鈉通道調製劑BmKI在建立誘導疼痛模型中的應用的製作方法

2023-11-30 17:16:51 1

專利名稱：鈉通道調製劑BmK I在建立誘導疼痛模型中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鈉通道調製劑BmK I在建立誘導疼痛模型中的應用。發明背景疼痛是人類共有而個體差異很大的一種主觀感受。生理性疼痛對機體具有保護作用，慢 性的病理性痛往往長期持續難以忍受，導致患者機體功能失調、康復困難以及精神抑鬱，給 家庭和社會帶來巨大的經濟負擔。由於慢性痛在臨床上缺乏有效的緩解策略，現有的藥物如 嗎啡、非甾體類抗炎藥等存在鎮痛效果不佳、成癮以及毒副作用等問題。因此，闡明慢性痛 的分子機理以便尋找有效的鎮痛策略，已成為生命醫學領域的重點。慢性痛的病因非常複雜，其臨床症狀表現為自發痛(spontaneous pain)，痛覺過敏 (hyperalgesia)和觸誘發痛(allodynia)。自發痛指無外來刺激自發產生痛；痛覺過敏定義為機體 對傷害性刺激產生誇大的痛反應；而觸誘發痛則指非傷害性輕觸刺激可產生疼痛感受。發生 於損傷區的痛敏稱為原發性痛敏(primary hyperalgesia),包括機械和熱痛敏；機體損傷對側 的痛覺過敏稱為鏡像痛敏(mirror image hyperalgesia^電壓門控鈉通道生理學特性的改變被認為是誘發諸如疼痛等眾多神經系統疾病的重要因 素。同時電壓門控鈉通道也已經被證實是許多鎮痛藥物的天然靶點。許多天然動物毒素多肽成分已被鑑定為選擇性地作用在不同物種電壓門控鈉通道或同一 物種不同電壓門控鈉通道亞型的調製劑。BmK I是從東亞鉗蠍粗毒(Buthus martensi Karsch Venom)中分離純化而得的一類特異性作用於鈉通道受體位點3的長鏈a-類蠍毒。它對於外 周神經系統具有強烈的致興奮性效應，抑制TTX敏感和不敏感的鈉通道的失活化過程，降低 TTX敏感鈉通道的激活閾值，易化鈉電流的激活，增加TTX不敏感鈉通道的峰鈉電流，從而 影響外周傷害性感受神經元的生理學特性。為了模擬人類炎症痛或神經病理痛的臨床症狀，前人建立的若干不同類型的炎症痛和神 經病理痛實驗動物模型見表一。表一 常用實驗性炎症痛模型及其模擬臨床症狀對比自發痛原發性熱 痛敏原發性機械 痛敏繼發性熱痛敏 /鏡像熱痛敏鏡像機械 痛敏蜂毒模型單相持續>48小時72-9小時>48小時無-120分鐘福馬林實驗 (Formalin)雙相 I相0-10分鐘； II相21-60分 鍾無無無無角叉菜膠模型 (Carrageenin)無有有未描述未描述辣椒素模型 (Capsaicin)單相短暫5-10 分鐘瞬間瞬間無無完全弗氏佐劑 (Complete Freund's adjuvant)無有有未描述未描述綜合比較各種炎症痛模型便可發現，迄今沒有一種模型可以模擬全部的疼痛臨床症狀。 每一種動物模型均有自身的特點和不足。特別是在模擬鏡像機械痛這一困擾醫學界的特殊臨 床症狀方面，還沒有一種動物模型能為探明鏡像痛機制提供穩定的研究載體。

發明內容
本發明的目的之一在於提供一種鈉通道調製劑BmKI在建立誘導疼痛模型中的應用。 上述的疼痛模型有實驗性自發痛模型、實驗性鏡像機械痛敏、實驗性熱痛敏或實驗性 水腫痛。本發明將鈉通道調製劑BmKI注射入大鼠左後足足心皮下，觀察BmKI對於大鼠自發痛、 機械痛敏、熱痛敏和水腫的誘導情況。結果證明，BmKI可以顯著地、劑量依賴性地誘導大 鼠產生長達2小時的單相自發痛行為、長達8天的雙側(即鏡像)機械痛敏行為、長達96小 時的單側(注射側)熱痛敏行為和長達24小時的注射側足部水腫症狀。因此本發明建立起的 新型、穩定的實驗性動物疼痛模型，為模擬疼痛的臨床症狀，研究疼痛的分子機制以及鎮痛 策略提供了研究載體，同時也為研發新型鎮痛藥物提供了可靠的篩選平臺。本發明中採用天然蠍毒素BmK I構建的誘導實驗性蠍蜇痛模型，新穎之處在於該模型不4僅能夠穩定的模擬臨床常見的自發痛、熱痛敏、機械痛敏等症狀，更能很好的模擬臨床鏡像
機械痛症狀和陣發性痛覺大發作症狀，較其他模型有著更高的研究價值。


圖1為大鼠左後足皮下注射不同劑量BmKI後誘導自發縮足反應持續時程。
圖2為大鼠左後足皮下注射不同劑量BmK I後誘導舔咬注射足的持續時程。
圖3為不同劑量BmKI誘導的2小時內大鼠自發抬足總次數。
圖4為不同劑量BmK I誘導的2小時內大鼠舔咬注射足總時長。
圖5為不同劑量BmK I誘導的2小時內痛覺大發作行為次數。
圖6為不同劑量BmK I誘導的注射側機械痛敏持續時程。
圖7為不同劑量BmK I誘導的注射對側機械痛敏持續時程。
圖8為不同劑量BmKI誘導的注射側熱痛敏持續時程。
圖9為BmK I不能誘導大鼠注射對側足熱痛敏產生。
圖10為不同劑量BmK I誘導的注射側足部水腫持續時程。
具體實施例方式
BmK I的分離純化詳細方法及實驗條件請參見Ji Y.H., Mansuelle P., Terakawa S.， Kopeyan C., Yanaihara N.， Xu K. & Rochat H. (1996) Two neurotoxins (BmK I and BmK II) from the venom of scorpion Buthus martensi Karsch: purification, amino acid sequences and assessment of specific activity, Toxicon， 34(9):987-1001
實施例一BmKI對大鼠自發痛行為的誘導觀察
在鋪有一面玻璃鏡的桌上放一高75 cm支架，架上置一20X20X30cmS透明有機玻璃盒 子，自桌上的鏡中觀察大鼠足底給藥後的反應。藥物注射前，將大鼠提前30分鐘置於盒中 適應實驗環境。足底注射BmKI後，動物放回檢測盒，持續觀測自發痛行為。以每5分鐘自 發抬足次數、每5分鐘碎咬注射足時間、總自發抬足次數、總舔咬足時間以及嘶叫等痛覺大 發作次數來評價傷害性自發痛反應。BmKI對大鼠自發痛行為的誘導情況詳見圖1 圖5。
結果發現，在大鼠左後足注射BmKI後，可劑量依賴性的誘導大鼠產生單相的、長達2 小時的自發痛行為。誘發的自發痛相關反應可很好的模擬臨床急性痛症狀，誘發的陣發性痛 覺大發作行為可以很好的模擬臨床陣發性痛覺發作症狀。
實施例二 BmKI對大鼠機械痛敏的誘導觀察
實例一中自發痛基本消失後，將大鼠置於在鋼絲網格(lcm^上的有機玻璃盒(20X20X30 cm3)中。用一系列vonFrev纖維(58Q11. Stoeltine Co., USA) (i0.6至U26e)來測量機械縮足反射闔值。當大鼠注射側後足接觸地面並正常負重時即可測量。從網格下剌激動物注射側 後肢足底中心皮膚，每根纖維彎曲至適當程度停留2-3秒，兩次測量間隔10秒。vonFrey纖 維的刺激強度由小到大。如果沒有縮足反射，使用更大克數的纖維繼續測量，測量最大值為 26g。取能引起50%縮足反應的最小克數值為機械縮足反射閾值。機械痛閾值取毒素注射後2 小時、4小時、8小時及注射後1天至9天共12個時間點進行採集。
結果發現，在大鼠左後足注射BmKI後，可劑量依賴性的誘導大鼠產生長達8天的雙側 後肢機械痛敏。BmKI對大鼠機械痛敏的誘導情況詳見圖6 圖7。誘發的注射對側機械痛敏 可以很好的模擬臨床常見的鏡像機械痛症狀。
實施例三BmKI對大鼠熱痛敏的誘導觀察
將一個20X20X30 cm3的有機玻璃罩放置在一塊厚度為2毫米的玻璃板上，大鼠置於其 中，玻璃下方是熱痛刺激儀的滷素燈照射頭(150W,24V，西安風嵐器械廠出品，RTY-3型)。 照射頭距玻璃板的下表面調至3 cm，照射光圈直徑調至3mm照射在玻璃板下方。熱刺激直 接施加在大鼠後足足心。測量自動切斷時間為15秒，以免損傷組織。同一位點重複測量5次。 同一位點測量每兩次間隔至少10分鐘，不同位點測量每兩次間隔5分鐘。測三次，取平均值 作為熱縮足反射閾值。熱痛閾值取毒素注射後2小時、4小時、8小時、24小時、48小時、 96小時共6個時間點進行採集。
結果發現，大鼠左後足注射BmK I後，可劑量依賴性的誘導大鼠產生長達96小時的單 側(注射側)後肢熱痛敏。BmKI對大鼠熱痛敏的誘導情況詳見圖8—圖9。誘發的熱痛敏可 以很好的模擬臨床熱痛覺過敏症狀。
實施例四BmKI對大鼠足部水腫的誘導觀察
大鼠後足水腫的誘導情況以足厚度為指標表示。足厚度取毒素注射前和注射後IO分鐘、 30分鐘、l小時、2小時、4小時、8小時、24小時共8個時間點，以千分尺測量後足中心背 腹徑長度所得。以足底注射前(基線)後足厚度淨增值表示水腫變化。每個時間點測量三次， 取平均值。BmKI對大鼠足部水腫的誘導情況，詳見圖IO。
結果發現，大鼠左後足注射BmK I後，可劑量依賴性的誘導大鼠產生長達24小時的單 側(注射側)足部水腫反應。誘發的該水腫反應可很好的模擬臨床炎症痛的急性局部水腫症 狀。
權利要求
1.一種鈉通道調製劑BmK I在建立誘導誘導疼痛模型中的應用。
2. 根據權利要求1所述的鈉通道調製劑BmK I在建立誘導誘導疼痛模型中的應用， 所述的疼痛模型為實驗性自發痛模型、實驗性鏡像機械痛敏、實驗性熱痛敏或實 驗性水腫痛。
全文摘要
本發明涉及一種新型特異性鈉通道調製劑BmKI的新應用。本發明將長鏈α類蠍神經毒素BmK I注射入大鼠左後足足心皮下，從行為學和形態學等方面，觀察其對大鼠自發痛、機械痛敏、熱痛敏和足部水腫的誘導情況，構建起實驗性動物蠍蜇痛模型。該項發明建立的實驗性動物疼痛模型，為研究疼痛和鎮痛分子機制提供了研究載體，同時也為研發新型鎮痛藥物提供了篩選平臺。
文檔編號A61K38/17GK101647999SQ20091005389
公開日2010年2月17日 申請日期2009年6月26日 優先權日2009年6月26日
發明者吉永華, 周智磊, 峰 姜, 楊宏天, 酩 程 申請人:上海大學