烯亞胺水溶液處理至少1小時的)過濾，並用5ml冰冷緩衝液(10mM Tris-HCl pH7.0、1M NaCl、10mM MgCl2)洗滌三次。用γ計數器測定濾膜上保留的放射性活性(讀數A)。為消除非特異性結合的影響，同樣進行上述程序，但將100倍摩爾(75μg，15μM)的冷激發劑加入同一樣品中，將該混合物懸浮於該檢測緩衝液中，將該懸浮液在0℃保溫2小時。將所得的讀數從讀數A中減去，得到激發劑特異性結合的讀數(Δcpm)。將加入3.6、7.1、10.8、14.4和28.8μg的該純化抗體而不是該冷激發劑得到的讀數從讀數A中減去。將得到的值與減去該冷激發劑讀數得到的值比較並以百分比表示，以激發劑特異性結合的讀數(Δcpm)做為100％(圖7)。加入28.8μg的該抗體導致該激發劑結合被抑制約51％。這些結果證實了該抗該激發劑結合域抗體抑制了該激發劑與該激發劑結合蛋白的結合。5)由抗激發劑結合域抗體抑制植物抗毒素的積累通過M.G.Hahn等的方法((1992)Molecular Plant Pathology第II卷A Practical Approach，IRL Press，第117-120頁)，用大豆子葉測定由葡聚糖激發劑的作用積累的植物抗毒素的量。
將純化的抗該激發劑結合域抗體(0，1，2，3，4，10和20μg/25μl/子葉)或做為對照的純化的抗來自酵母的dsRNA酶的抗體pacl(4、10和20μg/25μl/子葉)加入大豆子葉並將該混合物培育1小時。將葡聚糖激發劑(200ng/25μl/子葉)加入大豆子葉並將該混合物培育20小時以確定由葡聚糖激發劑的作用引起的植物抗毒素積累是否被該抗體抑制。將加入該抗體後由加入激發劑誘導的植物抗毒素積累的量以百分比表示，以僅加入該激發劑積累的植物抗毒素的量做為100％((圖8)。當以每片子葉加入20.0μl的抗激發劑結合域抗體時，植物抗毒素積累的量降低了53％。在對照中，甚至當以每片子葉加入20.0μg的抗pacl抗體時，植物抗毒素積累量也幾乎沒有變化。這些結果表明該得到的基因不是僅編碼一個激發劑結合蛋白，而是編碼在大豆中誘導抗性反應的該ER。實施例6將ER基因轉移至菸草植株按下述將來自大豆的ER基因轉移至菸草，並證實了該基因的表達。1)構建植物表達載體質粒用BamHI和SalI消化質粒pER23-1以產生位於這二個限制性酶位點之間的ER基因片段。將該片段插入下述的植物載體中。在一獨立的步驟中，用限制性酶BamHI和SacI消化植物表達型雙質粒pBI121(Clonetech)。然後，將用自動核酸合成儀合成的下列接頭DNA被退火和連接至該消化的雙質粒，將其導入大腸桿菌DH5α。從所得的克隆中選擇所需質粒pBIlinker。5′-CTAGAGGATCCGGTACCCCCGGGGTCGACGAGCT-3′(SEQ ID NO27)5′-CGTCGACCCCGGGGGTACCGGATCCT-3′(SEQ ID NO28)將上述基因片段插入所得的質粒pBIlinker中的花椰菜花葉病毒35S啟動子和藍曙紅合酶終止子之間(BamHI-SalI)以產生一導入植物的載體(pBI-ER)。2)將pBI-ER導入農桿菌將根癌農桿菌LBA4404(Clonetech)接種至50ml的YEB培養基(每升含有5g牛肉膏、1g酵母膏、1g腖、5g蔗糖和2mM MgSO4，pH7.4)，並於28℃培養24小時。然後，於4℃和3,000rpm離心20分鐘收集細胞。將細胞用10ml 1mM Hepes-KOH(pH 7.4)洗滌三次，用3ml 10％甘油洗滌一次，最後懸浮於3ml 10％甘油中，以得到將要導入目的DNA的農桿菌。
將50μl由此得到的細菌懸浮液和1μg的質粒pBI-ER置於一池中，用電穿孔裝置向該池施加25μF、2500V和200Ω的電脈衝，以將該質粒DNA導入該農桿菌。將得到的溶液轉移至Eppendorf管，然後加入800μl SOC培養基(每升含有20g胰蛋白腖、5g酵母膏、0.5gNaCl、2.5mM KCl、10mM MgSO4、10mM MgCl2和20mM葡萄糖，pH7.0)。於28℃靜置培養該細菌1.5小時。將50μl得到的培養溶液鋪平板於含100ppm卡那黴素的YEB瓊脂培養基(瓊脂1.2％)，並於28℃培養2天。
從所得的菌落中選出一單菌落，用鹼法從該菌落製備質粒DNA。將該質粒DNA用適當的限制性酶消化，將所得的DNA片段用1％瓊脂糖凝膠電泳分級分離和分析。結果，證實了該質粒DNA含有質粒pBI-ER。將該根癌農桿菌命名為Agro-ER。3)轉化菸草將上述Agro-ER菌株於28℃在含有50ppm卡那黴素的LB液體培養基中振蕩培養2小時。將1.5ml的該培養溶液在10,000rpm離心3分鐘收穫細胞，並用1ml LB培養基洗滌以除去卡那黴素。然後，再次於10,000rpm離心3分鐘收穫細胞，並再懸浮於1.5ml LB培養基以得到用於感染的細菌懸浮液。
在用該細菌感染菸草變種Bright Yellow中，從無菌植株採摘嫩葉。用外科手術刀無菌地將這些葉子切成1cm2大小的片，以葉背面向上置於該農桿菌懸浮液上，溫和振蕩2分鐘。然後，將這些葉片置於無菌濾紙上以除去多餘的農桿菌。將Whatman 1號濾紙(φ7.0cm)置於一培養皿中的MS-B5培養基上(含有1.0ppm苄基腺嘌呤、0.1ppm萘乙酸和0.8％瓊脂)(Murashige，T和Skoog，F.Plant Physiol.，15473，(1962))。以葉背面向上將葉片置於該濾紙上。用PARAFILM(AmericanNational Can)封住該培養皿，然後於25C以16小時光照和8小時黑暗的循環培養這些葉片2天。接著，將這些葉片轉移至含有250ppmclaforan的MS-B5培養基上，並以同樣方式再培養10天以除去該農桿菌。將這些葉片再轉移至含有250ppm claforan和100ppm卡那黴素的MS-B5培養基上，並以同樣方式再培養7天。在此期間，圍繞葉片的區域變為愈傷組織，產生苗原基。再培養10天後，將伸長的苗置於含有250ppm claforan和100ppm卡那黴素的MS-HF培養基(無苄基腺嘌呤和無萘乙酸的MS-B5培養基)上。培養10天後，將生根的那些苗做為卡那黴素抗性轉化子置於植物箱內的含有250ppm claforan的MS-HF培養基上。4)轉化體菸草的基因組DNA的PCR和免疫印跡分析為證實該目的基因已轉移入該轉化體，進行PCR。用自動核酸合成儀(Applied Biosystems；394型)合成下列引物並用於PCR。引物ER1 5′-CACCTTCAGCAACAATGGTT-3′(SEQ ID NO29)引物ER2 5′-CTATTCATCACTTCTGCTAT-3′(SEQ ID NO30)從該卡那黴素抗性轉化體菸草提取DNA並對其測定。按下述提取基因組DNA。簡言之，將20mg的菸草葉在200μl的提取緩衝液(0.5M NaCl、50mM Tris-HCl，pH8、50mM EDTA)中用槊料棒搗碎。然後，加入60μl 20％聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量40kDa)和52μl10％SDS，並於65℃加熱30分鐘。接著，加入40μl 5M乙酸鉀，將得到的混合物置於冰上30分鐘。然後，將該混合物離心以回收上清液；然後加入180μl異丙醇以回收DNA沉澱。用70％乙醇洗滌後，將該DNA溶於150μl TE溶液(10mM Tris-HCl，pH8、1mM EDTA、1μg/ml RNase A)。向79μl蒸餾水中，加入1μl該DNA溶液、10μl10×PCR緩衝液(Taq DNA聚合酶附帶的；Takara Shuzo)、8μl 2.5mM dNTP、引物ER1和ER2各100 pmol以及0.5μl Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)，配成100μl溶液。用該溶液按下述進行PCR。做為反應裝置，使用Gene Amp PCR系統9600(Perkin-Elmer)。首先，於94℃進行變性反應5分鐘。然後，進行30個循環的PCR1)94℃變性30秒，2)55℃復性30秒和3)72℃延伸1分鐘。反應後，將15μl的該反應溶液在1％瓊脂糖凝膠上電泳。將該凝膠用0.5μg/ml溴化乙錠溶液染色15分鐘，並在紫外燈下檢查。通過證實預期擴增的約2 kbp的特定DNA片段，證實了該目的基因已被整合進入該菸草基因組DNA。
亦進行了免疫印跡分析以檢查目的基因的表達。簡言之，將20mg的菸草葉在100μl的冰冷提取緩衝液(0.1M Tris-HCl，pH7.5、1mMPMSF)中用槊料棒搗碎。然後，加入50μl 3x SDS-PAGE樣品緩衝液(30％甘油、3％β-巰基乙醇、3％SDS、0.19 M Tris-HCl，pH 6.8、0.001％BPB)並於100℃加熱5分鐘。將得到的混合物於12,000rpm離心5分鐘以回收上清液。將該提取蛋白的一部分(15μl)進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳並轉移至PVDF膜(Millipore)。在此膜上進行免疫印跡，使用在實施例5製備的抗ER小鼠抗體做為第一抗體，以抗小鼠免疫球蛋白鹼性磷酸酶標記的抗體(Jackson)做為第二抗體，並使用鹼性磷酸酶著色底物(Wako Pure Chemical Industries)以檢測該ER蛋白的表達。有許多植株表達不同量的該ER蛋白。從這些植株中，選擇那些大量表達該ER蛋白的植株並對它們進行超敏反應試驗和真菌抗性試驗。實施例7該菸草轉化體的超敏反應試驗使用在實施例6中證實高表達該ER蛋白的菸草轉化體的葉、以及做為對照的非轉化體菸草植株葉和僅用該載體(pBI121)轉化的那些菸草植株的葉，檢測大豆激發劑對超敏反應的誘導。
將溫室中生長的菸草植株的葉從葉柄處剪下並置於透光的塑料盒中。將一段直徑5mm高5mm的矽膠管置於每片葉的上表面以保持一溶液。使得該段管保持一溶於緩衝液(3mM碳酸氫鈉，4mM乙酸鈉，pH8.0)的化學合成激發劑(β-D-glucohexaoside)、[N.Hong和T.Ogawa(1990)，Tetrahedron Lett.313179；來自東京大學和物理和化學研究所的Ogawa教授]或僅僅該緩衝液以使該溶液與每片葉的表面保持接觸。在過溼的情況下以防止該溶液乾涸、以16小時光照和8小時黑暗的循環於25℃培養這些葉7天。培養後，移去矽膠管，在UV光源(Funakoshi)上檢測菸草植物抗毒素合成的誘導。從非轉化菸草與該化學合成葡聚糖激發劑的組合或從僅用該載體轉化的菸草植株與該葡聚糖激發劑的組合上什麼也未發現。這意味著該菸草不能識別該葡聚糖激發劑。另一方面，從用該ER基因轉化的菸草TF1-11-1-15與該化學合成葡聚糖激發劑的組合上，發現了顯著數量的螢光物質(植物抗毒素)的積累。而且，在對照(即菸草植株與該緩衝液或去離子水的那些組合)中未發現任何變化。
從這些結果證明，如果該ER基因可以在大豆之外的其它宿主植物中表達，則有可能該轉化宿主可以獲得識別非轉化宿主不能識別的葡聚糖激發劑的能力。本發明不僅提供改變該植物對一物質識別的可能性，而且提供一種機制，植物依靠這種機制可以識別諸如在其細胞壁等中有葡聚糖結構的真菌的植物病原體。結果，在該植物中激發了諸如密切涉及抗病性的植物抗毒素的誘導的抗性反應。這種抗性反應的激發對於培育抗病性植物是重要的。實施例8該菸草轉化體的真菌抗性試驗將實施例6中證實高表達該ER蛋白的菸草轉化體自交或與表達葡聚糖酶的菸草植株(日本未審查專利申請No.4-320631)雜交以收穫種子，即後代。1)對芝麻疫黴的抗性將在Hokkaido大學保存的一菌株(在Difco的PDA培養基中繼代培養)轉移至一燕麥片瓊脂並於26℃培養4天。伸展於整合培養基的菌絲體的生長末端用瓶塞鑽孔器打孔以形成菌絲體碟，後者做為接種物使用。按下述製備該試驗用的燕麥片瓊脂培養基。將100克燕麥片粉懸浮於1升水中，於58℃加熱1小時並用紗布過濾。向濾液中加入20g瓊脂並高壓滅菌。然後，將得到的混合物分裝到培養皿中做為培養基使用。
在實施例6描述方法的基礎上，測試從上述種子獲得的幼苗的ER表達。然後，將該真菌接種至那些證實有顯著ER表達的幼苗的傷口處。簡言之，將葉從萌發2月的菸草植株切下並置於一塑料盒中的潤溼的濾紙上。將綁在一起的10根針在這些葉的左右兩側的各一點扎30次，產生同心圓式的刺傷。將少量去離子水加至這些傷口上，然後將該菌絲體碟接種至每個傷口。然後，將這些葉置於25℃ 96小時。本試驗的結果示於圖9和表3。每片測試的菸草葉抗性以抗性指數表示。抗性指數如下。「4」無病症；「3」該葉兩側多達25％的表面出現病症；「2」該葉兩側多達50％的表面出現病症；「1」該葉兩側多達75％的表面出現病症；「0」該葉兩側不少於75％的表面出現病症。表3.對芝麻疫黴的抗性菸草植株 P-1 2 3 4 5 6 7 G-1 4 6 7 8 9 10個體編號抗性指數 0 0 0 0 0 0 01 0 0 1 0 1菸草植株 ER-51 55 56 57 GxER-10 11 16 24 28 34 38個體編號抗性指數 00 1 0 2 4 2 1 1 2 2P用pBI121轉化的菸草(對照)G表達葡聚糖酶的菸草ER表達ER的菸草GxER共表達葡聚糖酶/ER的菸草結果，在對照植株(用pBI121轉化的植株和僅表達葡聚糖酶的植株)觀察到了病痕的形成和擴大，而在大多數共表達葡聚糖酶和ER的轉化體中，病痕的擴大沒有那麼顯著。因此，相信通過轉移該ER基因提高了對真菌的抗性。2)對立枯絲核菌的抗性將Gifu大學保存的菌株(Rhizoctonia solani AG3 M菌株；得自Gifu大學的Hyakumachi教授；在Difco的PDN培養基中繼代培養)接種至高壓滅菌的大麥粒和去離子水的混合物(50∶50按體積計)，於24℃培養10天並乾燥10天。然後，用制咖啡機將大麥粒磨碎並以0.5％(w/w)的比例與土壤(河沙∶蛭石∶泥炭蘚＝2∶2∶1)徹底混合。將受測試的種子播種到該混合物上，通過16小時光照和8小時黑暗的循環於25℃在60-80％溼度下生長。觀察它們的生長，並最終計數每個該測試菸草植株的健康個體的數目(圖10和圖11)。
結果，在對照植株(非轉化菸草)中觀察到病痕的形成和擴大；健康個體數急劇下降；大多數的植株枯萎。另一方面，在表達ER的植株中，幾乎觀察不到病痕或者觀察到病症發展的延遲(圖10)。因此，相信通過轉移ER基因提高了對真菌的抗性。3)使用Phytophthora nicotianae的遊動孢子進行真菌抗性試驗除了實施例8的第1)節描述的針頭接種的真菌抗性試驗之外，通過接種遊動孢子懸浮液進行另一真菌抗性試驗。將Hokkaido大學保存的一真菌菌株(在Difco的PDA培養基中繼代培養)轉移至一燕麥片瓊脂並於25℃黑暗培養一周。按下述製備燕麥片瓊脂培養基，將100克燕麥片粉懸浮於1升水中，於58℃加熱1小時並用紗布過濾；向濾液中加入20g瓊脂並高壓滅菌，將其分裝到培養皿中做為培養基使用。從得到的菌絲體菌區系，用6mm直徑的瓶塞鑽孔器衝出碟。將這些碟以規則的間隔(7碟/培養皿)置於9cm槊料培養皿上。向每個培養皿中加入25ml大豆煎汁培養基(soybean decoction medium)(通過研磨400g新鮮大豆，紗布過濾所得材料，向濾液中加入蒸餾水製成1升溶液，接著高壓滅菌製得)，將這些培養皿於25℃黑暗培養3天。在證實在幾乎所有培養皿上形成菌絲體叢後，廢棄該培養基。用水性Petri溶液(1mM KCl、2mM Ca(NO3)2、1.2mM MgSO4、1mMKH2PO4)洗滌該菌絲體叢三或四次，以儘可能地完全去除培養基組分。最後，用土壤提取物(通過加水至11.5g大田土壤使體積為1升，過濾該混合物並在高壓滅菌器中滅菌製備)洗滌該菌絲體叢一次。把水漱洗掉後，將該菌絲體置於15℃光照幾天，直至其表面有些乾燥。第一次發現該乾燥處理對大量形成該真菌的遊動孢子囊非常重要。將該土壤提取物加入由此形成的遊動孢子囊，並於15℃靜置光照2-3小時。證實形成足夠量的遊動孢子後，收集遊動孢子做為接種物。
將該遊動孢子接種至根據實施例6描述的方法證實顯著表達ER的那些植株中。簡言之，剪下萌發約四個月的菸草植株的葉子並將其置於在塑料盒中的溼潤的濾紙上。將切成約5mm長的矽膠環置於每片葉的左右二側。然後，將100μl的遊動孢子懸浮液(3-5×105遊動孢子/ml)用微量吸管加入該矽膠環內，由此將遊動孢子接種至該菸草葉的表面。然後，每片葉置於25℃ 144小時。本試驗的結果示於圖12和表4中。
每片測試的菸草葉抗性以抗性指數表示。抗性指數如下。「4」無病症；「3.5」病痕局限於接種部位；「3」多達半邊葉的25％出現病症；「2.5」多達半邊葉的37.5％出現病症；「2」多達半邊葉的50％出現病症；「1」多達半邊葉的75％出現病症；「0」半邊葉的75％以上出現病症。表4.對芝麻疫黴遊動孢子的抗性菸草植株 BY-12345678G-123個體編號抗性指數0 0010000 2 00菸草植株 ER-1 2 3 4 5 6 GxER-1 2 3 45個體編號抗性指數41 3 3 2.5 3.5 3.5 2 3 30BY非轉化菸草(對照)G表達葡聚糖酶的菸草ER表達ER的菸草GxER共表達葡聚糖酶/ER的菸草結果，在對照植株(非轉化菸草和僅表達葡聚糖酶的菸草)中觀察到病痕的形成和擴大，而在只表達ER或表達ER和葡聚糖酶的大多數植株中，病痕的擴大被抑制。因此，相信通過轉移ER基因提高了對真菌的抗性。實施例9新菜豆葡聚糖酶的克隆1)製備大豆mRNA將菜豆(Hirasaya Fancy Saitou)種子(Takayama Seed Co.)在蛭石上培養12天，然後按照U.Vogeli等的方法[Planta(1988)174364]用乙烯處理48小時以誘導葡聚糖酶表達。將植株於液氮中冷凍並儲存於-80℃直至使用。按照Ishida等的方法(「Cell Technology LaboratoryManipulation Manual」作者Ishida和Misawa，Kodansha Scientific)，從12g冷凍菜豆粉中得到2.35mg的總RNA。
接著，使用1.0mg的由此得到的總RNA，按照手冊用Oligo(dT)纖維素(Pharmacia)純化，然後得到31.5μg的純化poly(A)+RNA。2)製備菜豆cDNA文庫用Time Saver cDNA合成藥盒(Pharmacia)和隨機六聚引物，由5μg的該poly(A)+RNA合成cDNA。用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)將合成cDNA片段連接至λ噬菌體載體λgt10(Stratagene)。接著，使用DNA混合溶液，用Gigapack(Stratagene)將噬菌體載體包裝形成噬菌體顆粒，由此製備約1×105pfu的菜豆cDNA文庫。3)製備篩選探針基於B.V.Edington等關於克隆菜豆葡聚糖酶cDNA的報導[PlantMolecular Biology(1991)1681]，按下述準備PCR引物有義引物5』-CAAATGTTGTGGTGAGGGATGGCC-3』(SEQ ID NO31)和反義引物5』-AAATGTTTCTCTATCTCAGGACTC-3』(SEQ ID NO32)。按照Ishida的方法(「Gene High Expression Experiment Manual」，Ishida和Ando(Eds.)，Kodansha Scientific)用這些引物進行RT-PCR以產生約300bp的PCR片段。將該片段亞克隆入pBluescriptSKII+(Stratagene)的EcoRV位點。對於cDNA合成，使用1mg的總RNA和0.5mg的隨機六聚引物(Takara Shuzo)。測定了在該亞克隆中的該插入物(0.3 kbp)的DNA序列。結果，發現該DNA序列與B.V.Edington等(見上述)報導的葡聚糖酶cDNA相同。將該質粒DNA用HindIII和EcoRV消化，並用瓊脂糖凝膠電泳分級分離。用Gene Clean II(Bio 101)純化該插入DNA，以產生在上述2)中製備的菜豆cDNA文庫的篩選探針。4)通過雜交篩選和克隆該文庫將得到的做為篩選探針的DNA片段按照手冊用Megaprime DNA標記藥盒(Amersham)用[α-32P]dCTP標記並將該反應溶液用於後續雜交實驗。
將大腸桿菌C600 hfl(Invitrogen Co.)用在上述2)中製備的菜豆cDNA文庫轉染，並接種至在直徑約15cm培養皿上的補加了10mg/mlMgCl2的L培養基，以形成總共約1×105個噬菌斑。將這些噬菌斑印跡至尼龍膜(GeneScreen(+)；NEN DuPont)。該膜與32P-dCTP標記的葡聚糖酶cDNA片段反應，用放射自顯影檢測到的陽性噬菌體再用同樣方法篩選，得到1個噬菌體克隆。
用Lambda Sorb(Promega)從雜交實驗中分離的該陽性克隆中純化λ噬菌體DNA分子。將5μg的該DNA用EcoRI消化並用1％瓊脂糖凝膠電泳分級分離，以切出約1.2kb的條帶。用Gene Clean II(Bio101)處理該條帶，以回收含該DNA的溶液，將其亞克隆至載體pBlueseriptII KS+(Stratagene)的EcoRI位點。圖13展示了質粒pPG1的結構。5)測定編碼菜豆葡聚糖酶的DNA的核苷酸序列通過使用千序列缺失藥盒(Takara Shuzo)製備一系列具有間隔約200-300bp的缺失的質粒，使用螢光測序儀從兩個方向對其中克隆了該葡聚糖酶cDNA的該質粒DNA測序。得到的該DNA核苷酸序列示於SEQ ID NO33。結果發現該DNA片段含有一993 bp的ORF，後者起始於對應於預測為一信號序列的胺基酸序列的核苷酸序列，推測在該ORF中編碼了331個胺基酸殘基。該胺基酸序列示於SEQ IDNO34。
使用BLAST蛋白檢索的結果，發現從該得到的核苷酸序列推斷的胺基酸序列是一全新序列。與B.V.Edington等[Plant MolecularBiology(1991)1681]先前報導的胺基酸序列比較，有49％同源性(不包括象是信號序列的那部分)。此外，它與Y.Takeuchi等[Plant Physiol.(1990)93673]報導的得自大豆的胺基酸序列在全長度上有51％同源性。因為該推斷的胺基酸序列表現出與先前報導的葡聚糖酶的胺基酸序列有高度同源性，預期該得到的DNA序列也變一葡聚糖酶。我們也預期這裡討論的葡聚糖酶與先前報導的菜豆葡聚糖酶不同，它是胞外分泌型，因為該推斷的胺基酸序列在其N末端有一可能的信號序列，而在其C末端缺少一可能的導向液泡的序列。實施例10該菜豆葡聚糖酶的表達1)構建質粒pGST-PG1設計PCR有義引物5』-GGAATTCCGAATCTGTGGGTGTGTGTTAT-3』(SEQ ID NO35)和反義引物M13反序列引物(SEQ ID NO36)，使得該菜豆葡聚糖酶序列[不包括該信號序列，即N末端的Met(1)-Val(21)]可以以框架內方式連接至穀胱甘肽-S-轉移酶表達載體(Pharmacia；pGEX-4T-3)的下遊。用這些引物，用EX-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)在0.1mg的模板質粒pPG1 DNA上進行PCR(退火溫度＝50℃；20個循環)。將擴增的PCR片段用EcoRI消化並用瓊脂糖凝膠電泳分級分離，以產生約1kbp的DNA片段。用Gene CleanII純化該片段，並用JM109感受態細胞(Toyobo)將其亞克隆至pGEX-4T-3表達載體的EcoRI位點(pGST-PG1)。2)在大腸桿菌BL21中表達從上述1)中得到的亞克隆純化該質粒DNA，並將其重新轉移至大腸桿菌BL21感受態細胞(Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press)。該大腸桿菌BL21得自東京大學科學系的MasayukiYamamoto教授。3)純化GST融合葡聚糖酶將上述1)中得到的大腸桿菌的過夜培養物(4ml)轉移至200ml的含有100mg/ml氨苄青黴素的2×YT培養基並於37℃培養1.5小時。向其中加入IPTG(Takara Shuzo)，使其最終濃度為0.1mM，將這些細胞再培養4小時。通過10,000rpm 4℃離心10分鐘從該培養溶液中收穫細胞。按照Gene Expression Experiment Manual(見上述)，用穀胱甘肽Sepharose(Pharmacia)純化約1mg的穀胱甘肽-S-轉移酶/葡聚糖酶融合蛋白(分子量約62kDa)。
4)測定葡聚糖酶活性通過下述程序測定純化的穀胱甘肽-S-轉移酶/葡聚糖酶融合蛋白的葡聚糖酶活性。簡言之，將酶促反應溶液於37℃保溫。分別從反應開始的0、10、20和30分鐘時終止反應，用Nelson的方法[N.Nelson，J.Biol.Chem.(1944)153，375]定量測定釋放的葡萄糖。該酶促反應溶液的組成是0.5ml的50mM乙酸緩衝液(pH5.5)、做為底物的2.5mg昆布多糖和做為酶的0、0.51或5.1μg的穀胱甘肽-S-轉移酶/葡聚糖酶融合蛋白。
結果，葡萄糖以依賴於酶濃度和反應時間的方式從昆布多糖釋放(見圖14)。因此很清楚，該新克隆的cDNA有葡聚糖酶活性。這提示可以利用考慮之中的葡聚糖酶提高植物抗真菌性的可能性，同SEQ IDNO4編碼的來自大豆的葡聚糖酶一樣。工業應用性按照本發明，提供向其中轉移了編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列並表達該葡聚糖酶激發劑受體的植物以及構建這種植物的方法。
本發明的植物對真菌有高抗性。
序列表SEQ ID NO1的信息長度667個胺基酸類型胺基酸拓撲學線性分子類型肽序列描述SEQ ID NO1Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser Thr Val1 5 10 15Leu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser Ser Pro Leu Pro20 25 30 35Thr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr40 45 50Ile His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro55 60 65 70Ser Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr75 80 85 90Ile Ser Ala Pro Gln Gly Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser95 100 105Ser Tyr Ser Asp Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe110 115 120 125Phe Leu Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro130 135 140Leu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp Ser Asn145 150 155 160Thr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu Leu Tyr Ala Thr165 170 175 180Ser Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile Thr Ser Asn Ala Phe Ser185 190 195Gly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val200 205 210 215Leu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu220 225 230Pro Phe Cys Val Glu Tyr Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu235 240 245 250Leu Ala His Pro Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys255 260 265 270Ile Leu Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val275 280 285Gly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile290 295 300 305Lys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp310 315 320Val Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly325 330 335 340Lys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr345 350 355 360Pro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp365 370 375Leu Glu Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly380 385 390 395Ile Ile Thr Gln Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile400 405 410Tyr Asn Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu415 420 425 430Thr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile435 440 445 450Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Arg Leu
455 460 465Arg Cys Phe Asp Pro Tyr Val Leu His Ser Trp Ala Gly Gly Leu Thr Glu Phe470 475 480 485Thr Asp Gly Arg Asn Gln Glu Ser Thr Ser Glu Ala Val Ser Ala Tyr Tyr Ser490 495 500Ala Ala Leu Met Gly Leu Ala Tyr Gly Asp Ala Pro Leu Val Ala Leu Gly Ser505 510 515 520Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ile Glu Gly Thr Lys Met Trp Trp His Val Lys Glu525 530 535 540Gly Gly Thr Leu Tyr Glu Lys Glu Phe Thr Gln Glu Asn Arg Val Met Gly Val545 550 555Leu Trp Ser Asn Lys Arg Asp Thr Gly Leu Trp Phe Ala Pro Ala Glu Trp Lys560 565570 575Glu Cys Arg Leu Gly Ile Gln Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Ser Glu Ala Ile580 585 590Phe Ser Asn Val Asp Phe Val Lys Glu Leu Val Glu Trp Thr Leu Pro Ala Leu595 600 605 610Asp Arg Glu Gly Gly Val Gly Glu Gly Trp Lys Gly Phe Val Tyr Ala Leu Glu615 620 625 630Gly Val Tyr Asp Asn Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ile Arg Asn Leu Lys Gly Phe635 640 645Asp Gly Gly Asn Ser Leu Thr ASn Leu Leu Trp Trp Ile His Ser Arg Ser Asp650 655 660 665Glu667SEQ ID NO2的信息長度2004個鹼基對類型核酸鏈型雙鏈拓撲學線性分子類型cDNA來源生物體大豆(GlycinemaxL.)品系Green Homer序列描述 SEQ ID NO29 18 27 36 45 54GTT AAC ATC CAA ACC AAT ACA TCT TAC ATC TTC CCT CAA ACA CAA TCC ACT GTTVal Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser Thr Val63 72 81 90 99 108CTT CCT GAT CCC TCC AAA TTC TTC TCC TCA AAC CTT CTC TCA AGT CCA CTC CCCLeu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser Ser Pro Leu Pro117 126 135 144 153 162ACA AAC TCT TTC TTC CAA AAC TTT GTC CTA AAA AAT GGT GAC CAA CAA GAA TACThr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr171 180 189 198 207 216ATT CAT CCT TAC CTC ATC AAA TCC TCC AAC TCT TCC CTC TCT CTC TCA TAC CCTIle His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro225 234 243 252 261 270TCT CGC CAA GCC AGT TCA GCT GTC ATA TTC CAA GTC TTC AAT CCT GAT CTT ACCSer Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr279 288 297 306 315 324ATT TCA GCC CCA CAA GGT CCC AAA CAA GGT CCC CCT GGT AAA CAC CTT ATC TCCIle Ser Ala Pro Gln Gly Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser342 351 360 369 378TCC TAC AGT GAT CTC AGT GTC ACC TTG GAT TTC CCT TCT TCC AAT CTG AGC TTCSer Tyr Ser Asp Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe387 396 405 414 423 432TTC CTT GTT AGG GGA AGC CCC TAT TTG ACT GTG TCT GTG ACT CAA CCA ACT CCTPhe Leu Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro441 450 459 468 477 486CTT TCA ATT ACC ACC ATC CAT TCC ATT CTC TCA TTC TCT TCA AAT GAC TCC AACLeu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp Ser Asn495 504 513 522 531 540ACC AAG TAC ACC TTT CAG TTC AAC AAT GGT CAA ACA TGG CTT CTT TAT GCT ACCThr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu Leu Tyr Ala Thr549 558 567 576 585 594TCC CCC ATC AAG TTG AAC CAC ACC CTT TCT GAG ATA ACT TCT AAT GCA TTT TCTSer Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile Thr Ser Asn Ala Phe Ser603 612 621 630 639 648GGC ATA ATC CGG ATA GCT TTG TTG CCG GAT TCG GAT TCG AAA CAC GAG GCT GTTGly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val657 666 675 684 693 702CTT GAC AAG TAT AGT TCT TGT TAC CCC GTG TCA GGT AAA GCT GTG TTC AGA GAALeu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu
711 720 729 738 747 756CCT TTC TGT GTG GAA TAT AAC TGG GAG AAG AAA GAT TCA GGG GAT TTG CTA CTCPro Phe Cys Val Glu Tyr Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu765 774 783 792 801 810TTG GCT CAC CCT CTC CAT GTT CAG CTT CTT CGT AAT GGA GAC AAT GAT GTC AAALeu Aia His Pro Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys819 828 837 846 855 864ATT CTT GAA GAT TTA AAG TAT AAA AGC ATT GAT GGG GAT CTT GTT GGT GTT GTCIle Leu Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val873 882 891 900 909 918GGG GAT TCA TGG GTT TTG AAA ACA GAT CCT TTG TTT GTA ACA TGG CAT TCA ATCGly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile927 936 945 954 963 972AAG GGA ATC AAA GAA GAA TCC CAT GAT GAG ATT GTC TCA GCC CTT TCT AAA GATLys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp981 990 999100810171026GTT GAG AGC CTA GAT TCA TCA TCA ATA ACT ACA ACA GAG TCA TAT TTT TAT GGGVal Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly103510441053106210711080AAG TTG ATT GCA AGG GCT GCA AGG TTG GTA TTG ATT GCT GAG GAG TTG AAC TACLys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr
108910981107111611251134CCT GAT GTG ATT CCA AAG GTT AGG AAT TTT TTG AAA GAA ACC ATT GAG CCA TGGPro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp114311521161117011791188TTG GAG GGA ACT TTT AGT GGG AAT GGA TTC CTA CAT GAT GAA AAA TGG GGT GGCLeu Glu Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly119712061215122412331242ATT ATT ACC CAA AAG GGG TCC ACT GAT GCT GGT GGT GAT TTT GGA TTT GGA ATTIle Ile Thr Gln Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile125112601269127812871296TAC AAT GAT CAC CAC TAT CAT TTG GGG TAC TTC ATT TAT GGA ATT GCG GTG CTCTyr Asn Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu130513141323133213411350ACT AAG CTT GAT CCA GCA TGG GGT AGG AAG TAC AAG CCT CAA GCC TAT TCA ATAThr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile135913681377138613951404GTG CAA GAC TTC TTG AAC TTG GAC ACA AAA TTA AAC TCC AAT TAC ACA CGT TTGVal Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Arg 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Leu Ile Thr Tyr Thr Gly Thr Thr Asp Ala Gln Ser Gly Val20 25 30 35Cys Tyr Gly Arg Leu Gly Asn Asn Leu Pro Thr Pro Gln Glu Val Val Ala Leu40 45 50Tyr Asn Gln Ala Asn Ile Arg Arg Met Arg Ile Tyr Gly Pro Ser Pro Glu Val55 60 65 70Leu Glu Ala Leu Arg Gly Ser Asn Ile Glu Leu Leu Leu Asp Ile Pro Asn Asp75 80 85 90Asn Leu Arg Asn Leu Ala Ser Ser Gln Asp Asn Ala Asn Lys Trp Val Gln Asp95 100 105Asn Ile Lys Asn Tyr Ala Asn Asn Val Arg Phe Arg Tyr Val Ser Val Gly Asn110 115 120 125Glu Val Lys Pro Glu His Ser Phe Ala Gln Phe Leu Val Pro Ala Leu Glu Asn130 135 140Ile Gln Arg Ala Ile Ser Asn Ala Gly Leu Gly Asn Gln Val Lys Val Ser Thr145150 155 160Ala Ile Asp Thr Gly Ala Leu Ala Glu Ser Phe Pro Pro Ser Lys Gly Ser Phe165 170 175 180Lys Ser Asp Tyr Arg Gly Ala Tyr Leu Asp Gly Val Ile Arg Phe Leu Val Asn185 190 195Asn Asn Ala Pro Leu Met Val Asn Val Tyr Ser Tyr Phe Ala Tyr Thr Ala Asn200 205 210 215Pro Lys Asp Ile Ser Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Arg Ser Pro Ser Val Val Val220 225 230Gln Asp Gly Ser Leu Gly Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Ala Ser Val Asp Ala Val235 240 245 250Tyr Ala Ala Leu Glu Lys Ala Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ile Val Val Ser Glu255 260 265 270Ser Gly Trp Pro Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Ala Arg Thr275 280 285Tyr Asn Thr Asn Leu Val Arg Asn Val Lys Gln Gly Thr Pro Lys Arg Pro Gly290 295 300 305Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Val Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys Gln Pro310 315 320Glu Phe Glu Lys Phe Trp Gly Leu Phe Ser Pro Ile Thr Lys Gln Pro Lys Tyr325 330 335 340Ser Ile Asn Phe Asn345 347SEQ ID NO4的信息序列長度1044個鹼基對序列類型核酸序列描述SEQ ID NO49 18 27 36 45 54ATG GCT AAG TAT CAT TCA AGT GGG AAA AGC TCT TCC ATG ACT GCT ATA GCC TTCMet Ala Lys Tyr His Ser Ser Gly Lys Ser Ser Ser Met Thr Ala Ile Ala Phe63 72 81 90 99 108CTG TTT ATC CTT CTA ATC ACT TAT ACA GGC ACA ACA GAT GCA CAA TCC GGG GTALeu Phe Ile Leu Leu Ile Thr Tyr Thr Gly Thr Thr Asp Ala Gln Ser Gly Val117 126 135 144 153 162TGT TAT GGA AGA CTT GGC AAC AAC TTA CCA ACC CCT CAA GAA GTT GTG GCC CTCCys Tyr Gly Arg Leu Gly Asn Asn Leu Pro Thr Pro Gln Glu Val Val Ala Leu171 180 189 198 207 216TAC AAT CAA GCC AAC ATT CGC AGG ATG CGA ATC TAC GGT CCA AGC CCA GAA GTCTyr Asn Gln Ala Asn Ile Arg Arg Met Arg Ile Tyr Gly Pro Ser Pro Glu Val225 234 243 252 261 270CTC GAA GCA CTA AGA GGT TCC AAC ATT GAG CTT TTG CTA GAC ATT CCA AAT GACLeu Glu Ala Leu Arg Gly Ser Asn Ile Glu Leu Leu Leu Asp Ile Pro Asn Asp279 288 297 306 315 324AAC CTC AGA AAC CTA GCA TCT AGC CAA GAC AAT GCA AAC AAA TGG GTG CAA GACAsn Leu Arg Asn Leu Ala Ser Ser Gln Asp Asn Ala Asn Lys Trp Val Gln Asp333 342 351 360 369 378AAC ATC AAA AAC TAT GCC AAC AAT GTC AGA TTC AGA TAC GTT TCA GTG GGA AATAsn Ile Lys Asn Tyr Ala Asn Asn Val Arg Phe Arg Tyr Val Ser Val Gly Asn387 396 405 414 423 432GAA GTG AAA CCC GAA CAC TCA TTT GCA CAA TTT CTA GTG CCT GCA TTG GAA AACGlu Val Lys Pro Glu His Ser Phe Ala Gln Phe Leu Val Pro Ala Leu Glu Asn441 450 459 468 477 486ATT CAG AGG GCC ATT TCT AAT GCT GGC CTT GGA AAC CAA GTA AAA GTT TCC ACTIle Gln Arg Ala Ile Ser Asn Ala Gly Leu Gly Asn Gln Val Lys Val Ser Thr495 504 513 522 531 540GCC ATT GAT ACT GGT GCC TTG GCA GAA TCA TTC CCA CCA TCA AAG GGT TCC TTCAla Ile Asp Thr Gly Ala Leu Ala Glu Ser Phe Pro Pro Ser Lys Gly Ser Phe549 558 567 576 585 594AAA TCT GAT TAT AGA GGA GCA TAT CTT GAT GGT GTC ATC AGA TTT CTA GTG AACLys Ser Asp Tyr Arg Gly Ala Tyr Leu Asp Gly Val Ile Arg Phe Leu Val Asn603 612 621 630 639 648AAT AAT GCC CCA TTA ATG GTT AAT GTG TAC TCT TAC TTC GCT TAC ACT GCA AACAsn Asn Ala Pro Leu Met Val Asn Val Tyr Ser Tyr Phe Ala Tyr Thr Ala Asn657 666 675 684 693 702CCT AAG GAC ATT AGT CTT GAC TAT GCA CTT TTT AGG TCT CCT TCG GTG GTA GTGPro Lys Asp Ile Ser Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Arg Ser Pro Ser Val Val Val711 720 729 738 747 756CAA GAT GGT TCA CTT GGT TAC CGT AAC CTC TTT GAT GCT TCG GTT GAT GCT GTTGln Asp Gly Ser Leu Gly Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Ala Ser Val Asp Ala Val765 774 783 792 801 810TAT GCT GCA TTG GAG AAA GCA GGA GGA GGG TCA TTG AAC ATA GTT GTG TCT GAGTyr Ala Ala Leu Glu Lys Ala Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ile Val Val Ser Glu819 828 837 846 855 864AGT GGA TGG CCT TCT TCT GGT GGA ACT GCA ACT TCA CTT GAT AAT GCA AGA ACTSer Gly Trp Pro Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Ala Arg Thr873 882 891 900 909 918TAC AAC ACA AAC TTG GTT CGG AAT GTG AAG CAA GGA ACC CCT AAA AGG CCT GGTTyr Asn Thr Asn Leu Val Arg Asn Val Lys Gln Gly Thr Pro Lys Arg Pro Gly927 936 945 954 963 972GCA CCC CTT GAA ACT TAT GTG TTT GCC ATG TTT GAT GAA AAT CAG AAG CAG CCAAla Pro Leu Glu Thr Tyr Val Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys Gln Pro981 990 999100810171026GAG TTT GAA AAA TTT TGG GGG CTC TTT TCT CCT ATA ACT AAG CAG CCC AAA TACGlu Phe Glu Lys Phe Trp Gly Leu Phe Ser Pro Ile Thr Lys Gln Pro Lys Tyr10351044TCG ATT AAT TTC AAT TAASer Ile Asn Phe AsnSEQ ID NO5的信息序列長度13個胺基酸序列類型胺基酸拓撲學線性分子序列類型肽序列描述SEQ ID NO5Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Asn Ile Ser Pro Gln1 5 10 13SEQ ID NO6的信息序列長度14個胺基酸序列類型胺基酸拓撲學線性分子序列類型肽序列描述SEQ ID NO6Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Ser1 510 14SEQ ID NO7的信息序列長度17個胺基酸序列類型胺基酸拓撲學線性分子序列類型肽序列描述SEQ ID NO7Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp1 510 15 17SEQ ID NO8的信息序列長度13個胺基酸序列類型胺基酸拓撲學線性分子序列類型肽序列描述SEQ ID NO8Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile Lys1 510 13SEQ ID NO9的信息序列長度17個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO9AARAGYATHG AYGGNGA 17SEQ ID NO10的信息序列長度13個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO10WRTCNCCNAC NAC 13SEQ ID NO11的信息序列長度17個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO11GTNAAYAARA TNCARAC 17SEQ ID NO12的信息序列長度17個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO12ARRTTNAGRA ARTCYTC 17SEQ ID NO13的信息序列長度24個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO13AAGTAYAAGC CRCAAGCCTA TTCA 24SEQ ID NO14的信息序列長度17個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO14ATCGCCRACA ACMCCAA 17SEQ ID NO15的信息序列長度54個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO15GGAATTCGAG CTCGGTACCC GGGGGATCCT CTAGAGTCGA CCTGCAGGCA TGCASEQ ID NO16的信息序列長度58個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO16CCTTAAGCTC GAGCCATGGG CCCCCTAGGA GATCTCAGCT GGACGTCCGT ACGTTCGASEQ ID NO17的信息序列長度26個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO17ATGGATCCAT GGTTAACATC CAAACC 26SEQ ID NO18的信息序列長度26個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO18ATGGATCCGA ATATAACTGG GAGAAG 26SEQ ID NO19的信息序列長度26個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO19ATGGATCCCC AGCATGGGGT AGGAAG 26SEQ ID NO20的信息序列長度28個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO20TAGTCGACTA CTTCTCCCAG TTATATTC28SEQ ID NO21的信息序列長度28個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO21TAGTCGACTA CTTCCTACCC CATGCTGG 28SEQ ID NO22的信息序列長度28個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO22TAGTCGACTA TTCATCACTT CTGCTATG 28SEQ ID NO23的信息序列長度26個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO23ATGGATCCGC CCCACAAGGT CCCAAA 26SEQ ID NO24的信息序列長度26個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO24ATGGATCCAA TGACTCCAAC ACCAAG 26SEQ ID NO25的信息序列長度26個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO25ATGGATCCGA ATATAACTGG GAGAAG 26SEQ ID NO26的信息序列長度28個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO26TAGTCGACTA CTTCCTACCC CATGCTGG28SEQ ID NO27的信息序列長度34個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO27CTAGAGGATC CGGTACCCCC GGGGTCGACG AGCT 34SEQ ID NO28的信息序列長度26個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO28CGTCGACCCC GGGGGTACCG GATCCT 26SEQ ID NO29的信息序列長度20個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO29CACCTTCAGC AACAATGGTT 20SEQ ID NO30的信息序列長度20個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO30CTATTCATCA CTTCTGCTAT 20SEQ ID NO31的信息序列長度24個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO31CAAATGTTGT GGTGAGGGAT GGCC 24SEQ ID NO32的信息序列長度24個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO32AAATGTTTCT CTATCTCAGG ACTC 24SEQ ID NO33的信息序列長度996個鹼基對序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲學線性分子序列類型cDNA來源生物體菜豆(PhaseolusvulgarisL.)品系Hirasaya Fancy Saitou序列描述SEQ ID NO339 18 27 36 45 54ATG TCT GCC TTA TTG CTG CTT CTT GGA GTA TTA TCT TCC ACT GGA GTA CTG CTTMet Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ser Ser Thr Gly Val Leu Leu63 72 81 90 99 108ACT GGG GTA GAA TCT GTG GGT GTG TGT TAT GGA GGA AAT GGA AAC AAT CTA CCAThr Gly Val Glu Ser Val Gly Val Cys Tyr Gly Gly Asn Gly Asn Asn Leu Pro117 126 135 144 153 162ACA AAG CAA GCA GTG GTG AAT CTC TAC AAA TCA AAC GGA ATT GGC AAA ATC CGTThr Lys Gln Ala Val Val Asn Leu Tyr Lys Ser Asn Gly Ile Gly Lys Ile Arg171 180 189 198 207 216TTA TAC TAT CCA GAT GAA GGT GCC CTT CAA GCC CTC AGA GGT TCA AAC ATA GAALeu Tyr Tyr Pro Asp Glu Gly Ala Leu Gln Ala Leu Arg Gly Ser Asn Ile Glu225 234 243 252 261 270GTG ATA CTT GCT GTT CCT AAT GAT CAA CTT CAA TCT GTC TCC AAC AAT GGA AGTVal Ile Leu Ala Val Pro Asn Asp Gln Leu Gln Ser Val Ser Asn Asn Gly Ser279 288 297 306 315 324GCA ACA AAT TGG GTC AAC AAT TAC GTG AAA CCC TAT GCA GGA AAC GTG AAA TTGAla Thr Asn Trp Val Asn Asn Tyr Val Lys Pro Tyr Ala Gly Asn Val Lys Leu333 342 351 360 369 378AAG TAC ATT GCA GTT GGC AAC GAA GTT CAC CCT GGT GAT GCT CTA GCA GGC TCALys Tyr Ile Ala Val Gly Asn Glu Val His Pro Gly Asp Ala Leu Ala Gly Ser387 396 405 414 423 432GTT CTT CCA GCA CTT CAA AGC ATT CAG AAC GCA ATT TCT GCA GCA AAT TTG CAAVal Leu Pro Ala Leu Gln Ser Ile Gln Asn Ala Ile Ser Ala Ala Asn Leu Gln441 450 459 468 477 486CGC CAA ATC AAA GTC TCC ACA GCA ATA GAC ACC ACT CTA CTG GGC AAC TCT TACArg Gln Ile Lys Val Ser Thr Ala Ile Asp Thr Thr Leu Leu Gly Asn Ser Tyr495 504 513 522 531 540CCA CCA AAA GAT GGC GTT TTC AGC AAC AGT GCA AGT TCA TAC ATA ACT CCA ATCPro Pro Lys Asp Gly Val Phe Ser Asn Ser Ala Ser Ser Tyr Ile Thr Pro Ile549 558 567 576 585 594ATA AAC TTT TTA GCC AAA AAC GGT GCC CCA CTT CTT GCA AAC GTG TAC CCT TACIle Asn Phe Leu Ala Lys Asn Gly Ala Pro Leu Leu Ala Asn Val Tyr Pro Tyr603 612 621 630 639 648TTC GCC TAC GTT AAC AAT CAA CAA AAC ATT GGT CTT GAT TAT GCC TTG TTT ACCPhe Ala Tyr Val Asn Asn Gln Gln Asn Ile Gly Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Thr657 666 675 684 693 702AAA CAA GGC AAC AAC GAA GTT GGG TAC CAA AAC CTG TTT GAT GCA TTG GTG GATLys Gln Gly Asn Asn Glu Val Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Leu Val Asp711 720 729 738 747 756TCT CTG TAC GCA GCT CTT GAG AAA GTG GGA GCA TCA AAT GTG AAG GTT GTT GTGSer Leu Tyr Ala Ala Leu Glu Lys Val Gly Ala Ser Asn Val Lys Val Val Val765 774 783 792 801 810TCT GAG AGT GGG TGG CCA TCA CAA GGT GGA GTT GGA GCC ACT GTT CAA AAC GCASer Glu Ser Gly Trp Pro Ser Gln Gly Gly Val Gly Ala Thr Val Gln Asn Ala
819 828 837 846 855 864GGA ACG TAT TAC AGG AAT TTG ATC AAA CAT GTT AAG GGT GGC ACC CCA AAG AGGGly Thr Tyr Tyr Arg Asn Leu Ile Lys His Val Lys Gly Gly Thr Pro Lys Arg873 882 891 900 909 918CCT AAT GGA CCC ATA GAG ACT TAC CTC TTT GCC ATG TTT GAT GAA AAC CAG AAGPro Asn Gly Pro Ile Glu Thr Tyr Leu Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys927 936 945 954 963 972GGT GGT GCA GAA ACT GAG AAA CAC TTT GGT CTC TTC AGG CCT GAT AAA TCA CCAGly Gly Ala Glu Thr Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Arg Pro Asp Lys Ser Pro981 990 996AAA TAC CAA CTC AGT TTC AAT TGALys Tyr Gln Leu Ser Phe Asn***SEQ ID NO34的信息序列長度331個胺基酸序列類型胺基酸拓撲學線性分子序列類型肽序列描述SEQ ID NO34Met Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ser Ser Thr Gly Val Leu Leu1 510 15Thr Gly Val Glu Ser Val Gly Val Cys Tyr Gly Gly Asn Gly Asn Asn Leu Pro20 25 30 35Thr Lys Gln Ala Val Val Asn Leu Tyr Lys Ser Asn Gly Ile Gly Lys Ile Arg40 45 50Leu Tyr Tyr Pro Asp Glu Gly Ala Leu Gln Ala Leu Arg Gly Ser Asn Ile Glu55 60 65 70Val Ile Leu Ala Val Pro Asn Asp Gln Leu Gln Ser Val Ser Asn Asn Gly Ser
75 80 85 90Ala Thr Asn Trp Val Asn Asn Tyr Val Lys Pro Tyr Ala Gly Asn Val Lys Leu95 100 105Lys Tyr Ile Ala Val Gly Asn Glu Val His Pro Gly Asp Ala Leu Ala Gly Ser110 115 120 125Val Leu Pro Ala Leu Gln Ser Ile Gln Asn Ala Ile Ser Ala Ala Asn Leu Gln130 135 140Arg Gln Ile Lys Val Ser Thr Ala Ile Asp Thr Thr Leu Leu Gly Asn Ser Tyr145 150 155 160Pro Pro Lys Asp Gly Val Phe Ser Asn Ser Ala Ser Ser Tyr Ile Thr Pro Ile165 170 175 180Ile Asn Phe Leu Ala Lys Asn Gly Ala Pro Leu Leu Ala Asn Val Tyr Pro Tyr185 190 195Phe Ala Tyr Val Asn Asn Gln Gln Asn Ile Gly Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Thr200 205 210 215Lys Gln Gly Asn Asn Glu Val Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Leu Val Asp220 225 230Ser Leu Tyr Ala Ala Leu Glu Lys Val Gly Ala Ser Asn Val Lys Val Val Val235 240 245 250Ser Glu Ser Gly Trp Pro Ser Gln Gly Gly Val Gly Ala Thr Val Gln Asn Ala255 260 265 270Gly Thr Tyr Tyr Arg Asn Leu Ile Lys His Val Lys Gly Gly Thr Pro Lys Arg275 280 285Pro Asn Gly Pro Ile Glu Thr Tyr Leu Phe Ala Met Phe Asp Glu Asn Gln Lys290 295 300 305Gly Gly Ala Glu Thr Glu Lys His Phe Gly Leu Phe Arg Pro Asp Lys Ser Pro310 315 320Lys Tyr Gln Leu Ser Phe Asn***325 330SEQ ID NO35的信息序列長度29個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO35GGAATTCCGA ATCTGTGGGT GTGTGTTAT 29SEQ ID NO36的信息序列長度25個鹼基對序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學線性分子序列類型其它核酸，合成DNA序列描述SEQ ID NO36GGAAACAGCT ATGACCATGA TTAGC 2權利要求
1.構建抗致病性真菌的植物的方法，包括將編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列整合入植物染色體並在該植物中表達該葡聚糖激發劑受體。
2.權利要求1的方法，其中該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列包含大致示於SEQ ID NO1中的胺基酸序列的編碼核苷酸序列。
3.權利要求1的方法，其中該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列包含大致示於SEQ ID NO2中的核苷酸序列。
4.權利要求1的方法，其中該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列包含導入質粒pER23-1的核苷酸序列。
5.權利要求1的方法，另外包含將編碼葡聚糖酶的DNA序列整合入植物染色體並在該植物中表達該葡聚糖酶。
6.權利要求5的方法，其中該編碼葡聚糖酶的DNA序列包含大致示於SEQ ID NO3或34中的胺基酸序列的編碼核苷酸序列。
7.權利要求5的方法，其中該編碼葡聚糖酶的DNA序列包含大致示於SEQ ID NO4或33中的核苷酸序列。
8.權利要求1的方法，其中將該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列轉移至農桿菌中，然後使該農桿菌感染植物，由此將所述葡聚糖激發劑受體編碼DNA序列整合入該植物的染色體。
9.權利要求1的方法，其中將該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列轉移到選自葉、莖、根、塊莖、原生質體、愈傷組織、種子胚、苗原基和花粉的植物材料中。
10.權利要求9的方法，其中將該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列轉移到選自葉、莖、根、塊莖、原生質體、愈傷組織、種子胚、苗原基和花粉的植物材料中，然後由所述植物材料再生植株。
11.權利要求1的方法，其中該致病性真菌在其細胞壁組分中含有葡聚糖。
12.權利要求1的方法，其中該致病性真菌屬於疫黴屬或絲核菌屬。
13.權利要求1的方法，其中該植物易受在細胞壁組分中含有葡聚糖的致病性真菌的感染。
14.權利要求1的方法，其中該植物是茄科植物或豆科植物。
15.對致病性真菌有抗性的植物或所述植物的子代，所述植物具有轉移入的編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列並表達該葡聚糖激發劑受體。
16權利要求15的植物或其子代，其中該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列包含大致示於SEQ ID NO1中的胺基酸序列的編碼核苷酸序列。
17.權利要求15的植物或其子代，其中該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列包含大致示於SEQ ID NO2中的核苷酸序列。
18.權利要求15的植物或其子代，其中該編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列包含導入質粒pER23-1的核苷酸序列。
19.權利要求15的植物或其子代，其中該植物還具有轉移入的編碼葡聚糖酶的DNA序列並表達該葡聚糖酶。
20.權利要求19的植物或其子代，其中該編碼葡聚糖酶的DNA序列包含大致示於SEQ ID NO3或34中的胺基酸序列的編碼核苷酸序列。
21.權利要求19的植物或其子代，其中該編碼葡聚糖酶的DNA序列包含大致示於SEQ ID NO4或33中的核苷酸序列。
22.權利要求15的植物或其子代，其中該致病性真菌在其細胞壁組分中含有葡聚糖。
23.權利要求15的植物或其子代，其中該致病性真菌屬於疫黴屬或絲核菌屬。
24.權利要求15的植物或其子代，其中該植物易受在細胞壁組分中含有葡聚糖的致病性真菌的感染。
25.權利要求15的植物或其子代，其中該植物是茄科植物或豆科植物。
26.編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列的用途，其目的是賦予植物抗致病性真菌性，或其目的是增強植物對致病性真菌的抗性。
27.編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列的用途，其目的是構建抗致病性真菌的植物。
全文摘要
通過將編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列整合入植物染色體以實現表達產生抗致病性黴菌的植物的方法;抗致病性黴菌的植物,該植物有導入的編碼葡聚糖激發劑受體的DNA序列並在該植物中表達;以及它們的用途。
文檔編號C12N15/82GK1209038SQ96199945
公開日1999年2月24日 申請日期1996年12月13日 優先權日1995年12月15日
發明者柿谷誠, 梅基直行, 石田功, 山岡直人 申請人:麒麟麥酒株式會社