利用基因工程微生物生產的細胞外的多羥基鏈烷酸酯的製作方法

2023-07-23 21:26:46 3

專利名稱：利用基因工程微生物生產的細胞外的多羥基鏈烷酸酯的製作方法
技術領域：
本發明涉及多羥基鏈烷酸酯(polyhydroxyalkanoates， PHA)的生物合成 領域，更具體地說，本發明涉及一種基因工程微生物，其具有與PHA的代謝 特別是與其生成有關的至少一個基因。該微生物適用於PHA的工業生產。進 一步地，本發明還涉及一種生產PHA的方法。
背景技術：
多羥基鏈烷酸酯(PHA)是一種聚合體，該聚合體是可生物降解和生物 相容的熱塑性材料(3-羥醯基脂肪酸的聚酯)，從可再生資源中獲得，在工業 和生物醫學中有廣泛的應用(Williams and Peoples, 1996年)。PHA通過許多 細菌合成，並且由於其可能應用於替代傳統的石化製作塑料從而保護環境不 被塑料廢物危害而得到了廣泛的研究。PHA根據其側鏈長度和其生物合成方法，可分成兩類。那些具有短的側 鏈的，例如，(R) -3-羥醯基丁酸單元((R)-3-hydroxybutyric acid units)的同 聚物PHB，是晶體熱塑性塑料，而具有長鏈的PHA更具有彈性。前者在大 約70年前被發現(Lemoigne and Roukhelman, 1925年)，而相對來說後者的材 料是近來才被發現的(deSmet et al., 1983， J. Bacteriol. 154: 870-78)。然而，在 這之前，同時包含(R) -3-羥醯基丁酸單元和更長的包含5到16個碳原子的 側鏈(R) -3-羥酸單元的源自微生物的PHA已經被識別出來(Wallen, Rohweder， 1974, Environ. Sci. Technol. 8: 576-79)。許多生產(R) -3-羥醯基丁 酸單元和更長的包含5到16個碳原子的側鏈(R) -3-羥酸單元同聚物的細菌 被發現(Steinbuchel, Wiese, 1992， Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 691 97; Valentin et al" 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 507-14; Valentin et al" Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994, 40: 710-16; Abe et al., 1994, Int. J. Biol.Macromol. 16: 115-19; Lee & a/., 1995， Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 901-09; Kato & a/" 1996， Appl. Microbiol. Biotechnol. 45: 363-70; Valentin & a/.，1996， Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 261-67; US Patent No. 4,876,331)。這些同聚物 可被稱為PHB-co-HX(此處的X是3-羥醯基鏈烷酸酯或鏈垸酸酯或具有6個 或更多碳原子的丁烯酸乙酯(alkenoate)。一個含有兩種成分的同聚物的有用例 子是PHB-co-3羥基己酸酯(PHB-co隱3HH) (Brandl " a/.，1989， Int. J. Biol. Macromol. 11: 49-55; Amos & Mclnerey, 1991， Arch. Microbiol. 155: 103-06; US Patent No. 5,292,860)。
然而，儘管PHA由於它們具有作為可再生資源的生物可降解熱塑性和 生物聚合物的潛在可能而得到了廣泛的研究(如上所述)並且已經進行商業 生產和銷售(Hmbak, O. 1992)，它們的生產成本比傳統的石化塑料的成本高很 多，因此造成了廣泛使用的主要障礙(Choi and Lee 1997)。如上所述，許多細 菌都生產PHA，例如，產鹼桿菌屬細菌(Alcaligenes eutrophus)、產鹼桿菌
(Alcaligenes latus)、固氮菌(Azotobacter vinlandii)、 假單胞菌(Pseudomonas acitophila)、假單胞菌(Pseudomonas oleovarans)、大腸桿菌(Eschericha coli)、 紅球菌屬真養菌(Rhodococcus eutropha)、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum )、 光合細菌(Chromatium vinosum )、 食烷菌屬石油去汙菌
(Alcanivorax borkumensis)等。現有技術中已知的所有生產PHA的細菌均 在細胞內產生PHA，並將其積累在PHA顆粒中(Steinbtichel, 1991)。導致PHA 生產成本高，並因此與石化製作的塑料相比沒有優勢的一個主要方面是，將 PHA從細菌細胞中分離回收比較困難。為了降低PHA的總生產成本， 一個 有效的分離過程一般被認為是用下列方法對細胞進行分裂
(1) 合適的溶液，
(2) 次氯酸鹽提取PHA和/或
(3) 非PHA細胞材料的消化。
但是，進行工業化生產時，現有技術中的所有已知方法需要大量的化學 試劑和/或酶，這對減少分離回收的成本來說是一個困難。因此，需要有新的 進行PHA分離回收的方法。發明內容本發明的目的是提供一個系統，可進行商業化水平的PHA生產，同時 降低生產出的PHA的分離回收成本。本發明要解決前述的技術問題，是通過提供一種滿足上述需求並且可應 用在前述系統中的微生物。本發明的第一實施例涉及基因工程微生物，其在至少一個基因中具有至 少一個修飾因子，所述至少一個基因對PHA的代謝相關蛋白質進行編碼，或 者，優選地，所述至少一個基因對在PHA的產生過程中幹預微生物代謝的蛋 白質進行編碼，其中的至少一個修飾因子引起細胞外沉積，例如，分泌PHA， 優選地，在/到培養基中通過微生物生產的中鏈或長鏈PHA。優選地，所述 微生物包括如圖11、 12、 14、 16和18到25或功能片段或其不同的核苷酸片 段。更優地，所述微生物可包括如圖11、 12、 14、 16和18到25的所示的功 能片段或其修飾因子的一個核苷酸序列的第180號到第680號核苷酸，優選 地包括第230號到第640號，更優地包括第310號到第550號，最優地包括 第350號到第510號核苷酸。發明者已經發現，本發明的基因工程微生物通過細胞外沉積，例如分泌 PHA (細胞內生產)在/到培養基中來生產細胞外PHA。所述沉積，例如， 微生物分泌PHA還沒有在現有技術中描述過。優選地，本發明所述微生物生 產大量的PHA，優選地，過度生產PHA，並將大部分PHA產品沉積在細胞 外，而不是像現有技術中的微生物那樣。細胞外沉積，例如，分泌和過量生 成PHA到培養基中，是通過改變至少一個與PHA代謝有關的多肽的基因編 碼來達到的，優選地是通過在編碼幹擾PHA的生產的多肽(酶)的基因中的 至少一個修飾因子來得到的。本發明中的術語"多肽"也包括"肽"、"蛋白質" 或"酶"。各種編碼多肽的基因與PHA的代謝有關。幾個這樣的基因在如圖5所 示的表1中列出。因此，本發明中的基因包括任何編碼與PHA代謝有關的多 肽的基因，優選地，包括任何編碼與PHA的生產有關的基因。優選地，這些基因編碼(不限於)PHA合酶、多(3-羥醯基鏈垸酸酯)合成酶、enyol-輔 酶A羥化酶和PHB合酶。另外的也與脂肪酸代謝有關酶，例如，脂肪酸合成或P氧化(多(3-羥 醯基丁酸酯)解聚酶、還原酶，或硫解酶)，也可被改變。然而，這些酶並不 特別地影響PHA合成，因此，較不希望對其修改來增加PHA的合成。優選地，需要用來生產PHA的基因並不包括在本發明的微生物中。優 選地，任何引入的PHA生產基因的修改(見上述)目的不是減少而是增加它 們的酶的活性。因此，本發明的微生物可以提供比現有技術中的微生物更高 的PHA產量。相反的是，本發明的微生物包含任何對PHA的生產有利的編碼多肽的 基因。尤其是，本發明的微生物在基因編碼的用例如乙醯輔酶A硫酯酶的硫 酯酶功能去除了醯基輔酶A分子的酶。根據不同的特定微生物， 一個或多個 醯基輔酶A硫酯酶作用於脂肪酸代謝。醯基輔酶A硫酯酶作用於脂肪酸代謝。 醯基輔酶A硫酯酶在具有兩個這樣的酶，即醯基輔酶A硫酯酶I (&"基因 編碼的)和醯基輔酶A硫酯酶II， (tes^基因編碼的)。硫酯酶I對C12到 C18醯基輔酶酯顯示出特異性，而硫酯酶II斷開C6到C18醯基輔酶酯，和 鏈長為C12到C18的P-羥基醯基輔酶A酯(Barnes " a/.,1970, The Journal of Biological Chemistry, vol. 245, No. 12， issue of June 25, 3122-3128)。 7fe"基因 在脂肪酸的重新開始(&"ow)生物合成的主鏈終止中涉及，並且調節大腸 桿菌中的從脂肪酸重新開始(&"OW)生物合成路逕到脂肪酸的p-氧化的醯 基-醯基載體蛋白(acyl-ACP)媒介(Klinke, SQ " a/.，1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 540-548)。迄今為止，對teW基因在細菌的代謝中的生理作用 知之甚少。最近的一篇報導描述了硫酯酶II中通過斷開3-羥醯基-輔酶A硫酯鍵， 從而將它們轉化成自由的3-HAA，因此在3-羥醯基烴酸的(3-HAA)的產生 起到了重要的作用(Zweng, Z a a/.，2004, Appl. Environ. Microbiol. 70(7): 3807-3813)。本發明中，發現各種微生物表達硫酯酶，對3-羥醯基-輔酶A硫 酯這種PHA合成的原料的斷開具有特別的活性。這些硫酯酶使得可以釋放自由的3-HAA。然而，轉化到3-HAA的反應是與PHA的合成的PHA-合成酶 競爭的，PHA-合成酶作用於同樣的細胞媒介(即3-羥醯基-輔酶A)。本發明 發現，(i)釋放自由的3-HAA和PHA的合成是相互幹擾的的代謝途徑，並且 (ii)功能敲除的特異性的硫酯酶，稱為類^s5基因的硫酯酶(toB-Z汰e thioesterase)，提供了 PHA在細胞外基質中的沉積。類te^基因的功能敲除 修飾因子(下面有詳述)被識別出來增加在一定個數的微生物中細胞間的3-羥醯基-輔酶A的數量，因此使得3-羥醯基-輔酶A引導代謝(作為PHA的 前體)向PHA合成進行(參考圖8)。如上解釋的，本發明是基於一般性發現用(R)-3-羥醯基輔酶A (敲除) 的修飾硫酯酶作為替代，使生產PHA的微生物在細胞外基質中沉積PHA。 在食垸菌(J汰fl"/vomx)、惡臭假單胞菌(/^^^/owowos;n^Wa)、銅綠假單胞 菌(屍sewdomowaw )、 丁香假單胞菌(i^ei/^/omowos 5yn.wgae)、榮光假單胞菌(屍sewdo歸"iZsy7womscms)、不動桿菌"cZ"柳6acters/ .)、新月 柄桿菌(a //o^c^a^ce"^)中，對(R)-3-羥醯基輔酶A有特異性的硫酯 酶，是類^8基因的醯基輔酶A硫酯酶，另外的生產PHA的微生物的PHA 是基於稍微不同的代謝，使用另外的醯基輔酶A硫酯酶的代謝，例如，醯基 輔酶A硫酯酶或來生產3-HAA。在任何情況下，特別用(R)-3-羥醯基輔酶A來修飾的硫酯酶來生產 3-HAA，減小硫酯酶例如類醯基輔酶A硫酯酶的活性達50%，較優達 60%，更優達至少80%，更優達90%。在特別的優選實施例中，此硫酯酶例 如類醯基輔酶A硫酯酶的活性完全被抑制。本發明也包括此處所揭示的類te^S蛋白同源族(也包括它們的編碼的核 苷酸)，尤其是硫酯酶。在本發明中所指的類蛋白同源族是指在不同的 微生物中包括的不同於此處類tes5蛋白同源族的任何蛋白或肽序列，優選地 展示出與此類to5蛋白族同源族，並且展示出相似的甚至是相同的生物功會^ 本領域技術人員用本領域的方法很容易得到此處的類/e^蛋白同源族的一個 (重要)同源族，比如，採用本發明所揭示的確定序列標識或採用活性分析 來得到。根據本發明，食垸菌用兩個硫酯酶來表徵，即對(R)-3-羥醯基輔酶 A有特異性的醯基輔酶A類基因和脂肪酸的生產有關的醯基輔酶A硫 酯酶Z"5基因。通過進行同源族搜索(BLAST搜索)在幾個生產PHA的細 菌中，發明者篩選另外的顯示出與食垸菌相同的或類似的代謝結構的微生物 (具有高特異性的醯基輔酶A硫酯酶類/^5基因和另外的硫酯酶(&^5))。在食烷菌屬石油去汙菌(」/ca"z'wrax 6oAwme"^:s ) SK2也表達許多相 關的生產PHA的Y-蛋白細菌(例如，惡臭假單胞菌(屍"M^W20"os; ^V/a)、 銅綠假單胞菌(jPsew^fo附o"(2s flm/gi"osa)、 丁香假單胞菌(屍sew^/omo"(XS ,/"gae)、 螢光假單胞菌(屍sewcfo附o"fl51 y/womscera)、變形菌(誠oman'"flZo/A/e"57'51 )、 不動桿菌(」C/"咖6flCter S/7.)、 新月柄桿菌 (CWo6flC/W^^cewfM)。食烷菌類tes5基因蛋白在另外的微生物中命名不同，例如，命 名為類^^硫酯酶、假定的醯基輔酶A硫酯酶II或假設蛋白(hypothetical protein)。然而，應當理解，術語"類^5"目的在於包括上述各種名稱的微生 物的所有的硫酯酶在內。這些食垸菌類^^基因蛋白的同源族在表4中列出 (見圖10的表4)。本發明者通過用^^和類&s5蛋白的不同功能解釋了在 食垸菌類的兩種硫酯酶和上述的另外的微生物中，也就是和類te^B蛋白 的存在。很相似的是，類tes5蛋白不對醯基輔酶A衍生物的C6到C18起作 用，同時，類^^蛋白不斷開羥醯輔酶A。此結論被早期的對te^5蛋白的研 究支持，研究顯示，與大腸桿菌中的類似的硫酯酶II所不同的是(Bames a a/.ji/pra),生產PHA的渾球紅假單胞菌(i /zocfoZ)(3"er5p/^eraz'cfe)(Wieczorek, RA " a/.， 1996, FEMS Microbiology Letters 135: 23-30)的硫酯酶II不能對 羥醯基輔酶A底物進行水解(Seay, T " a/.，1982, Biochemistry May 6， 25(9): 2480-2485)。在優選實施例中，本發明的微生物一般包括至少一個上述的修飾了的基 因，此處的修飾因子整合到了它的染色體中。與PHA代謝和優選地(R)-3-羥醯基輔酶A的降解有關的蛋白的至少一個 編碼基因的修飾，是通過用基因工程技術在所述核苷酸序列中插入一個修飾 因子來得到的。術語"基因工程化的"("genetically engineered")(或基因修飾的)是指人為地操縱本發明的微生物的基因和/或基因產物(多肽)。接著，修飾(突變)通過序列分析來得以確認(參見作為例子的圖11至14和圖15 至33的核苷酸序列)。術語"修飾"(modification)包括對本發明的微生物的任何操縱和變更， 尤其是本發明所述微生物的至少一個基因。優選地，所述修飾導致所述核苷 酸序列的至少一個基因的改變， 一般是由於調節區域的修飾，例如基因的啟 動子區域表達的胺基酸序列水平的表達出來。優選地，導致所述核苷酸序列 改變的修飾是通過相加、替代、刪除或插入一個或多個核苷酸序列的結果。 更進一步地，所述修飾可包括微生物中的一個或多個基因的額外的複製和/ 或基因的(完全)刪除。刪除也可以是由於通過重組或插入轉位子(transposon) 影響基因而引起。在一個優選實施例中，本發明的微生物的修飾引起編碼與 生產PHA的代謝幹擾有關的蛋白質的基因的完全或部分失活(例如，通過將 PHA合成路徑中的中間物進行生化轉化)，優選地，此蛋白質是硫酯酶，更 優地,此蛋白質是能將PHA合成路徑中的中間物進行降解的硫酯酶，最優地， (特異性地)將(R)-3-羥醯基輔酶A轉化成3-HAA。在最優實施例中，本發明 的微生物相對於類硫酯酶(食垸菌)或(在另外的微生物中的)同源族 是有缺陷的。此缺陷特徵是由於基因水平的各種的各種修飾或者是由於減少 或破壞了相關的硫酯酶的活性即轉錄後的修飾減少而導致的。另外，根據本發明，與PHA合成有關的一個或多個基因的修飾可發生。 這些修飾可導致PHA合酶、聚(3-羥基丁酸酯)合成酶、enyol-輔酶A水合 酶和/或PHB合酶和/或另外的與脂肪酸代謝有關的酶。在食烷菌中編碼enyol-輔酶A水合酶的基因，例如有ABO 2240、 ABO—0526、ABO—1238、 ABO—0987、 ABO—0148或ABO—1645。 enyol-輔酶A水合酶將PHA的生物合成的P氧化 與催化從卩氧化的中間產物enyol-輔酶A產生-3-羥醯基輔酶A聯繫起來。食 烷菌中有兩種編碼PHA合成的基因ABO—2214和ABO—1418。 PHA合酶催 化PHA合成的關鍵的最後一步。 一般來說，這些酶的酶活性由於引入的修飾 而提高了。根據本發明，基因工程微生物具有至少一個對在PHA的生產中幹預代謝的蛋白質進行編碼的基因，並且，優選地，具有PHA代謝中的至少一個修 飾因子。因此，所述微生物只有一個在PHA的生產中與代謝幹擾有關的蛋白 的編碼基因只有一個修飾因子是可能的。然而，所述微生物有在PHA的生產 中與代謝幹擾有關的蛋白的同樣的編碼基因中或在兩個(或更多)不同的基 因中有多個修飾因子也是可能的。在此情況下，多於一個的修飾因子引起不 同基因型的結果是可能的。例如，這些修飾因子中的一個可導致PHA的分泌 而另外的修飾因子引起PHA的過量生產(如下所述的)。另外，本發明的微生物也可能在具有不同功能的不同基因中有多個修飾 因子，也就是在(至少) 一個與PHA的生產的代謝幹擾有關的蛋白有關的編 碼基因中發生(至少) 一個修飾，同時，在(至少) 一個與PHA的生產的代 謝有關的蛋白有關的編碼基因中發生(至少) 一個修飾。此外，更多的基因 可被修飾，例如，在分泌機制中的蛋白的編碼基因。在這種情況下，在(至 少)一個與PHA的分泌增加有關的蛋白的編碼基因中發生(至少)一個修飾， 同時，在(至少) 一個與PHA的過量生成有關的蛋白有關的編碼基因中發生 (至少) 一個修飾(如下所述)。現有技術中的幾個合適的基因工程技術可用來產生本發明的微生物。一 般地，任何來源的基因都可被斷成若干片斷並用各種方法進行修飾，包括用 微生物和它們的酶或作為分子工具的可換位的元素的方法。本發明中，甚至 可能用本發明的微生物用基因工程的方法完全構建人工的與PHA的生產的 代謝有關的蛋白有關的和/或抑制3-HAA生產有關的編碼基因(例如，增加 生產的PHA的產量)。 一旦想要的基因被選擇出或被創造出，它就可以被插 入到本發明的微生物中來在其中表達來產生想要的基因產物。例如，廣泛的 基因工程的方法是基於分子克隆。在分子克隆中，來自任何類型的包括雙鏈 的DNA的基因片段與載體重組並被引入到合適的寄主物中。通常所用的克 隆載體包括例如質粒和噬菌體(例如，質粒pBR322、X噬菌體，也如下所述)。 分子克隆可分成下列的步驟1、 離析和分裂源DNA (例如，基因組DNA， cDNA，合成的DNA等)2、 將DNA片段與DNA連接酶連接成克隆載體和3、例如通過轉化在寄主生物(微生物)中引入並維持。因此，本發明的微生物可包括例如人工或自然基因(與強的啟動子可操 作地連接)，其可過量表達PHA合成路徑中的蛋白質，因此增加PHA路徑中 的中間物。結果，PHA的生產量比在自然條件下高許多。另外的基因被插入 到細胞中並位於分開的例如載體(例如，質粒)DNA分子中，或者被合併到 細胞的染色體中。改變核苷酸序列的另一個優選的方法涉及基因中的特定鹼基對被改成 另外的鹼基對的引起的寡核苷酸的定向位點突變(參見，例如，Comack B, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 8.01-8.5.9, Ausubel F， "fl/.，eds. 1991)。在此方法中，用如上述的方法進行合成包含感興趣的突變 的寡核苷酸的序列。然後使此寡核苷酸與含有野生型的核苷酸序列的模板雜 交。在此方法的一個優選實施例中，所述模板是單鏈的模板。特別優選的是 包含如fl基因間區域這樣的區域的質粒。當助手噬菌體加到噬粒的培養基中 時，此區域可以產生單鏈的模板。模板的寡核苷酸退火後，DNA依賴的DNA 聚合酶用來從寡核苷酸中合成與模板DNA互補的第二條鏈。產物是包含了 由於寡核苷酸的修飾導致的錯配的異源雙鏈核酸分子。在寄主物細胞的DNA 複製後，兩種類型的質粒均存在，即野生型和新形成的突變型。此方法可使 實施人員引入方便的限制位點，例如，不管所使用的轉錄或翻譯調節的元素 是什麼，編碼核苷酸序列可被替代。用於大腸桿菌的構建方法可用來構建其 它生物的類似載體，如果需要的話，僅僅用所述領域的技術人員所熟知的合 適的調節元素來替代即可。本發明的一個特別優選方法涉及轉位子修飾，即一種隨機的重組。此過 程通常包括在嵌入在染色體中的可移動DNA片段的末端的斷裂反應，以及 這些末端在多個不同的非同源性目標DNA位點上的附著。它並不涉及異源 雙鏈核酸分子的形成。轉位子可用作突變劑而不用化學突變劑或物理突變劑。 轉位子(也稱為可換位的元素)可整合到染色體(例如，細菌的染色體中) 的各種位置中並引起突變(突變定義為遺傳獲得或人工改變的在核苷酸鹼基對和/或在肽或多肽的胺基酸序列中的基本序列的改變)，其中在基因中的插 入通常導致基因功能的喪失。因此，它們提供了一種容易做到的通過染色體 來產生修飾因子的方法。轉位子突變的最方便的元素是含有抗生素抗性基因 的元素。含克隆轉位子的克隆可通過抗生素抗性基因菌落分離來選擇。兩個廣泛用來引起突變的轉位子是包含抗四環素(tetracycline)的標記的TnlO， 以及對新黴素(neomycin)和卡那黴素(kanamycin)有抗性的Tn5。相應地， 本發明的一個優選實施例涉及微生物，其中的至少一個修飾因子是通過轉位 子突變來進行的，優選地是基於小Tn5卡那黴素元素(miniTn5 Km element) (其序列見圖14和圖15)轉位子突變，更優地，是基於小Tn5鏈黴素 (streptomycin)轉位子突變(見實施例1)。在本發明的優選實施例中，所述微生物包含修飾因子，其引起在如下所 述的基因下遊到修飾了的基因上轉位子插入後的極化效應，優選地其引起 Tn5插入後的極化效應。另一個涉及保守性的位點特異性重組包括產生很短的異源雙鏈核酸分 子並且因此需要短的與供體和受體DNA分子相同的DNA序列。在此路徑中， 在兩個特殊的位點產生斷開和結合，在每個參加的DNA分子中各有一個。 得到的雙鏈分子通過轉錄被插入到克隆寄主物中並且選擇出修飾因子。根據 兩個組合位點的方向，DNA整合、DNA切除或DNA倒位可發生。通過保守 性的位點特異性重組來開啟基因或關閉基因特別有用。如上所述，與PHA的生產的代謝幹擾有關的蛋白的編碼基因的至少一 個基因的至少一個修飾因子可導致細胞外沉積，例如，分泌微生物生產的 PHA，優選地分泌中鏈或長鏈的PHA，優選地將其分泌到周圍的媒質中。因 此，本發明的微生物一般沉積，例如，分泌PHA，優選地分泌中鏈或長鏈的 PHA，優選地分泌到周圍的自然媒質或培養基中。本發明中的術語"沉積"意 思是微生物釋放(細胞內)生產的PHA，優選地，釋放到周圍的媒質中，此 媒質是包含所有需要的組分和合適的條件(營養、緩衝劑、pH、溫度)適合 微生物存在和生長的培養基。所述沉積可以是由於活細胞的主動過程所致 ("分泌")和/或由於微生物(過度)生產PHA導致死亡而釋放PHA所致。典型的羥基單元聚酯(PHA)包含具有5到16個碳原子的側鏈羥基單元[(化)-3-羥基單元]。術語"長鏈PHA"的目的是為了包括含有12個，優選地包括至少 14個碳原子每個單體(分子)，其中5個到12個碳原子意思是指"中鏈的 PHA"。根據本發明，展示了用本發明的的微生物來過量生成PHA(見圖1、 4、 6和7)。因此，與PHA的生產的代謝幹擾有關的蛋白的編碼基因的至少一個 基因的至少一個修飾因子可導致細胞外沉積，特別是導致有(部分)缺陷的 硫酯酶，更特別是用3-羥醯基-輔酶A作為具有高特異性的底物導致(部分) 硫酯酶(除了在培養基中沉積PHA之外)過量生成PHA，優選地生產中鏈 和/或長鏈的PHA。術語"過量生成"意思是本發明的微生物的PHA生產比野 生型的微生物的PHA生產的至少5倍，優選地為至少10倍，較優地為至少 15倍，較優地為至少25倍，更優地為至少40倍，最優地為至少60倍，最 優地為至少80倍，甚最優為至少100倍。野生型的微生物是指生產PHA的 沒有基因工程化的其基因沒有經過人工修飾(突變)的微生物。野生型的微 生物生產正常水平的PHA，但並不顯示出沉積性質。另外，本發明的微生物 具有與PHA合成有關的蛋白的編碼基因的基因的至少一個修飾因子。此修飾 因子可以是由於修飾後的啟動子而過量表達此蛋白或另外的PHA合成基因 的修飾了的調節元素或PHA合成基因的另外的拷貝(通過例如微生物的轉 錄)或通過基因編碼區的修飾，其可增加PHA合酶的活性和/或特異性。一 般地，術語"微生物"意指大量的各種原核微生物(例如，細菌、藍菌 (cyanobacteria))和真核微生物(例如，原生動物、真菌)的單個細胞或細 胞族群。本發明的微生物的優選地包括生產PHA的細菌食烷菌屬石油去汙 菌(v4/cflw/vonxc 6orA:wmeww》)、惡臭假單胞菌(i^eMfitomowas/ i/aV/a)、銅t錄 假單胞菌(屍so^omowos aerMg^iosa)、 丁香f叚單胞菌(PseMctomowas s^n'打gae)、 螢光假單胞菌(/^ewc o附owas^/7womsce"s)、變形菌(誠o應n'wa /oz7n.e肌'51)、 不動桿菌(v4cz力etoZ7ac/er5p.)、新月柄桿菌(Caw/o6a"er cmycew加s)。儘管如 此，任何其他的生產PHA的微生物，例如，真養產鹼桿菌"/^/fge"" e旨o/ /m51)、產鹼桿菌屬細菌"/cfl,/ge"es ew加; Aw51)、產鹼桿菌"/cfl/Zge"ey/ato)、固氮菌"zoZo6ac^ V7'w/aw必)、假單胞菌(屍se^omowos acz7o/7h7a)、 假單胞菌(i^ei^/omowos o/eowmms), 大腸桿菌(j&cAm.c^z co//)，紅球菌 屬真養菌(i Aodococcus ew^o; /ja)、紫色色桿菌(C7^omo6acten'wm vz'o/ace"m)、 光合細菌(aramfl"iW2 v/wosi/m)。另外，任何並不自然生產PHA的微生物 也可用於本發明，如果這樣的微生物包括表達載體，此載體包括基因簇或相 應的表達盒(expression cassette),此表達盒可表達PHA生產所需的酶，特 別是PHA合酶、聚(3-羥基丁酸酯)合成酶、enyol-輔酶A羥化酶並包含上 述的至少一個修飾因子。如此的表達載體可被用任何合適的方法，例如，轉 染、轉導、轉錄等(見下述)引入到微生物中，尤其可引入到所述微生物的 細胞中，例如大腸桿菌中。本發明的特別優選的微生物是貧營養細菌(oligotrophy bacterium),優 選地是嗜鹽(halophilic)貧營養細菌，更優地是海洋石油烴降解菌(marine oil-degrading bacterium),尤其優選地是同族食烷菌，優選地是食烷菌屬石油 去汙菌，更優選地是食烷菌屬石油去汙菌(爿/ca"/vora;c Z o^i/附e"w's ) SK2。 食垸菌屬石油去汙菌是在水環境中廣泛存在的海洋石油烴降解菌。它是具有 中等嗜鹽性的貧營養細菌，可用石油碳氫化合物來作為碳和能量來源。食烷 菌屬石油去汙菌是最令人感興趣的，因為在石油汙染了的海水中它是最廣泛 存在的物種(Harayama & a/"1999; Kasai " a/"2001; 2002; Syutsubo " a/.，2001)，並且，相應地，在生物治汙上具有關鍵的應用。對於包括食垸菌 在內的貧營養海洋細菌石油汙染構成了營養豐富的臨時條件，其特徵是具有 高的C/N比。在這樣的條件下，當缺乏氮不在是一個限制因素時，微生物將 存儲過量的碳來作為能量來源。在這種具有高C/N比率的確利於微生物細胞 內的存儲內含物。相應地，碳過量使得生產PHA的細菌種類以PHA顆粒的 形式積累(Steinbtichel 1991)。以前，有人記述了食垸菌屬石油去汙菌不能生 產PHA(Yakimovet all. 1998)。然而，不利於PHA積累的培養條件是由於在 培養基中的高的氮的濃度(5g/1)。食垸菌屬石油去汙菌的基因組的功能分析 揭示了與生產PHA有關的蛋白的基因編碼(如與其他生物進行的同源性研究 所示的一樣)。因此，根據本發明，揭示了多羥基鏈烷酸酯是生產PHA的細菌。對此蛋白的胺基酸序列排列揭示了在PHA合成代謝中的此蛋白與其他細 菌種類中的蛋白具有低的序列同源性(見圖5，表l)，揭示了食垸菌屬石油 去汙菌中的PHA生產的代謝根源。如上所述，本發明的微生物典型地包括至少一個幹擾PHA生產有關的 蛋白的編碼基因的修飾因子，優選地，所述蛋白是硫酯酶，更優地所述蛋白 是在PHA合成的代謝中的編碼蛋白質即合成3-HAA的硫酯酶。然而，本發 明也提供核苷酸序列包括在PHA代謝中有關的蛋白的編碼的編碼基因，其中 的基因具有至少一個引起本發明的微生物生產的PHA分泌的修飾因子。優選 地，本發明的核苷酸序列的修飾因子是基於從包括PHA合酶、PHB合酶、 醯基輔酶A轉化酶、enyol-輔酶A羥化酶、還原酶、硫解酶、醯基輔酶A硫 酯酶。另一方面，本發明提供用至少一個修飾因子的基因，優選地使得編碼 的酶的活性有缺陷，此基因編碼類fe^醯基輔酶A硫酯酶、優選地此基因編 碼食垸菌屬石油去汙菌的類Z^5醯基輔酶A硫酯酶，更優地，此基因編碼食 垸菌屬石油去汙菌SK2或另外的微生物中的此酶的同族，尤其是如表4所示 的(圖10)。本發明的一個優選實施例的微生物已經根據《國際承認用於專利程序的 微生物保藏布達佩斯條約》，被保藏在德國國家菌種保藏中心，標識參考是 SK2 C9, (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen imd Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb， 38124 Braunschweig, Germany with the identification reference SK2 C9 mutant and the Accession Number DSM17483)。涉及包括或包含圖ll、圖12、 18至25或它們的功能片段的一個核苷酸 序列的一個優選實施例。本發明的核苷酸序列是包含編碼序列和最終的進一步的序列的DNA。所 述核苷酸分子是雙鏈或單鏈分子，單鏈的RNA或DNA可以是編碼(意義) 鏈或非編碼(反義)鏈。如果需要的話，所述核苷酸序列可包括另外的非編 碼序列，例如，非編碼的3'-和5'-序列(例如包括調節序列)。所有的核苷酸序列，除非另外設計的話，是從5'端寫到3'端。術語"核苷酸序列"也包括下 述的片段或其修飾因子。更進一步，本發明的核苷酸序列可以融合到包括和 包含例如標記序列、指導序列和核苷酸序列編碼的多肽序列來幫助多肽的分 離或純化。代表性的序列包括但不限於那些編碼穀胱甘肽-S-轉移酶融合蛋 白、聚組氨酸(poly-histidine)(例如，6聚組氨酸His6)、血球凝集素 (hemagglutinin)、單純皰疹病毒標籤(HSV-Tag)。術語"功能"片段或核苷酸序列的修飾涉及核苷酸序列，能夠構成典型的 修飾了的在PHA的代謝中的蛋白質的編碼基因，或在微生物生產PHA的代 謝中幹擾的蛋白質的編碼基因，和/或編碼生物活性(例如，在PHA或蛋白， 在PHA的生產中的代謝中幹擾的)多肽的基因，如下所述。另外，在本發明中，核苷酸序列是指使PHA在細胞外媒質中沉積蛋白的 編碼，其中的蛋白在微生物中與通過PHA合酶PHA和合成競爭。本發明所 述的"功能失常的"核苷酸序列包括原始的核苷酸序列，根據圖17和圖26至 33，其中的序列用已經用轉位子插入來中斷了 (例如，圖14和15中所示例 的)上述揭示的核苷酸序列和相應的基因。更進一步，"功能失常的"核苷酸 序列可包括圖11和圖12的核苷酸序列，其已經被轉位子插入所中斷。術語核苷酸序列的"片段"包括此處描述的核苷酸序列的部分，來自至少 25個連續的核苷酸片段至50個連續的核苷酸片段，優選地為至少60個連續 的核苷酸片段，更優地至少120個核苷酸片段，更優地至少180個連續的核 苷酸片段，更優地至少250個連續的核苷酸片段，更優地至少410個連續的 核苷酸片段或更長。在本發明中，較短的片段用來作為探針和引物。尤其優 選的引物和探針與編碼多肽的核苷酸序列的選擇性的雜交。引物是核苷酸序 列，其功能是作為酶或合成延長的起始底物。探針是核苷酸序列，與本發明 的核苷酸序列雜交，的片段或互補性的核苷酸序列。本發明的編碼多肽的片 段保持了上述的功能並特別有用。可在此用雜交來分析特定片段或基因的是否與本發明一致，因此也屬於 本發明的範圍。雜交描述了核苷酸序列鏈與互補的鏈通過鹼基對結合的過程。 兩個不一樣但很相似的互補性的核苷酸序列，兩條鏈的互補程度和鏈的長度各種各樣，這樣的條件被用來雜交化。本領域的技術人員熟悉這樣的條件和
雜交方法，並且可以進行標準雜交分析(參見例如Sambrook J， Maniatis T (2001) s甲ra)。結果，與本發明的核苷酸序列或功能片段或功能變異體雜交 的的所有的核苷酸序列都屬於本發明的範圍。
核苷酸序列的變異體是指通過添加、替代、刪除或插入一個或多個核苷 酸而保持上面所述的核苷酸序列的功能特性的核苷酸序列。這樣的核苷酸序 列可表達某些特定方面的改變了的性質(例如，增加或減少了的表達率)。除 了這些，本領域技術人員將認識到本發明的多肽的胺基酸，如下所述，可被 多個不同的核酸密碼子編碼，因為由於遺傳密碼的兼併性絕大多數的胺基酸 序列是被不止一個核苷酸密碼子編碼。由於這些改變了的核苷酸序列將編碼 同樣的胺基酸序列，本發明也包括這些改變了的核苷酸序列。
本發明的核苷酸序列的變異體與在此描述的核苷酸序列具有很大的同一 性。尤其優選的是與在此描述的核苷酸序列具有至少30%的同一性、優選地 至少為40%的同一性、更優為至少50%的同一性、甚優為至少60%的同一性、 甚更優為至少80%的同一性、甚更優為至少90%，最優為至少95%的同一性。
為了確定上述的兩種核苷酸序列的同一性的比率，這些序列可以調整來 達到最佳的比較目的(例如，可在第一條核苷酸序列中引入間隙)。相應的核 苷酸位置的核苷酸序列可以進行比較。當第一序列的一個位置與第二個序列 的位置是同樣的核苷酸時，則分子在那個位置就是相同的。在兩個序列之間 的同一性百分比是兩個序列之間的共有的相同位置的個數的函數。因此，可 以用數學算法來確定兩個序列的同一性百分比。優選的、非限定性的用於比 較兩個序列同一性的算法例子是Karlin等人提出的算法(1993)， PNAS USA, 90:5873-5877。這樣的算法被包括在NBLAST程序中，可用來識別與本發明 的核苷酸序列具有想要的同一性的序列。為了得到有空隙的聯配，可用 Altschul等(1997)提出的Gapped BLAST的方法，Nucleic Acids Res, 25:3389-3402。當使用BLAST和Gapped BLAST程序時，可使用各自程序的 默認參數(例如，NBLAST)。確定兩個核苷酸序列的所述方法可應用於氨基 酸序列中。本領域的技術人員可通過執行下述的標準方法來生產本發明的核苷酸序
列的片段或變異體(參見例如，Sambrook J, Maniatis T (2001) swpra)。 一般說 來，製備如此的核苷酸序列的功能片段或變異體可通過修飾(改變)編碼本 發明的多肽的DNA序列、並用合適的方法如PCR技術倍增DNA序列來達 到。這些核苷酸序列的修飾(突變)可通過上述的基因工程技術來產生。核 苷酸序列的功能片段和功能變異體的分離可通過標準的方法如篩選法來進行 (例如，篩選基因組DNA庫)，然後通過序列化或雜交(用合適的探針，例 如，通過產生目標核苷酸想要的序列的寡肽)以及純化步驟，如果合適的話。
本發明也包括本發明所述的核苷酸序列的基因產物。本發明的基因產物 不僅涉及轉錄，根據RNA，優選為mRNA，還涉及等位基因、多肽或蛋白或 酶，尤其是純化形式的。優選的基因產物是核苷酸序列編碼的多肽。優選地， 本發明的多肽包括在圖13、圖17和圖26至圖33。
本發明所述的"功能"多肽意指所述多肽可用來生產沉積的例如分泌的 PHA，優選地與其他的與PHA代謝有關的多肽。優選地，PHA的過量生成 是通過PHA合成路徑中的功能多肽來達到的。本領域中熟知測量和分析生 產、分泌和/或過量生成物質例如PHA的方法(參見例如Sambrook J, Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor,NY)並且也在本發明中有描述，例如，實 施例3至8，圖l、圖3、圖4、圖6。本發明的"功能多肽"並不限於此，可 包括圖17和圖26至圖33中的天然多肽序列。
相應地，在本發明中，多肽可用於使PHA在細胞外媒質中沉積，尤其是 通過微生物中的PHA合酶的合成的競爭，因此，此處可稱為"功能不良"的多 肽，例如，此處定義的類Zm5蛋白。這樣的競爭可能會發生，如上所解釋的 那樣，由於硫酯酶對c的斷開具有高度的特異性，形成了PHA合成的阻礙。 這些硫酯酶允許釋放自由的3-HAA。然而，轉化成3-HAA是與PHA合酶合 成PHA的反應競爭的，其作用與同樣的細胞媒質(即3-羥醯基-輔酶A)。如 上所解釋的，本發明發現，(i)釋放自由的3-HAA和PHA的合成是幹擾代謝 路徑，(ii)特定硫酯酶的功能敲除，此處稱為類^^蛋白硫酯酶，使得PHA在細胞外媒質中沉積。本發明的"功能不良"的多肽包括圖17和圖26至圖33 所示的自然多肽序列或圖16和圖18至圖25所示的核苷酸序列編碼的多肽序 列，其中的序列已經被轉錄子插入所中斷(例如，如圖14和圖15所示例的) 如上揭示的核苷酸序列和相應的基因。更進一步，本發明的多肽可包括圖ll 和圖12所示的已經被轉錄子插入所中斷的核苷酸序列編碼的多肽序列。
生產本發明的多肽已經為人們所熟知，並可通過執行許多不同的標準的為 本領域技術人員所熟知的方法(參見例如Sambrook J， Maniatis T (2001) w/ ra)，例如用固相肽合成或重組方法。兩種方法都在美國專利4617149中描 述，其被完整地引用在本專利中。固相化學合成多肽的原理被本領域的技術人 員所熟知，並且被例如Dugas H. and Penney C. (1981)， Bioorganic Chemistry, 第54-92頁中有描述。例如，肽可通過固相法，用Applied Biosystems 430A肽 合成器(可從美國應用生物系統(Applied Biosystems)公司，Foster City, Calif. 購得)來合成，而且合成循環用AppliedBiosystems來供應。關鍵的保護的氨基 酸，例如，叔丁氧羰基(t-butoxycarbonyl)保護的胺基酸，和另外的試劑可從 許多化學供應商得到。本發明的多肽可通過標準的方法例如離心、過濾或色譜 法和沉澱步驟從培養基中分離出(參見例如Sambrook J， Maniatis T (2001)
本發明的多肽也可與至少一個第二半族融合。所述至少第二半族可以是 胺基酸、寡肽或多肽並可在合適的位點連接到本發明的多肽上，例如，N-末 端，C-末端或中間。連接序列可用來將本發明的多肽與至少一個另外的半族 融合。根據本發明的一個實施例，連接序列優選地形成5到50個的各種殘基， 更優為5到15個各種殘基。在優選實施例中，連接序列包含至少20%，更 優為至少40%，甚更優為至少50%的甘氨酸殘基。合適的連接序列可很容易 選擇並由本領域的技術人員製備。另外的半族可連接到本發明的序列中，如 果想要的話。如果所述多肽是作為融合蛋白來產生的，融合伴侶(例如，HA、 HSV-標籤、His6)可用來幫助純化和/或分離。如果想要的話，所述融合伴侶 然後可以在生產過程的末端從多肽中移除(例如，通過蛋白水解斷開或本領 域中的另外的方法)。本發明也提供包含核苷酸序列的載體。術語"構建"、"重組構建"和"載 體"是同樣的意思，定義了包括一個或多個其他核苷酸序列(或功能片段或功 能變異體)的核苷酸序列。載體可通過轉錄到合適的細胞(寄主細胞)中引起
核苷酸的表達來使用。所述載體可以是質粒、噬菌粒(phage particle)或僅 僅是潛在的基因組插入物。 一旦被轉錄到合適的寄主物中，載體就複製並在 寄主物基因組中獨立地發揮功能，或者在合適的條件下，整合到基因組本身 中。
上述載體的"另外的序列"涉及 一般地，合適的載體包括複製的起源， 例如，Orip， colE10ri，可以插入到要表達的(轉錄和/或翻譯)和/或可選擇 的核苷酸序列例如編碼螢光蛋白，例如GFP，或基因具有抗體抗性，例如， 從Tn3的p-內醯胺酶基因，來自Tn903的抗卡那黴素的基因或來自Tn9的抗 氯黴素的基因。
術語"質粒"意思是指染色體外的自我複製的基因元素。質粒一般是通過 較低的"p"處理和/或然後用字母和數字來標識。此處所述的開始質粒要麼可 商業上可購得，要麼可不受限地公共可得或可以從公知的步驟從可得的質粒 來構建。另外，本領域的技術人員熟知等效的質粒。用來製備本發明的載體 的開始質粒可用標準的氯化銫DNA分離法例如從包含這些質粒的大腸桿菌 來得到。
本發明的載體包括(重組)DNA克隆載體和(重組)表達載體。本發明 的優選載體是大腸桿菌pBR32、 XL-Blue MRF'和pBK-CMV、 X噬菌體等。 DNA克隆載體指自動複製劑，包括但不限於質粒和噬菌體，包括DNA分子， 一個或多個另外的本發明加入的核苷酸序列。涉及任何DNA克隆載體重組 的表達載體，包括本發明的核苷酸序列可操作地連接到合適的寄主物中的合 適的控制序列中，此控制序列可作用於插入的核苷酸序列的表達。可操作的 連接意思是指核苷酸序列連接到控制序列，以使核苷酸序列可以表達(例如， 轉錄和/或翻譯)的方式。轉錄意思是指包含在核苷酸序列DNA中的信息轉 錄到互補RNA序列的過程。
上述的控制序列被本領域的技術人員所熟知，並可選擇來表達本發明的核苷酸序列並控制轉錄。這些控制序列包括但不限於多腺苷酸化信號、啟動 子(例如，自然的或合成的啟動子)或影響轉錄的增強子，可選的操縱子序
列來控制轉錄，局部控制區域或沉默子使得可組織特異性轉錄，在mRNA上 的適合於核糖體結合位點的序列，能夠穩定mRNA的序列和控制轉錄和翻 譯。這些控制序列可被修飾，例如，通過刪除、添加、插入或替代一個或多 個核苷酸，而且同時保持它們的功能。另外的合適的控制序列在本領域中為 人們所熟知並且在例如Goeddel (1990)中有描述(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego, CA)。
在細菌系統中的啟動子也包括可與編碼想要的多肽相連接的 Shine-Dalgarno序歹U 。
例如，有用的表達載體可包括染色體片段、非染色體片段和合成的DNA 序列，例如各種己知的SV40和已知的細菌質粒，例如來自大腸桿菌包括col El、 pBK、 pCRl、 pBR322、 pMb9, pUC 19和它們的變異體，廣泛的寄主質 粒載體，例如RP4,噬菌體DNAs ，例如X噬菌體，例如，NM989和另外 的噬菌體，例如，M13和絲狀單鏈DNA噬菌體和從質粒和噬菌體DNA組合 而來的載體，例如，經過修飾而用了噬菌體DNA或另外的表達控制序列的 質粒。用表達載體的表達技術為本領域的技術人員所熟知，並在Sambnx)kJ， Maniatis T (2001) swpra中有描述。
優選地，本發明的載體，尤其是表達載體，包括基因簇，此基因簇包括 上面所定義的修飾，例如，具有在PHA的代謝中的蛋白的編碼蛋白，或優選 地，與PHA的生產的代謝幹擾有關的蛋白的編碼基因的至少一個基因，其中 的至少一個修飾引起細胞外沉積，例如，分泌微生物生產的PHA到培養基中， 優選地，分泌微生物生產的中鏈或長鏈的PHA到培養基中。這樣的表達載體 可引入到任何合適的上述的微生物中來產生發明的微生物產生分泌的PHA。 這樣的基因簇典型地包括所有的需要或涉及PHA的代謝有關的基因。結果， 也包括上述的(表達載體)包括所述的基因簇。
本發明也提供細胞(也是寄主細胞)包括本發明的載體或核苷酸(或 功能片段或功能變異體)。細胞(寄主細胞)意指任何此處描述的有用的微生物。更進一步，細胞或寄主物具有能力來作為本發明的核苷酸或載體的表達 載體。優選地，所述細胞是原核細胞。細胞包括(例如，作為轉錄、轉染或 轉導的結果)此處所述的載體或核苷酸序列，但不限於細菌細胞(例如，食 烷菌屬石油去汙菌、大腸桿菌)。特定細胞的選擇在一定程度上是依賴於特定 的用來驅動表達本發明的核苷酸序列的表達載體。
載體可被引入到細胞(寄主細胞)中，用任何合適的方法(例如，轉錄、
電穿孔、用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE葡聚糖或任何其他物質來轉染， 基因槍法，脂質體轉染，感染或轉導)。轉導涉及引入DNA引入(核苷酸序 列)因此DNA可複製，要麼通過染色體外元素或通過染色體整合。轉化細 菌寄主物的方法在本領域中為人們所熟知。各種方法，例如，核注入，原生 質體融合或用媽處理法，如在Sambrook J, Maniatis T (2001) s甲ra中概述的 那樣。轉染是指用載體(寄主細胞)不管實際是否表達了編碼序列。當任何 標誌或操作或載體在細胞中發生時通常會被識別出來。 本發明的另一個方面是涉及生產PHA包括下列步驟
培養本發明的微生物細胞
從培養基中提取PHA 在適合的條件下培養微生物或細胞的標準方法已經在現有技術中為人所熟 知。參見，例如，在下列的例子中，也可在材料中(Sambrook J, Maniatis T (2001) ■swjora )。
PHA可以用傳統的方法從培養基中分離出來，包括用離心或過濾、沉積 或將成分(PHA)從上清液中分離出來，然後是純化，例如，用色譜法步驟， 例如離子交換色譜法、親和層析法或類似的現有的步驟(也參見實施例4)。
本發明的另一方面涉及微生物，多肽、核苷酸、載體和/或本發明的細胞 生產和沉積例如分泌和/或過量生成PHA，尤其是中鏈和/或長鏈的PHA。
總之，本發明涉及與PHA的生產的代謝幹擾有關的蛋白的編碼基因的 至少一個基因的至少一個修飾可導致細胞外沉積，例如，分泌微生物生產的 PHA，或優選地，分泌微生物生產的中鏈和/或長鏈的PHA到培養基中。基 於miniTn5 Str/Sp元素和miniTn5 Km元素的轉位子突變(見實施例1)，用於引入與PHA的生產的代謝幹擾有關的蛋白的編碼基因的至少一個基因的 至少一個修飾。結果，進行在生物膜形成中篩選miniTn5修飾缺陷，通過測 量修飾細胞貼附在塑料表面的能力不足(見實施例2)。修飾(下文中用"C9" 或"C9突變"表示)被分離出來，展示了由於表達了分泌的後來被識別為PHA 的多聚物物質，生物膜的形成有明顯的缺陷。
通過用化學分析的方法，確定了用本發明的基因工程微生物，例如從食 垸菌屬石油去汙菌中得到的微生物，以及那些微生物通過以顆粒的形式積累 的細胞內的PHA的生產和沉積，例如分泌PHA。用這些基因工程微生物尤 其是在高的碳/氮比的條件下的十八烷上生長的食烷菌屬石油去汙菌分泌的 混合的不同的PHA (羥基己酸甲酯、羥基辛酸甲酯、羥基癸酸甲酯、羥基十 二垸酸甲酯)能夠以細胞內顆粒和存儲物的形式來產生。
除此之外，本發明還成功地分離和表徵了具有至少一個修飾因子的微生 物的，尤其是具有至少一個編碼幹擾PHA的生產中的代謝中幹擾的蛋白的修 飾因子，其中的至少一個修飾引起細胞外沉積。本發明繞過了細胞內生產的 PHA的提取的成本問題，並可導致高的PHA產量。
下面的圖和例子是為了闡釋本發明，而不應視為對本發明的範圍的限 制。本發明所引用的參考文獻都完整地包括在本發明中。
在另外的實施例中，提供了如上述的生產3-HAA的酶。這樣的酶包括 但不限於從食烷菌屬石油去汙菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、丁香假單 胞菌、螢光假單胞菌、不動桿菌、新月柄桿菌的可生產3-HAA的硫酯酶。
本發明進一步包括酶的使用，提供來生產上述的3-HAA，和/或它們的 編碼核苷酸，來產生PHA，優選地，中鏈或長鏈的PHA。這樣的酶類可被用 現有技術中的方法來轉染到上述的微生物中，例如，作為載體或作為(裸露) 核苷酸，或以蛋白質的形式，例如，與細胞穿透肽融合在一起。


圖1是野生型的食垸菌屬石油去汙菌SK2(以下稱為"SK2"或"SK2野生 型")和突變型食烷菌屬石油去汙菌SK2 (以下稱為"C9突變型")以2%的丙酮酸鹽或1.5%十八烷來作為碳源生產PHA。檢査細胞和相應的上清液中的 PHA含量，以g/1表示。PHA的產量的順序如下C9突變型上清液十八烷〉 C9突變型上清液丙酮酸鹽〉SK2野生型細胞+上清液十八垸> SK2野生型 細胞+上清液丙酮酸鹽。來自生長在丙酮酸鹽上或十八垸上的C9突變型細胞 的PHA的數量從太低而不能量化(第三和第五個探針)。在丙酮酸鹽上生長 的C9突變型產出的PHA的量是在丙酮酸鹽上生長的SK2野生型產出的PHA 的量的10倍。另外，在十八垸上生長的C9突變型產出的PHA的量是在十 八烷上生長的SK2野生型產出的PHA的量的10倍。因此，根據本發明，基 因工程微生物可以沉積，例如，分泌和過量生成PHA。
圖2是食烷菌屬石油去汙菌SK2族變形的超薄部分的電子顯微鏡照片。 細胞被培養在含有1.5X(w/v)的十八烷和0.27g/1的NH4C1 (存儲條件)中， 並在靜態生長期收穫。這些超薄切片證實了細胞內顆粒的存在。
圖3是生長在Permanox疏水性的用十八烷覆蓋的細胞培養片上的SK2 野生型細胞和C9突變細胞的電子掃描顯微鏡照片。圖3A和3C展示了 SK2 野生型細胞的結果，圖3B和3D展示了C9突變細胞的結果，證實了分別產 生並分泌細胞外PHA和將PHA分泌到周圍的培養基中。雖然兩副圖都包含 杆狀的細胞，但是顯然，C9突變細胞嵌入在一些沉積的例如分泌的物質中間， 而SK2野生型的細胞並不如此。這些結果支持假設C9突變族在一些細胞外 的通過化學分析的方法證明是PHA的多聚物的生產有關。進一步的投影技術 的方法得到的在存儲條件的十八垸上生長的SK2野生型和C9突變型EM照 片支持假設突變族生產的PHA沉積例如分泌在培養基中。C9突變族的投 影技術得到的EM圖片揭示了 C9突變細胞的表面的小孔可能與細胞內生產 的PHA的分泌有關。
圖4是C9突變細胞和SK2野生型細胞的生長特性的比較圖。由圖可見， 當丙酮酸鹽作為碳源時，C9突變型與SK2野生型具有可比較的生長特性。 當用十八垸作為碳源時，甚至C9突變型的生長特性比SK2野生型的還更好。 SK2野生型在十八烷上生長時與C9突變型比較具有一些缺陷。這一現象可 解釋為高的細胞內的PHA含量抑制了 SK2野生型細胞的分裂。細胞計數也顯示了在十八烷上生長的C9突變細胞(數據沒有展示出來)在高的碳氮比 的條件下，將合成的PHA釋放到媒質種，仍然可進行細胞分裂。結論是，本 發明的微生物肯定可以用於商業上和工業上的生物技術。
圖5展示的表1是生產PHA並將其運轉的食垸菌屬石油去汙菌SK2的 基因序列數據的計算機分析的結果。
圖6展示的表2是PHA和其組分的分析。
為了確定野生型食烷菌屬石油去汙菌SK2(下面以"SK2"或"SK2野生型" 代表)和突變型食烷菌屬石油去汙菌(下面以"C9變異型"代表)沉積的例如 分泌的實際上為PHA的物質，進行了進一步的化學分析，並且揭示了 PHA 的存在。細胞生長在丙酮酸鹽上或十八烷上，將之作為PHA積累條件下(流 入，PHA存儲條件)的碳和能量來源，例如，高的C/N比(C:N為100:1), 並且將細胞從媒質中分離出來。檢査細胞和相應的上清液PHA含量。來自 C9突變型和SK2野生型的細胞或上清液用氯化鈉消化，並接著用丙酮/乙醚 來溶解提取(Solaiman"fl/.,1999)。 PHA的生產的量的大小順序如下
C9突變型上清液十八烷〉C9突變型上清液丙酮酸鹽> SK2野生型細 胞+上清液十八烷〉SK2野生型細胞+上清液丙酮酸鹽
從在丙酮酸鹽或十八烷上生長的C9突變型細胞中分離出來的PHA的量 由於太低而不能量化(也參見圖1)，生長在十八烷上的SK2野生型細胞生 產的PHA的量大約是生長在丙酮酸鹽上的細胞生產的PHA的量的3倍 (18mg/l比6.5mg/0。
如在表2中所示的，SK2野生型細胞所生產的PHA的量是很少的(在 丙酮酸鹽中為6.5mg/1，在十八垸中為18mg/l)，並且依賴於碳源，在垸烴中 生產更多的PHA。 SK2野生型生產的PHA包括羥基已酸乙酯(C6)、羥基辛 酸酯(C8)、羥基癸酸甘油酯(CIO)、羥基十二酸甘油酯(C12)，其中羥基 癸酸甘油酯是主要的單體成分。因此，儘管以前的研究(Yakimov等1998) 發現，在高的C/N比的條件下，食烷菌屬石油去汙菌族從烷烴中產生多羥基 鏈烷酸酯的混合物。此外，食烷菌屬石油去汙菌SK2後來的在高的C/N比條 件下的確顯示了光學顯微鏡下可見的包含PHA的顆粒(也見圖2)。表2也展示了 SK2野生型也在細胞內積累PHA (沒有細胞外生產)，而 C9突變型所生產的PHA沉積例如分泌到細胞媒質中(細胞外生產)。單體重 復單元組分和聚合物的分子量(來自所有批次的)分別通過氣相色譜、法/質譜 分析法和凝膠滲透色譜法來確定。
圖7所示的表3是來自食垸菌屬石油去汙菌的PHA的分子量。展示了 在丙酮酸鹽和十八烷上生長的C9突變型和在丙酮酸鹽和十八垸上生長的 SK2野生型。食烷菌屬石油去汙菌SK2野生型的聚合物具有C6到C12的重 復單元組分。分子量從180000至540000Da (每個分子達2500個單體)。此 對應於每個不同的聚合物每個單體，重複1027至2246個單元。C9突變型具 有相似的組分和/或分子量，雖然組分的PHA的分子量比在SK2野生型中的 稍低。單體的分子量並不與碳源有關。
這些數據有力地支持了以下假設基因修飾影響了 PHA生產的方式，但 不影響產生的聚合物的組分。
圖8是假設的在烴類/丙酮酸鹽上生長的多羥基鏈烷酸酯的PHA生物合 成的路徑(Modified version of Klinke 1999 Hypothetical pathway of MCL PHA biosynthesis of PHA polymerase- and thioesterase I-containing五.co/z. JMU193 grown on gluconate)。烴類通過單氧酶、醇類脫氫酶和醛類脫氫酶的連續作用 的最終氧化步驟而被降解，產生被醯基輔酶A合成酶激活的自由脂肪酸，並 進入醯基輔酶A的p-氧化。在(3-氧化中產生的(S)-3-羥醯基-輔酶A通過異構 酶的作用而異構成(R)-3-羥醯基-輔酶A。丙酮酸以醯基輔酶A的形式進入脂 肪酸生物合成。脂肪酸生物合成產生的醯基ACP通過和的激活而 轉化成自由脂肪酸。脂肪酸生物合成中產生的自由脂肪酸被醯基輔酶A合成 酶所活化，並進入P-氧化循環。在(3-氧化中產生的3-羥醯基-輔酶A被用 來通過類^^的醯基輔酶硫酯酶的活化而進行生物合成A3-羥基丁酸，或被 用來通過phaC合成酶而進行PHA的合成。在類的醯基輔酶硫酯酶的突 變使得不產生3-HAA，並導致PHA不受控制的生產。
因此，換句話說，根據本發明，類^^8基因的突變使得3-羥垸基醯胺-輔酶A不釋放自由的3-羥垸基醯胺，這將增加PHA的前體3-羥醯基-輔酶A，導致不受控的PHA的生成和後續的分泌。
圖9是兩個類基因的操縱子的結構和形成單個操縱子的"假定的醯 基轉移酶"的結構。
確定轉位子(見例l)的插入位點揭示了mini-Tn5插入到了醯基輔酶A 硫酯酶類(Abo—1044)，它是編碼PHA的代謝/生產/合成的蛋白質的多 個基因中的一個，並且很可能破壞基因的功能，因此使基因失活。類^^接 著是下遊的磷酸甘油乙醯基轉移酶(l-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase)的"假定醯基轉移酶"基因(Abo—1045)。"假定醯基轉移酶"的 ORF基因包括645bp的、表達與前述的類&^B基因的ORF有3個重疊，並 且其預測編碼214胺基酸序列的蛋白，預測的分子量是23.7kDa。類基 因和"假定醯基轉移酶"基因在圖9所示的一個操縱子中排列。
為了分析如上所述的PHA分泌和過量生成的表現型是編碼與PHA代謝 /生產/合成有關的蛋白的基因，尤其是類tes5醯基輔酶A硫酯酶基因的結果， 並且估計轉位子對下遊基因的極化作用的可能性，構建了位點導向的突變， 並將其表現型與C9突變型做比較(見實施例3)。為了構建敲除突變，此基 因的野生型在載體中被放大並克隆，此載體在食垸菌屬石油去汙菌中並不復 制。鏈黴素抗性盒(Str resistance cassette)被插入到此基因的獨特位點中， 構建結果用來代替此基因的野生型拷貝。此結果通過光學顯微鏡和培養基的 化學分析來得到確認(數據沒有展示出)。它們也顯示出，敲除突變沉積例如 分泌了PHA在媒質中，這意味著插入到了 "假定醯基轉移酶"中的mini-Tn5 具有極化作用。因此，考慮到類&s5在PHA生產中的正面作用，PHA分泌 和表現型的過量生成可在類^s萬的失活之外，並也可被插入到"假定醯基轉 移酶"基因中的Tn-5來引起。
圖10的表4展示了被類tes5基因編碼的醯基輔酶A硫酯酶蛋白的幾個 緊密相連的革蘭氏陰性細菌食垸菌屬石油去汙菌SK2(Abo一1044)的基因同源 性。這些數據是相應的假定醯基轉移酶蛋白的同源性搜索的結果(BLAST搜 索)。可從表4看出，類^^蛋白與假定的醯基輔酶A硫酯酶n、假定蛋白 和類硫酯酶命名不同。這些搜索的細菌是多功能降解菌KT2440(i^eMdomomw /7M"f/a KT2440 )、銅綠假單胞菌PA01 (i^ewdomowas am^'"osa PA01 )、 丁香假單胞菌B728a (屍sewc/omowas ,/"gae pv B728a)、 螢光假單胞菌(屍^M^ mowos y7womsce"s PfO-l)、變形菌L2TR (/Wo附fln'wfl /0//n'e"w's L2TR)、不動桿菌(j"'"eto^c&r )和新月柄桿菌CB15
(Om/oZ)actercTesce"^f CB15)。然而，應當理解，術語"類to 5"、"類 基因"和/或"類to萬蛋白"和此處的描述的涉及上述的所有的不同命名。表4 中的蛋白展示了食垸菌屬石油去汙菌SK2的與類化W基因的高度同源性 (Abo—1044)。
圖11是形成單個的操縱子的兩個類te^8基因的核苷酸序列(Abo—1044) (帶下劃線的)和"假定的醯基轉移酶"(Abo—1045)。第一行是來自類/e^5 的上遊區域。類的起始密碼子是atg，並且用黑體字表示。Tn5插入發 生在類to5的位點527，並用//標出。來自類^5基因的下遊是"假定的醯 基轉移酶"基因。在類ZM萬(Abo一1044)的末端和"假定的醯基轉移酶" (Abo—1045)的起始位點之間有3bp的重疊。
圖12是食烷菌屬石油去汙菌的類tes5核苷酸序列。Tn5插入發生在位 置557，並且用//標出。起始和結束密碼子以黑體字母來標識。
圖13是類的食烷菌屬石油去汙菌的胺基酸序列。
圖14是miniTn5 Km元素的核苷酸序列。
圖15是新黴素和卡那黴素抗性的新黴素磷酸轉移酶的胺基酸序列。
圖16是食烷菌屬石油去汙菌的"假定的醯基轉移酶"的核苷酸序列。起始
和結束密碼子以黑體字母來標識。
圖17是食烷菌屬石油去汙菌的"假定的醯基轉移酶"的胺基酸序列。
圖18是惡臭假單胞菌KT2440的假定的醯基輔酶A硫酯酶II的核苷酸序列。
圖19是銅綠假單胞菌PA01的假定的PA2871蛋白的核苷酸序列。 圖20是丁香假單胞菌pv B728a的假定的醯基輔酶A硫酯酶II的核苷酸 序列。
圖21是螢光假單胞菌PfO-l的醯基輔酶A硫酯酶的核苷酸序列。圖22是變形菌L2TR的類醯基輔酶A硫酯酶的核苷酸序列。 圖23是不動桿菌ADP1的假定醯基輔酶A硫酯酶II的核苷酸序列。 圖24是新月柄桿菌的假設蛋白CC2472的核苷酸序列。 圖25是赤細菌屬桿菌(五o^w^c^ HTCC2594的假設蛋白
ELI0992的核苷酸序列。
圖26是惡臭假單胞菌KT2440的假定醯基輔酶A硫酯酶II的胺基酸序列。
圖27是銅綠假單胞菌PA01的假設蛋白PA2871的胺基酸序列。 圖28是丁香假單胞菌pv B728a的假定的醯基輔酶A硫酯酶II的胺基酸 序列。
圖29是螢光假單胞菌PfO-l的醯基輔酶A硫酯酶的胺基酸序列。 圖30是變形菌L2TR的類醯基輔酶A硫酯酶的胺基酸序列。 圖31是不動桿菌ADP1的假定醯基輔酶A硫酯酶II的胺基酸序列。 圖32是新月柄桿菌的假設蛋白CC2472的胺基酸序列。 圖33是赤細菌屬桿菌(￡o^raZ)acter /z'torafc) HTCC2594的假設蛋白 ELI0992的胺基酸序列。
具體實施例方式
材料細菌族、媒質和生長條件
食垸菌屬石油去汙菌SK2用於所有的野生型的實驗。細菌在修飾過的 ONR7a媒質中30。C下生長(Yakimov等1998)，其中加入了 0.27g/l的NH4C1 代替KN03來作為氮源。丙酮酸鹽(2%)或十八烷(1.5%)用於作為碳和 能量來源。
大腸桿菌在加入了必需的鏈黴素(50pg/ml)、氯黴素(12,5pg/ml)、卡 那黴素(50|ig/ml)、萘瞎酸(nalidixic acid) (10)ig/ml)的Luria-Bertani媒質 中在37"C下生長。用與大腸桿菌族S17-1結合來將質粒引入食垸菌屬石油去 汙菌中。實施例1: Mini-Tn5突變
轉位子突變基於Lorenzo等(1998)提出的miniTn5 Str/Sp元素(和Tn5 Km元素)。食垸菌屬石油去汙菌SK2在ONR7a媒質中在3(TC生長，處於 生長靜止期時，對細胞進行離心。大腸桿菌的原料和輔助部分在LB培養基 上與鏈黴素或氯黴素37i:生長過夜，用新鮮的LB培養基衝洗並離心。食垸 菌屬石油去汙菌和大腸桿菌和輔助部分以4: 1: l的比例混合，並放在具有 LB瓊脂和鹽(Na2HP04.2H20, 0.45 g/l; NaN03, 2.5 g/l; NaCl, 11.5 g/l; KC1, 0.38 g/l; CaCl2.2H20, 0.7 g/l)和作為碳和能量來源的2%的丙酮酸鹽的膜濾器上。 板在3(TC放置24小時。細胞用10mMMgSO4衝洗，轉化結合子在具有萘啶 酸和鏈黴素的ONR7a上選擇。
mini-Tn5的族的插入位點通過以前所述的(Ochman等1988)反向PCR 來確定。簡單說來，分離出突變型的總的DNA，並用不切斷mini-Tn5元素 的ClaI來消化。得到的DNA片段成為圓形，插入的mini-Tn5空白區用兩個 啟動子來放大OTR末端(GGC CGC ACT TGT GTA TAA GAG TCA G)和 1TR末端(GCGGCC AGATCTGATCAAGAG ACAG)。 PCR的條件是 94°C 1， 5分鐘，48°C l分鐘，70。C4分鐘，30次循環。PCR產物用凝膠純 化，並用ABI Prism 377 sequencer (AP Biosystems)上的BigDye terminators來 進行自動的DNA測序。為了確定類Z^B的轉位子突變的精確位點，我們設 計了可以讀中斷基因1086F (TTA CTG GCT TCG CAG GAA TGG)和
實施例2:生物膜形成試驗
為了篩選出生物膜形成中的mini-Tn5突變缺陷，用了 O，Toole和Kolter (1998)所描述的試驗方法。這個試驗對細菌細胞粘附在聚氯乙烯(PVC)塑料的 96孔板上的粘附能力進行評價。ONR7A培養基(100 pl/孔)用複製裝置 (replicator device)進行接種。接種後，板被置於30。C， 48小時，然後每孔 中加入25 pl的1%結晶紫(crystal violet ， CV)(此染料會染細胞，但不會 染PVC)。此板在室溫下靜置15分鐘，用水反覆徹底衝洗，並對生物膜的形成進行評價。
生物膜的形成通過加入2 x 200 ^il的95%乙醇到CV-染色後的微孔板 中來量化。CV-染色後的生物膜用200^1的95%乙醇來溶解，其中的125ml 被轉移到新的聚苯乙烯微孔板中，其吸光度用酶標儀在600nm來確定(700 微孔板酶標儀系列，Cambridge Technology )。
實施例3:位點導向的"假定醯基轉移酶"基因
為了分析，如果觀察到的C9突變族是類的對最小轉位子對下遊基 因的極化效果失活的結果，構建了作為目標的"假定醯基轉移酶"。下遊的"假 定醯基轉移酶"從具有引物1087F: (CAGTGATGGCTATGGTCAAAG)和 1087R: (CTTTGATCAGTCCGGCAAAAC)的食烷菌屬石油去汙菌SK2來放 大，並且克隆到包含抗氨苄青黴素(ampicillin)基因的pCR2.1 TOPO克隆 載體(Invitrogen)來反選擇。抗鏈黴素盒從Tn5 Str/Sp質粒得到(de Lorenzo 等.，1998)並插入到基因的獨特的位點中。非功能的"假定醯基轉移酶"然 後通過同源重組再次引入食垸菌屬石油去汙菌SK2的基因組中。為了確保與 DNAStrR克隆聯繫的載體的丟失，被平行放在含有鏈黴素、萘啶酸的ONT7A 瓊脂和包含氨苄青黴素的ONT7A瓊脂中來識別出分離出的丟失了與 TopoCloning載體一起的AmpR標記。測量敲除突變型的生長特性及PHA積 累，並與mini-Tn5的突變型和野生型相比較。
實施例4: PHA的化學分析
為了分析野生型食烷菌屬石油去汙菌SK2和突變族釋放到培養基中的 PHA，細菌培養在含2%的丙酮酸鹽或1.5%的十八垸來作為碳源(存儲條件) 的ONR7a培養基中。細菌被培養在旋轉混合器中(100rpm)在3(TC直到處 於生長期的靜態末期。細胞通過離心的方法來收集(60' 12000)上清液和細 胞團分別收集，凍幹後接著用來進行PHA的化學分析。
實施例5: PHA量化細胞和上清液的等份試樣用冰水衝洗，並在8(TC的真空乾燥過夜。PHA 用次氯酸鈉消化細胞，並且用丙酮/二乙醚來提取(SolamainWa/.,1999)。
實施例6:氣相色譜法/質譜法
為了確定PHA的組分，將大約2mg的PHA放入盛有氯仿、甲醇、硫 酸(比例為l: 0.85: 0.15)的小燒瓶中，在100'C的恆溫控制曹中反應2小 時。此方法通過將其(3-羥基甲酯(FAME)的甲醇分解作用而將PHA降解。 反應之後，加入0.5ml的蒸餾水，搖晃試管l分鐘。相分離之後，有機相被 去除，轉移到小燒瓶中用於分析。FAME用具有30mx0.25mmHP-5(5y。 二 苯亞碸和95%聚二甲基矽氧烷)融合的矽毛細管柱；流動率為lml/分鐘；樣 品輸入溫度是，以8。C/分鐘的速率至23(TC，界面溫度是25(TC;離子源溫 度是175°C;電子衝擊模式70 eV，以0.5s/掃描從45到450 amu的氣相色譜 -質譜儀來分析(GC/MS， model Varian 3400CX, Varian Chromatography Systems, Sugar Land, TX,和VGAutospec spectrometer)。本發明的用來試驗的PHA的 樣品的純度為高達99.5%。在其中沒有檢測到微量的蛋白質、碳水化合物和 酯類。見表l中的數據。
實施例7:凝膠滲透色譜法
實施例6中的樣品在HPLC系統中用光譜物理泵(Spectra-Physics pump) 和HPX-87H交換樹脂柱(Aminex HPX-87H column)來在下列的條件下分析 (Bio-Rad, Hercules, Calif.):柱溫5(TC、梯度、等強度、移動相，5 mM的硫 酸，流率0.5ml/分鐘，光散射。見表2中的數據。
實施例8:電子顯微鏡
細胞在含有1.5% (w/v)的十八垸和NH4C1 (存儲條件)ONR7a中培養， 並在生長靜止期收集。用來進行掃描電子顯微鏡的細胞也在同樣的條件下生 長，唯一不同的是，十八垸是嵌入在屍emm"ox細胞培養片上的(NalgeNunc)。 按照Golyshina (2000)的方法對細胞進行投影，細胞嵌入並根據Yakimov(1998)的方法製作超薄切片，並用Liinsdorf等(2001)所述的方法掃描電子 顯微鏡進行觀察。
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權利要求
1、一種基因工程微生物，其特徵在於，其在至少一個基因中具有至少一個修飾因子，所述至少一個基因對多羥基鏈烷酸酯(PHA)的代謝相關蛋白質進行編碼，或者對在PHA的產生過程中幹預微生物代謝的蛋白質進行編碼，所述至少一個修飾因子導致中鏈和/或長鏈的PHA的細胞外沉積和/或過量生成。
2、 根據權利要求1所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述至少一 個基因對在PHA的產生過程中幹預微生物代謝的蛋白質進行編碼，所述蛋白 質是一種酶，其為中間物而與PHA的合成路徑酶競爭。
3、 根據權利要求1所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述酶是硫 酯酶。
4、 根據權利要求2或3所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述硫 酯酶作為底物對3-羥醯基-輔酶A起作用。
5、 根據權利要求2或3所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述硫 酯酶是類^^醯基輔酶A硫酯酶。
6、 根據權利要求2至5中任一權利要求所述的基因工程微生物，其特 徵在於，所述酶由一段核苷酸序列進行編碼，所述核苷酸序列包括圖11和圖 12所示的修飾後的核苷酸序列或其同源物。
7、 根據權利要求2所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述酶由一 段核苷酸序列進行編碼，所述核苷酸序列包括圖14、 16和圖18到圖25所示 的自身的核苷酸序列或其同源物，所述自身的核苷酸序列通過所述至少一個 修飾因子進行修飾。
8、 根據權利要求1至7中任一權利要求所述的基因工程微生物，其特 徵在於，所述至少一個修飾因子導致修飾後的基因完全或部分失活。
9、 根據權利要求1至8中任一權利要求所述的基因工程微生物，其特 徵在於，所述至少一個修飾因子是從包括Tn5和TnlO轉位子在內的轉位子 插入而產生的，包括Tn5轉位子的插入，進一步包括在所述基因的下遊至修飾後的基因之間插入。
10、 根據權利要求1至9中任一權利要求所述的基因工程微生物，其特 徵在於，所述至少一個修飾因子通過轉位子突變而產生，包括基於miniTn5 Km元素的突變，進一步包括基於miniTn5 Str/Sp元素的突變。
11、 根據權利要求1至10中任一權利要求所述的基因工程微生物，其 特徵在於，所述基因被結合到所述微生物的染色體中。
12、 根據權利要求1所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述至少一 個基因編碼PHA合酶、PHB合酶、醯基輔酶A轉移酶、enyol-輔酶A水合 酶或還原酶。
13、 根據權利要求1所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述的至少 一個修飾因子引起PHA在細胞外沉積或過量生成。
14、 根據權利要求13所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述細胞 外沉積或過量生成PHA，是相應的野生型的微生物的PHA生產的至少5倍、 10倍、15倍、25倍、40倍、60倍、80倍或100倍。
15、 根據權利要求13所述的基因工程微生物，其特徵在於，所述微生 物包括以下細菌食垸菌屬石油去汙菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、丁 香假單胞菌、螢光假單胞菌、變形菌、不動桿菌、新月柄桿菌、產鹼桿菌屬 細菌、產鹼桿菌、固氮菌、紅球菌屬真養菌、紫色色桿菌、光合細菌。
16、 根據權利要求1至15中任一權利要求所述的基因工程微生物，其 特徵在於，所述的微生物是食烷菌屬，包括食烷菌屬石油去汙菌，進一步包 括食烷菌屬石油去汙菌SK2。
17、 一種組成至少一個基因的核苷酸序列，其特徵在於，所述至少一個 基因中具有至少一個修飾因子，所述至少一個基因對多羥基鏈烷酸酯(PHA)的代謝相關蛋白質進行編碼，或者對在PHA的產生過程中幹預微生物代謝的 蛋白質進行編碼，所述至少一個修飾因子導致中鏈或長鏈的PHA的細胞外沉 積和/或過量生成。
18、 根據權利要求17所述的基因工程化的核苷酸序列，其特徵在於， 所述基因包括PHA合酶、PHB合酶、醯基輔酶A轉移酶、enyol-輔酶A。
19、 根據權利要求17所述的基因工程化的核苷酸序列，其特徵在於， 所述基因是類te^g的醯基輔酶A硫酯酶，包括是食垸菌屬石油去汙菌、惡臭 假單胞菌、銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、螢光假單胞菌、變形菌、不動杆 菌、新月柄桿菌、產鹼桿菌屬細菌、產鹼桿菌、固氮菌、紅球菌屬真養菌、 紫色色桿菌、光合細菌的類f^B的醯基輔酶A硫酯酶。
20、 根據權利要求17所述的基因工程化的核苷酸序列，其特徵在於， 所述基因是類tes5的醯基輔酶A硫酯酶，包括食垸菌屬石油去汙菌的類 的醯基輔酶A硫酯酶，進一步包括是食垸菌屬石油去汙菌SK2的類tes5的 醯基輔酶A硫酯酶。
21、 根據權利要求17至20所述的基因工程化的核苷酸序列，其特徵在 於，所述至少一個修飾因子通過轉位子插入而產生，包括Tn5轉位子在所述 基因的下遊至修飾後的基因之間插入。
22、 根據權利要求17至21所述的基因工程化的核苷酸序列，其特徵在 於，所述至少一個修飾因子是通過轉位子突變而產生，包括基於miniTn5 Km 元素的突變，進一步包括基於miniTn5 Str/Sp元素的突變。
23、 根據權利要求17至22所述的基因工程化的核苷酸序列，其特徵在 於，所述核苷酸包括如圖11和圖12所示的核苷酸序列或其同源物。
24、 根據權利要求17至22所述的基因工程化的核苷酸序列，其特徵在 於，所述核苷酸包括如圖14、圖16和圖18至圖25所示的自身的核苷酸序 列，所述自身的核苷酸序列通過所述至少一個修飾因子進行修飾。
25、 根據權利要求17至24中任一權利要求所述核苷酸序列編碼的多肽。
26、 根據權利要求25所述的多肽，其特徵在於，所述多肽包括圖ll或 圖12所示的胺基酸序列中的其中一者。
27、 一種包括權利要求17至24中任一權利要求所述的核苷酸序列的載體。
28、 一種包括用於生產PHA的基因簇的載體，其特徵在於，所述基因 簇包括具有至少一個修飾因子的一個基因，所述至少一個基因對多羥基鏈烷 酸酯(PHA)的代謝相關蛋白質進行編碼，或者對在PHA的產生過程中幹預權利要求1至16中任一項所述基因工程微生物的代謝的蛋白質進行編碼，所 述至少一個修飾因子導致中鏈或長鏈的PHA的細胞外沉積和/或過量生成。
29、 一種包括權利要求27或28所述載體和/或權利要求17至24中任一 項所述核苷酸序列的細胞。
30、 一種生產PHA (PHA)的方法，包括下列步驟a. 培養權利要求1至16中任一權利要求所述的微生物或權利要求29所 述的細胞；以及b. 從培養基中回收PHA。
31、 權利要求1至16中任一項所述的微生物，和/或權利要求17至24 中任一項所述的核苷酸序列，和/或權利要求26或27所述的載體，和/或權 利要求29所述的細胞，在中鏈和/或長鏈PHA的生產及沉積中的應用。
32、 權利要求1至16中任一項所述的微生物，和/或權利要求17至24 中任一項所述的核苷酸序列，和/或權利要求26或27所述的載體，和/或權 利要求29所述的細胞，在中鏈和/或長鏈PHA的過量生成中的應用。
全文摘要
本發明涉及多羥基鏈烷酸酯(PHA)的生物合成領域。本發明涉及一種基因工程微生物，其具有與PHA的代謝特別是與其生成有關的至少一個基因。該微生物適用於PHA的工業生產。本發明還涉及一種生產PHA的方法。
文檔編號C12N9/16GK101297030SQ200680029128
公開日2008年10月29日 申請日期2006年8月9日 優先權日2005年8月9日
發明者彼得·戈利夏因, 曼紐爾·費勒, 朱利亞·薩比羅瓦, 沃爾夫-雷納·亞伯拉罕, 海因裡希·倫斯多爾夫, 肯尼恩·蒂米斯 申請人:亥姆霍茨感染研究中心