阿卡維基轉移酶及其製備與應用的製作方法

2023-12-05 05:38:06 1

>受體阿卡波糖(RT)受體(RT)麥芽糖(PA％)新組分(PA％)(RT)去離子雙蒸水纖維二糖脫氧-D-葡萄糖葡萄糖酸內酯D-葡萄糖異麥芽糖異麥芽三糖昆布二糖麥芽糖麥芽三糖麥芽四糖麥芽五糖麥芽六糖麥芽七糖甲基-D-吡喃葡糖苷宮殿糖(Palatinose)潘糖槐糖木二糖D-木糖L-木糖31.431.330.430.630.231.830.928.530.231.831.132.631.230.329.231.131.130.528.530.729.113.54.517.15.710.113.915.615.826.838.140.641.742.61.813.521.216.510.85.95.82.917.22.63.77.69.75.416.338.119.819.917.917.218.911.59.31416.320.85.7110291411167272120201520139203422/561525.06.637.418.019.623.530.138.840.642.14343.63.824.837.533.216.7/17.314.816.0在放射活性試驗中測定AT活性時，用糊精也觀察到交換寡糖相對活性(％)麥芽糖100麥芽三糖27麥芽四糖40麥芽七糖49纖維二糖15糊精455.用AT處理阿卡波糖的修改方法原則上，AT催化的反應也可以用來按照以下原則從培養溶液中富集阿卡波糖，而同時將阿卡波糖同系物轉化為阿卡波糖1)在阿卡維基轉移酶的存在下，將阿卡波糖或阿卡波糖同系物[阿卡維基-(G)n]與高分子量糊精或澱粉[(G)m]反應，阿卡維基-(G)n+(G)m→阿卡維基-(G)m+(G)n通過透析或沉澱多糖，除去低分子量雜質，然後2)與麥芽糖反應，釋放阿卡波糖，阿卡維基-(G)m+(G)n→阿卡維基-(G)n+(G)m通過使用澱粉和固定化AT的反應器(例如柱)也可以得到同樣的效果-通過澱粉/AT柱過濾粗阿卡波糖溶液-洗滌除去雜質-用麥芽糖洗脫阿卡波糖在上述反應流程中，G表示葡萄糖，m和n分別表示1-20的整數，而m與n不同。6.E.coli菌株的培養，質粒DNA的製備和DNA片斷的分離在37℃、LB培養基中培養E.coliDH50α。在選擇壓力下(氨苄青黴素，100μg/ml)保持含質粒細菌。培養在260rpm的轉式搖床上進行。保溫至少16小時的混合物稱為過夜培養物(OC)。來自在選擇壓力下保溫的1.5mlOC的細胞用來製備質粒DNA。用鹼SDS裂解法分離質粒(BimboimandDoly，1979)。完全按生產商的說明將限制性內切酶用於載體DNA的專一水解(GibcoBRL，Eggenstein，Germany)。使用5U恰當的限制性內切酶來限制10μg質粒DNA，在37℃保溫2小時。再加入等量的限制性內切酶，將混合物再保溫至少1小時以確保完全水解。根據DNA片斷的大小，在0.5-1.2％垂直瓊脂糖凝膠板上電泳分離酶切的DNA。用無菌解剖刀切下含DNA片斷的凝膠塊並稱重，以洗脫DNA。然後用JETsorb盒按照生產商的說明，將DNA片斷從瓊脂糖中洗脫出來(Genomed，BadOeynhausen，Germany)。7.遊動放線菌屬菌株SE50/110的生長，染色體DNA的製備、切割以及凝膠電泳分離將遊動放線菌屬菌株SE50/110在30℃、TSB培養基中在轉式搖床上培養3天。在小培養管中以240rpm進行種子培養(5ml)，主要培養(50ml)以100rpm在500ml固定的燒瓶中進行。培養後，通過離心沉澱細胞，在TE緩衝液中洗滌兩次。通過酚/氯仿抽提法(Hopwoodetal.，1985)，用1.5-5mg細胞(鮮重)製備總DNA。將20μg染色體DNA在37℃用10U恰當的限制性內切酶(GibcoBRL，Eggenstein，Germany)，在適宜的緩衝液中水解2小時。再加入等量的限制性內切酶，將混合物再保溫至少1小時以確保完全水解。在0.6％垂直瓊脂糖凝膠板上電泳分離酶切的DNA。再用JETsorb盒，將DNA片斷洗脫出來(見實施例6)。8.acbD基因探針的製備將按實施例6製備的pAS2的片斷用GibcoBRL，Eggenstein，Germany提供的切口平移系統，按照後者的說明進行放射活性標記。為此使用0.5-1.0μgDNA片斷，以及[α32P]dCTP(3000Ci/mM；Amersham.Braunschweig，Germany)。將混合物煮沸10分鐘(變性)，立即加入雜交液(見實施例9)中。9.將DNA轉移至膜上，DNA的雜交(Southern雜交)以及放射自顯影將DNA片斷從瓊脂糖凝膠通過Southern轉移法轉移至膜上(Southern，1975)。將按實施例7描述得到的瓊脂糖凝膠在0.25MHCl中衝洗20分鐘。將膠置於三層3MMWhatman紙(Whatman，Maidstone，England)上，將HybondTM-N+膜(Amersham，Braunschweig，Germany)置於膠上，使得不產生氣泡。然後將幾層吸水紙置於膜上。將大約1kg重物置於一疊濾紙上。通過吸過0.4MNaOH轉移DNA。轉移至少12小時後，用2×SSC衝洗尼龍膜5分鐘，然後晾乾。尼龍膜在50-100ml預雜交液中68℃水浴振蕩至少2小時。在此期間至少更換兩次溶液。在雜交加熱箱中雜交至少12小時。使用15ml含acbD探針II(見實施例8)的雜交溶液。隨後用6×Potwash和1×Potwash各洗滌15分鐘，將尼龍膜進行充分地洗滌。然後用密閉膜包好仍溼潤的尼龍膜。用Hyperfilm-MP(Amersham，Braunschweig，Germany)於-80℃，在暗盒中使用增感屏進行放射自顯影，至少進行16小時。10.SstI片斷從遊動放線菌屬菌株SE50/110總DNA中的分離和克隆用SstI完全水解遊動放線菌的染色體DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，將長度為9.0-12kb的DNA片斷從瓊脂糖中洗脫出來(見實施例6)。從E.coliDH5α製備載體質粒pUC18，用SstI水解，用鹼性磷酸酶(Boehringer，Mannheim，Germany)按生產商的說明進行處理。在體積為20μl、片斷與載體的比率為3∶1、含有0.01-0.1μgDNA混合物中進行連接。使用1UT4DNA連接酶與適宜的緩衝液(GibcoBRL，Eggenstein，Germany)。用完全連接混合物轉化E.coliDH5α轉化感受態細胞(按照Hanahan，1983)。將抗氨苄青黴素轉化子轉移至LB-Amp選擇平板上(氨苄青黴素，100μg/ml)。11.從阿卡波糖生物合成組中鑑定含有11kbSstI片斷的質粒檢查抗氨苄青黴素轉化子與acbD探針II雜交的11kbSstI片斷的存在。在所有情況下，這些克隆的10個在選擇平板上顯出，保溫過夜，然後用3mlLB培養基將其從平板上洗下來。從20個這樣的10克隆庫中分離質粒DNA(用Birnboin和Doly，1979的方法)。用限制性內切酶EcoRI和HindIII水解20個不同的質粒製品，以從多重接頭上取出克隆的SstI片斷。限制性混合物在0.6％瓊脂糖凝膠上分次電泳，將DNA從瓊脂糖凝膠上通過Southern轉移，轉移至尼龍膜上(見實施例9)。其中一個庫與acbD探針II反應陽性，將其分為10個獨立的克隆。同樣分離這些克隆的質粒並經過上述方法。雜交的質粒命名為pAS5。它含有10.65kbSstI片斷。12.2.6kbHindIII/PstI片斷的克隆為了能夠鑑定其它閱讀框架，由質粒pAS5製備幾個HndIII/PstI亞克隆。為此質粒pAS5用限制性內切酶HindIII和PstI水解。得到以下片斷1.4kbPstI片斷5.4kbPstI片斷0.05kbPstI/HindIII片斷2.6kbHindIII/PstI片斷3.8kbPstI片斷(連接到pUC18載體的1.1kbPstI/SstI片斷)產生的DNA片斷通過瓊脂糖凝膠電泳分離，從膠上洗脫(見實施例6)。由E.coliDH5α製備pUC18載體質粒，用HindIII和PstI水解，用鹼性磷酸酶(Boehringer，Mannheim，Germany)按照生產商的說明進行處理。克隆2.6kbHindIII/PstI片斷。如實施例10進行連接和轉化。帶有2.6kbHindIII/PstI的質粒片斷命名為pAS5/15.1。13.從遊動放線菌的染色體DNA擴增以及克隆兩個0.3kbDNA片斷為了對質粒pAS5/15.5和質粒pAS5/15.6中克隆的DNA片斷之間重疊的DNA區進行測序，由這些質粒(見實施例14)的已知DNA序列合成兩個引物(acbD3和acbD4)。用這些引物，從遊動放線菌的染色體DNA上擴增0.3kbDNA片斷。變性溫度為95℃(1分鐘)，退火溫度為68℃(20秒)，引物在72℃延伸(20秒)。進行25個擴增周期。按照生產商的說明使用Taq聚合酶(GibcoBRL，Eggenstein，Germany)。PCR混合物含有5％甲醯胺。將BIOMETRAPersonalCycler(Gottingen，Germany)用於PCR反應。PCR混合物用乙醇沉澱，隨後將DNA連接到pUC18(用HindIII水解)中，將該重組質粒克隆到E.coliDH5α中。為了對質粒pAS5/15.5和質粒pAS5/15.6重疊的DNA區進行測序，用兩個引物acbD5和引物acbD6用同樣的試驗混合物擴增另一0.3kbDNA片斷，並克隆。pAS5/15.18和pAS5/15.19.克隆後，用引物acbD3和acbD4擴增的PCR片斷產生亞克隆pAS5/15.18，而用引物acbD5和acbD6擴增的PCR片斷產生亞克隆pAS5/15.19。14.來自pAS5的亞克隆片斷由pAS5亞克隆幾個片斷，以闡述雙鏈DNA的序列(圖1)。pAS5/15.1.質粒pAS5用限制性內切酶HindIII和PstI水解。產生，克隆其中的2.6kbHindIII/PstI片斷。為此，在0.7％瓊脂糖凝膠上分離限制性混合物，從膠上洗脫出2.6kbHindIII/PstI片斷(見實施例6)，將其連接到pUC18(用HindIII/PstI水解)中，然後將該重組質粒克隆到E.coliDH5α中。pAS5/15.2；pAS5/15.3；pAS5/15.4；pAS5/15.5.質粒pAS5/15.1用限制性內切酶SalI水解。產生的6個片斷在1％瓊脂糖凝膠上分離。片斷的大小為0.75kb、0.5kb、0.4kb、0.35kb、0.05kb和3.2kb(連接到pUC18的0.5kb片斷)。將亞克隆標記的片斷從膠上洗脫出(見實施例6)。用限制性內切酶SalI如實施例6製備用於克隆的pUC18載體。如實施例10進行連接。將0.75kb片斷連接到製備的pUC18中，產生質粒pAS5/15.2。將0.5kb片斷連接到製備的pUC18後，得到質粒pAS5/15.3。質粒pAS5/15.4含有0.4kb片斷，而0.35kb片斷是質粒pAS5/15.5的成分。pAS5/15.6；pAS5/15.7；pAS5/15.9.質粒pAS5/15.1用限制性內切酶PvuII水解。產生的5個片斷在1.2％瓊脂糖凝膠上分離。片斷的大小為1.25kbPvuII片斷0.15kbPvuII片斷0.8kbPvuII片斷(連接到來自pUC18的0.1kbHindIII/PvuII片斷的0.7kbPvyII/HindIII片斷)0.66kbPvuII片斷(連接到來自pUC18的0.16kbPstI/PvuII片斷的0.5kbPvyII/PstI片斷)2.4kbPvuII片斷(pUC18的殘餘部分)將1.25kb片斷連接到pUC18(用HincII水解)中，將該重組質粒克隆到E.coliDH5α中，產生質粒pAS5/15.6。將0.8kb片斷克隆到HincII水解的pUC18載體後，得到質粒pAS5/15.7。質粒pAS5/15.9含有0.15kb片斷。pAS5/15.12.質粒pAS5/15.1用限制性內切酶NcoI和KpnI水解。將產生的0.9kbNcoI/KpnI片斷從1.2％瓊脂糖凝膠上洗脫出(見實施例6)，連接到載體pUCBM21(用NcoI/KpnI水解)中，將該重組載體克隆到E.coliDH5α中，產生質粒pAS5/15.12。15.遊動放線菌2.6kbHindIII/PstI片斷的DNA測序將實施例13和實施例14描述的質粒進行測序。來自一個製品(見實施例6)的6-8μg質粒DNA用於測序反應。用自讀測序盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)進行測序反應。使用dsDNA測序的標準方案。將螢光標記的通用測序引物和反測序引物用作測序反應的起始分子(見表3)，以使能夠用A.L.F.評價核苷酸序列。將8mlHydroLinkRanger(serva，Heidelberg，Germany)、33.6g尿素、8ml10×TBE緩衝液和水混合至80ml，將混合物過濾滅菌並脫氣1分鐘以製備凝膠。加入350μl10％(w/v)過硫酸銨和40μlN，N，N』，N』-四甲基乙二胺起始聚合反應。將溶液注入膠模(50×50×0.05cm)中。在38W、45℃恆溫下進行電泳。1×TBE緩衝液用作電泳緩衝液，使用也用來控制電泳儀(A.L.F.Manager2.5program；Pharmacia)的連接的計算機(Compaq386/20e)將測定的螢光處理為DNA序列。16.阿卡維基轉移酶在淺青紫鏈黴菌中的過量表達由穿梭載體pUWL201在淺青紫鏈黴菌TK21中表達遊動放線菌的阿卡維基轉移酶基因(acbD)(U.Wehmeier，未發表，Fig.2)。質粒(6.4kb)由載體pUWL199(Wehmeier，1995)組成，其中用含有ermE*p啟動子(Bippetal.，1994)的KpnI/XbaI片斷和pBLUESCRIPT多重接頭(Stragenea)的HincII/ClaI部分取代2.0kbKpnI/XbaI片斷。將質粒pAS5/15.1(見實施例12)用限制性內切酶HindIII和PstI水解，以將acbD基因克隆到E.coliDH5α和S.TK21中。將產生的2.6kbHindIII/PstI片斷連接到載體pUWL201(用HindIII和PstI水解)中，將產生的重組質粒克隆到E.coliDH5α中。產生的質粒命名為pAS9。從E.coliDH5α用鹼裂解法製備質粒pAS9，用原生質體轉化法(Hopwoodetal.，1985)將其克隆到淺青紫鏈黴菌TK21中。在該克隆中，acbD基因在組成型ermE*p啟動子(M.Bibb，Norwich，England；個人通訊)的控制下。淺青紫鏈黴菌TK21/pAS9在TSB培養基(25μg/ml硫鏈絲菌肽)中培養後，在SDS聚丙烯醯胺凝膠(Lugtenbergetal.，1975)上可以探測到75kDa明顯帶的上清液中的額外蛋白。17.由於基因斷裂的阿卡維基轉移酶的失活遊動放線菌阿卡維基轉移酶基因(acbD)用基因斷裂法失活。為此，將遊動放線菌的染色體acbD基因用抗生素抗性基因部分取代。通過同源重組插入抗生素抗性基因。初步試驗證明，遊動放線菌對抗生素紅黴素、鏈黴素、安普黴素、新黴素和卡那黴素敏感。因此將抗生素抗性基因ermE、aphD1、aaC4和aph用於誘變。在第一個實施例中，來自載體pUGT1(Inghametal.，1995)的抗紅黴素抗性基因(ermE)用來失活acbD。為此，用KpnI水解pUGT1後，在瓊脂糖凝膠上分離出1.5kb大小的KpnI片斷上的抗性基因，然後從膠中分離出抗性基因。用限制性內切酶NcoI將質粒pAS5/15.1(見實施例12)線性化。NcoI識別序列在2.6kb克隆的染色體片斷的1050bp處。用DNA聚合酶I的Klenow片斷按照生產商的說明(GibcoBRL，Eggenstein，Germany)，將質粒pAS5/15.1和製備的1.5kbKpnI片斷的水解末端轉化為光滑的DNA雙鏈末端。隨後通過連接，將存在於1.5kbKpnI片斷的紅黴素抗性基因克隆到E.coliDH5α中的質粒pAS5/15.1的acbD基因中。將該質粒線性化。用常規方法(原生質體轉化)導入。也可以通過與E.coliS17-1和遊動放線菌接合轉移重組質粒。電擊法成為質粒轉移的另一選擇方法。用由紅黴素抗性基因破壞的、構建的質粒的acbD基因取代染色體acbD基因，產生同源重組。由於發生雙鏈交叉，產生遊動放線菌屬SE50/110抗紅黴素的acbD突變體。以下方法也可以用來將其它抗性基因重組到遊動放線菌中(1)電擊法，(2)原生質體轉化(Hopwoodetal.，1985)，(3)菌絲轉化(MadonandHutter，1991)和(4)接合(Mazodieretal.，1989)。緩衝液和溶液細菌生長培養基LB培養基胰蛋白腖10gNaCl10g酵母浸出物5g水至1000mlpH用4MNaOH調至7.5TSB培養基胰蛋白腖-大豆肉湯(氧化型)30g水至1000mlTE緩衝液(pH8.0)Tris-HCl10mMNa2-EDTA1mM質粒DNA的標準製備(由Bimboin和Doly，1979的方法修改)混合物I50mM葡萄糖50mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA(pH8.0)5mg裂解酶/ml混合物II200mlNaOH1％(w/v)SDS(十二烷基磺酸鈉)混合物III3M乙酸鈉1.8M甲酸DNA/DNA雜交20×SSC3MNaCl0.3M檸檬酸鈉預雜交液6×SSC0.01M磷酸鈉緩衝液，pH6.81mMEDTA0.5％SDS0.1％脫脂奶粉雜交液在標記反應後，將acb探針加入15ml預雜交液中。6×Postwah6×SSC0.5％SDSDNA測序TBE緩衝液(pH8.0)1MTris鹼0.83M硼酸10mMEDTA文獻1)Bibb，M.J.etal.(1994)ThemRNAforthe23SrRNAmethylaseencodedbytheermEgeneofSaccharopolysporaerythraeaistranslatedintheabsenceofaconventionalribosome-bindingsiteMol.Microbiol.14，33-545.2)Birnboim，H.C.，J.Doly(1979)ArapidalkalineextractionprocedureforscreeningrecombinantplasmidDNANucleicAcidsRes.7，1513-15233)Hanahan，D.(1983)StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmidsJ.Mol.Biol.166，557-5804)Hopwood，D.A.etal.(1985)GeneticmanipulationofStreptomyces；Alaboratorymanual；TheJohnInnesFoundation，Norwich，England5)Ingham，C.J.，etal.(1995)Rho-independentterminatorswithout3′poly-UtailsfromtheearlyregionofactinophagephiC31NucleicAcidsRes.23，370-373.6)Lugtenberg，B.etal.(1975)ElectrophoreticresolutionofthemajoroutermembraneproteinofEscherichiacoliintofourbandsFEBSLett.58，254-258.7)Madon，J.，R.Hütter(1991)TransformationSystemforAmycolatopsis(Nocardia)mediterranei；direct8)Mazodier，P.etal.(1989)IntergenicconjugationbetweenEscherichiacoliandSureptomycesspeciesJ.Bacteriol.171，3583-35859)Sanger，F.etal.(1977)DNAsequencingwithchainterminatinginhibitorsProc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-546710)Southern，E.M.(1975)DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresisJ.Mol.Biol.98，503-52111)Wehmeier，U.F.(1995)NewfunctionalEscherichiacoli-Streptomycesshuttlevectorsallowingblue-whitescreeningonXgalplatesGene165，49-150權利要求1.阿卡維基轉移酶。2.來源於遊動放線菌屬菌株SE50或SE50/13或SE50/110及其變異株的阿卡維基轉移酶。3.基本上純的阿卡維基轉移酶。4.具有圖3胺基酸序列的阿卡維基轉移酶及其功能衍生物。5.圖4中編碼阿卡維基轉移酶的DNA序列及其功能衍生物。6.將阿卡波糖微量組分轉化為阿卡波糖的方法，阿卡維基-Gn+麥芽糖→阿卡波糖+Gn，其中Gn表示葡萄糖、雙糖和麥芽寡糖，其特徵在於，反應由阿卡維基轉移酶催化。7.阿卡維基轉移酶在諸如α-澱粉酶抑制素(trestatin)或抑澱粉酶素之類的其它假寡糖轉化為阿卡波糖中或其它糖苷酶抑制劑的轉化中的用途。8.阿卡維基轉移酶的用途，即從培養的上清液中富集阿卡波糖，而同時通過與高分子量糊精或澱粉在阿卡維基轉移酶的存在下，將阿卡波糖同系物轉化為阿卡波糖，阿卡維基-(G)n+(G)m→阿卡維基-(G)m+(G)n其中，G表示葡萄糖，m和n分別表示1-20的整數，而且m與n不同；藉助於透析或反滲透或通過沉澱多糖，除去低分子量雜質，然後在足夠高濃度的麥芽糖存在下，用阿卡維基轉移酶與麥芽糖反應，釋放阿卡波糖，阿卡維基-(G)m+(G)n→阿卡維基-(G)n+(G)m9.阿卡維基轉移酶在異源宿主生物中的重組製備。10.含有按照權利要求5的DNA的載體。全文摘要本發明涉及來自放線菌、主要來自遊動放線菌屬菌株SE50/110及其變異體的阿卡維基轉移酶,涉及酶的分離、純化和定性的方法,涉及編碼阿卡維基轉移酶的acbD基因的分離和定性,涉及阿卡維基轉移酶在異源宿主生物中的表達,涉及用來將阿卡波糖微量組分轉化為阿卡波糖以及用於阿卡波糖製備的阿卡維基轉移酶的用途,涉及阿卡維基轉稱酶在阿卡波糖純化中的用途,也涉及通過使阿卡維基轉移酶失活以降低微量組分生成的生產變異株的製備。文檔編號C12R1/19GK1172161SQ9710490公開日1998年2月4日申請日期1997年3月21日優先權日1996年3月22日發明者A·克魯格,H·G·德爾維,J·G·倫茲,W·施洛德,H·佩普,K·格爾克,B·沙珀,M·漢克,W·派珀斯伯格,J·迪斯特勒,A·斯拉特拉斯曼申請人:拜爾公司