腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達及其用途的製作方法

2023-12-01 05:07:11

專利名稱：腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及化合物在醫學領域的應用，尤其涉及腎上腺素受體激動劑在治療貧血 病中的應用。
背景技術：
腎上腺素受體激動劑是指一類具有類似腎上腺素的功能或具有能使腎上腺素受 體產生興奮作用的化合物，大多具有β 「苯乙胺的化學基本結構，包含苯環、碳鏈和氨基， 其所含化學基團的不同可以決定其藥效的側重、強弱和時效差異。按照其主要結構特徵可 分為兒茶酚胺類和非兒茶酚胺類(見表1)。表1主要腎上腺素受體激動劑結構特徵類別
同時，不同的腎上腺素受體激動劑可以選擇性地作用於α、β等受體(見表2)。
表2主要腎上腺素受體激動劑與腎上腺素受體結合的特徵類別
在臨床使用的腎上腺素受體激動劑中，去氧腎上腺素常作為非兒茶酚胺類α受體激動劑的代表性藥物，異丙腎上腺素常作為兒茶酚胺類β受體激動劑的代表性藥物，開展腎 上腺素受體激動劑的藥理學研究，通過對該代表性藥物的研究，了解腎上腺素受體激動劑 的藥理學的功能研究(趙亞力，等。2008。中華老年多器官疾病雜誌。2008年12月第7卷 第 6 期，495-498)。在腎上腺素受體激動劑中的臨床應用，已知的臨床採用例如去氧腎上腺素 (phenylephrine, ΡΕ)對血管有強烈的收縮效應。在臨床上主要用於減充血劑，擴瞳劑和升 壓藥。由於去氧腎上腺素是一種直接的選擇性的α-腎上腺受體刺激物，並不引起內源的 去甲腎上腺素的釋放。因此，去氧腎上腺素一般不會引起對中樞神經系統的刺激、失眠、焦 慮不安等等副作用。其作為減充血劑的效應來自其鼻血管收縮，從而導致竇狀隙血管的血 流下降，減少黏膜水腫。也有用以局部的注射治療陰莖的異常勃起的療效。其使用的主要副 作用是導致血壓增高(Hatton et al.，2007. Annals of Pharmacology. 41: 381-390; Dai et al. , 2010. European Journal of Pharmacology. 629, 82-88)。又如異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO),異丙腎上腺素是一種擬交感(神經) 的β腎上腺刺激藥物。其結構上與腎上腺素相似，可以與β 1和β 2受體結合。其主要的臨 床主要用途是心動過緩或心傳導阻滯。通過激活心臟的β 1受體，可以誘導心律的變時、心 髒神經調節的變導，增強心肌收縮性。在沙丁胺醇(salbutamol)廣泛使用前，ISO也被作為 氣霧治療哮踹，主要通過的是作為β 2腎上腺素受體的激動劑鬆弛氣管改善呼吸。其主要 的進藥方式是靜脈注射、口服、吸入氣霧、皮下和肌肉注射等。其主要的副作用是對心血管 系統的影響，可以導致心律加快，可能使患者發生心律失常(Wallukat 2002. Herz. 27， 683-690; Evans et al. , 2010. British Journal Pharmacology. 159，1022-1038)。動物體內含有多種血紅蛋白基因，為有效的氧攜帶需求，有效的血紅蛋白常由2 個α-珠蛋白與另外的兩個珠蛋白組成異源蛋白四聚體，成為高效的氧氣攜帶蛋白體。而 與α-珠蛋白有效的這類四聚體的另外兩個珠蛋白常伴隨著紅細胞的形態變化、紅細胞發 生的部位發生轉換，從而導致血紅蛋白的成分發生變化。人類的血紅蛋白在胚胎起始期主 要表達ε_珠蛋白與α-珠蛋白結合，在大約原腸期6-8周時，發生了人類的胚胎期的血 紅蛋白轉換(embryonic switch), ε -珠蛋白的編碼基因開始沉默，而與此同時，取而代之 的是胚胎型珠蛋白(Y-珠蛋白)基因開始表達，此類Y-珠蛋白表達上升並維持在整個胎 兒成長期，此後再次的血紅蛋白轉換，即胎兒期轉換(fetal switch)發生於圍產期(出生後 1月結束)，在這一次血紅蛋白的表達轉換過程中，Y-珠蛋白的表達基本沉默，人體開始表 達β-和δ-珠蛋白基因和其產物的合成，使胚胎期的血紅蛋白(fetal hemoglobin, HbF) 的表達在成年血紅細胞中的合成下降，在成年階段的α 2 Y2珠蛋白四聚體的含量僅佔成年 的血紅蛋白總含量的1%以下，成年階段主要的血紅蛋白為血紅蛋白Α，即α2β2四聚體，而 另外一種也僅在成年期表達合成的成年血紅蛋白Α2 (即Ci2 δ2)也含量較少，低於血紅蛋 白總量的2%。由於發生較晚的胎兒期轉換fetal switch)對人類的生活影響較大，一般血 紅蛋白表達的轉換(hemoglobin switch)所指的便是此次轉換(Grosveld et al.，1987. Cell. 51，975-985; Bank. 2006. Blood. 107，435-443)。經過近30年的研究，人們發現人類的至少5個功能性珠蛋白的編碼基因ε、G Y、 AY、δ和β均位於第11號染色體上的一段IOOkb的位置，呈串聯狀態存在，其中至少發現 在人類β-珠蛋白編碼位點前含有一個位點控制區域(locus control region, LCR)，近幾
4年的研究表明對該LCR位點的表觀遺傳學特性的改變和調控對於人類的血紅蛋白的沉默、 表達和轉換具有重要的調節作用(Grosveld et al.，1987. Cell. 51，975-985; Yinet al. , 2007. Blood. 110，4101—4107)。一類由多種不同的遺傳突變導致的對成年階段珠蛋白的表達發生影響的遺 傳病，其表現為珠蛋白的合成完全消失或出現了明顯的下降。這類病例常發生於地中 海地區、中東、非洲和南亞，因此此疾病得名β型地中海貧血病。在某些病人中由於β-珠 蛋白的不足出現了成年階段α-珠蛋白合成未能與足量的β-珠蛋白結合成為成熟的血紅 蛋白四聚體，而導致血紅細胞的破裂和骨髓等生血部位發生的紅細胞前體的破壞。目前已 有超過200餘種不同的人類突變已被鑑定發生於該類患者人群中，包括β和δ β編碼區 域的缺失、β編碼區中終止密碼的提前出現導致無功能的蛋白合成、抑制珠蛋白前體 RNA的成熟加工過程等的突變。目前在我國也已有20多種突變的發生報導(李霞，等。2008。 中國優生與遺傳雜誌。16卷，第43頁)。根據導致珠蛋白缺陷的突變基因的攜帶者 主要出現在地中海地區，但由於種族間的通婚和移民活動的頻繁，過去不曾發現患病的區 域也開始有患者的出現記錄，例如隨著近期亞洲移民的湧入，北美地區β型地中海貧血病 的罹患群體也在出現變化，近來也主要出現在亞裔移民人群中(Vichinsky et al. , 2005. Pediatrics. 115，e818_825)。β型地中海貧血病也是我國南方地區最常見的遺傳性血液 病，主要發生於廣東、廣西和海南等省人群中，根據部分人口的調查統計，在廣東、廣西省攜 帶地中海貧血基因者分別達到了 11%和13%。其中在廣西橫縣2006年的一項調查也表明該 縣的新生兒中出現β型地中海貧血病的發病率高達4. 57% (顏秀梅，等。2007。中國婦幼 保健。22，1196)。鐮刀型血紅細胞貧血病是一種較為常見的隱性血紅蛋白突變遺傳病。是由點突變 導致人類β-珠蛋白編碼區的第六位纈氨酸(valine)改變為穀氨酸(glutamic acid)而 導致S型的血紅蛋白的合成。這種突變將導致無氧狀態下的S型血紅蛋白的溶解度大大下 降，從而使其在低氧狀態中的S型血紅蛋白在紅細胞中形成多聚體，從而導致紅細胞易碎。 該病例在沙哈拉以南的非洲地區、中東、地中海地區、印度此大陸、中南美洲易出現，純系突 變病人的伴隨著嚴重的併發症，壽命下降(Bianchi et al. , 2007. eCAM. 6，141-151; Testa, U. 2009. Annals of Hematology. 88， 505-528)。對於上述兩種由於成年階段的β-珠蛋白的突變導致的貧血病，一般的有效應急 治療方式是輸血，通過輸入健康的血液及對含有正常成年血紅蛋白的健康紅細胞的補充， 暫時改善患者血液的攜氧能力。然而此類方式由於血紅細胞的代謝周期，效果僅是緩解， 需要不斷通過輸血補充，這將帶來費用和對血源安全控制的高昂成本，並非根治措施。類 似的措施也有脊髓移植，此方法要求脊髓配型以及對原有脊髓幹細胞的完全破壞並培育轉 入的脊髓幹細胞達致正常擴增的風險，一般的配型基本來自近親，只能在16歲前施行該項 手術，並要求患者無肝病史。目前，此法仍是減輕該類患者有前途的治療方式，其長效性尚 待觀察。另外的替代治療措施是基因治療則受目前技術應用的憂患和操作的高額成本而 在可見的未來難以成熟推廣(Bianchi et al.，2007. eCAM. 6，141-151; Gambari and Fibach, 2007. Current Medical Chemistry. 14， 199—212)。然而由於有人發現在β型地中海貧血病患者中同時伴隨著Y-珠蛋白高表達的 遺傳突變者，其症狀大大減輕，使得許多醫療工作者開始了對Y-珠蛋白在成年中的再誘導表達對於上述兩種由於成年階段的珠蛋白的突變導致的貧血病的臨床治療效果開 始了觀察研究，研究發現對胚胎型血紅蛋白(HbF)，S卩Y-珠蛋白的誘導可以具有對上述兩 種由於成年階段的β-珠蛋白的突變導致的貧血病的明顯改善(Bianchi et al. , 2007. eCAM. 6, 141-151； Gambari and Fibach, 2007. Current Medical Chemistry. 14, 199-212; Testa, U. 2009. Annals of Hematology. 88， 505-528)。藉助人類血細胞前體細胞系K562作為研究平臺，根據人們對人體血紅蛋白串 聯基因簇的調節機制的認識(Rutherford et al.，1981. Proceedings of National Academy of Sciences, USA. 78, 348-352; Bianchi et al., 2007. eCAM. 6, 141-151)，近十年來，人們開始了對具有對人體胚胎型血紅蛋白的化學品的篩選及臨床應 用的毒副作用開展了一些研究觀察(Bianchi et al.，2007. eCAM. 6，141-151; Gambari and Fibach, 2007. Current Medical Chemistry. 14, 199-212)
5_氮胞苷(5-azaCytidine，5-Aza)是第一種被用以作為患者胚胎型血紅蛋白誘導表 達，病用作對前述兩種由於成年階段的珠蛋白的突變導致的貧血病患者開展治療的 化學品。其後致癌性相對較小的衍生物地他西濱(5-aZa-2』 -dexycytidine)被引入主要 開展臨床研究，受試的100%鐮刀型貧血病患者均由於其胚胎型血紅蛋白的高表達而使病 情有所緩解。2008年此藥物進入美國食品衛生署批准的針對鐮刀型貧血病治療的II期 臨床試驗(Appleton et al. , 2007. Journal of Clinical Oncology. 25，4519-4521; Saunthararajah et al. , 2008. British Journal of Haematology. 141, 126—129)。許多證據表明組蛋白去乙醯化酶的抑制劑可以導致胚胎型血紅蛋白的合成增加， 根據報導具有此類特性的化合物已有丁酸鈉(sodium butyrate)、adipicin、scriptaid{6 -(1, 3-Dioxo-lH, 3H_benzo [de] isoquinolin-2-yl) -N-hydroxyhexanamide}、曲古菌素 A( trichostatin A, TSA)、MS-275、RB7、丙戊酸(valproic acid)等，其中研究較多的是丁酸 鹽，但此類藥物的長期使用竟會出現對胚胎型的血紅蛋白的合成抑制，因此需要間歇使用， 另外也不是100%的鐮刀型紅細胞貧血病的患者都能對丁酸鹽類藥物發生應答效應(Witt et al. , 2000. Blood. 95，2391—2396; Cao, H. 2004. Hematology. 9，223—233; Johnson et al., 2005. Cell and Molecular Biology. 51, 229-238; Roondah1, G. 2006. Haematology. 81，374—376; Yin et al.，2007. Blood. 110，4101—4107)。早在1984年就在猴中發現羥基脲(hydroxyurea)可以刺激胚胎型血紅蛋白的產 生，但也不是所有的鐮刀型紅細胞貧血病的患者都能對羥基脲發生應答效應。2004年進 行的臨床試驗發現羥基脲可以減少在中度至重度鐮刀型貧血病導致急性胸悶的成年患者 中發生呼吸危及或休克的頻率，從而降低對其輸血和入院治療的需求，在這個以安慰劑為 對照的實驗結束後，羥基脲為美國食品衛生署批准為治療鐮刀型貧血病的藥物。多數鐮 刀型紅細胞貧血病的患者可以由羥基脲誘導胚胎型血紅蛋白的產生，但其誘導表達的合 成量卻明顯因人而異，這可能與血紅蛋白基因簇處的遺傳多態性有關。羥基脲是一個可 以通過促進自由氧基產生的細胞毒性物質，因此，有人擔憂其長期使用對體內遺傳物質的 改變，從而導致腫瘤的產生，但最近有美國健康研究院組織的統計表明使用該藥物的鐮刀 型貧血病患者與其他該病患者並未表現出明顯的腫瘤發病率上的差異。同時羥基脲針對 β-地中海貧血病的療效也取得了較為人滿意的結果。只是其療效也與人群的遺傳背景 相關(Steinberg et al. , 2003. JAMA. 289，1645-1652; Testa, U. 2009. Annals of
6Hematology. 88， 505-528·)。由於血液細胞的分化過程受多種血液幹細胞活性因子調控，例如紅細胞生成素 (erythropoiesis,印ο)和血液幹細胞因子(stem cell factor, SCF)。這類因子由於可 以促進有效的紅細胞生成，從而導致胚胎型血紅蛋白的重新表達達至胎兒時期，所以被認 為具有治療β-珠蛋白缺陷導致的疾病。在針對再生障礙性貧血、臍帶血液移植或癌症患 者進行的相關臨床試驗觀察中，紅細胞生成素和血液幹細胞因子誘導胚胎型血紅蛋白的 作用得到證實，只是有時伴有過敏反應，因此，有人建議如果採用紅細胞生成素和血液幹 細胞因子進行對鐮刀型貧血病和β地中海貧血病開展臨床治療，需要考慮長期低劑量的 方式，並適當關注其患者的過敏症狀的發生(Gabbianelli et al. , 2008. Blood. 111， 421-429.)。近來針對胚胎型血紅蛋白的誘導性化合物還有薩立多胺(Thalidomide)，該化 合物是一種穀氨酸衍生物，過去是用作鎮靜藥或治療暈船。後由於其致畸作用而被撤除 市場，隨後又作為免疫調節藥物、抗炎症和抑制血管生成藥物重新獲得採用的臨床處方 藥。2007年有報導在體外實驗中可以觀察到對胚胎型血紅蛋白的誘導作用。另外來那 度胺(Lenalidomide)和尼洛替尼(pomalidomide)，一類用作腫瘤藥物的免疫調節劑，在 2008也被顯示具有誘導胚胎型血紅蛋白的作用，尤其是在與羥基脲聯合使用時，具有較強 的對誘導胚胎型血紅蛋白的協同效應。近來，天然化合物中對胚胎型血紅蛋白的篩選工 作也得到重視，目前已有報導的自天然植物、微生物等產生的誘導胚胎型血紅蛋白的化合 物已有香檸檬油(Bergaptene)、異補骨脂素(Angelicin)、雷帕黴素(Rapamycin)、白藜蘆 醇(Resveratrol)、光神霄素(Mithramycin)禾口 5-甲氧基補骨月旨素(5—methoxypsoralen， 5-M0P)等。其主要篩選手段即為採用人類K562細胞系作為效應篩選平臺，進行體外誘導 人類胚胎型血紅蛋白的效應化合物的篩選，目前，針對這些天然化合物所開展的臨床應用 觀察的報導所見不多(Bianchi et al. , 2007. eCAM. 6，141-151; Gambari and Fibach, 2007. Current Medical Chemistry. 14， 199—212)。由上可知，雖然大量數據已表明多種化合物在臨床上具有對胚胎型血紅蛋白的誘 導效應，但也可見其誘導效率隨患者遺傳背景或多態性而異，許多影響因素甚至並非與突 變的血紅蛋白連鎖位點的遺傳多態性相關。其中由於治療或緩解β地中海貧血症需要更 高地對胚胎型血紅蛋白的誘導效率，而今主要的誘導劑的體內誘導能力仍不足以彌補體內 β-珠蛋白的缺失所帶來的症狀。以此角度看來，過去曾有學者認為血液幹細胞因子相對最 有希望，因其通過誘導紅細胞的生成，對胚胎型血紅蛋白的誘導作用相對較強，只是其可能 伴隨的副作用值得關注。因此，合理的解決途徑將是通過各類效應化合物的協同作用，通過 其誘導胚胎型血紅蛋白的各種誘導機制間的互補，通過長效、低劑量、交替的臨床使用，達 至最大可能的避免同一種藥物的長期使用對副作用的積累，並同時有效誘導人類胚胎型血 紅蛋白的合成，為由於珠蛋白的缺陷或表達水平異常而產生的各類血紅蛋白病、貧血 病的治療提供有力的治療手段。

發明內容
本發明的目的是提供了腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達。本發明的 另一目的是提供上述具有誘導胚胎型珠蛋白表達作用的腎上腺素受體激動劑用於治療β-珠蛋白自身缺陷或表達水平發生缺陷的遺傳疾病，可以緩解如β型地中海貧血病或鐮 刀型細胞貧血病的貧血症狀。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案
腎上腺素受體激動劑通過注射或者口服，對人類血細胞中胚胎型珠蛋白的表達具有誘 導作用，因此，腎上腺素受體激動劑可用於誘導人類胚胎型珠蛋白的表達。將具有誘導胚胎型珠蛋白表達作用的腎上腺素受體激動劑用於治療珠蛋白 自身缺陷或表達水平發生缺陷的遺傳疾病，可以緩解如β型地中海貧血病或鐮刀型細胞 貧血病的貧血症狀。本發明的優點和效果是將腎上腺素受體激動劑用於誘導胚胎型珠蛋白表達，因 而其可用於治療β-珠蛋白自身缺陷或表達水平發生缺陷的遺傳疾病，如對β型地中海 貧血病或鐮刀型細胞貧血病的患者進行其胚胎型珠蛋白的誘導，以緩解貧血病人的貧血症 狀。
具體實施例方式下面通過實施例，對本發明作進一步的說明。實施例一
腎上腺素受體激動劑通過注射或者口服，對人類血細胞中胚胎型珠蛋白的表達具有誘 導作用，因此，腎上腺素受體激動劑可用於誘導人類胚胎型珠蛋白的表達。所述的腎上腺素受體激動劑採用去氧腎上腺素、或異丙腎上腺素、或腎上腺素、或 去甲腎上腺素、或麻黃鹼、或多巴胺、或間羥胺、或多巴酚丁胺。所述的腎上腺素受體激動劑採用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素。將具有誘導胚胎型珠蛋白表達作用的腎上腺素受體激動劑用於治療珠蛋白 自身缺陷或表達水平發生缺陷的遺傳疾病，可以緩解如β型地中海貧血病或鐮刀型細胞 貧血病的貧血症狀。所述的腎上腺素受體激動劑採用去氧腎上腺素、或異丙腎上腺素、或腎上腺素、或 去甲腎上腺素、或麻黃鹼、或多巴胺、或間羥胺、或多巴酚丁胺。所述的腎上腺素受體激動劑採用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素。實施例二
用去氧腎上腺素(phenyl印hrine，ΡΕ)和異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)作用於 腎上腺素α或β受體的刺激物處理成年斑馬魚，導致了斑馬魚胚胎型血紅蛋白在成年階 段的再表達。其表達方法和結果如下
la、將放入含有為50微摩爾濃度的去氧腎上腺素水體中飼養7天的成年斑馬魚作為去 氧腎上腺素處理組；將放入含有為50微摩爾濃度的異丙腎上腺素水體中飼養7天的成年斑 馬魚作為異丙腎上腺素處理組；在正常水體中同期飼養的成年斑馬魚作為對照組；
lb、用乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)和肝素作為抗凝劑， 分別採集去氧腎上腺素處理組、異丙腎上腺素處理組和對照組的斑馬魚血液；
lc、對各組斑馬魚血樣中血細胞中血紅蛋白mRNA含量均採用下列方法進行檢測； Id、提取血液的總RNA樣本，反轉錄合成cDNA，應用螢光實時定量多聚酶鏈反應對血液 樣本中的斑馬魚的成年型α血紅蛋白和胚胎型β血紅蛋白的mRNA進行定量檢測，檢測反
8應中使用的擴增引物分別為
斑馬魚成年型血紅蛋白mRNA (NCBI基因文庫序列號為NM_131257) 斑馬魚成年型α血紅蛋白的正向引物5' - TACCATGAGTCTCTCTGATA -3' 斑馬魚成年型α血紅蛋白的反向引物5' - TCAGCCCAATGAGAGAAATA -3' 斑馬魚胚胎型β血紅蛋白mRNA (NCBI基因文庫序列號為ΝΜ_001080093) 斑馬魚胚胎型β血紅蛋白的正向引物5' - CGAGAAGGCCACCATTCAAG -3' 斑馬魚胚胎型β血紅蛋白的反向引物；5' - CCCAGGATGGCAGCGGCATT -3' 檢測中以斑馬魚細胞骨架蛋白，β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA作為內參標準(NCBI 基因文庫序列號為NM_131031)
斑馬魚β-肌動蛋白的正向引物5，- cgagcaggagatgggaacc-3 斑馬魚β-肌動蛋白的反向引物5』 -caacggaaacgctcattgc-3』 le、螢光實時定量多聚酶鏈反應對血液樣本中的斑馬魚的成年型α血紅蛋白和胚胎 型β血紅蛋白mRNA的定量檢測得到如下結果
如表3所示，經去氧腎上腺素或異丙腎上腺素處理成年斑馬魚後，其血細胞樣品中胚 胎型β血紅蛋白mRNA較對照組明顯升高，而成年型α血紅蛋白mRNA則略有下降。
表3.螢光實時多聚酶鏈反應對斑馬魚血細胞中血紅蛋白的mRNA表達水平的檢 測結果
實施例三
分別採用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素體外誘導人類血細胞系K562中的胚胎型珠 蛋白mRNA的表達。其表達方法和結果如下
2a、人類血細胞系K562放入培養液中，在溫度為37°C、溼度為95%、CO2濃度為5%的培 養箱中培養，培養液為含10%胎牛血清、青黴素100單位/升、鏈黴素100毫克/升的RPM I 1640培養基；
2b、在培養箱中取K562細胞，用培養液將K562細胞密度調為IO5個細胞/毫升K562 細胞液；
2c、取20毫升K562細胞液，加入去氧腎上腺素，使去氧腎上腺素終濃度至5微摩爾，培養4天後的細胞培養物作為去氧腎上腺素處理組；取20毫升K562細胞液，加入異丙腎上腺 素，使異丙腎上腺素終濃度至5微摩爾，培養4天的細胞培養物作為異丙腎上腺素處理組； 取20毫升K562細胞液，培養4天的細胞培養物作為對照組； 2d、分別取三個組的細胞培養物5毫升；
2e、對各組細胞培養物中的珠蛋白mRNA含量均採用下列方法進行檢測； 2f、在細胞培養物中提取總RNA，取5微克總RNA反轉錄合成cDNA，應用螢光實時定量 多聚酶鏈反應對K562細胞培養物樣本中的成年型β珠蛋白和胚胎型珠蛋白的mRNA進行 定量檢測，檢測反應中使用的擴增引物分別為
人類胚胎型珠蛋白mRNA (NCBI基因文庫序列號為NM_000559. 2) 人類胚胎型珠蛋白的正向引物5' -AATGTGGAAGATGCTGGAGGAGAA -3' 人類胚胎型珠蛋白的反向引物5' -CTTCTTGCCATGTGCCTTGACTT -3' 人類成年型β-珠蛋白mRNA (NCBI基因文庫序列號為NM_00518. 4) 人類成年型β-珠蛋白的正向引物5' -CCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTAC -3' 人類成年型β -珠蛋白的反向引物；5 『 -TAGACCACCAGCAGCCTGCC -3 『 檢測中以人類細胞骨架蛋白，β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA作為內參標準(NCBI基 因文庫序列號為NM_001101.3)
人類β -肌動蛋白的正向引物5 『 -AAGAGCTACGAGCTACCTGAC -3 『 人類β -肌動蛋白的反向引物5 『 -ATGCCACAGGACTCCATGCC -3 『 2g、螢光實時定量多聚酶鏈反應對Κ562細胞樣本中的人類胚胎型珠蛋白mRNA和成年 型β -珠蛋白mRNA的定量檢測得到如下結果
如表4所示，經去氧腎上腺素或異丙腎上腺素處理K562細胞後，細胞中的人類胚胎型 珠蛋白mRNA較對照組明顯升高，而成年型β珠蛋白mRNA則略有下降。
表4.螢光實時多聚酶鏈反應對人類血細胞系K562培養物中珠蛋白mRNA表達水 平的檢測結果
上述結果表明，去氧腎上腺素或異丙腎上腺素具有對成年斑馬魚的胚胎型血紅蛋白在 成年階段再表達的誘導作用；去氧腎上腺素或異丙腎上腺素體外處理人類血細胞系K562， 可以誘導人類胚胎型珠蛋白mRNA的表達。因而去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素可用於治 療由人類β-珠蛋白自身缺陷或表達水平發生缺陷的遺傳疾病，如β型地中海貧血病或鐮刀型細胞貧血病的患者進行其胚胎型珠蛋白的誘導，以緩解貧血病人的貧血症狀。
綜上研究結果，說明斑馬魚或人體血細胞通過接觸腎上腺素α或β受體激動劑 的去氧腎上腺素或異丙腎上腺素，可以誘導處理後的斑馬魚或人類血液細胞中的胚胎型血 紅蛋白的表達，因此，去氧腎上腺素或異丙腎上腺素通過注射和口服，導致的對人類血細胞 中的胚胎型珠蛋白的表達誘導作用，可以用以對由於β _珠蛋白自身缺陷或表達水平發生 缺陷的遺傳疾病，如β型地中海貧血病或鐮刀型細胞貧血病的患者進行其胚胎型血紅蛋 白的誘導，以緩解貧血症狀。
權利要求
腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達，其特徵在於，腎上腺素受體激動劑用於誘導人類胚胎型珠蛋白的表達。
2.根據權利要求1所述的腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達，其特徵在於， 所述的腎上腺素受體激動劑採用去氧腎上腺素、或異丙腎上腺素、或腎上腺素、或去甲腎上 腺素、或麻黃鹼、或多巴胺、或間羥胺、或多巴酚丁胺。
3.根據權利要求1所述的腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達，其特徵在於， 所述的腎上腺素受體激動劑採用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素。
4.權利要求1所述的腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達的用途，其特徵在 於，腎上腺素受體激動劑用於治療人類β型地中海貧血病或鐮刀型細胞貧血病。
5.根據權利要求4所述的腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達的用途，其特徵 在於，所述的腎上腺素受體激動劑採用去氧腎上腺素、或異丙腎上腺素、或腎上腺素、或去 甲腎上腺素、或麻黃鹼、或多巴胺、或間羥胺、或多巴酚丁胺。
6.根據權利要求4所述的腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白表達的用途，其特徵 在於，所述的腎上腺素受體激動劑採用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素。
全文摘要
本發明公開了腎上腺素受體激動劑誘導胚胎型珠蛋白的表達及其用途，涉及化合物在醫學領域的應用，尤其涉及腎上腺素受體激動劑在治療貧血病中的應用。本發明將腎上腺素受體激動劑用於誘導胚胎型珠蛋白的表達，因而這些物質可用於治療β-珠蛋白自身缺陷或表達水平發生缺陷的遺傳疾病，如對β型地中海貧血病或鐮刀型細胞貧血病的患者進行其胚胎型珠蛋白的誘導，以緩解貧血病人的貧血症狀。
文檔編號A61P7/06GK101926998SQ20101027774
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月10日 優先權日2010年9月10日
發明者尹乃達, 梅芸, 殷戰, 賀江燕 申請人:中國科學院水生生物研究所