抗原組合物的製作方法
2023-12-01 08:54:46 2
專利名稱：抗原組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的適於胃腸道外和黏膜給藥的抗原組合物，它包含在水性介質中的抗原和糖類，其中的糖類呈現其具有酸性部分的衍生物形式，優選以羧酸衍生物的形式存在。抗原組合物呈現穩定的固體形式，在加入液體賦形劑和佐劑進行重建後，經過胃腸道外和黏膜給藥，可在體液中快速溶解，從而釋放重建的疫苗進入人體。特別地，凍幹製劑由含有抗原的粉末或餅狀物組成，優選呈現無定形物狀態(玻璃狀)，通過乾燥或升化，優選通過冷凍乾燥來升化液體溶液或懸浮液而得到這種製劑。
當前，在製藥領域中，人們對能確保加工和貯藏時期蛋白質穩定性的製劑很關注。含水液體製劑是在製造過程中最容易也是最經濟和易於操作的，也很方便的適於最終用戶使用。可是，在液體製劑中發生化學或物理降解是普遍發生的現象，導致蛋白質的破壞，例如化學變性和降解，而這經常是不可逆的。
這些問題可以通過穩定的蛋白質混合物的乾燥固體，尤其是(但不是唯一的)穩定的凍幹蛋白質混合物來克服。穩定的凍幹製劑及其在製備過程中已經出現的問題已有所描述(Carpenter，J.1997，Pharmaceutical Res.14，969-975)。這種製劑必須是能保證蛋白質的穩定性、所屬產品的構型、產品強度(特別是對於胃腸道外給藥)，和呈現優美的餅狀物結構。相似的考慮也適於其他固體製劑，例如真空乾燥的或噴霧乾燥的粉末。必須重視幾個必要條件，其中重要的一個是保證等滲性，這對於用於胃腸道外給藥是關鍵的，特別是蛋白質質量較低時，以疫苗製劑為例，每瓶包含大約50μg的蛋白質，總量大約15mg。鹽特別是NaCl，用於調節混合物的等滲性，但是因為其降低了溶液的凝固點，使製劑變得很難凝固(由於很低的凝固點)，同時增加升華時去除水分的時間。多元醇和糖類，例如甘露醇或乳糖已被成功地用於獲得等滲性混合物的餅狀物(M.C.Lai和E.M.Topp，J.of Pharm.Sci.，1999，88，489-500)。
當混合物含有高濃度的鹽時，在凍幹過程中出現了一個重要問題，例如在高濃度鹽溶液中純化蛋白質時。另外，在一些情況下，蛋白質也需要高鹽濃度以保持在溶液中和/或避免出現聚結和沉澱現象。當鹽是NaCl時更容易出現這些問題，這是因為溶液中的NaCl使共晶熔點降低和使製劑難於完全凍幹。
一些方案被推薦使用，但不是都很滿意。糖類濃度的增加與以下幾方面相關，i)滲透壓增加，ii)與胃腸道外給藥的不相容性，和iii)自身重建的問題，例如當重建液體自身已是等滲的時。其他可選擇的，向製劑中加入少量的甘露醇使結晶變得容易，使製劑成堅固的結晶網狀的餅狀物(Kim，A.等J.Pharmaceutical Sc.1998，87，931-935)。不能適用於很高濃度的鹽溶液中，例如高於15mM到大約30mM的NaCl。向製劑中加入高分子量的非生物降解性聚合物質(如Taylor，L.和Zographi，G.，在J.Pharmaceutical Sc.1998，87，1615-1621中所描述的)，要考慮到與藥物組合物的不相容性或疫苗的安全性問題。
本發明為這些製劑提供了一種選擇，它沒有上面所說的缺點。本發明在於發現了可在高鹽濃度下貯存的具有穩定固體形式的抗原組合物，而高濃度的鹽通常會妨礙具有可接受結構的乾燥粉末或凍幹餅狀物的形成。具體而言，本發明在於發現了可與含有高濃度NaCl(尤其高於30mM)的抗體組合物的乾燥或凍乾物相配伍的適宜賦形劑(即填充劑)。儘管本發明所用的賦形劑或填充劑帶有離子電荷，但仍是有利的，在高濃度的鹽存在下，它們有助於增強填充劑分子之間的分子間作用，從而形成餅狀製劑並長時間保持穩定。
本發明更進一步地提供了固體形式的抗原組合物，例如凍幹的、噴霧乾燥的或噴霧冷凍乾燥的或真空乾燥形式和重建的液體形式。依照本發明，更進一步地提供了製備本發明的組合物的工藝包括混合組合物的成分，和冷凍這些成分和乾燥冷凍後的混合物，或將混合物噴霧(例如在熱空氣中)，或將混合物真空乾燥，或噴霧冷凍乾燥。
在一個實施方案中，本發明的固體製劑是凍幹的多孔形式，稱為「餅狀物」，或其磨碎形式，該製劑在處理和貯存過程中是穩定的，與胃腸道外給藥相容並只有很少的殘留水分。本發明的疫苗餅狀物是通過升華疫苗的水溶液或懸浮液而形成的，在本發明的優選方式中升華是通過冷凍乾燥進行的。
在另一個實施方案中，本發明的固體製劑是乾燥的粉末，特別是噴霧乾燥或噴霧冷凍乾燥或真空乾燥的粉末，其中含有較低的殘留水分。
相應地，本發明的一個目的是提供新的適合冷凍乾燥、噴霧乾燥或真空乾燥的抗原組合物，其中含有在水性介質中的抗原、糖類或其具有酸性部分(moiety)的衍生物和任選的防腐劑。在一個優選的實方案中，水溶性抗原介質包含濃度至少為15mM，優選至少30mM的NaCl。代表性的水溶性抗原溶液或懸浮液將是經緩衝的，或pH值被調節到與胃腸道外或黏膜給藥相一致的pH。優選的固體製劑包括至少一種抗原，其含量按重量計為約0.00001％到約5％。更優選抗原的量按重量計為約0.001％到約1％。還更優選抗原的量按重量計為約0.01％到約0.05％。典型地，溶液中NaCl的濃度範圍為約15mM到約150mM。優選NaCl的濃度至少為20mM，更優選至少為約30mM。填充材料(bulking material)按重量計為約50％到約99.99999％，優選為從60％到約90％。
本發明的填充劑在高濃度的NaCl存在下可保持餅狀物的化學和物理的穩定性，防止餅狀物萎縮。也提供對於抗原的保護。填充劑是糖類或它們的衍生物，優選為無定形或結晶態，更優選無定形。依照本發明，優選的糖類是糖類或其具有很高分子間相互作用力的衍生物(糖類的熔點越高，晶體的分子間相互作用力越大)，從而可以獲得固體形式，特別是餅狀物結構，來對抗在冷凍乾燥過程中出現的坍塌現象。優選使用高分子量的糖類。
糖類衍生物優選具有反應性官能團，例如氨基部分或酸性部分。因此，本發明優選使用具有酸性部分，也就是作為質子供體的部分的糖類衍生物。酸性部分可以是單酸或多酸。可以提到的特別的酸性部分包括-O-P(O)(OH)2(磷酸酯)、-O-P(O)-O-P(O)(OH)2(二磷酸酯)、-O-P(O)-O-P(O)-O-P(O)(OH)2(三磷酸酯)、-SO4H(硫酸酯)和-CO2H(羧酸)。優選的酸性部分是羧酸。糖類衍生物可任選與糖類例如蔗糖聯合使用。
糖類或糖類衍生物可任選地是一水化合物或多水化合物(二水化合物、三水化合物等)。在一個更優選的實施方案中，所用的糖類是其羧酸衍生物的形式。優選地，是以其羧酸鹽的衍生物的形式來使用。因此，本發明的一方面提供了適於冷凍乾燥、噴霧乾燥、噴霧冷凍乾燥或真空乾燥的抗原組合物，其中包括在水性介質中的抗原、糖類和任選的防腐劑，其中糖類是以其羧酸衍生物形式存在。
更優選所使用的糖類衍生物是其鹽形式，優選鈣或鈉鹽，更優選為鈉鹽。
適於本發明的糖類的非限制性例子包括下面物質的羧酸衍生物蔗糖，麥芽糖，海藻糖，棉子糖，乳糖，果糖，半乳糖，甘露糖，麥芽酮糖，異麥芽酮糖，半乳糖果糖，或右旋糖。優選的填充劑是乳糖醇，山梨糖醇，葡萄糖，半乳糖和半乳糖醇即乳糖酸，葡糖酸，葡糖醛酸，半乳糖醛酸，和半乳糖二酸的羧酸衍生物。可以是它們的無水或水合形式(見表1)。甚至更優選的，可優選使用乳糖酸(如
圖1所示)、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸，更優選地，是有利於形成糖-糖分子間相互作用的鹽形式。鈉或鈣鹽是優選的。最優選的填充劑是乳糖醛酸鈉。典型地，所使用的糖類衍生物的濃度大約為80mM或更高(冷凍乾燥之前的液體混合物)。這樣就可提供可接受的餅狀物結構並使其長期保持穩定。
表1.糖類及其羧酸及鹽類衍生物表1顯示，與相應的非離子型分子相比，在離子型分子的晶狀固體晶疇中，分子和分子間的相互作用力較高(由很高的熔點來證明)。
任何可接受的餅狀物結構是指符合任何，優選符合所有的下列標準-餅狀物的體積與冷凍乾燥步驟前的初始液體體積相似；-餅狀物的大小(size)與冷凍乾燥之前的液體相似。換句話說，與冷凍乾燥之前最初的液體相比餅狀物僅出現儘可能少量的收縮。
-餅狀物的外觀呈均質性(homogeous)。
餅狀物的尺寸和體積的測量依照下面實施例部分第3.2段所描述的方法進行。
此外，可接受的餅狀物結構也可理解為經過一星期37℃的加速穩定試驗後其形狀、尺寸和顏色沒有變化的團塊，或者經過至少六個月的實時穩定性試驗(優選至少一年，理想的是至少兩年)其形狀、尺寸和顏色無任何變化的團塊。
防腐劑選自抗氧化劑、自由基清除劑和還原劑。優選為抗氧化劑，例如沒食子酸烷基酯，丁基化的羥基茴香醚，丁基化的羥基甲苯，去甲二氫愈創木酸和生育酚，抗壞血酸，異抗壞血酸，亞硫酸的鉀和鈉鹽，甲醛合次硫酸鈉，檸檬酸，乙二胺四乙酸和它的鹽，卵磷脂，酒石酸，硫二丙酸。
可以使用製藥領域中任何普通的冷凍乾燥、真空乾燥或噴霧乾燥、噴霧冷凍乾燥技術來製備本發明的抗原組合物。例如，冷凍乾燥技術和其他合適的賦形劑的詳細資料，可參見Cameron等，″Good Pharmaceutical freeza-dryingPractice″，Interpharm，Buffalo Grove(1997)。相應地，本發明另一方面提供在此所定義的抗原組合物的製備方法，包括混合含有NaCl抗原的溶液、填充劑和任選的緩衝溶液和防腐劑，然後冷凍乾燥、真空乾燥或噴霧乾燥、噴霧冷凍乾燥所得的混合物。儘管本發明方法包括在環境溫度下的蒸發作用，依照本發明的優選方法是玻瓶冷凍乾燥方法。例如，在一個工藝中，包括將無菌過濾的抗原組合物無菌填充到無菌玻瓶中，接著通過冷凍乾燥進行升華。將無菌的冷凍乾燥用的橡皮塞部分插入玻瓶中，然後，將玻瓶冷凍，舉例來說，溫度從-195.8℃到-5℃，優選在-80℃到-10℃之間，然後在冷凍狀態下進行真空乾燥。在乾燥之後，在從冷凍乾燥裝置取出玻瓶之前，完全插入塞子。
依照本發明的一個優選方法是噴霧乾燥方法，採用或不採用同軸加壓空氣(或惰氣)，通過噴霧噴嘴用泵輸送液體組合物來獲得很小的組合物液滴。這樣的液滴在大量通氣的區域形成(溫度在+20℃到+250℃之間)，這樣通過蒸發作用獲得快速乾燥，在通過旋風分離器分離後獲得乾燥的粉末。
依照本發明的另一個優選方法是噴霧冷凍乾燥方法，採用或不採用同軸加壓空氣(或惰氣)，通過噴霧噴嘴用泵輸送液體組合物來獲得很小的組合物液滴。這樣的液滴在很冷的室中形成(溫度在-5℃到-195.8℃之間)，這樣獲得對液滴的快速冷凍，在隨後的標準冷凍乾燥過程後獲得乾燥的冷凍物。
依照本發明的另一個優選方法是真空乾燥方法。這一方法包括將組合物的無菌濾過溶液無菌填充到無菌玻瓶中。將無菌的冷凍乾燥用的橡皮塞部分插入玻瓶，然後對玻瓶施加受控的真空進行蒸發，一直到最後乾燥。在從冷凍乾燥設備取出玻瓶之前，完全插入塞子。
對冷凍乾燥或烘乾過程加以控制，以保證餅狀物中的殘留水分的濃度小於3％，優選小於2％，更優選為大約1％或更低。包封於其中的抗原在給藥中保持生物學的活性，也就是說能夠誘導宿主的免疫反應。可以預見的是，本發明的組合物可用於配製來源廣泛的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括人、細菌、或病毒的核酸，病原體衍生的抗原或抗原製品，腫瘤來源的抗原或抗原製品，宿主衍生的抗原，包括GnRH和IgE肽，重組產生的蛋白質或肽，和嵌合體融合蛋白。
優選地，本發明疫苗製劑包含能引起抗人病原體的免疫反應的抗原或抗原組合物，所說的抗原或抗原組合物源自HIV-1(例如Tat、nef、gp120或gp160)，人類皰疹病毒例如gD或它的衍生物或即刻早期蛋白(例如來自HSVl或HSV2的ICP27)，巨細胞病毒((尤其是人類)(例如gB或它的衍生物)，EB病毒(例如gp350或它的衍生物)，水痘-帶狀皰疹病毒(例如gpI、II和IE63)，或者來自於肝炎病毒例如B型肝炎病毒(例如B型肝炎表面抗原或它的衍生物)，A型肝炎病毒，C型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或來自其他的病毒病原體例如副粘病毒呼吸道合胞病毒(例如F和G蛋白或它的衍生物)，副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16、18，..)，蟲媒病毒(例如黃熱病病毒、登革熱病毒、蜱傳播的腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒(全部存活或滅活的病毒，裂解流感病毒，生長在雞蛋或MDCK細胞中，或Vero細胞或全流感病毒體(例如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所描述的)或純化或其重組蛋白，例如HA、NP、NA、或M蛋白，或它們的組合)，或衍生於細菌性病原體例如奈瑟氏菌屬，包括淋病奈瑟氏菌和髓膜炎奈瑟氏菌(例如莢膜多糖和它的軛合物，轉鐵蛋白結合蛋白，乳鐵蛋白結合蛋白，Pilc，粘附素)；致熱螺旋體(例如M蛋白或其片段，C5A蛋白酶，脂磷壁酸)，S.agalactiae，S.mutans；H.ducreyi；莫拉氏菌屬，包括黏膜炎莫拉氏菌，也已知為卡他布蘭漢氏球菌(例如高和低分子量的細菌細胞表面配基和玻璃酸酶)；博德特氏菌屬，包括百日咳博德特氏菌(例如百日咳桿菌粘附素，百日咳毒素或它們的衍生物，如絲狀的紅血球凝聚素，腺苷酸環化酶，噬菌體傘毛)，副百日咳博德特氏菌和支氣管膿毒素博德特氏菌；分枝桿菌屬，包括結核病分枝桿菌(例如ESAT6，抗原85A，-B或-C)，牛分枝桿菌，麻風分枝桿菌，M.avium，副結核分枝桿菌，齒垢分枝桿菌；軍團桿菌屬，包括嗜肺軍團菌；埃希氏桿菌屬，包括腸源性結腸埃希氏桿菌屬(例如定居因子，不耐熱毒素或它們的衍生物，耐熱毒素或它的衍生物)，腸出血性大腸桿菌，致病性大腸桿菌(例如志賀樣毒素或它的衍生物)；弧菌屬，包括霍亂弧菌例如霍亂毒素或它的衍生物)；志賀氏菌屬，包括索氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、弗氏志賀氏菌；耶爾森菌屬，包括結腸耶爾菌素(例如Yop蛋白)，黑死病耶爾菌素，偽肺結核耶爾菌素；彎曲桿菌屬，包括空腸彎曲桿菌(例如毒素、粘附素和透明質酸酶)和結腸彎曲桿菌；沙門氏菌屬，包括傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌，李斯特菌屬，包括產單核細胞李斯特菌；螺桿菌屬，包括幽門螺桿菌(例如尿素酶，過氧化物酶，形成空泡的毒素)；假單胞菌屬，包括銅綠假單胞菌；葡萄球菌屬，包括金黃色葡萄球菌，上皮葡萄球菌；腸道球菌屬，包括糞腸球菌、屎腸球菌；梭菌屬，包括破傷風梭菌(例如破傷風毒素和它的衍生物)，肉毒梭菌(例如肉毒桿菌毒素和它的衍生物)，艱難梭菌(例如梭菌毒素A或B和它們的衍生物)；桿菌屬，包括炭疽桿菌(例如肉毒桿菌毒素和它的衍生物)；棒狀桿菌屬，包括白喉棒桿菌(例如白喉毒素和它的衍生物)；包柔氏螺旋體屬，包括布氏疏螺旋體(例如OspA、OspC、ObpA、DbpB)，嘎氏疏螺旋體(例如OspA、OspC、ObpA、DbpB)，安德森疏螺旋體(例如OspA、OspC、ObpA、DbpB)，赫氏蜱疏螺旋體；埃裡希氏體屬，包括馬埃利希氏體和人類細胞性埃利希體病試劑；立克次體，包括立氏立克次體；衣原體屬，包括砂眼衣原體(例如MOMP，肝素結合蛋白)，肺炎衣原體(例如MOMP，肝素結合蛋白)，鸚鵡熱衣原體；細螺旋體屬，包括問號鉤端螺旋體；密螺旋體屬，包括蒼白密螺旋體(例如罕見外膜蛋白)，齒垢密螺旋體，豬痢疾密螺旋體；或者衍生自寄生蟲例如原形體，包括惡性瘧原蟲；弓形體屬，包括Tgondii(例如SAG2，SAG3，Tg34)；內變形蟲屬，包括痢疾阿米巴；巴貝蟲屬，包括B.microti；錐蟲屬，包括T.cruzi；賈第蟲屬，包括賈第蟲屬；Leshmania spp.，包括L.major；肺囊蟲，包括P.carinii；毛滴蟲屬，包括T.vaginalis；Schisostoma spp.，包括S.mansoni，或衍生自酵母例如假絲酵母屬，包括白體假絲酵母；隱球菌屬，包括新型細球菌隱球菌，在本發明一個優選方面，用於口服給藥的快速溶解的疫苗餅狀物不包含輪狀病毒。
優選的細菌性疫苗包括衍生自鏈球菌屬，包括肺炎鏈球菌的抗原(例如莢膜多糖和它的軛合物PsaA、PspA，鏈球菌溶血素，膽鹼結合蛋白)和蛋白抗原肺炎球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，MicrobialPathogenesis，25，337-342)，及其突變去毒的衍生物(WO90/06951；WO99/03884)。其他優選的細菌性疫苗包括衍生自嗜血桿菌屬的抗原，該嗜血桿菌包括流感嗜血桿菌型B(例如PRP和它的軛合物)，非可分型(non-typeable)的流感嗜血桿菌，例如OMP26，高分子量的細菌細胞表面配基，P5，P6，蛋白質D和脂蛋白D，和絲束蛋白和絲束蛋白衍生肽(US 5,843,464)或多備份(multiple copy)形式變異體或其融合蛋白。其他優選的細菌性疫苗包括衍生自黏膜炎莫拉氏菌(包括它的外膜囊泡，和OMP106(W097/41731))和腦膜炎奈瑟氏球菌B(包括它的外膜囊泡，和NspA(WO 96/29412)的抗原。
B型肝炎表面抗原的衍生物是本領域熟知的，包括尤其是那些在歐洲專利申請EP-A-414374；EP-A-0304578，和EP 198-474中描述的PreS1、PreS2 S抗原。在本發明的另一個優選方面中，疫苗製劑包含HIV-1抗原、gpl20，特別是在CHO細胞中表達的抗原。在更進一步的實施方案中，本發明的疫苗製劑是包含如上文所述的gD2t。
在本發明的一個優選的實施方案中，疫苗包含源於人乳頭瘤病毒(HPV)的抗原，它被認為是負責生殖器疣(HPV 6或HPV 11等)，和HPV病子宮頸癌的病毒(HPV16、HPV18等)。
特別優選的預防或治療生殖器疣的疫苗形式包括LI微粒或衣殼體，和一種或多種選自HPV6和HPV 11蛋白質E6、E7、LI和L2的抗原的融合蛋白。最優選的融合蛋白形式是L2E7，例如在WO 96/26277披露的，和在GB9717953.5(PCT/EP98/05285)中披露的蛋白質D(1/3)-E7。
優選的用於預防和治療HPV子宮頸感染或癌的疫苗組合物包含HPV 16或18抗原。例如，L1或L2抗原單體，或病毒樣微粒(VLP)形式的LI或L2抗原或者單獨出現在VLP或病毒衣殼體結構中的L1獨自蛋白。這樣的抗原、微粒樣病毒和病毒衣殼體是已知的。例如可以參見WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184。也可以包括單獨或作為融合蛋白形式的早期蛋白質，例如優選自E7、E2或E5；特別優選的示例包括包含L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。
特別優選的HPV16抗原包含早期蛋白E6或E7，所述E6或E7與來自HPV16的蛋白質D載體融合形成蛋白質D-E6或E7或它們的組合；或L2與E6或E7的組合(WO 96/26277)。另外，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可呈單一分子的形式，優選的是蛋白質D-E6/E7融合體。這樣的疫苗可任選地包含來自HPV18的E6和/或E7蛋白，優選地以蛋白質D-E6或蛋白質D-E7融合蛋白或蛋白質D E6/E7融合蛋白的形式。
本發明的疫苗還可以包含來自於其他HPV株的抗原，優選來自於HPV 6、11、31、33或45株。
本發明的疫苗更進一步包含來自可引起瘧疾的寄生蟲抗原。例如，優選的抗原來自鐮刀狀瘧原蟲包括RTS、S和TRAP。RTS是雜合體蛋白質，其基本上包括鐮刀狀瘧原蟲的環孢(CS)蛋白的所有C-端部分，所述C-端部分通過B型肝炎表面抗原上preS2部分的4個胺基酸與B型肝炎病毒的表面(S)抗原結合。它的完整結構在國際專利申請PCT/EP92/02591中被披露，(WO93/10152享有UK專利申請9124390.7的優先權)。在酵母中表達時，RTS以脂蛋白微粒形式生成，當與來自HBV的S抗原共同表達時，形成已知的RTS、S的混合顆粒。TRAP在國際專利申請PCT/GB89/00895中被描述，公開於WO90/01496。本發明一個優選的實施方案是瘧疾疫苗，其中的抗原製品包含RTS、S和TRAP抗原的組合。可能作為多級瘧疾疫苗的候選成分的其他瘧原蟲抗體，包括鐮刀狀瘧原蟲MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其瘧原蟲類似物。
所述製劑也可以包含抗癌抗原，並可用於治療癌症的免疫療法中。例如，這種佐劑製劑被發現可與腫瘤排異抗原一起應用，所述腫瘤例如前列腺癌、乳癌、結腸直腸的癌、肺癌，胰癌、腎臟癌或黑素瘤癌。示例抗原包括MAGE1和MAGE3或者用於治療黑素瘤的其他MAGE抗原，PRAME，BAGE或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，628-636頁；Van den Eynde等，International Journal of Clinical Laboratory Research(1997發表)；Correale等(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，p293。確實，這些抗原在許多腫瘤類型(例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌)中被表達。其他的腫瘤特異性抗原包括但不限於前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu，KSA(GA733)，MUC-1，PRAME，癌胚抗原(CEA)，PSCA(PNAS 95(4)1735-17401998)，PSMA，P501S(Wo98/37814中的113序列號IO)即已知為PS108或前列腺蛋白(WO 98/50567)。另一個腫瘤抗原是前列腺特異性絲氨酸蛋白酶(前列腺酶，胰蛋白酶樣)披露在Ferguson，等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96，3114-3119)和國際專利申請WO 98/12302(相應的已授權專利US 5,955,306)、WO98/20117(相應的已授權專利US 5,840,871和US5,786,148)(前列腺特異性激肽釋放酶)和WO00/04149(P703P)。其他前列腺特異性抗原已知來自Wo98/37418，和WO/004149。另一個抗原是STEAP PNAS96 14523 145287-121999。用於本發明中的其他與腫瘤相關的抗原包括Plu-1，J Biol.Chem 274(22)15633-15645，1999；HASH-2(WO01/62778)，cripto(Salomon等Bioessays 199，21 61-70，US5654140)Criptin美國專利5 981 215。其他與治療癌症疫苗特別相關的抗原還包括酪氨酸酶和生存素。
其他適合本發明使用的腫瘤特異性抗原包括但不限於腫瘤特異性神經節苷脂例如GM2和GM3或其載體蛋白共軛物；或所說的抗原是自身肽激素例如完整長度的促性腺激素釋放激素(GnRH，WO 95/20600)，短的10個胺基酸肽，用於治療多種癌症，或用於免疫去勢(immunocastration)。
可以預見的是，本發明的組合物可用於配製含有來源於疏螺旋體屬的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括核酸、病原體衍生的抗原或抗原製品、重組形成的蛋白質或肽和嵌合體融合蛋白。特別的抗原是OspA。OspA可以是脂質化(lipidated)形式的具有宿主細胞(E.Coli)優點的完全成熟的蛋白，被稱為(Lipo-OspA)或者是未脂質化的衍生物。這樣的未脂質化的衍生物包括未脂質化的NS1-OspA融合蛋白，其具有流感病毒上非結構蛋白(NS1)和完整OspA蛋白的第一個81-N端胺基酸，而另一種MDP-OspA是非脂質化形式的攜帶3個額外N-氨基末端胺基酸的OspA。
本發明的疫苗可以用於預防或治療變態反應。這樣的疫苗將包含變應原特異性(例如Der pl)和變應原非特異性抗原(例如源於人IgE的肽，包括但不限於stanworth十肽(EP 0 477 231B1))。
在使用過程中但是在給藥前，一般可在藥學上可接受的稀釋劑或載體中重建本發明的組合物。藥學上可接受的稀釋劑的例子包括水和鹽水。優選在給患者服藥前對組合物或疫苗進行重建。優選溶解餅狀物的時間小於10秒，更優選小於5秒，優選小於3秒，最優選小於1秒。
在本發明的一些實施方案中，抗原可用藥學上的載體進行配製。本發明的疫苗可使用的藥用載體包括本領域已知適合口服給藥的、特別適合於嬰兒的載體。
本發明的病毒也可配製於基於脂質的載體中，例如病毒體或脂質體、水包油乳液或載體微粒中。
有利地，其他免疫興奮劑包括皂角苷衍生物，例如QS21和單磷酸類脂A，尤其是3-去-O-醯化單磷酸類脂A(3D-MPL)。作為佐劑的純化皂角苷在WO98/56415中有所描述。皂角苷和單磷酸類脂A可單獨或結合應用(舉例來說可見於WO 94/00153中)，也可與其他試劑一起配置在佐劑系統中。3D-MPL是由Ribi Iinmunochem(Montana)生產的佐劑，其生產工藝在GB 2122204有所描述。
氫氧化鋁是本發明疫苗組合物中特別優選的成分。
本發明的抗原組合物溶液和在重建後獲得的溶液是等滲溶液。在一個優選的實施方案中，本發明組合物的pH值從大約6到大約10，優選從大約7到大約9。本發明的抗原組合物可在經黏膜或胃腸道外，優選胃腸道外，最優選經靜脈、皮下或肌肉注射給藥時重建。不管用什麼方法，如果需要的話可以是其他適當的劑型(例如鼻腔噴霧和其他黏膜製劑)。
當供非腸道給藥時，本發明的組合物可被包裝在合適的藥用裝置，例如注射器、玻瓶或安瓿中，這樣加入稀釋劑或載體就可原位配製含有活性組分的適宜立即給予患者的水溶液形式。這樣的裝置形成了本發明的一個方面。在黏膜給藥時，凍幹的或乾燥的製劑可以以密封於藥用泡罩包裝中的片劑形式提供。
本發明的另一方面提供包含減毒的活細菌或病毒、或活的病毒或細菌載體的組合物，其中組合物是本發明的凍幹固體或乾燥固體，可在給藥時快速溶解。
可採用已知技術配製和使用本發明疫苗，其中使用適量的活病毒有效地抗感染並且對接受疫苗者沒有明顯的不良反應。活病毒的合適用量通常是每劑量104到107ffu。疫苗的典型劑量可以是每劑量包含105到106ffu，也可以在一段時間給若干劑量，例如間隔兩個月給予2個劑量。然而，可以給予2個以上的劑量，例如3或4個劑量的方法，尤其是在發展中國家。劑量的間隔期可以多於或少於兩個月。可以通過對抗體滴度的標準研究和其他對受試者有影響的反應，來確定單/多劑量方案的最佳活病毒量、最佳給藥次數。
可對每一疫苗劑量中的蛋白質量加以選擇，該量應能誘導典型的接受疫苗者的免疫保護性反應，但沒有明顯的不良反應。這取決於所用的特定免疫原及其表現。一般地，每劑量預期包含1-1000μg的蛋白質，優選1-500μg，更優選1-100μg，最優選1到50μg。可採用觀察接受疫苗者出現適當免疫反應的標準試驗，來確定具體疫苗的最佳用量。在最初的接種疫苗之後，受試者需要一個或多個間隔開的促升免疫。
本發明通過下列實施例進行詳細說明。
實施例I最大濃度的PO4-NaCl緩衝溶液獲得可接受的凍幹餅狀物，使用標準的冷凍乾燥糖類1.1.導言在一個標準的凍幹循環中採用多種濃度的磷酸鹽(PO4)/NaCl緩衝溶液。
磷酸鹽-NaCl緩衝溶液可相當於簡單的磷酸鹽緩衝液(無NaCl)。
在配製過程中，為了使每種緩衝劑經類似稀釋後具有相當的滲透壓(包括糖類貢獻的滲透壓)，應對濃度加以調節。在從此以後呈現的本發明的表格中，存在於最終製劑中的濃度是恰好在冷凍乾燥步驟之前得到的。
1.2.結果依照實施例3.2.中列出的標準來評定餅狀物的外觀1.2.1蔗糖(3.15％)組合物
1.2.2麥芽糖(3.15％)組合物
1.2.3海藻糖(3.15％)組合物
1.2.4棉子糖(3.15％)組合物
1.2.5結論製劑中的磷酸鹽(PO4)/NaCl與冷凍乾燥不相容。確實，在濃度超過2mMPO4/30mMNaCl時，所得的餅狀物結構是不可接受的。當採用PO4/NaCl緩衝液時，蔗糖、麥芽糖、海藻糖和棉子糖得到相同的結果。
很清楚NaCl對冷凍乾燥中不好的結果負責任。確實，使用PO4(無NaCl)的緩衝液會達到高得多濃度-最高達120mM PO4，對於棉子糖-最高達90mM PO4，在蔗糖中-最高達60mM PO4，對於麥芽糖和海藻糖1.3.蔗糖分子排列有美感的外觀圖2顯示在無NaCl存在時無定形蔗糖分子排列有美感的外觀。沒有顯示殘留的水分子。
凍幹的餅狀物結構基本上是基於「糖-糖」分子相互作用構建的。所述分子間的相互作用是分子定向、分子構象和成分原子的原子半徑的結果。
無定形結構(分子間的高度無序(deorder))的分子間相互作用比晶體結構(分子間的高度有序)要弱。
比較起來，圖3顯示了在有60mMNaCl存在時，90mM蔗糖的無定形分子排列有美感的外觀。沒有顯示殘留水分子。
氯化鈉的離子相互作用幹擾了「糖-糖」分子間相互作用。實施例I中的結果顯示，NaCl的存在減弱了「糖-糖」分子間相互作用。
實施例II在給定的固定PO4(4mM)-NaCl(60mM)濃度下，對能形成可接受的凍幹餅狀物的幾種糖類(或賦形劑)進行評價。
這些試驗的目標值設定在一定的PO4(6mM)-NaCl(60mM)濃度下，如實施例I所示，該NaCl濃度導致不可接受的凍幹餅狀物結構，通常在純化後在最終的抗原溶液中達到這個結構。
試驗1除了常規蔗糖以外，採用具有羧酸官能團的糖類分子固結餅狀物結構。乳糖酸如圖一所示。
試驗2使用具有羧酸官能團的糖類分子來固結餅狀物的結構(在沒有蔗糖的情況下)。
這樣，在乳糖酸系列中，它們的鹽(Na、Ca、或Tris抗衡離子)的性質在「糖-糖」分子間的相互作用中扮演重要角色。Tris分子較大(相對於Na)，所以將「糖類」分子彼此推開，減弱了「糖-糖」相互作用(相對於Na)。
在固定的NaCl濃度時
在遞降的NaCl濃度時
試驗3使用具有羧酸官能團的糖類分子來固結餅狀物的結構，採用糖類的不同羧酸的衍生物。
實施例III原料和方法1.抗原組合物的製備通過無菌操作，逐步地依次加入並混合正確定量的無菌水、無菌的濃縮的糖類溶液、無菌的濃縮的緩衝液、無菌的濃縮的鹽溶液和無菌的濃縮的抗原溶液，製得配方的大量混合物。
將配製好的大量混合物分裝入適於冷凍乾燥的小玻瓶中(典型地在3ml有機矽玻璃小瓶中裝有0.5ml所述混合物)。
將冷凍乾燥橡皮塞放置在小瓶上(部分密封的)。
2.冷凍乾燥將含有0.5ml配製好的疫苗的小瓶放置在預冷(-69℃)冷凍的乾燥器(Martin-Christ或Usifroid)中，同時監測和調節冷凍乾燥條件，以儘可能遵循下述時間—溫度曲線
在真空操作結束時，通過推壓塞子將小瓶完全密封。
然後用鋁製瓶帽密封塞子。
在分析或使用前，將凍幹的玻璃瓶放置在+4℃儲存。
3.對餅狀物的外觀檢查3.1.在37℃下加速的穩定性將含有製劑的十個凍幹玻瓶放置在通風櫥(37℃)中一個星期，然後儲藏在+4℃。然後檢查餅狀物。
3.2.餅狀物檢查在對凍幹的餅狀物進行冷凍乾燥和加速的穩定性試驗(在37℃7天)後，進行目檢。
測量餅狀物的尺寸來評估收縮百分率，然後依照不同類別進行分類-收縮 意思是指餅狀物的最初尺寸(高度或直徑)至少減少20％-輕微收縮 意思是指餅狀物的最初尺寸(高度或直徑)至多減少20％-合格 意思是指在凍幹後和在37℃一周後餅狀物的最初尺寸(高度或直徑)至多減少20％，同時在37℃下一星期後也沒有發生顏色改變-不合格 意思是指僅僅在凍幹後或者在37℃下一周後餅狀物的最初尺寸(高度或直徑)至少減少了20％，或者在37℃下一星期後發生顏色改變將刻度尺置於玻瓶底面，並通過玻璃觀測餅狀物直徑(或高度)來測量餅的側面。
4.緩衝劑選用磷酸鹽-NaCl緩衝劑(在室內也稱為「磷酸鹽10-150」)，因為大多數抗原是在這樣的緩衝溶液中純化的。需要指出的是，我們使用NaH2PO4+K2HPO4的組合。通過稱量準確的NaH2PO4/K2HPO4的比例，以獲得所需pH值。這樣，不用HCl或NaOH來調節緩衝劑的pH值。
逐漸減少的數量在配製過程中使用0.4、0.3、0.2、0.1和0.05ml的緩衝劑。最終的填充體積總是0.5ml。
不含NaCl的選擇磷酸鹽緩衝劑，使其與磷酸鹽-NaCl緩衝劑相當。開始是150mM的溶液，在配製過程中使用逐漸減少的數量0.4、0.3、0.2、0.1和0.05ml。
滲透壓通過Friske型1/10滲壓計來進行測量。
權利要求
1.一種適合冷凍乾燥、噴霧乾燥，噴霧冷凍乾燥或真空乾燥的抗原組合物，它含有在水性介質中的抗原、糖類和任選的防腐劑，其中糖類呈具有酸性部分的衍生物形式。
2.如權利要求1所述的抗原組合物，其中所述的糖類以其羧酸衍生物形式存在。
3.如權利要求2所述的抗原組合物，其中所述的羧酸衍生物選自乳糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸或半乳糖二酸。
4.如權利要求1到3中任意一項所述的抗原組合物，其中水性介質包含濃度至少為30mM的NaCl。
5.如權利要求1到4中任意一項所述的抗原組合物，它以經噴霧乾燥、真空乾燥或冷凍乾燥的形式存在。
6.如權利要求5所述的抗原組合物，它以重建的形式存在。
7.如權利要求6所述的抗原組合物，其中所述的重建的組合物中包含佐劑。
8.如權利要求7所述的抗原組合物，其中所述的佐劑選自水包油乳液、3D-MPL、CpG、QS21或它們中的兩種或更多種的混合物。
9.如權利要求1到8中任意一項所述的抗原組合物，其中所述的抗原或抗原組合物源自於下面包含下列的組人類免疫缺陷病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，單純皰疹病毒類型1，單純皰疹病毒類型2，人巨細胞病毒，登革熱病毒，甲、乙、丙或戊型肝炎病毒，呼吸道合胞病毒，人乳頭瘤病毒，流感病毒，Hib，腦膜炎病毒，沙門氏菌，奈瑟氏菌，包柔氏螺旋體菌，衣原體，博德特氏菌，瘧原蟲或弓形蟲，stanworth十肽；或與腫瘤相關的抗原(TMA)，MAGE，BAGE，GAGE，MUC-1，Her-2neu，LnRH，CEA，PSA，KSA，或PRAME，Cripto，HASH2，前列腺酶，前列腺蛋白。
10.製備權利要求1到4所述的抗原組合物的方法，包括混合組合物的成分和使混合物經受冷凍乾燥、真空乾燥或噴霧乾燥的過程。
11.製備權利要求4的抗原組合物的方法，包括混合組合物的成分，和冷凍這些成分並乾燥冷凍後的混合物或對這些成分進行噴霧。
全文摘要
本發明涉及一種新型的適於胃腸道外和黏膜給藥的抗原組合物，包含在水性介質中的抗原和糖類，其中的糖類呈具有酸性部分的衍生物形式，優選呈羧酸衍生物的形式。抗原組合物呈穩定的固體形式，在加入液體賦形劑和佐劑進行重建後，經過胃腸道外和黏膜給藥，可在體液中快速溶解，從而釋放重建的疫苗進入人體。特別地，凍幹製劑由含有抗原的粉末或餅狀物組成，優選呈無定形物狀態(玻璃狀)，通過乾燥或升化液體溶液或懸浮液得到這種製劑，優選通過冷凍乾燥來進行升化。
文檔編號A61K9/19GK1674867SQ03818902
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月12日 優先權日2002年8月13日
發明者V·范德韋爾德 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司