檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球及其製備方法
2023-12-05 20:07:16
專利名稱：檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微 球及其製備方法。
背景技術：
蛋白酶抑制劑廣泛存在於植物體內，尤其在植物的貯藏器官內含量相當高。在植 物體內蛋白酶抑制劑的生物學功能主要有兩個方面①通過與內源蛋白酶相互作用，調控 組織細胞內的有關生理生化過程；②防止細胞、組織內的蛋白質成分被外源蛋白酶所降解。 其更重要的作用在於作為一種抵禦外界植食性昆蟲和微生物攻擊的化學防衛因子。研究證 實，大多數植物來源的蛋白酶抑制劑對植物內源性蛋白酶沒有抑制作用，但對外源蛋白酶 有特異的抑制活性，這就為通過基因工程提高農作物防衛系統的效能提供了自然進化上的 ■石出。豇豆胰蛋白酶抑制劑(cowpea trypsin inhibitor，CpTI)屬絲氨酸蛋白酶抑制 劑。與Bt毒蛋白相比，其殺蟲機理完全不同且具有殺蟲廣譜，對人畜安全，昆蟲不易產生抗 性的優點而受到人們的重視。通過轉基因技術將CpTI基因導入作物而獲得的轉基因植株 已在我國部分地區得到了大規模的應用，但迄今對於轉基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制劑的 檢測方法不多，且檢測靈敏度、檢測限和抗幹擾能力等亟待提高。目前，有關CpTI抑制劑免 疫檢測技術的研究報告和相關專利技術國內外報導很少，迫切需要開發高效、準確、快速的 新型免疫檢測技術和產品。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球及其製備方 法，進一步填補CpTI抑制劑免疫檢測技術的研發空白；取材簡單、操作方便；製備方法細 致嚴謹，重複性高；所製備的免疫膠乳微球顆粒小，粒徑均勻，能檢測CpTI融合蛋白最低限 0.2yg/ml，其相關係數 R2=O. 67。本發明的目的是通過以下技術方案來實現
一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球，免疫微球由抗CpTI蛋白多克隆抗體 包被，微球顆粒大小為200nm，最低檢測限為CpTI融合蛋白0. 2 μ g/ml，相關係數R2=O. 67。—種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法，包括以下步驟
1)設計全長CpTI基因序列，根據原核細胞表達的優先密碼子重新修飾並採用全基因 合成技術構建全長CpTI基因表達序列；
2)將步驟1)得到的CpTI基因片段通過限制酶切割插入穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基 因融合表達載體中，構建細菌融合表達載體；
3)通過步驟2)對表達載體進行細菌表達後，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合蛋白；
4)將經過步驟3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐劑後免疫小鼠，經分離純 化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；
5)將經過步驟4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗體通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯活化微 球，得到檢測CpTI蛋白的免疫膠乳微球。在上述所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中，在步驟2) 中的穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因融合表達載體是pGEX-4T-2，構建完成後的融合表達載 體是 pGEX-4T-2-CpTI。在上述所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中，在步驟3) 中的親合層析柱為穀胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose) 4B。在上述所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中，在步驟5) 中採用單分散羧基化聚苯乙烯微球為基質材料，羧基化聚苯乙烯微球大小200nm，表面載基 團為羧基，羧基化聚苯乙烯的分子式如下
該微球的活化是首先用活化劑EDC (碳化二亞胺)活化微球，然後加入保護劑N-羥 基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)使微球形成穩定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子之用。本發明的有益效果為採用單分散羧基化聚苯乙烯微球為基質材料，用化學偶聯 方法偶聯抗CpTI多克隆抗體獲得，取材簡單、操作方便；製備方法細緻嚴謹，重複性高；所 製備的免疫膠乳微球顆粒小，粒徑均勻，能檢測CpTI融合蛋白最低限0. 2 μ g/ml，其相關 係數 R2=O. 67。
下面根據附圖對本發明作進一步詳細說明。圖1是本發明實施例所述的羧基化聚苯乙烯微球的掃描電鏡圖；圖2是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 CpTI基因的原序列全長圖譜；
圖3是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 經優化後的CpTI基因序列圖譜；
圖4是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 菌落PCR驗證CpTI基因插入片段電泳圖譜；
圖5是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 質粒)(ba I酶切電泳圖譜；
圖6是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 CpTI表達載體的測序圖譜；
圖7是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 GST-CpTI融合蛋白SDS-PAGE的檢測圖譜；
圖8是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 GST-CpTI融合蛋白Wfestern Blotting的檢測圖譜；
圖9是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 抗血清效價測定圖10是本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中 採用膠乳增強免疫比濁法檢測CpTI融合蛋白結果圖。
具體實施例方式本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球，免疫微球由抗 CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小為200nm (圖1)，最低檢測限為CpTI融合蛋白 0. 2μ g/ml，相關係數 R2=O. 67。本發明實施例所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法，包括 以下步驟
1)設計全長CpTI基因序列，根據原核細胞表達的優先密碼子重新修飾並採用全基因 合成技術構建全長CpTI基因表達序列；
2)將步驟1)得到的CpTI基因片段通過限制酶切割插入穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基 因融合表達載體中，構建細菌融合表達載體；
3)通過步驟2)對表達載體進行細菌表達後，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合 蛋白；
4)將經過步驟3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐劑後免疫小鼠，經分離純 化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；
5)將經過步驟4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗體通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯活化微 球，得到檢測CpTI蛋白的免疫膠乳微球。在上述所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中，在步驟2) 中的穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因融合表達載體是pGEX-4T-2，構建完成後的融合表達載 體是 pGEX-4T-2-CpTI。在上述所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中，在步驟3)中的親合層析柱為穀胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose ) 4B。在上述所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法中，在步驟 5)中的微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，大小200nm，表面載基團為羧基；該微球的活 化是首先用活化劑EDC (碳化二亞胺)活化微球，然後加入保護劑N-羥基硫代琥珀醯亞胺 (Sulfo-NHS)使微球形成穩定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子之用。實例
本發明在具體實施時，包括以下步驟 1)構建全長CpTI基因表達序列
(a)設計全長CpTI基因序列，結果如圖2所示；
(b)根據原核細胞表達的優先密碼子重新修飾，採用全基因合成技術構建全長CpTI基 因，共333對鹼基，克隆至載體pGEM-T Easy,結果如圖3所示；
(c)通過菌落PCR驗證CpTI基因片斷插入的正確性，結果如圖4所示；
(d)將克隆CpTI基因菌實施擴增培養，提取質粒後進行酶切和瓊脂糖電泳分析，結果 如圖5所示；
(e)DNA測序，保證基因的全部序列100%準確，結果如圖6所示。2)表達和純化提取GST-CpTI融合蛋白
(a)將CpTI基因片段通過限制酶切割插入PGEX-4T-2載體中，構建細菌融合表達載體 pGEX-4T-2-CpTI ；
(b)將融合表達載體pGEX-4T-2-CpTI轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，細胞生長條件為 230轉/分，溫度37° C;
(c)當菌體生長OD595值為0.5-0. 8時，加入1. OmM的誘導劑IPTG，在25° C誘導3小 時；在4° C時，以5，000X g離心5分鐘，收集菌體；
(d)菌體經PBS緩衝液清洗3次後，超聲破碎；破碎細胞在4°C時，以14，000' g離 心1小時，收集上清；
(e)將上清循環通過穀胱甘肽瓊脂糖凝膠(GlutathioneSepharose )4B親合層析柱， 4° C過夜；未結合蛋白用10倍床體積的IX PBS衝洗；
(f)將結合的GST-CpTI融合蛋白用洗脫液洗脫並收集、保存；並對表達和純化提取的 GST-CpTI融合蛋白做SDS-PAGE和^festern Blotting分析，結果如圖7和8所示。3)製備抗CpTI多克隆抗體
(a)將GST-CpTI融合蛋白抗原與弗氏佐劑混合後，充分乳化；採用背部多點注射法免 疫BALB/c小鼠；每次免疫的抗原量約10 μ g，免疫三次；每次免疫兩周後經尾動脈取血檢 測抗體效價；
(b)以適宜濃度的抗原包被酶標板，100μ 1/孔，4° C過夜；
(c)洗滌後，加入待檢的血清樣品，ΙΟΟμΙ/孔，37°C 1小時；設陰性對照孔；
(d)洗滌後，加入HRP標記的羊抗鼠IgG的抗體試劑，100μ 1/孔，37° C避光顯色15 分鐘；用2Μ H2SO4終止反應後，閱讀各孔的Α490值；並對製備的抗GST-CpTI融合蛋白抗體， 經ELISA法檢測，抗體能與GST-CpTI，GST蛋白特異性結合，其相關係數達到顯著水平，效價 >1:8000，結果如圖9所示。4)製備用於檢測CpTI蛋白的免疫膠乳微球(a)將單分散羧基化聚苯乙烯微球用活化劑EDC(碳化二亞胺)活化，然後加入保護劑 N-羥基硫代琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)使微球形成穩定的活潑酯中間體；
(b)加入抗CpTI蛋白多克隆抗體，溫育1-2小時；
(c)洗滌後，收集免疫微球；
(d)通過CA-1680型生化分析儀，採用膠乳增強免疫比濁法，檢測CpTI融合蛋白樣品。
採用本發明所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法，製備 出的免疫膠乳微球經生化分析儀檢測，用於檢測CpTI蛋白的免疫膠乳微球最低檢測限為 CpTI融合蛋白0.248/!111，其相關係數1 2=0.67，結果如圖10所示。由此可見，本發明所制 備的用於檢測CpTI蛋白的免疫膠乳微球檢測靈敏度較高，且操作簡單、重複性強，顯示了 良好的應用前景。
權利要求
1.一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球，其特徵在於免疫膠乳微球由抗 CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小為200nm，最低檢測限為CpTI融合蛋白0. 2 μ g/ ml，相關係數R2=O. 67。
2.根據權利要求1所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球，其特徵在於，所 述免疫膠乳微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，顆粒大小為200nm，表面載基團為羧基。
3.—種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法，其特徵在於，包括以下 步驟1)設計全長CpTI基因序列，根據原核細胞表達的優先密碼子重新修飾並採用全基因 合成技術構建全長CpTI基因表達序列；2)將步驟1)得到的CpTI基因片段通過限制酶切割插入穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基 因融合表達載體中，構建細菌融合表達載體；3)通過步驟2)對表達載體進行細菌表達後，利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合 蛋白；4)將經過步驟3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐劑後免疫小鼠，經分離純 化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；5)將經過步驟4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗體通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯活化微 球，得到檢測CpTI蛋白的免疫膠乳微球。
4.根據權利要求3所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法，其特 徵在於，在步驟2)中所述穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因融合表達載體是pGEX-4T-2，構 建完成後的融合表達載體是pGEX-4T-2-CpTI。
5.根據權利要求3所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備方法，其特 徵在於，在步驟3)中所述親合層析柱為穀胱甘肽瓊脂糖凝膠4B。
6.根據權利要求3-5任一項所述的檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球的製備 方法，其特徵在於，在步驟5)中所述免疫膠乳微球是單分散羧基化聚苯乙烯微球，顆粒大 小為200nm，表面載基團為羧基；所述免疫膠乳微球的活化是首先用碳化二亞胺活化微球， 然後加入N-羥基硫代琥珀醯亞胺使微球形成穩定的活潑酯中間體，以備連接抗體分子之 用。
全文摘要
本發明涉及一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的免疫膠乳微球及其製備方法，該免疫微球由抗CpTI蛋白多克隆抗體包被，微球顆粒大小200nm；所述免疫膠乳微球的製備方法包括以下步驟設計全長CpTI基因序列；將CpTI基因片段通過限制酶切割插入穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因融合表達載體中，構建細菌融合表達載體；利用親合層析柱純化獲得GST-CpTI融合蛋白；將GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐劑後免疫小鼠，經分離純化得到鼠抗CpTI多克隆抗體；將抗體通過化學偶聯法偶聯活化後的微球，得到檢測CpTI蛋白的免疫膠乳微球。本發明的有益效果為靈敏度較高，且操作簡單、重複性強；所製備的免疫膠乳微球顆粒小，粒徑均勻，能檢測CpTI融合蛋白最低限0.2μg/ml，其相關係數R2=0.67。
文檔編號G01N33/531GK102109521SQ201010591728
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者李俊生, 潘衛東, 王學霞, 肖能文 申請人:中國環境科學研究院