一種茶葉籽酚類化合物的定性方法與流程
2023-12-05 16:31:06 1
本發明涉及酚類化合物的定性研究領域，尤其涉及一種茶葉籽酚類化合物的定性方法。
背景技術：
茶樹(Camellia Sinensis O.Ktze)為山茶科山茶屬植物，起源於我國雲貴高原。茶樹葉子、果實等植物材料富含茶多酚。酚類化合物是植物中一種重要的次生代謝產物，其分子結構中含有若干個酚性羥基基團，一般分為酚酸類、黃酮類、單寧類、黃烷醇類和苷類等。兒茶素類是山茶屬植物的特徵酚物質，屬於黃烷醇類化合物，一般存在於該屬植物的花、莖、葉和果實中。研究表明，植物酚類化合物是一種天然抗氧化劑，能清除人體內的NO和ROS自由基，抑制氧化酶活性和激活抗氧化酶體系。另有報導表明，酚類化合物能有效抑制細菌和真菌的生長，同時可以抑制癌細胞增殖，降低致癌誘變劑的活性。
目前，國內外對茶葉籽酚類化合物組成的研究報導不多，主要集中於對酚類物質提取工藝的優化和總酚含量測定，其中應用最為廣泛的分析技術為紫外分光光度法，而對酚類化合物組成的定性則採用UHPLC技術。顯然，目前的分析方法需依賴已知的標準品，具有一定的局限性；同時，液相色譜技術靈敏度不高，難以用於微量物質的鑑定。
技術實現要素：
為了解決茶葉籽酚類定性問題，本發明的目的在於提供一種無需標準品、分析靈敏度高、選擇性好的茶葉籽酚類定性方法。
為實現上述目的，本發明提供一種茶葉籽酚類化合物的定性方法，其特徵在於，採用超高效液相色譜-四級杆-飛行時間串聯質譜法(UHPLC-Q-TOF-MS)鑑定。
一種茶葉籽酚類化合物的定性方法，其特徵在於，採用超高效液相色譜-四級杆-飛行時間串聯質譜法鑑定。
所述鑑定包括以下步驟：
樣品前處理：稱取茶葉籽粉置於錐形瓶中，加入提取液搖勻、震蕩提取、離心，收集上層澄清液，沉澱物重複提取，合併上清液旋蒸濃縮至幹後得到提取物，提取物用有機溶液溶解得到溶解液，溶解液經有機膜過濾，密封冷藏得到待分析液；
離子色譜圖的獲得：設置相應的液相色譜條件和質譜條件，通過超高效液相色譜-四級杆-飛行時間串聯質譜法對前處理中獲得的待分析液進行檢測，得到總離子流色譜圖及提取特徵離子色譜圖；
茶葉籽提取物化學成分的初步鑑定：分析檢測所獲得的總離子流色譜圖及提取特徵離子色譜圖，計算該特徵離子對應的未知化合物的元素組成和精確分子量，依據元素組成和精確分子量對未知化合物進行初步鑑定；
誘導裂解：選擇離子豐度>106cps的分子離子峰對未知化合物進行碰撞誘導裂解，通過裂解所得的二級質譜得到未知化合物相應的碎片離子；
茶葉籽提取物化學成分判斷：根據未知化合物的裂解情況和裂解所得的碎片離子推斷提取物中酚類化合物種類。
所述樣品前處理步驟中的提取液為乙醇水溶液，優選，提取液選取醇類溶液提取效果好，但是甲醇等醇溶液具有一定毒性，選取環境友好的50％乙醇水溶液(v/v)作為提取液，乙醇溶液濃度低於50％時，萃取效果較差；濃度高於50％時，有機溶劑含量太高。
所述樣品前處理步驟中的溶解液為甲醇水溶液，優選，50％甲醇水溶液(v/v)溶解效果及分離效果最佳，甲醇溶液濃度低於50％時，溶解效果差；濃度高於50％時，分離效果差。
所述樣品前處理步驟中的震蕩提取為60℃振蕩提取1h，溫度低於60℃，提取效果差，溫度高於60℃，有機化合物容易發生氧化反應；振蕩時間高於1h，提取效果變化不明顯，且有機化合物容易發生氧化反應；低於1h，提取效果差。
所述樣品前處理步驟中的離心為轉速4000rpm離心10min，旋蒸濃縮為在35℃下旋蒸濃縮至幹；離心時間少於10min，離心效果差，高於10min，離心效果變化不明顯；濃縮溫度低於35℃，濃縮不徹底，溫度高於35℃，有機物容易發生反應。
進一步的，所述樣品前處理為：準確稱取茶葉籽粉於錐形瓶中，加入20-30倍茶葉籽粉重量體積比(g/ml)的50％乙醇水溶液v/v搖勻，於60℃下振蕩提取1h後，在4000rpm轉速下離心10min，收集上層澄清液，繼續向剩餘沉澱物中加入8-10倍茶葉籽粉重量體積比(g/ml)的50％乙醇水溶液v/v清洗，離心收集上清液，重複提取1-3次，合併上清液於35℃下旋蒸濃縮至幹後，用50％甲醇水溶液v/v定容至0.25倍茶葉籽粉重量體積比(g/ml)得到溶解液，溶解液經0.2μm有機濾膜過濾得到待分析液，密封冷藏待分析。
所述色譜圖的獲得步驟中的液相色譜條件為：
色譜柱為Agilent Eclipse Plus-C18，100mm×2.1mm，1.8μm；
流動相：A為0.1％甲酸水溶液v/v，B為0.1％甲酸乙腈溶液v/v；
梯度洗脫：0-5min：5％-10％B，5-7min：10％-20％B，7-9min：20％B，9-10min：20％-50％B，10-12min：50％B，12-13min：50％-5％B，13-15min：5％B；以上百分含量均為體積比；
流速0.4mL/min；柱溫30℃；進樣量2.0μL；平衡時間3min。
進一步的，所述離子色譜圖的獲得步驟中的質譜條件為：
一級質譜，採用鞘流電噴霧雙噴源，在負離子掃描方式下進行數據採集，參比離子m/z為112.9855和980.0163，乾燥氣為高純N2，毛細管電壓4000V，霧化氣壓力30psig，碎裂電壓140V，乾燥氣溫度190℃，乾燥氣流速9L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速10L/min，離子掃描範圍m/z 100～1100；
二級質譜，採用鞘流電噴霧雙噴源，在負離子掃描方式下進行數據採集，參比離子m/z為112.9855和980.0163，乾燥氣為高純N2，毛細管電壓4000V，霧化氣壓力30psig，碎裂電壓140V，乾燥氣溫度190℃，乾燥氣流速9L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速10L/min，離子掃描範圍m/z 100～1100；碰撞能量設定為10～40eV。
所述茶葉籽提取物化學成分的初步鑑定為，首先提取總離子流色譜圖中主要色譜峰對應的特徵質譜離子，通過Qualitative Analysis離線分析軟體提取該特徵質譜離子對應的色譜圖，通過Q-TOF定性軟體計算該特徵質譜離子對應的化合物的元素組成和精確分子量，通過查閱參考文獻匯總山茶屬植物酚類化合物的基礎信息，將未知化合物的元素組成與山茶屬植物酚類化合物的基礎信息進行比對，依據元素組成和精確分子量對未知化合物進行初步鑑定。
所述參考文獻為：
1.牛研,王書芳.LC-Q-TOF-MS和LC-IT-MSn分析當歸芍藥散中化學成分[J].中草藥，2014，45(8)：1056～1062
2.Vallverdú-Queralt A,Estruch R,Lamuela-Raventos R M.Bioactive compounds present in the Mediterranean sofrito[J].Food Chemistry,2013,141(4):3365-72.
3.劉國強,董靜,王弘,等.EGC/GC和EGCG/GCG的ESI-IT-TOF質譜裂解規律研究[J].質譜學報,2009,30(05):287-294.
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5.Zou L L,Li X X,Shi Q S,et al.An effective integrated method for comprehensive identification of eighty-five compounds in Zhi-Zi-Da-Huang decoction by HPLC-DAD-ESI-MS(TOF)and HPLC-DAD-ESI-MS/MS(QqQ)without the help of reference standards[J].Analytical Methods,2014,6(12):4312～4327
6.許文，傅志勤，林婧,等.HPLC-Q-TOF-MS和UPLC-QqQ-MS的三葉青主要成分定性與定量研究[J].中國中藥雜誌，2014，39(22)：4365～4372.
7.張小平,蔣可志，呂惠卿，等.HPLC-Q-TOF MS鑑定條葉榕根莖乙酸乙酯提取物中的主要化學成分[J].質譜學報，2015，36(4)：310～320
包括但不限於上述參考文獻。
本發明有益效果：本發明通過乙醇水溶液對茶葉籽粉進行提取，採用超高效液相色譜-四級杆-飛行時間串聯質譜技術對茶葉籽酚類化合物定性研究，本發明技術能夠在無標準品的情況下對粗提液中微量物質進行初步組成和結構分析，本發明與現有酚類化合物定性方法相比具有分析靈敏度高、選擇性好的優點，可以提高分析的特異性和準確度。
1、本發明色譜柱採用Agilent Eclipse Plus-C18，100mm×2.1mm，1.8μm，能較全面地反應茶葉籽提取物的化學成分，分離效果最佳；
2、本發明流動相採用乙腈-0.1％甲酸水溶液能有效抑制拖尾，峰形佳，響值高；
3、本發明質譜鑑別在負離子模式下全掃描檢測，大多數酚類化合物在負離子模式下響應較好，峰容量更大。
4、本發明首次鑑定了茶葉籽中酚類化合物的組成，為全面快速分析茶葉籽成分及其深度研發應用提供參考。
5、本發明通過分析各化合物的母離子以及碎片離子的精確質量，結合軟體與文獻數據等推斷化合物的結構。
附圖說明
圖1為茶葉籽提取液的UHPLC-QTOF/MS分離檢測得到的總離子流色譜圖；
圖2為茶葉籽提取液的UHPLC-QTOF/MS分離檢測得到的重疊提取特徵離子色譜圖；
圖3A、圖3B、圖3C、圖3D為UHPLC-Q-TOF/MS技術鑑定茶葉籽乙醇提取物中酚酸化合物的結構圖；
圖3E、圖3F為UHPLC-Q-TOF/MS技術鑑定茶葉籽乙醇提取物中兒茶素類化合物的結構圖；
圖3G、圖3H為UHPLC-Q-TOF/MS技術鑑定茶葉籽乙醇提取物中黃酮類化合物的結構圖；
圖4為化合物2的提取色譜圖；
圖5為化合物2的二級質譜圖；
圖6為化合物2推斷的裂解方式圖；
圖7為化合物4的提取色譜圖；
圖8為化合物4的二級質譜圖；
圖9為化合物4推斷的裂解方式圖；
圖10為24種酚類化合物標品UHPLC-Q-TOF-MS精確質量提取離子色譜圖；
圖11為表沒食子兒茶素及標準品匹配質譜圖；
圖12為原兒茶酸及標準品匹配質譜圖。
具體實施方式
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1：一種茶葉籽酚類化合物的定性方法
材料與試劑：
茶葉籽，採自福建省泉州市安溪茶園。
乙腈、甲醇、甲酸(均為色譜純)：美國Sigma-Aldrich公司；正己烷(色譜純)：西隴化工股份有限公司；實驗用水為自製超純水；苯甲酸、4-羥基苯甲酸、原兒茶酸、一水合沒食子酸、鄰苯二甲酸、4-羥基苯乙酸、香草酸、肉桂酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、綠原酸、表兒茶素、芹菜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、楊梅素、柚皮素(均為分析級標準品)：阿拉丁試劑公司；兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(均為分析級標準品)：美國Sigma公司；0.2μm有機濾膜：英國Whatman公司。儀器與設備：
Agilent 1290系列超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，配備在線脫氣系統、四元泵、自動進樣裝置、柱溫箱；Agilent 6540UHD高分辨飛行時間質譜儀(美國安捷倫公司)，配有鞘流雙電噴霧離子源(dual JetStream ESI)，MassHunter Data Acquisition實時採集工作站和Qualitative Analysis離線分析軟體；BS2202S分析天平，德國Sartorious公司；QL-861漩渦混合器，海門其林貝爾儀器製造公司；離心機：湖南湘儀；R215旋轉蒸發儀(配備B491水浴鍋，V700真空泵)，瑞士BUCHI公司；DLSB系列冷凝水循環，鄭州長城科工貿公司。
樣品前處理：
準確稱取茶葉籽粉1.00g於100mL錐形瓶中，加入25mL50％乙醇水溶液(v/v)搖勻，於60℃下振蕩提取1h後，在4000rpm轉速下離心10min，收集上層澄清液。繼續向剩餘沉澱物中加入10mL提取液清洗，離心收集上清液。重複提取三次，合併上清液於35℃下旋蒸濃縮至幹後，用50％甲醇水溶液(v/v)定容至0.25mL，溶解液經0.2μm有機濾膜過濾，密封冷藏待分析。
設置技術參數：
色譜條件
色譜柱：Agilent Eclipse Plus-C18，100mm×2.1mm，1.8μm；流動相：A為0.1％甲酸水溶液，B為0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脫：0-5min：5v/v％-10v/v％B，5-7min：10v/v％-20v/v％B，7-9min：20v/v％B，9-10min：20v/v％-50v/v％B，10-12min：50v/v％B，12-13min：50v/v％-5v/v％B，13-15min：5v/v％B。流速0.4mL/min；柱溫30℃；進樣量2.0μL；平衡時間3min。
質譜條件
採用鞘流電噴霧雙噴源，在負離子掃描方式下進行數據採集，參比離子m/z為112.9855和980.0163。具體質譜參數：乾燥氣為高純N2，毛細管電壓4000V，霧化氣壓力30psig，碎裂電壓140V，乾燥氣溫度190℃，乾燥氣流速9L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速10L/min，離子掃描範圍m/z 100～1100。二級質譜參數中碰撞能量設定為10～40eV。每天採集運行前，必須使用調諧液(氟化膦嗪、三嗪、三甲銨乙內酯和三氟醋酸混合物)進行質量軸校準，確保質量精度誤差在1×10-6以下。
應用UHPLC-Q-TOF/MS在上述色譜和質譜條件下對茶葉籽提取物進行分析，在負離子模式下測定提取液，得到圖1該提取物的總離子流色譜圖及圖2提取特徵離子流色譜圖。
其中圖1為茶葉籽提取液的UHPLC-QTOF/MS分離檢測得到的總離子流色譜圖，橫坐標為採集時間，縱坐標為離子豐度，圖2橫坐標為離子保留時間，縱坐標為離子豐度，由圖2可得特徵離子在保留時間1-12min產生了24個波峰，每一波峰代表一種化合物。
茶葉籽提取物化學成分的初步鑑別：通過Qualitative Analysis離線分析軟體對圖1提取特徵離子得到對應的提取離子色譜圖(圖2)，通過Q-TOF定性軟體計算該特徵離子對應的化合物的元素組成，通過查閱參考文獻匯總山茶屬植物酚類化合物的基礎信息，將未知化合物的元素組成與匯總的化合物信息進行比對，依據精確分子量對未知化合物進行初步鑑定。
誘導解離：選擇合適的分子離子峰對未知化合物進行碰撞誘導解離，通過裂解所得的二級質譜得到未知化合物相應的碎片離子。
茶葉籽提取物化學成分判斷：根據離子的裂解情況推斷茶葉籽乙醇提取物中的24種酚類化合物，其中包括13種酚酸化合物、4種兒茶素類化合物和7種黃酮類化合物，結果見表1，表1中總結出了不同峰號對應的保留時間、標準品保留時間、分子式、準分子離子峰及理論值、誤差、二級特徵碎片、定性化合物，結構示於圖3A-圖3H，由表1和圖3A-圖3H可知，其中圖3A、圖3B、圖3C、圖3D為酚酸化合物包含化合物1,2,3,5,6,7,9,10,13,14,15,17,21，圖3E、圖3F為兒茶素類化合物包含化合物4,8，11,12，圖3G、圖3H為黃酮類化合物包含化合物16,18,19,20,22,23,24。
表1茶葉籽酚類化合物UHPLC-Q-TOF/MS鑑定分析結果表
(1)酚酸類
酚酸類化合物極性強，保留時間較短，結合文獻及專業資料庫，在茶葉籽乙醇提取物中共鑑定出13種酚酸類物質,化合物1,2,3,5,6,7,9,10,13,14,15,17,21。以化合物2為例，其精確質量提取離子色譜圖見圖4，由圖4可知化合物2的保留時間為2.562對應的二級質譜圖見圖5。如圖5所示，母離子[M-H]-的m/z為153.0197，對應的最佳分子式為C7H6O4，經參考文獻比對，發現其與原兒茶酸分子離子峰一致，故初步推測其為原兒茶酸。可能的裂解方式示於圖6所示，母離子[M-H]-丟失羧基上一個-CO2基團，產生m/z 109.0295的碎片離子，進一步脫水得到m/z 91.0189的碎片離子。這個特徵離子與實際採集得到的二級碎片離子圖一致，結合文獻報導，推斷該化合物為原兒茶酸。
(2)兒茶素類
兒茶素類化合物容易發生丟失C2H2O碎片、C環的1，4鍵斷裂和丟失B環的裂解方式。在茶葉籽乙醇提取物中共鑑定出4種兒茶素類物質,化合物4,8，11,12。以化合物4為例，化合物4的精確質量提取色譜圖及二級質譜圖如圖7和圖8所示，其[M-H]-離子峰m/z為305.0653，對應的最佳分子式為C15H14O7，經參考文獻比對，發現其與表沒食子兒茶素一致，故初步推測其為表沒食子兒茶素。可能的碎裂方式如圖9所示，C環的1-4鍵斷裂，可產生m/z 125.0244的碎片離子。而丟掉B環和部分A環，可分別生成m/z為179.0350和219.0663的碎片離子。除了碎片離子m/z 219.0663由於豐度偏低而實測值偏大，相對偏差為9.13ppm之外,母離子和其它兩個主要碎片離子的實測m/z值與理論值相對偏差均在3ppm以內，而且子離子碎片信息與文獻報導一致。據此推斷，該化合物應該為表沒食子兒茶素。
(3)黃酮類
黃酮類化合物母體骨架特殊，負離子模式下，不同的黃酮類化合物均有典型的裂解規律，如C環易發生逆Diels-Alder(RDA)裂解。依據這些典型裂解方式，共初步鑑定出7種黃酮類成分：柚皮素、楊梅素、槲皮素、山奈酚、木犀草素、二氫槲皮素、芹菜素。如化合物18的碎片離子峰m/z為317.0299，經參考資料及資料庫比對與楊梅素分子離子峰一致，初步推測其為楊梅素。楊梅素C環RDA裂解產生m/z 151.0037的碎片離子，丟失B環產生m/z 178.9991的碎片離子。在化合物18的碎片離子中發現m/z 151.0030和m/z 178.9978的碎片離子，因此鑑定該化合物為楊梅素。
實施例2：驗證試驗
為驗證本發明提供的茶葉籽酚類化合物定性效果，進一步將已初步鑑定出的化合物與標準品進行保留時間和二級質譜圖比對。在與實施例1相同色譜質譜條件下，得到混合標準品的總離子流色譜圖，經精確質量數提取，得到精確質量提取色譜圖(圖10)。由圖10可知茶葉籽中有24中酚類化合物，將鑑定的茶葉籽酚類化合物與標準品的保留時間進行比較，如表1所示，所有24個鑑定的化合物與對應標準品的保留時間差異均在±0.1min以內。同時，樣品中實際採集得到的二級碎片離子與標準品中分子離子峰裂解的碎片離子偏差均在1m/z以下。以表沒食子兒茶素(圖11)和原兒茶素(圖12)為例，由圖11可知茶葉籽中二級質譜圖中的特徵離子m/z 109.0296及m/z 153.0197與表沒食子兒茶素的標準品的特徵離子基本一致，分別為m/z 109.0295及m/z 153.0202，相對質量偏差在5ppm以內。，由圖12可知茶葉籽中二級質譜圖中的特徵離子m/z 109.0290、125.0247、179.0350、305.0653與原兒茶素的標準品的特徵離子基本一致，分別為m/z 109.0296、125.0242、179.0347、305.0663，相對質量偏差在5ppm以內。因此本發明可有效的判斷茶葉籽中酚類化合物的種類。
綜上所述，本發明提供了一種茶葉籽酚類化合物的定性方法，應用超高效液相色譜-四級杆-飛行時間串聯質譜法(UHPLC-Q-TOF-MS)檢測茶葉籽酚類化合物具有無需標準品、分析靈敏度高、選擇性好等優點。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。