炎症的藥物控制的製作方法

2023-07-23 22:29:56

專利名稱：：炎症的藥物控制的製作方法
技術領域：
：本發明涉及對炎性反應的控制，抑制或減輕炎症的藥物，促進、誘導或加重炎症的藥物和通過抑制或促進炎症治療疾病的方法。具體地說，本發明涉及對體內血紅素加氧酶(heme-oxygenase)的活性或數量進行控制，或對活性或數量同時進行控制。除其它應用之外，本發明可以具體應用於下述情況在表現為炎性反應或被炎性反應惡化的疾病(例如在如風溼性關節炎的慢性炎症的治療中)的治療中，在患有例如哮喘的過敏反應的患者中，在患有ROS(反應性氧族)具有致病作用的疾病患者中，例如重灌注損傷和動脈硬化、以及在患有由藥物治療或病理導致的免疫抑制狀態的患者中，例如愛滋病。慢性炎症給許多國家的資源加上了沉重的社會和經濟負擔，但是安全和有效的療法的數目卻是有限的。目前，主要的研究力量集中於那些負責啟始和保持病理過程的介質上。相反，幾乎沒有注意力集中在負責消除炎性反應的內源因子上。主要的抗炎藥劑是糖皮質激素和非甾類抗炎藥(NSAID)。它們都受到充分編目的缺點的影響，實際上，在英國報導的藥物不良反應中的近四分之一是由NSAID造成的。NSAID的副作用通常是影響胃腸道，並且也影響肝臟、腎臟、脾臟、血液和骨髓。NSAID在一些慢性炎症的治療中並非有效。糖皮質激素是有力的抗炎劑，它既抑制炎症的急性期，也抑制炎症的慢性期。但是，它們也帶來了危險，即它們也抑制了免疫應答，並且能在許多方面降低基本細胞修復過程。一般地，它們必須通過注射給藥，而口服施用無效。因此存在對其它抗炎藥物的持續需要，它們可以口服給藥，並且它們對慢性炎症有效。相反地，已知存在許多的疾病，它們對炎性反應有顯著的抑制作用。一個例子是獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)，被HIV感染會典型地導致這樣的免疫抑制，以至患者死於單獨的、偶發的感染，通常是對健康人很少致命的細菌或病毒感染。在這種病例中，炎症的刺激或誘導可能有助於防止非HIV感染死亡。但是，沒有為這種前炎症(pro-inflammatory)目的的適宜的已知藥物。血紅素(鐵-原卟啉-IX)作為血紅素蛋白(例如血紅蛋白和細胞色素)的輔基，在細胞代謝中起著重要的作用。它的分解代謝是一個兩步的過程。第一步是限速反應，是由微粒體酶——血紅素加氧酶催化的膽綠素和一氧化碳的生成。第二步是由胞質酶——膽綠素還原酶催化的從膽綠素生成膽紅素的反應。血紅素加氧酶發現於肝臟、腎臟、脾臟和皮膚，並且也被限制在特定的細胞類型中，值得注意的是成纖維細胞和巨噬細胞。該酶至少以兩種異構形式(isoform)存在，一個是組成酶，另一個是誘導酶。血紅素、重金屬離子(例如錫、金、鉑和汞)和過渡金屬離子(例如鐵、鈷、鉻和鎳)都可以誘導血紅素加氧酶。而且，血紅素加氧酶是以廣義的針對刺激，如熱激(heatshock，由此得到另一個名稱熱激蛋白32；hsp32)和氧化應激，以及細胞因子，如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子和IL-6的應激反應的一部分被誘導的。由於能保護易受傷害的細胞酶免於失活，應激反應看來是有益的。在傳統中藥中，動物膽汁被用於治療支氣管炎、哮喘和其它過敏反應已有幾世紀之久了。最近人們發現膽綠素和膽紅素能夠清除反應性氧族(ROS)，它可能具有一些前炎性反應的作用，包括蛋白酶抑制劑的失活、透明質酸解聚成血管原性片段，以及改變蛋白以引發內源性抗原。Abraham等，《國際生物化學雜誌》，20(6)；543-558頁(1988)提供了血紅素加氧酶及其在哺乳動物生理活動中的作用的綜述，包括其由內源的和外源的因子引起的活性。討論了該酶與NADPH-細胞色素P-450還原酶的相互作用，也討論了重金屬離子在誘導血紅素加氧酶活性中起到的作用。金屬卟啉被描述成抑制劑。在參考文獻的第845頁，作者寫道「總的說來，當細胞處於應激或疾病狀態時，血紅素加氧酶的活性增加。實際上，該酶可以看作標示異常情況發生的紅燈。」Sacerdoti等，《科學)》243388-390頁(1-20-89)斷言過敏反應與腎細胞色素P450的水平有關，並且該酶可通過誘導血紅素加氧酶的生成而耗盡。這可以通過用Co2+處理來解決。McCarty(《化學文摘》，1001864024(1984)旨在說明硒在降低白三烯方面的作用，白三烯被認為是過敏和炎症的主要介質。實際上，McCarty描述了口服施用飲食輔藥的方法。美國專利5102670號涉及通過向患者腫脹的眼睛施用血紅素加氧酶誘導物來增加血紅素加氧酶的生成，以減少存在於眼中的12(R)hydroxyeicostetraenoicacid(12(R)-HETE)以及同樣存在於眼中的12(R)Dihydroxyeicosatrienoicacid(12(R)-DIHETE)，從而緩解眼球腫脹。該專利提供的緩解角膜結膜的腫脹的方案依賴於減少主要發現於眼中的花生四烯酸的代謝產物12(R)HETE和12(R)DIHETE。具體地說，它解釋了治療效果主要在於保持血-眼房水屏障，一種只在眼中存在的屏障。因此，該專利所述只涉及眼，其它方面的應用很少。在幾乎相同的時期，紐約Drummond的Rockefeller大學的Messrs.GeorgeS.Drummond和HallahKappas與其他人員一起參與了涉及血紅素加氧酶的研究。研究的結果至少部分地收錄於美國專利4657902、4699903、4684637、5010073和5223494號。美國專利4657902號旨在說明新的化合物—錫中卟啉(tinmesoporphyrin)—和包含它的組合物的應用，該應用是抑制血紅素在哺乳動物中的代謝，從而控制哺乳動物的色氨酸的代謝率，並將該代謝率提高到使哺乳動物排出血紅素的水平。該專利在其公開內容第1欄第22-36行指出「在哺乳動物和其它脊椎動物中，血紅素被血紅素加氧酶氧化降解，形成開鏈四吡咯膽綠素。在哺乳動物中，膽綠素被膽綠素還原酶還原成膽紅素。在肝臟中，膽紅素在被排出前被肝葡糖苷醯轉移酶系統轉化成單和雙葡糖苷醯結合體。膽紅素是有毒化合物，但通常其毒性不會表現出來，因為膽紅素迅速結合到血漿蛋白上，運送到肝臟，結合併被排出。但是在幼體內，血清中存在有害健康的高濃度膽紅素，它可能產生神經毒性。棘手的神經綜合症例如「核黃疸症」是最嚴重的膽紅素毒性的表現。」因此，發明人在第3欄第43-48行指出「現在已經發現化合物錫中卟啉(SnMP)可以被用於治療需要這種治療的哺乳動物，包括人，以降低血紅素代謝率，從而提高血紅素的分泌率並控制色氨酸在肝臟中的代謝率。」美國專利4699903號旨在說明一種通過施用錫二碘次卟啉來提高需要提高血紅素的處理水平的哺乳動物的血紅素分泌率的方法。美國專利4684637號公開了通過施用錫或鉻原卟啉IX以在哺乳動物體內降低代謝率從而降低血紅素代謝率的方法。美國專利5010073號涉及以脾臟為靶的脂質體金屬卟啉製劑，它抑制脾臟中血紅素加氧酶的活性。美國專利5223494旨在描述一種通過施用中卟啉來抑制血紅素加氧酶在腸道中的活性的方法，用於降低需要該預防措施的哺乳動物對食品中鐵的吸收。後面部分的專利涉及對所選體內組織中的血紅素加氧酶的抑制，它是通過為特定的目的，以那些體內組織(例如，脾臟或腸道)為靶而實現的。熱激蛋白(HSP)或應激蛋白在生物圈中屬於最高度保守和最豐富的一類蛋白。雖然蛋白的許多異構形式是在正常的生理條件下表達的，並且在細胞中起重要作用，但是它們大都被威脅細胞完整性的因素所調節。這些因素包括熱激和冷激、氧基、重金屬、缺氧、感染、酒精、離子載體和硫醇反應性藥劑。這提高了HSP在細胞中的濃度，而導致細胞可以暫時抵抗其他致命損傷，並且對一些生物介質不進行應答。HSP在病理狀況下的作用吸引了許多注意力。由於其廣泛的種間胺基酸同源性，對HSP的免疫應答可能是高度交叉反應性的，甚至是自體反應性的。對HSP的免疫應答已經在大鼠輔助關節炎(adjuvantarthritis)中、在鼠降植烷關節炎中、在非肥胖型糖尿病鼠的糖尿病中、在風溼性關節炎中、在全身性紅斑狼瘡中、在動脈硬化症中和在腫瘤監視(tumoursurveillance)中被發現。因此，HSP可能在病理狀況下具有自相矛盾的作用，在細胞和組織處於應激環境時具有細胞保護作用，但是在一些自身免疫疾病中引起有害的免疫應答。由L-精氨酸和分子氧在一氧化氮合成酶(NOSEC1.14.13.39)的同功酶的催化下生成的一氧化氮(NO)，參與了許多生理和病理過程。這種分子的反應性和其與金屬蛋白絡合的能力是其許多生物反應的基礎。例如，包含血紅素的可溶性鳥苷酸環化酶(EC4.6.1.2.)在血管平滑肌中被NO激活，導致血管調節(Vasoregulation)，然而在宿主防禦中，鐵硫酶的抑制造成病原入侵中的代謝紊亂。炎症涉及不同介質的順序釋放，這些介質包括作用於血管的介質、化學誘引劑、細胞因子、前列腺素、自由基和蛋白水解酶。在風溼性關節炎，一種慢性炎症中，HSP在患者的滑液襯中被調節。但是，它們在炎症中的作用有待徹底闡明。本發明的目的是提供改進的(或至少可選的)用來控制炎症的方法，具體地說，是提供治療慢性炎症或炎性反應的刺激的方法，例如治療免疫抑制病症。我們現在已經發現，通過控制體內血紅素加氧酶的劑量或活性，或其劑量和活性，(1)獲得了一般化的抗炎效果或反應，其中血紅素加氧酶被誘導，或者(2)獲得了一般性的炎性反應，其中血紅素加氧酶被阻遏(或抑制)。根據本發明的一個方面，通過施用一種化合物來治療炎性反應，該物質誘導血紅素加氧酶，或刺激或提高血紅素加氧酶的活性。該治療可以是全身的或定向的，例如定向到發現於人體單核細胞和巨噬細胞中的可誘導的血紅素加氧酶。該治療誘導血紅素加氧酶的生成和/或刺激其活性；特殊的醫療應用包括慢性炎症的治療，例如風溼性關節炎，過敏反應的治療，例如哮喘，以及損傷、動脈硬化症和栓塞的治療。在本發明的一個實施方案中，一種藥物組合物包含與藥用載體結合的，可誘導、刺激或提高血紅素加氧酶的活性的化合物。該組合物以注射用溶液、口服可接受組合物或局部用組合物的形式存在。一種適宜的注射用溶液包括滅菌的含鹽溶液，優選地包含接近生理濃度的鹽。對於口服施用，該組合物可以是固體形式，例如藥片、藥丸或可懸於水中或溶於水中的粉末。這樣的固體組合物的製備對於本領域的技術人員是已知的。在口服組合物中補充增味劑是一種選擇，以使該組合物更加可口，或至少使口腔減少一點難受。適宜的增味劑包括甜味劑、香味劑和可以掩蓋或減少藥物活性組分中任何不愉快或不希望的味道的藥劑。對於局部用組合物，優選的載體是非水載體，它適於將該組合物在使用後保持在一定位置。適宜的載體包括乳膏、凝膠、蠟、油或乳液。本發明由此提供了另一種抗炎藥物。它可以根據所選的具體化合物口服給藥，並且最初的試驗顯示了有用的抗炎活性。據信，血紅素加氧酶的產物在炎症的發展過程中具有多種作用，而被大多數NSAID、環氧酶靶向的該酶的產物具有較少的作用，所以本發明的組合物顯示了比NSAID可能更強的藥物活性。本發明的另一個實施方案是一種抗炎組合物，它包含血紅素加氧酶誘導劑或刺激劑和藥用載體。本發明的另一個實施方案是一種化合物在生產治療炎症的藥劑方面的應用，該化合物誘導、刺激或提高血紅素加氧酶的活性。適合於誘導血紅素加氧酶的藥劑包括的A型前列腺素；A型前列腺素的類似物、衍生物、複合物和結合物，它們是前列腺素A受體的激動劑；前列腺素A受體的激動劑；維生素B12；氯高鐵血紅素；保留了血紅素加氧酶抑制活性的上述物質的片段、亞單位、結合物、類似物、衍生物和複合物。適宜的劑量是每公斤例如人的體重從0.1至30μmol。舉例來說，在使用氯高鐵血紅素(FePP)時，適宜的劑量是從約0.06mg氯高鐵血紅素至約24mg氯高鐵血紅素每公斤體重。用於誘導或激活血紅素加氧酶的可選的藥劑是抑制或降低一氧化氮合成的藥劑。我們已經發現了一氧化氮(NO)的水平和血紅素加氧酶的活性之間基本上是反比關係，降低NO水平導致HO活性的提高，並且是抗炎性的。因此，本發明第一方面的另一個實施方案是一種藥物組合物，它包含作為活性組分的降低NO水平的物質，例如一氧化氮合成酶抑制劑(NOS)。根據本發明的另一實施方案，提供了一種在患者體內誘導(提高)血紅素加氧酶水平的方法，該方法包括施用有效劑量的血紅素加氧酶誘導劑以降低患者的炎性反應。在本發明的具體實施方案中，炎症是通過誘導或刺激單核細胞中的血紅素加氧酶(例如在單核細胞和巨噬細胞中發現的可誘導的血紅素加氧酶)來治療的。這在治療慢性炎症時是有好處的，這些炎症是由在炎症部位的大量的上述細胞治療和表徵的。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在人體內控制炎性反應的方法，該方法包括通過施用有效劑量的血紅素加氧酶誘導劑降低炎性反應。優選地，誘導劑在任何適當方式的適當的藥用載體(例如，無菌水、鹽水(無菌))中施用。一種pH值介於pH7和pH8之間的具有緩衝能力的、等滲的水溶液是適宜的。冰凍乾燥製劑也是適宜的。冰凍乾燥製劑可以用無菌水恢復。在本發明優選的實施方案中，治療了特殊的慢性炎症。可以根據本發明的第一方面進行治療的包含慢性炎症在內的疾病包括慢性炎性關節疾病—例如風溼性關節炎，慢性炎性腸道疾病—例如節段性迴腸炎，呼吸系統炎性疾病—例如哮喘，腦的慢性炎症—例如多發性硬化，以及軟組織炎症—例如腱鞘炎。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在人體內一般性地降低炎性反應(治療炎症)的方法，該方法包括監測HSP32異構形式的血紅素加氧酶的出現(表達)，如果低於正常水平，施用有效劑量的血紅素加氧酶誘導劑以提高血紅素加氧酶的表達，從而緩解炎性反應(炎症)。該誘導劑優選地以單核細胞和巨噬細胞為靶。藥劑的量可以在一段時間內施用。但是，迄今為止所使用的化合物的作用在每次單劑量給藥後24小時出現峰值，在給藥48小時後消失。製劑可以是單位劑型(對單一劑量)，或者可以包裝成多劑型組合物，可以從中取出並使用適宜的劑量。例如，小瓶中的溶液可以提供多劑型組合物，從中可以取出並施用一定量的藥劑。本發明第一方面的組合物和應用可選地可以用(1)NSAID和(2)NOS(一氧化氮合成酶)抑制劑中的一個或兩個來補充。根據本發明的第二方面，提供了一種通過抑制或阻遏血紅素加氧酶來刺激炎性反應的方法。在第二方面的實施方案中，用於刺激或加強炎症的藥物組合物包含血紅素加氧酶抑制劑和藥用載體。術語「刺激炎症」和「加強炎症」是指炎症的至少一種特有特徵被刺激或加強；術語「抑制炎症」、「緩解炎症」和所有這些術語的變體也是這樣。在使用本發明第二方面的組合物進行免疫抑制治療(例如治療愛滋病)時，施用血紅素加氧酶抑制劑以刺激單核細胞和/或巨噬細胞的活性。這兩類細胞對於抵抗細菌和病毒感染是很重要的，所以提高它們的活性提供了新的例如對愛滋病的治療方法。適合於抑制血紅素加氧酶(例如，單核細胞和巨噬細胞中的可誘導的血紅素加氧酶)的藥劑典型地為FePP的類似物(注意，它誘導血紅素加氧酶)，其中鐵離子被其它的金屬離子所置換，或PP被置換。舉例如下SnPPSnMPSnDPPCrPPCrMPCrDPPZnPPZnMPZnDPPMnPPMnMPMnDPP其中Sn＝錫，Cr＝鉻，Zn＝鋅，Mn＝錳，PP＝原卟啉，MP＝中卟啉，DPP＝二碘次卟啉這些藥劑的適當劑量範圍是從每公斤如人的體重0.1至50μmole。舉例來說，當使用錫原卟啉(SnPP)時，SnPP的適當劑量範圍是從0.07mg/kg至46mg/kg人體重。前列腺素A受體的拮抗劑是另一種適合於降低血紅素加氧酶活性的藥劑。用於降低HO活性的可選的藥劑是提高NO水平的藥劑。因此，本發明第二方面的另一個實施方案是一種藥物組合物，其包含作為活性成分的可以提高患者NO水平的物質。可選地，該物質是一氧化氮合成酶(NOS)的底物或該酶的激活劑。一種已知的NOS的底物是L-精氨酸，並且一種已知的NO受體是硝基氫氰酸鈉。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種降低體內血紅素加氧酶水平的方法，該方法包括施用有效劑量的血紅素加氧酶抑制劑以降低炎性反應，該抑制劑以例如單核細胞和巨噬細胞中的可誘導的血紅素加氧酶為靶。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種在人體內控制炎性反應的方法，該方法包括通過施用有效劑量的血紅素加氧酶抑制劑來激活炎性反應，該抑制劑以例如單核細胞和巨噬細胞中的可誘導的血紅素加氧酶為靶。該抑制劑可以以任何適當的方式在適當的藥用載體(例如，無菌水、鹽水(無菌))中施用。一種pH值介於pH7和pH8之間的具有緩衝能力的、等滲的水溶液是適宜的。冰凍乾燥製劑也是適宜的。冰凍乾燥製劑可以用無菌水恢復並施用。根據本發明的另一個實施方案，提供了一種提高炎性反應的方法(例如用於治療患有愛滋病的患者)，該方法包括監測血紅素加氧酶的HSP32異構形式的存在(表達)，如果高於正常水平，則施用有效劑量的血紅素加氧酶抑制劑，從而提高炎性反應。藥劑的量可以在一段時間內施用。但是，迄今為止所使用的化合物的作用在每次單劑量給藥後24小時出現峰值，在給藥48小時後消失。本發明進一步的實施方案是血紅素加氧酶抑制劑在製造一種藥物時的應用，該藥物用於治療免疫抑制疾病。另一個是血紅素加氧酶抑制劑在製造一種藥物時的應用，該藥物用於提高單核細胞和巨噬細胞的活性。免疫抑制還可能由其它療法的副作用造成，例如由於為抑制移植器官排斥而設計的藥物的使用造成的移植後免疫抑制。在這些情況下，排斥大部分是由T細胞應答介導的，所以免疫抑制是為了除去有害的T細胞活性。但是，也會見到同時失去單核細胞和巨噬細胞的活性(通常是由於數量減少)。於是，本發明第二方面的另一種應用是選擇性地刺激單核細胞和巨噬細胞。「選擇性」是指這些細胞的活性和/或數量的增加在很大比例上比T細胞的活性和/或數量的任何增加要高。下面參考附圖，用一些具體的實施方案來說明本發明圖1表明在將角叉菜膠注射到鼠胸膜腔後，急性炎症第2、6和24小時的發展情況(空方塊——細胞滲出物，實心方塊——總細胞，每個時間點n＝6)；圖2表明在急性炎症過程中，以nmol膽紅素/60』/mg蛋白對時間(小時)測量的HO活性(每個時間點n＝6)；圖3是用Western雜交分析顯示的HSP缺失的照片，峰值出現在第24小時；圖4顯示在將角叉菜膠注射到鼠胸膜腔後，急性炎症以小時計的發展情況(□分泌體積，■總炎症細胞，n＝10)；圖5表明炎症細胞血紅素加氧酶(HO)活性在角叉菜膠胸膜炎期間對時間(小時)的變化，活性以pmole膽紅素/mg蛋白/小時表示，n＝9(結果表達為均值±s.e.均值，■外周血液單核細胞(PBMNs)，□炎症細胞時間過程)；圖6和7顯示了血紅素加氧酶異構體的Western雜交分析圖6)炎症細胞團HO-1泳道的分析，炎症細胞於第2、6、12、24和48小時採集，脾臟勻漿(SP)、PBL(BL)，圖7)炎症細胞團HO-2道的分析，炎症細胞於第2、6、12、24和48小時採集，脾臟勻漿(SP)、PBL(BL)；圖8-10顯示炎症細胞血紅素加氧酶1塗片的免疫定位，它證實了單核細胞中血紅素加氧酶-1蛋白的提高了的陽性染色；圖8)正常兔血清(對照)，圖9)6小時炎症細胞塗片，圖10)48小時炎症細胞塗片；圖11-16顯示了血紅素加氧酶(HO)調節劑對炎症的效果和HO的活性錫原卟啉二氯化物(SnPP)對急性炎症在第24小時的效果(圖11-滲出物體積，圖12-細胞數)、鐵原卟啉IX二氯化物(FePP)對急性炎症在第24小時的效果(圖13-滲出物體積，圖14-細胞數)、在24小時的炎症細胞中施用SnPP(圖15)和FePP(圖16)對HO活性的效果，治療後炎症細胞與上述原卟啉一起收集並用圖5的方法測定HO的活性，n＝6。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；圖17和18顯示了NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對鼠腦和脾血紅素加氧酶活性的效果，圖17-腦勻漿，圖18-脾勻漿(0.1、0.5、1、5或10mM的L-NAME與反應混合物一起溫育。結果表示為沒有接受化合物的對照(con)組的活性的百分比，n＝8，***P＜0.001)；圖19和20顯示了L-精氨酸對鼠腦和脾血紅素加氧酶活性的效果，圖19-腦勻漿，圖20-脾勻漿。0.1、0.5、1、5或10mM的L-精氨酸與反應混合物一起溫育。結果表達為沒有接受化合物的對照(con)組的活性的百分比，n＝8，*P＜0.05，***P＜0.001)；圖21和22顯示了D-精氨酸對鼠腦和脾血紅素加氧酶活性的效果，圖21-腦勻漿，圖22-脾勻漿。0.1、0.5、1、5或10mM的D-精氨酸與反應混合物一起溫育，結果表達為沒有接受化合物的對照(con)組的活性的百分比，n＝8)；並且圖23和24顯示了硝基氫氰酸鈉對鼠腦和脾血紅素加氧酶活性的效果，圖23-腦勻漿，圖24-脾勻漿。0.001、0.01、0.1、1或10mM的硝基氫氰酸鈉與反應混合物一起溫育。結果表達為沒有接受化合物的對照(con)組的活性的百分比，n＝8，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。實施例1在以下的實施例中，我們檢測了血紅素加氧酶在急性和慢性炎症中的表達和可能的參與。血紅素加氧酶-1的高度可誘導的異構體最近被分類為HSP(HSP32)。這是血紅蛋白的輔基的分解代謝中的限速酶。該反應的主要產物，膽紅素，是有力的自由基清除者，並可能代表一種內源機制，該機制可以使細胞保護自己免受自由基的損害。一氧化碳(CO)也是由該反應產生的。由於與一氧化氮——炎症的主要介質的結構相似性，以及兩種分子都有結合血紅蛋白的能力，CO在炎症中的作用是一個複雜的問題，我們找到了一個答案。在本實施方案中，使用了急性炎症的鼠角叉菜膠胸膜炎模型以決定HSP32在炎症細胞中的表達和活性。炎症的標記、細胞滲出物和細胞個數在2、6和12小時持續增長，峰值在24小時，消失於48小時。炎症在早期的時間點由多形核白細胞(PMN)支配，隨著炎性反應的發展，單核細胞的數量增加。單核細胞的增加與Western雜交分析確定的HSP32蛋白水平的提高有關，強標記帶出現在24和48小時。免疫組織化學法確定HSP32蛋白出現於單核細胞中。血紅素加氧酶(HO)活性也在第2、6和24小時檢測，只有後邊的時間點顯示了活性。然後檢測用氯高鐵血紅素(一種HSP32表達的誘導劑)調節HO活性的效果和錫原卟啉-IX(血紅素的合成類似物，它抑制HO的活性)。6小時時與對照相比，誘導劑或抑制劑對炎症沒有明顯的效果。但是，在24小時時，抑制劑使細胞的滲出物明顯地提高了135％(p＜.001Mann-Whitney)，而誘導劑分別使細胞滲出物和細胞個數降低了83％(p＜.001)和50％(p＜.001)。因此這些化合物的效果相當於HSP32在這個急性炎症的模型中的暫時表達。材料和方法動物和藥品200±20克的雄性的Wistar鼠(Tuck＆SonsLtd.，Essex，英國)被用於炎症。動物或者通過靜脈注射施用15mg/kg的鐵原卟啉IX氯化物(FePP)—炎症前18小時，或者通過皮下注射施用兩倍劑量的40μ摩爾/kg的錫原卟啉二氯化物(SnPP)—炎症前18小時和炎症誘導時(卟啉獲自卟啉產品公司，Logan，猶他州)。藥物在0.1N的NaOH中製備，並與鹽水1∶1混合，然後將它們調節到pH7.4，藥物載體。總注射體積為0.2毫升。對照組動物只接受載體。胸膜炎的誘導在鼠體內誘導角叉菜膠胸膜炎，並按照上述Tomlinson等的方法製備細胞團。HO活性細胞團中的HO活性在後線粒體上清液中用定量膽紅素的生成來測量(JollieDR等，生物化學和生物物理進展，1985年，第240卷，51-59頁)，膽綠素還原酶用鼠肝細胞液取代(3mg/ml)。蛋白以BSA為標準，用Bradford法估測。Western雜交分析向細胞團中加入含有1％TritonX100的蛋白酶抑制劑緩衝液並用載膠緩衝液(Tris，50mM，SDS，10％；甘油，10％；2-巰基乙醇，10％溴酚藍，2mg/ml)以1∶1的比例煮沸(10分鐘)並在10，000g離心10分鐘使之裂解。上清液的蛋白濃度用上述方法測定，每個樣品的總蛋白等價物(20μg)用Laemmli緩衝液系統將分配到10％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺微膠(Hoefer；Staffordshire，英國)上，並轉移到聚乙烯吡咯烷酮二氟化物膜(Millipore，Hertfordshire，英國)上。非特異性的IgG用5％的幹乳蛋白阻斷，並與多克隆抗體和HSP321∶1000的稀釋液(Stressgen公司，維多利亞，加拿大)溫育。蛋白帶用擴增的鹼性磷酸酶藥劑盒(Sigma公司，Poole，英國)檢測，並用硝基藍四唑(NBT)-5-溴-4-氯-3-碘磷酸(BCIP)顯影。Rainbow標記和預染色的藍色蛋白標記被用於測定蛋白的分子量。統計結果用均值±s.e.均值表達。統計分析由Mann-WhitneyU-檢測決定，認為＜0.05的P值有顯著性。圖1顯示了在胸膜腔炎症過程中滲出物體積和細胞個數的發展；它們都在注射角叉菜膠後24小時最大。滲出物細胞團中HO活性的顯著提高，圖2，和圖3(照片)，與炎性反應中的峰值相一致。然後研究HO抑制劑SnPP和誘導劑FePP對角叉菜膠炎症的作用(表1)。6小時時的滲出物體積和細胞個數並未被預處理的HO抑制劑或誘導劑所改變。但是，炎症開始後24小時，與載體對照組相比SnPP使滲出物體積增加了128％(P＜0.001)，然而與載體對照組相比，FePP使滲出物體積減小了73％，細胞個數減少了50％(都是P＜0.001)。然後檢測血紅素加氧酶抑制劑錫原卟啉二氯化物(SnPP)和誘導劑鐵原卟啉IX氯化物(FePP)對急性炎症的作用。實驗動物或者於炎症誘導前18和0小時接受雙劑量的40μmoles/kgSnPP皮下注射，或者於炎症前18小時接受單劑量的15mg/kgFePP靜脈注射。實驗動物與通過適當途徑只接受載體的對照動物比較。***P＜0.001這些結果第一次用一個急性炎症模型證明了在炎症細胞中HSP32表達和HO活性的誘導。上文描述的HO活性的提高與胸膜腔中巨噬細胞的數量的增加有關。在這個模型中，免疫組織化學證明了炎症巨噬細胞對HSP32的強陽性免疫反應性，但不包括周圍單核細胞(未提供數據)。對HO活性的預刺激或抑制的作用分別在24小時顯著緩解或加劇炎症。這說明HO調節劑主要是在第24小時對巨噬細胞起作用，在第6小時炎症部位多形核白細胞佔優勢時沒有明顯作用。通過本發明實現的HO活性的提高代表了一種新型的用於治療慢性炎症疾病的療法，相反，活性的降低對於那些具有有害炎性反應的患者有益。實施例2方法藥物施用動物在-18小時時和炎症誘導時接受雙劑量的3、10或30μmoles/kgSnPP(HO抑制劑)或載體對照。動物在炎症誘導前18小時接受單劑量的3、10或30μmoles/kgFePP(HO誘導劑)或載體對照，n＝9。胸膜炎的誘導200+20克的雄性Wistar鼠用氟烷麻醉，將150μl的溶於0.9％NaCl的1％角叉菜膠溶液注射到胸膜腔。在注射刺激劑後2、6、12、24和48小時通過用1毫升包含3.15％的檸檬酸三鈉、苯甲磺醯氟1mM(Sigma化學公司，Poole，英國)、胃蛋白酶抑制劑A(Sigma)和溶於10mMpH7.3磷酸緩衝液(PBS)中的0.2mMleupeptin的蛋白酶抑制劑緩衝液灌洗胸腔來收集滲出物。棄去任何被血液汙染的滲出物。使用DN型Coulter計數器數細胞(Coulter電子公司，Luton，英國)。每個樣品在800g離心10分鐘，所得細胞團用下述方法製備。免疫組織化學外周血液和滲出物細胞樣品塗覆於聚-L-賴氨酸塗敷的塗片上，風乾。在免疫標記或組織染色前塗片用4％的溶於0.1M磷酸緩衝液的多聚甲醛固定1小時。內源的過氧化物酶用甲醇中0.3％的H2O2耗盡，試樣用PBS中的0.1％TritonX100洗滌。非特異性的IgG用PBS中的0.1％基本無球蛋白的BSA中的1∶50NGS封閉。試樣用多克隆抗-HO-1抗體(1∶200)或多克隆抗-HO-2抗體(1∶1000)在4℃溫育過夜，用生物素標記的山羊抗-兔第二抗體洗滌並再溫育30分鐘。在與VectastainABC山葵-過氧化物酶(Vector實驗室，Peterborough，英國)溫育30分鐘後，在適當的時間(5-10分鐘)加入溶於0.05M的pH7.6的Tris緩衝液的底物0.05％二氨基聯苯胺四氯化物(Sigma)。得到陽性免疫反應性標記棕色物。初級抗血清用NGS替代作為陰性對照。用常規的組織染色、蘇木精和紅色染料確認形態觀察結果。統計將(n個)實驗結果用均值±s.e.均值表示。統計分析由Student氏非對稱t檢測決定，認為＜0.05的P值有顯著性。血紅素加氧酶檢測用上述SierraES等，《分析生物化學)》1992年第200卷27-30頁的方法測定HO活性。細胞在蛋白酶抑制劑緩衝液中超聲破碎10秒鐘。用上述方法檢測血紅素加氧酶。反應混合物(15μl)包括11.2μM[14C]血紅素比活(54Ci/mol)，1mMNADPH，2mM葡萄糖-6-磷酸，0.1單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，3mg/ml肝細胞漿蛋白和50-100μg樣本蛋白。反應用加入血紅素啟動，在37℃溫育30分鐘，通過加入過量的冷血紅素和膽紅素並加冰停止反應。將2μl反應混合物兩次點到矽膠薄層色譜板上。色譜用氯仿∶醋酸的20∶1的稀釋液顯影。切下相當於血紅素和膽紅素的斑點並置於10ml的閃爍液中以備計數。用Bradford法測定蛋白(BradfordMM等，《分析生物化學》1976年第72卷248-254頁)，使用BSA作為標準蛋白。活性表示為pmole膽紅素/mg蛋白/小時，n＝9。結果表示為均值±s.e.均值。結果將角叉菜膠注射到鼠胸膜腔內導致急性胸膜炎的產生，以炎症細胞數和滲出物體積測定，炎症在24小時達到最高峰(圖4)。在第48小時，炎症損害事實上已被消除，細胞數和滲出物體積分別降低到炎症高峰時的25％和11％。早期炎症的特徵在於多形核細胞(PMN)匯集到胸膜腔，並且在第24和48小時單核細胞(MN)的比例增加[表2]。隨著炎症的發展，HO活性顯著增加，記錄到的最高活性是在炎症消除中(圖4)，當MN主導炎症損害時。Western雜交分析證明了HO-l蛋白水平的顯著提高(未提供數據)。在炎症細胞切片中，HO-l免疫反應性特異性地定位在單核細胞上，而PMN幾乎沒有顯示染色。隨著炎症的發展，陽性染色的細胞數增加(圖8-10)。用HO-2的多克隆抗體發現了定位於單核細胞的相似的免疫反應性染色結果。這些結果說明了炎症細胞中HO表達和活性的提高。為了查明提高的HO活性不僅與組織保護有關，而且參與了急性炎症的緩解，我們使用了一種HO抑制劑，錫原卟啉(SnPP)，在角叉菜膠注射前18小時和注射時皮下給藥，以及一種HO誘導劑，鐵原卟啉IX氯化物(FePP)，在炎症誘導前18小時皮下給藥(MainesMD等，FASEBJ.，1988年第2卷2557-2568頁)。注射角叉菜膠6小時後——炎症的PMNs期，與載體控制組對比，SnPP和FePP處理對炎症損害都沒有作用(未提供數據)。但是，注射角叉菜膠24小時後，當MNs佔優勢時，接受SnPP(HO抑制劑)的動物在炎症滲出物上表現出劑量依賴性增加，與對照組相比，施用了3μmoles/kgSnPP的動物滲出物增加了70％(圖11)。我們注意到最高劑量的SnPP(30μmoles/kg)進一步增加了滲出物的體積，但是導致了炎症細胞數的降低(圖12)，可能的解釋是後者是毒性作用。相反，接受FePP——HO誘導劑的動物在炎症細胞數和滲出物體積方面都表現出劑量依賴性抑制(圖13和圖14)，施用的所有劑量都顯著緩解炎症，與載體對照組相比，FePP的最低劑量(3μmoles/kg)使炎症細胞數和滲出物體積分別降低了90％和55％。在這個模型中，所實現的抑制程度優於最適劑量的傳統抗炎藥或類固醇。對炎症細胞團HO活性的分析證明了施用SnPP後HO活性的降低和施用FePP後HO活性的提高(圖15和16)。這些發現支持HO活性對緩解急性炎症致關重要的觀點。這些數據還說明，SnPP和FePP的主要作用方式是通過調節HO的活性，而不是其它的機制，因為實驗現象表現了劑量依賴性，並且卟啉的相反作用只有在HO表達時才被發現。最後，本實施例的發現暗示了急性炎症緩解過程中HO的直接參與。HO在MNs——一種與慢性炎症緊密相關的細胞類型中的存在，支持了這樣一個觀點該酶是作為慢性炎性反應的調節劑，並且因此，它是本發明的不同方面的療法的目標。實施例3方法雄性Wister鼠(160+20g，Tuck公司，英國)的腦和脾在蛋白酶抑制劑緩衝液中用玻璃勻漿器勻漿苯甲磺醯氟1mM、胃蛋白酶抑制劑A1.5mM和leupeptin0.2mM溶於10mMpH7.3磷酸鹽緩衝液。用Bradford法測定蛋白量，牛血清清蛋白用作標準蛋白。一氧化氮合成酶的活性用瓜氨酸法測定，數據用pmol瓜氨酸/mg蛋白/30分鐘計算(VaneJ.R.等，(1993)《美國國家科學院院刊》第91卷2046-2050頁)。血紅素加氧酶的活性用上述方法測定(SierraE.E.等，(1992)《分析生物化學》第200卷27-30頁)。總之，15μl的反應混合物包括11.2μM[14C]血紅素(比活54Ci/mol)、1mMNADPH、2mM葡萄糖-6-磷酸、0.1單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、3mg/ml肝細胞漿蛋白、100-50μg的樣本蛋白和相關濃度的檢測藥物；L-精氨酸、D-精氨酸、NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)或硝基氫氰酸鈉。包含檢測藥物的反應混合物可以在加入血紅素啟動反應前於37℃平衡30分鐘。反應在30分鐘後通過加入過量的冷血紅素和膽紅素並置於冰浴中終止。將2μl反應混合物兩次點到矽膠薄層色譜板上。所有的樣品雙向層析。色譜用氯仿∶醋酸的20∶1的稀釋液顯影。切下相當於血紅素和膽紅素的斑點並置於10ml的閃爍液以備計數。數據以pmole膽紅素/mg蛋白/小時計算。原始數據的統計分析使用Student氏非對稱t檢驗。結果表示為均值±s.e.均值，認為P＜0.05具有顯著性。結果用我們的檢測系統確定鼠腦勻漿含有HO和NOS活性。相反，鼠脾勻漿含有雙倍HO活性，而缺少NOS活性(表3)。NOS抑制劑L-NAME的加入導致腦HO活性的劑量依賴性提高，5mML-NAME顯著提高活性80％(圖17)。相反地，腦勻漿中NOS底物L-精氨酸的加入導致HO活性的劑量依賴性降低(圖19)。使用的最高濃度的L-精氨酸10mM使HO活性降低75％。對映異構體L-精氨酸和D-精氨酸沒有作為底物被NOS使用，因此對腦HO活性沒有顯著作用(圖21)。脾HO活性與腦活性不同，並不被加入L-NAME、L-精氨酸或D-精氨酸所改變(圖18、20和22)。但是，NO供體硝基氫氰酸鈉的加入導致脾和腦勻漿中HO活性的劑量依賴性降低(圖23和24)。加入10mM的硝基氫氰酸鈉使腦和勻漿中HO的活性分別降低75％和80％。這些結果表明由NOS產生的NO抑制HO活性。認識到在正常生理條件下存在於腦中的NOS和HO的異構體是酶的構成形式是非常重要的，這些酶分別是cNOS和HO-2(BredtD.S.等，(1990)《美國國家科學院院刊》第87卷682-685頁，以及VermaA.，等(1993)《科學》第259卷381-384頁)；而在正常生理條件下脾臟只含有HO的可誘導形式(MainesM.D.(1988)《(FASEB雜誌》第2卷2557-2568頁)。NO抑制劑和供體對HO活性的作用已經在鼠腦和鼠脾勻漿中被檢驗，在腦中NOS和HO的內源活性都很高，而在脾中HO活性更高，但NOS的活性比在腦中低。我們發現一氧化氮的底物——L-精氨酸(0.1-10mM)而非D-精氨酸在鼠腦勻漿中降低血紅素加氧酶的活性，並且精氨酸類似物L-NAME(0.1-10mM)在相同組織中提高其活性。在脾勻漿中，一氧化氮的內源活性低於腦中的，這些化合物沒有作用。一氧化氮供體硝基氫氰酸鈉(0.001mM-10mM)在腦和脾中都降低血紅素加氧酶的活性。本發明人相信在NOS被誘導的情況下，NO對HO活性的調節作用將被放大。另外，還說明NO對重要炎症介質——前列腺素的生成的調節是通過它與含有血紅素的酶——環氧化酶的相互作用完成的。我們已經證明了HO在炎症模型中的抗炎作用。我們建議NOS和HO在炎性反應中具有互惠的調節作用，該作用是本發明不同方面的基礎。表1治療組滲出物體積(亳升)細胞總數1066小時皮下注射的載體(n＝27)1.26±0.0172±7皮下注射的SnPP(n＝26)1.59±0.1267±6靜脈注射的載體(n＝23)1.29±0.1569±8iv.v注射的FePP(n＝26)0.99±0.1150±824小時皮下注射的載體(n＝29)0.79±0.1263±6皮下注射的SnPP(n＝24)1.80±0.2158±6靜脈注射的載體(n＝22)1.37±0.1690±6iv.v注射的FePP(n＝25)0.37±0.0745±6表2炎症細胞切片的免疫細胞化學分析*多形核細胞(PMNs)和單核細胞(MNs)在炎症細胞切片中的相對百分比。#存在的PMNs和MNs的百分比，它們是對血紅素加氧酶異構體呈陽性的。N.D.存在的細胞不足於進行分析。表3在鼠腦和脾勻漿中血紅素加氧酶和一氧化氮合成酶的活性。均值±s.e.均值。因此，根據本發明，對炎症的控制在本發明的實施例中是通過(1)控制HO，或(2)控制一氧化氮的水平或與控制HO結合實現的。由於可以對本發明的實施方案進行許多修改而不背離本發明的範圍，因此這意味這裡包含的所有的材料應被理解為對本發明的說明，而不是限制。權利要求1.一種化合物在製造控制炎症的藥物中的應用，該化合物可以在哺乳動物中改變血紅素加氧酶的活性、數量。2.權利要求1的化合物在製造治療炎症的藥物中的應用，該化合物可以提高血紅素加氧酶活性。3.權利要求2的化合物的應用，該化合物可以誘導血紅素加氧酶。4.權利要求2的化合物的應用，該化合物可以降低一氧化氮水平。5.權利要求4的化合物的應用，該化合物是一氧化氮合成酶抑制劑。6.一種治療炎症的藥物組合物，該組合物包含提高血紅素加氧酶活性的化合物，其中該組合物是以片劑、丸劑、可懸於水溶液的粉末、可溶於水溶液的粉末、還包含油、蠟、凝膠、乳膏或乳液的局部製劑的形式存在的，或者是滅菌的注射用水溶液。7.權利要求6的藥物組合物，它包含提高血紅素加氧酶的活性的化合物，該化合物選自A型前列腺素；前列腺素A受體的激動劑；維生素B12；氯高鐵血紅素；以及保留血紅素加氧酶誘導活性的氯高鐵血紅素的片段、亞單位、結合物、類似物、衍生物或複合物。8.權利要求6或7的藥物組合物，它還包含增味劑，並且用於口服。9.提高血紅素加氧酶活性的化合物在製造藥物中的應用，該藥物可以治療慢性炎症。10.提高血紅素加氧酶活性的化合物在製造藥物中的應用，該藥物可以治療的疾病選自風溼性關節炎、慢性腸炎、多發性硬化、哮喘、氣管炎、腱炎和腦部慢性炎症。11.權利要求1的化合物在製造刺激炎性反應的藥物中的應用，該化合物可以降低血紅素加氧酶活性。12.權利要求11的化合物的應用，該化合物是血紅素加氧酶抑制劑。13.權利要求12的化合物的應用，其中血紅素加氧酶抑制劑是FePP的類似物。14.權利要求13的化合物的應用，其中類似物選自SnPP、SnMP、SnDPP、CrPP、CrMP、CrDPP、ZnPP、ZnMP、ZnDPP、MnPP、MnMP、MnDPP，其中PP相當於原卟啉，MP相當於中卟啉，DPP相當於二碘次卟啉。15.權利要求11的化合物的應用，該化合物可以提高一氧化氮水平。16.權利要求11-15中任一權項的化合物的應用，該應用是製造用於治療免疫抑制的藥物。17.權利要求16的化合物的應用，該應用是製造用於治療愛滋病的藥物。18.權利要求11-17中的任一權項的化合物的應用，該應用是製造用於刺激單核細胞的藥物。19.一種藥物組合物，它包含提高一氧化氮水平的化合物。20.權利要求19的藥物組合物，它包含一氧化氮合成酶的底物或一氧化氮供體。21.一種控制患者炎症的方法，它包括施用改變血紅素加氧酶活性的藥物組合物。22.用於緩解炎症的權利要求21的方法，它包括施用增加血紅素加氧酶活性或提高血紅素加氧酶水平的化合物。23.權利要求22的方法，它包括施用血紅素加氧酶誘導劑。24.權利要求21或22的方法，它包括施用前列腺素A受體激動劑。25.用於刺激炎性反應的權利要求21的方法，它包括施用降低血紅素加氧酶活性的化合物。26.權利要求25的方法，它包括施用提高一氧化氮水平的化合物。27.權利要求25的方法，它包括施用血紅素加氧酶抑制劑。28.權利要求27的方法，它包括施用FePP的類似物，該類似物抑制血紅素加氧酶。29.權利要求25-28中任一權項的方法，該方法用於治療免疫抑制，例如愛滋病中的免疫抑制。全文摘要通過控制血紅素加氧酶(HO)的水平和/或活性實現對炎症的控制。血紅素加氧酶誘導劑是抗炎性的(圖14)，被用於治療炎症，例如慢性炎症。血紅素加氧酶抑制劑可以促進炎症，被用於治療免疫抑制病症。可選的或補充的血紅素加氧酶的活性控制是通過控制一氧化氮的水平實現的，提高水平會促進炎性反應。文檔編號A61K45/00GK1166785SQ9519638公開日1997年12月3日申請日期1995年9月22日優先權日1994年9月22日發明者D·威利斯,A·R·摩爾,D·A·威洛比申請人:威廉哈維研究有限公司