同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體的製作方法

2023-12-01 07:09:31 1

專利名稱：同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體，是用於鑑定外源目的DNA片段是否具有啟動轉錄或起始翻譯功能的載體質粒。
背景技術：
含有篩選標記的轉基因載體在基因工程中具有廣泛的用途。常見轉基因載體包含有一個或多個篩選標記或報告基因，以方便對插入外源核苷酸片段重組質粒的篩選和鑑定。其中螢光蛋白基因在活細胞中的表達產物具有生物活性穩定、信號特異性強、有效活性維持時間長、方便檢測和對外源目的基因表達活性幹擾小等特點，所以常利用螢光蛋白基因的表達來研究外源核苷酸片段的功能。通常情況下，同一報告基因載體中僅含有一個熒 光蛋白基因，將目的DNA片段克隆到螢光蛋白基因的N端或C端，構建的重組質粒轉染相應宿主細胞，通過檢測螢光蛋白的表達即可判定目的核酸片段是否具有相應功能，但難以同步反映重組報告基因質粒的轉染效率和判定目的DNA的生物功能。

發明內容
本發明的目的是提供一種同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP，2012年07月06日送藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，分類命名大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏號 CGMCC 6320。本發明構建同向串聯共表達雙色螢光蛋白的報告基因載體所採用的技術方案是利用基因克隆技術，在親本載體PIRES2-EGFP啟動子pCMV後的Bgl II位點與SV40polyA序列之間置換入如下DNA序列自5'至3'方向依次插入紅色螢光蛋白基因DsRed2、優化組合的多克隆酶切位點MCS(包括Sal I,Spe I,Sca I,Pvu I、Nhe I,Mlu I,EcoR I,Xba I,BamH
I、Sac II, Sac I, Sma I和EcoR V，其中Nhe I為非單克隆位點)、綠色螢光蛋白基因EGFP和Xho I位點序列(如SEQN0. I中的第609-2085nt)，獲得如SEQN0. I (第l_5408nt)所示核苷酸序列的同向串聯共表達雙色螢光蛋白的新型報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP。所述同向串聯共表達雙色螢光蛋白的報告基因載體的DNA分子也屬於本發明的保護範圍。含有所述載體分子、所述重組報告基因載體的轉基因重組菌或細胞也屬於本發明的保護範圍。本發明的同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體具備經直接酶切、連接構建插入目的DNA的重組報告基因質粒及轉染細胞等簡單操作，就可以用於分析和鑑定插入目的DNA序列生物活性的功用；由pCMV啟動轉錄的多順反子mRNA中，上遊紅色螢光蛋白的表達指示轉染效率，下遊綠色螢光蛋白的表達與否及其產量反映目的DNA序列是否具有相應生物活性及其活性高低。


圖I同向串聯共表達雙螢光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP的構建圖譜。圖2載體骨架P Λ SG的PCR擴增與克隆鑑定電泳圖譜。圖3構建同向串聯共表達雙螢光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP的電泳圖
-i'TfeP曰。圖4重組報告基因質粒PDsRed2-LTR-EGFP的酶切鑑定電泳圖譜。圖5各質粒轉染CHO細胞的螢光檢測結果。
具體實施例方式下述實施例中如無特殊說明，所用方法均為常規基因克隆方法，所用試劑均可經商業途徑購得。實施例I.構建同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS_EGFP(I)載體骨架P Λ SG的PCR擴增與克隆在載體pIRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)的基礎上，設計含有linker序列的引物P Λ SG F、P Λ SG R擴增缺失IRES和EGFP基因片段的載體骨架ρ Λ SG (包括pCMV、PUCori、Kan/Neo、SV40polyA 功能或基因序列)。P ASG F 5/ -CGCCTCGAGTCTAGATCATAATCAGCCATACC-3'，(含有 XhoI、XbaI 的識別位點)；ρ ASG R 5/ -CCGGATATCGAATTCGAAGCTTGAGC-3'，(含有 EcoR I、EcoR V 的識別位點)。25 μ I 反應體系的組成是雙蒸水 15. O μ 1，Ex Taq IOXBuffer 2. 5 μ 1，dNTPs
2.O μ I,MgCl2L 5 μ l，pASG Fl. O μ l，pASG R I. O μ l，pIRES2_EGFPTE 溶液 I. O μ I,ExTaq
1.O μ I。PCR擴增條件是 95°C 5min ；95°C 50sec,55°C 50sec,72°C 5min，共 32 個循環；最後經72°C IOmin充分延伸後冷卻至4°C保存。PCR產物經O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳分離大小為3975bp的ρ Λ SG PCR產物，切膠同收後與pMD 18-TSimple Vector連接構建重組克隆psT- Δ SG。經常規轉化經CaCl2製備的DH5a感受態細胞，塗布含Ampicillin的LB固體平板，37°C過夜培養。到時選取平板上優勢抗性生長的單菌落，用引物ρ Λ SG F, ρ Δ SG R做菌落PCR檢測。初步檢測為陽性的克隆菌落經挑菌，在含Ampicillin的LB液體培養基中過夜擴增後送商業公司測序。提取結果正確的克隆樣品的質粒進行EcoR I、XhoI雙酶切和Bgl II單酶切反應，鑑定載體質粒PsT- Δ SG。psT- Δ SG經EcoRI和XhoI雙酶切出2710bp和3957bp兩條帶，經Bgl II單酶切出6667bp的一條帶。克隆、鑑定psT-Λ SG的電泳結果如圖2所示。圖2中，I.擴增ρ Λ SG的PCR產物、
2.菌落PCR鑑定ρΛ SG的擴增結果、3. psT-Λ SG經EcoR I和XhoI雙酶切產物、4. psT-Λ SG經 Bgl II 單酶切產物、5. DNA MarkerDL15000.(2)構建同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP在載體pDsRed2-Cl(PT3603_5，Clontech)的基礎上，設計引物 DsRed2F、DsRed2R擴增紅色螢光蛋白基因DsRed2(723nt)。DsRed2F :5'-CAGATCTACCATGGCCTCCTCCGAGAAC-3'，(含有 Bgl II 識別位點);DsRed2R 5'-GAATTCACGCGTGCTAGCGATCGAGTACTAGTCGACTACAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3'，(含有Sal I、Spe I、ScaI、PvuI、獨§1、MluI和EcoRI識別位點，其中NhsL不是單克降酶切位點)。PCR 反應體系是雙蒸水 15·0μ 1，ExTaq 10XBuffer2. 5 μ I, dNTPs 2. Ομ I,MgCl2L 5 μ I, DsRed2F I. O μ I, DsRed2R I. O μ 1，pDsRed2_ClTE 溶液 1.0 μ 1，Ex TaqI. O μ I。PCR 擴增條件是 95°C 5min ；95°C 50sec, 55°C 50sec, 72V 50sec，共 32 個循環；最後經72°C IOmin充分延伸後冷卻至4°C保存。

PCR產物經O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收後與pMD 18-T Simple Vector連接。連接產物經常規轉化經CaCl2製備的DH5a感受態細胞，塗布含Ampicillin的LB固體平板，37 °C過夜培養。到時用引物DsRed2F、DsRed2R做菌落PCR檢測，陽性克隆菌落經含Ampicillin LB液體培養基擴增後送商業公司測序。提取結果正確的克隆樣品的質粒進行Bgl II和EcoRI雙酶切，鑑定重組質粒psT-DsRed2。在載體pIRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)的基礎上，設計引物EGFPF、EGFP R擴增綠色螢光蛋白基因EGFP(766nt)。EGFP F5'-GAATTCTAGAGGATCCGCGGAGCTCCCGGGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3，(含有 EcoR I、Xba I、BamHI、Sac II、Sac I、Sma I 和 EcoR V 識別位點)；EGFPR 5' -CGCGGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'，(含有 Xho I 識別位點)。PCR 反應體系是雙蒸水 15. O μ I，Ex Taq IOXBuffer 2· 5 μ I，dNTPs 2· O μ I，MgCl2L 5 μ 1，EGFP F I. O μ I, EGFP R I. O μ 1，plRES2_EGFP TE 溶液 1.0 μ 1，Ex Taq
I.O μ I。PCR 擴增條件是 95°C 5min ；95°C 50sec, 55°C 50sec, 72V 50sec，共 32 個循環；最後經72°C IOmin充分延伸後冷卻至4°C保存。PCR產物經O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收後與pMD 18-T Simple Vector連接。連接產物經常規轉化經CaCl2製備的DH5a感受態細胞，塗布含Ampicillin的LB固體平板，37 °C過夜培養。到時用引物EGFP F、EGFP R做菌落PCR檢測，陽性克隆菌落經在含Ampicillin LB液體培養基擴增後送商業公司測序。提取結果正確的克隆樣品的質粒進行EcoR I、Xho I雙酶切反應，鑑定重組質粒psT-EGFP。取載體質粒psT- Λ SG經Bgl II、Xho I雙酶切後的載體片段ρ Λ SGBg_xh,psT-DsRed2 經Bgl II,EcoR I 雙酶切目的片段 DsRed2Bg_Ei，以及 psT-EGFP 經EcoR I、Xho I雙酶切目的片段EGFPEi_a，用T4連接酶進行連接。10 μ I的反應體系是ρ Δ SGBg_xh 2. O μ 1，DsRed2Bg_Ei 3. 0 μ l,EGFPEi_xh 3. 0 μ I, IOXT4Buffer I. 0 μ I,T4Iigase I. O μ I。連接反應條件是16°C 4h，到時轉至4°C保存。連接產物常規轉化經CaCl2製備的DH5 α感受態細胞，塗布含Kanamycin的LB固體平板，37°C過夜培養。到時用引物EGFP F、EGFP R與DsRed2F、DsRed2R分別作菌落PCR篩選，兩次均呈陽性的克隆菌落經挑菌在含Kanamycin的LB液體培養基中過夜培養，提取質粒分別進行Bgl II和Sal I、Bgl II和EcoRI、EcoR I和Xho I及EcoR V和Xho I雙酶切反應，鑑定重組同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP ;其載體圖譜如圖I所示。PDsRed2-MCS-EGFP經Bgl II、Sal I雙酶切出4722bp和686bp兩條帶、經Bgl II、EcoR I雙酶切出4692bp和716bp兩條帶、經EcoR I、Xho I雙酶切出大小為4653bp和755bp兩條帶、經EcoR V、Xho I雙酶切出大小為4682bp和726bp兩條帶；其酶切鑑定瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示。圖3中，l:Bgl II,Sal I雙酶切結果、2 :Bgl
II、EcoRI雙酶切結果、3 :EcoR I,Xho I雙酶切結果、4 :EcoR V,Xho I雙酶切的結果、5 :DNAMarker DL15000。2.構建插入REV LTR的重組雙色螢光報告基因質粒pDsRed2_LTR-EGFP取攜帶REV LTR的重組質粒psT-LTR與重組雙螢光蛋白報告基因載體質 粒 pDsRed2-MCS-EGFP 同樣經 EcoR I、EcoR V 雙酶切後的目的片段 LTR1^v(SSOnt)、pDsRec^-MCS-EGFPh，用 T4 連接酶進行連接。10 μ I 的反應體系是=IOXT4Buffer I. O μ 1，pDsRed2-MCS-EGFPI_v I. Ομ I, LTR1^v 7· O μ 1，T4Iigase I. O μ I。連接反應條件是 16 °C 4h,到時轉至4°C保存。連接產物常規轉化經CaCl2製備的DH5 α感受態細胞，塗布含Kanamycin的LB固體平板培養基，37°C過夜培養。到時挑取優勢抗性單克隆菌落過夜培養，提取質粒分別進行Bgl II和Sal I、EcoR I和EcoR V、EcoR V和Xho I組合的雙酶切反應，鑑定重組質粒pDsRed2-LTR-EGFP。pDsRed2_LTR-EGFP 經 Bgl II、Sal I 切出 5272bp 和 686bp 兩條帶、經 EcoR I、EcoR V 切出 5402bp 和 556bp 兩條帶、經 EcoR V、Xho I 切出 5232bp 和 726bp兩條帶、經 Bgl II, EcoR I, EcoRV, Xho I 四酶切出 3937bp (載體片段)、716bp (DsRed2)、556bp (LTR)和726bp (EGFP)四條帶，但由於716bp和726bp的兩者大小相差太少，故電泳時短時間內不可能被明顯分離開，而重合成寬度擴大、亮度幾乎加倍的一條帶，其瓊脂糖凝膠電泳結果如圖4所示。圖4中，I =BglII, SalI雙酶切的結果、2 =EcoRI, EcoRV雙酶切的結果、3 =EcoRV,Xho I雙酶切的結果、4和5 Bgl II,EcoR I.EcoR V,Xho I四酶切的結果、6 DNA Marker 15000。3.細胞轉染取親本載體質粒pIRES2-EGFP、pDsRed2_Cl 和重組質粒 pDsRed2-MCS_EGFP、pDsRed2-LTR-EGFP 各約 O. 8μ g，參照《分子克隆(第三版)》P1276_1281，用 Lipofectamine轉染已長成單層的CHO細胞。24h後將轉染細胞置於螢光顯微鏡下檢測綠色和紅色螢光蛋白的表達。螢光檢測結果如圖5所示，親本載體質粒pDsRed2-Cl轉染的細胞中只有紅色螢光蛋白表達(圖5，B)，pIRES2-EGFP轉染的細胞中只有綠色螢光蛋白表達(圖5，C)，同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP轉染的細胞中只有紅色螢光蛋白表達(圖5，D)，在MCS區克隆入REV LTR的重組同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2-LTR-EGFP轉染的細胞中，綠色和紅色螢光蛋白都獲得了高效表達(圖5，E、F);同時以未轉染的空白CHO細胞作對照(圖5，A)。圖5中，A :未轉染的空白CHO細胞，B :pDsRed2_Cl轉染的CHO細胞，C :pIRES2_EGFP轉染的 CHO 細胞，D pDsRed2-MCS-EGFP 轉染的 CHO 細胞，E 和 F pDsRed2-LTR-EGFP 轉染的CHO細胞。〈110〉泰山醫學院〈120〉同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP<141)2012-08-181-5408SEQ NO. I5408DNA 〈213〉人工序列〈220〉1tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtcattagttcat agcccatata tggagttccg60cgttacataa cttacggtaa atggcccgcctggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt120gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagtaacgccaata gggactttcc attgacgtca180atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc240aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta300catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac360catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg420atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg480ggactttcca aaatgtcgta acaactccgccccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt540acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta600ccggactcag atctaccatg gcctcctccg agaacgtcat caccgagttc atgcgcttca660aggtgcgcat ggagggcacc gtgaacggccacgagttcga gatcgagggc gagggcgagg720gccgccccta cgagggccac aacaccgtga agctgaaggt gaccaagggc ggccccctgc780ccttcgcctg ggacatcctg tccccccagttccagtacgg ctccaaggtg tacgtgaagc840accccgccga catccccgac tacaagaagctgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc900gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg cgaccgtgac ccaggactcc tccctgcagg960acggctgctt catctacaag gtgaagttca tcggcgtgaa cttcccctcc gacggccccg1020tgatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctccaccga gcgcctgtac ccccgcgacg1080gcgtgctgaa gggcgagacc cacaaggccctgaagctgaa ggacggcggc cactacctgg1140tggagttcaa gtccatctac atggccaaga agcccgtgca gctgcccggc tactactacg1200tggacgccaa gctggacatc acctcccaca acgaggacta caccatcgtg gagcagtacg1260agcgcaccga gggccgccac cacctgttcctgtagtcgac tagtactcga tcgctagcac1320gcgtgaattc tagaggatcc gcggagctcccgggatatca tggtgagcaa gggcgaggag1380ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtcgagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag1440ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgatgccacctacg gcaagctgac cctgaagttc1500atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccctggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac1560ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgaccacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc1620gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgcaccatcttct tcaaggacga cggcaactac1680
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權利要求
1.一種DNA分子，其特徵是經優化MCS序列串聯的可同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP，具有SEQ NO. I中第609_2085nt的DNA序列。
2.含有權利要求I所述報告基因載體質粒的構建方法。
3.根據權利要求2所述的報告基因載體質粒，其特徵在於pCMV下遊連接有優化MCS串聯表達的雙色螢光蛋白報告基因序列DsRed2-MCS-EGFP，所述報告基因載體的核苷酸序列為SEQ NO. I中的第l-5408nt的DNA序列。
4.含有權利要求I所述報告基因載體質粒的轉基因細胞。
5.含有權利要求2或3所述報告基因載體質粒的轉基因細胞。
6.含有權利要求I所述報告基因載體質粒的重組菌。
7.含有權利要求2或3所述報告基因載體質粒的重組菌。
8.權利要求2或3所述報告基因載體質粒在檢測目的DNA序列功能中的應用。
全文摘要
本發明涉及同向串聯共表達雙色螢光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP。它是在載體pIRES2-EGFP的基礎上，經PCR反應獲得缺失IRES和EGFP序列的載體骨架pΔSG，構建其T載體克隆psT-ΔSG，酶切後與同步酶切的、攜帶附加優化MCS序列的螢光蛋白報告基因DsRed2、EGFP進行連接、亞克隆而得。將待分析目的DNA序列定向克隆入pDsRed2-MCS-EGFP的MCS區，獲得的重組質粒轉染相應宿主細胞，DsRed2的本底表達指示轉染效率，EGFP的表達有賴MCS區目的DNA序列的活性，其表達與否及表達量的多少，皆作為指徵目的DNA序列是否具有相應生物活性及其高低。優化的MCS序列適合更廣泛的基因克隆操作；DsRed2和EGFP表達的檢測時效範圍寬，且相互獨立、互為表徵，成像效果清晰、鮮明，使實驗操作更簡便，結果更具說服力。
文檔編號C12N15/65GK102839188SQ20121031518
公開日2012年12月26日 申請日期2012年10月14日 優先權日2012年10月14日
發明者王玉, 於愛蓮, 姜世金, 施魯笛 申請人:泰山醫學院