充分分離植物組織的方法和裝置的製作方法

2023-07-23 03:07:46 1

專利名稱：：充分分離植物組織的方法和裝置的製作方法
技術領域：
：本發明一般地涉及充分分離適於遺傳轉化或組織培養的目標植物組織，如胚。
背景技術：
：製備用於植物繁殖、再生和轉化的組織耗時費工，尤其是因為它通常包括手工切除可轉化或可培養的植物組織。例如，在玉米(Zeamays)中，通常手工切除單個的未成熟胚以提供可遺傳轉化的外植體。胚性組織(embryogenictissue)的手工切除費力，且具有對工人造成人體工程學損傷的風險。此外，當高通量的轉化和植物生產需要較大量的可轉化的植物組織時，必須僱用和培訓更多的工人以滿足增加的需求。此外，獲得的植物組織的質量可以存在明顯的差異，這取決於工人個人的技術水平、小心、注意力和疲勞程度。在分離可轉化的植物組織的先前技術中，組織差異和缺乏自動化的可行性造成了問題，因為質量差的組織負面影響隨後的組織培養、遺傳轉化和植物繁殖。然而，甚至為生產適於商業開發和農業使用的單個轉基因植物，也可能有必要完成單一品種的數以萬計的單個轉化事件。因此，在本領域中非常需要改良的製備目標植物組織的方法，其更有效，減少工人的整體勞動負擔，減少處理植物材料所需的勞動量，和/或其產生比手工生產的組織具有更高、更一致的質量的植物組織。
發明內容在一個方面，本發明提供了獲得適於組織培養和/或遺傳轉化的胚的方法，包括在基本上由水和/或具有大約0m0sm/kg至大約600m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度(osmolality)的滲透劑組成的液體培養基中從植物種子至少部分地切除胚，其中，在從植物種子切除胚後，胚仍然保持進行組織培養和/或遺傳轉化的活性。滲透劑可進一步是惰性滲透劑。在進一步的實施方式中，該方法包括在液體培養基中從植物種子或穗的群體至少部分地切除多個胚。滲透劑可以選自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖或其它滲透劑。在特別的實施方式中，培養基基本上由水和/或濃度為大約0.05M至大約0.5M的甘露醇或濃度為大約0.05M至大約0.5M的蔗糖組成。該方法可進一步包括遺傳轉化所述胚和從轉化的胚再生轉基因植物的步驟。在該方法的某些實施方式中，胚遺傳轉化的步驟包括使用包括殺菌劑的共培養培養基。在特別的實施方式中，殺菌劑是羧苄青黴素。在更另外的實施方式中，共培養培養基包含大約0.5-1.5mg/L的2，4-D。胚可以是禾本科(Poaceae)成員，如玉米、水稻、小麥或小米。在特別的實施方式中，胚是玉米胚或小米胚。在其它的實施方式中，胚可以是大豆胚、棉花胚或另一種雙子葉植物的胚。在另一種實施方式中，該方法包括在包括以下部分的培養基製備系統中製備液體培養基(a)水的入口；(b)滲透劑的入口；和(c)用於混合水和滲透劑以產生液體培養基的室，其中，水的入口和滲透劑的入口連接到混合室上以使水和滲透劑輸送到混合室。在某些實施方式中，水的入口和/或滲透劑的入口連接到容納水和/或滲透劑的一個或多個室。該方法可以進一步包括連接混合室和流體噴射裝置。在其它的實施方式中，該方法進一步包括用選自過濾器、紫外輻射源或Y輻射源和滅菌熱源的滅菌裝置對液體培養基滅菌。滅菌裝置可以在水和/或滲透劑進入混合室之前對其滅菌。或者，滅菌裝置在液體培養基進入混合室的同時和/或之後對其進行滅菌。在再另一種實施方式中，該方法包括在液體培養基離開混合室後對其進行滅菌。該方法可以進一步包括測量容納水的室、容納滲透劑的室或混合水和滲透劑的室中的一個或多個的填充水平。在進一步的實施方式中，該方法包括控制水和滲透劑向用於混合水和滲透劑的室的輸送。在特別的實施方式中，該方法包括通過電子感應水和/或滲透劑的輸送來控制輸送。在另一個方面，用於製備適於組織培養和/或遺傳轉化的植物胚的方法包括(a)將包括植物胚和/或種皮的植物種子組織置於水性環境中；(b)將所述組織與選擇性地附著到胚或種皮上的試劑接觸；和(c)根據試劑對胚或種皮的選擇性附著分離至少第一胚。在某些實施方式中，所述試劑包括氣泡。在特別的實施方式中，氣泡具有大約100微米至大約1mm的最大平均尺寸。在某些實施方式中，氣泡可能包含選自空氣、氧氣、氮氣及其組合的氣體。此外，在某些實施方式中，步驟(c)包括根據胚的浮力分離第一胚。該方法也可以包括在水性環境中包含表面活性劑，其可以減少氣泡彼此之間的聚並。在某些實施方式中，表面活性劑選自聚醚、PPG(聚(丙二醇))和PEG(聚(乙二醇))。在特別的實施方式中，PPG具有大約340至大約3500道爾頓的分子量，而PEG具有大約100道爾頓至大約9000道爾頓的分子量。在更其它的實施方式中，所述試劑包括與水性環境不混溶的第二液體。第二液體可以選自與胚的存活和轉化相容的植物油(如菜籽油)、礦物油或其它疏水液體。在某些實施方式中，植物種子組織包括通過在基本上由水和/或具有大約OmOsm/kg至大約600m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度的滲透劑組成的液體培養基(水性環境)中從植物種子至少部分地切除胚而產生的胚，其中，在胚從植物種子切除後，胚仍然保持進行組織培養和/或遺傳轉化的活性。在特別的實施方式中，水性環境基本上由包含水和/或具有大約7m0sm/kg至大約500m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度的滲透劑的培養基組成。該方法可以包括將植物種子組織置於水性環境中而不先將胚與非胚組織分離。在特定的實施方式中，植物種子組織是玉米植物種子組織。在其它實施方式中，植物種子組織是大豆植物種子組織或棉花植物種子組織。在另一個方面，本發明提供了用於製備適於組織培養和/或遺傳轉化的植物胚組織的裝置，包括(a)用於在水性環境中保持包括多個植物胚和非胚組織(如植物種子皮)的植物種子組織的容器；和(b)用於向水性環境輸送選擇性地附著到胚或種子上的試劑的至少第一噴嘴，其中，噴嘴產生具有大約0.1mm至大約1mm的平均直徑的氣泡。在某些實施方式中，本發明提供一種裝置，其中，容器填充培養基和包括胚和非胚組織的植物種子組織。在特別的實施方式中，該裝置進一步包括用於根據胚在水性環境中的浮力分離胚組織的收集器。在更其它的實施方式中，氣泡可能包含選自空氣、氧氣、氮氣及其組合的氣體。在更另外的一個方面，本發明提供用於製備適於組織培養和/或遺傳轉化的植物胚的方法，包括(a)將第一液體培養基流引到玉米粒或包含植物胚的其它組織上以從玉米粒或組織提取胚乳；和(b)將第二液體培養基流引到玉米粒或組織上以從玉米粒或組織提取胚。在某些實施方式中，液體培養基基本上由水或具有大約7m0sm/kg至大約500m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度的滲透劑組成。在特定的實施方式中，玉米粒可以包括在玉米穗上。在某些實施方式中，該方法可以進一步包括相對於第一和第二液流移動玉米穗，以從玉米粒連續除去胚乳和胚。在某些實施方式中，第一和/或第二液流構成小於玉米粒寬度的寬度。在特別的實施方式中，第一和/或第二液流構成大約0.003」的寬度和大約1」的高度，且第一和/或第二液流在大約30PSI至大約75PSI的壓力下產生。在某些實施方式中，第一和/或第二液流可以由在離噴嘴至少2.5」的距離處產生穩定的層狀流體流的噴嘴引出。在更其它的實施方式中，玉米粒可以位於距噴嘴尖端大約174-2」處。在某些實施方式中，第一和/或第二液流以基本上同樣的力量接觸穗上的一排玉米粒中的各個玉米粒。在另一個方面，本發明提供了獲得適於組織培養和/或遺傳轉化的玉米或其它植物胚的裝置，包括(a)用於將培養基引到玉米粒或含有植物胚的其它組織之上的至少第一流體噴射口；和(b)用於保持玉米粒或其它組織在培養基的路徑中的裝置。玉米粒可以包含在玉米穗上。在某些實施方式中，用於保持玉米粒或其它組織的裝置包括薄片(sheet)或圓筒形薄片。在其它實施方式中，用於保持玉米粒或其它組織的裝置包括網狀物或多個狹槽；或向待保持的組織施力的壓力凸輪或螺杆。種子或果實組織可以通過機械力、摩擦力、離心力或吸力保持在用於保持玉米粒或其它組織的裝置上。在特定的實施方式中，保持器可以包括壓力凸輪、螺絲推運器(auger)或螺杆。在某些實施方式中，用於保持玉米粒或其它組織的裝置懸置在氣相中、液相中或部分地懸置在氣相和液相中。在其它實施方式中，用於保持玉米粒或其它組織的裝置相對於流體力固定或可相對於流體力移動。本發明的另一個方面包括製備適於組織培養和/或遺傳轉化的植物胚的方法，其中，用於保持玉米粒或其它組織的裝置在容器中離心以向玉米粒或其它組織施力。該裝置可進一步設計為包括第一和第二流體噴射口。此外，在某些實施方式中，用於保持玉米粒的裝置包括用於相對於第一和第二流體流移動玉米穗以控制第一和第二流體流與玉米粒之間的接觸角的裝置。在特別的實施方式中，該裝置進一步包括檢測器以鑑別切除的胚乳組織和胚。在某些實施方式中，該裝置進一步包括至少第一分離器以將胚與非胚組織分離。在特別的實施方式中，通過選自尺寸排阻、差別密度和差別疏水性的方法將適於組織培養的胚與非胚組織分離。該裝置可以進一步設計為包括根據大小將胚與非胚組織分離的篩子。在特別的實施方式中，用於保持玉米粒的裝置包括用於相對於流體噴射口移動玉米穗或相反的第一電動機。圖1描述如實施例4所述的使用正機械壓力充分分離胚的本發明裝置的一種實施8方式。圖2描述如實施例7所述的使用流體噴射正壓力從種子移出胚的本發明裝置的一種實施方式。圖例(A)在X、Y和Z維上運動的機械手，(B)旋轉玉米穗的電動機，(C)抓緊器(grasper)，(D)保持玉米穗的手柄，(E)阻止材料向上飛濺的擋板，(F)阻止材料向上飛濺的凸緣(flange),(G)引導流體流動的孔，(H)透明管，(I)玉米穗，(J)震動篩，(K)乾酪包布(cheesecloth)或其它多孔材料，和(L)廢料容器。圖3描述如實施例7所述的使用磁性「手柄」的安裝機構的一種實施方式，玉米穗可通過該磁性「手柄」固定到機械臂上。圖4描述如實施例7所述的可用於本發明某些方面的噴嘴的一種實施方式。該噴嘴產生基本上均勻的、平板樣流體射流。圖5描述如實施例13所述的可用於本發明方法的裝置的一種實施方式。該裝置包括用於產生基本上扁平的流體射流的噴嘴和任選的吸入頭。圖5(上)描述了這種裝置的一種實施方式的橫截面圖，顯示了噴嘴、任選的吸入頭和玉米穗如何相對於彼此定位。圖5(下)示意地描述定位於裝置中的玉米穗。圖例(A)基部，(B)噴嘴，C)連接穗的基部的軸，(D)吸入頭，(E)玉米穗，和(F)引導流體流的孔。圖6描繪如實施例13中詳細描述的可用於在本發明方法中的用於施加負壓的部件的一種實施方式。圖例(A)—個或多個引導流體流的孔。圖7A-C描繪如實施例13中詳述的使用力的組合併可用於本發明的某些方面中的裝置的實施方式的不同視圖。該裝置包括具有能夠向之前已打開或截斷果皮的玉米粒的基部施加預定量的機械壓力的前緣(leadingedge)的頭和用於施加負流體壓力的部件。該裝置可以進一步包括用於分配流體或弓I導流體流的裝置。圖8描述了其中圓柱體的頂部全部、部分或主要被略小於玉米穗和玉米穗所附著的手柄的直徑的軟質材料膜或薄片覆蓋的本發明實施方式。具體而言，顯示了來自McMaster-Carr(McMaster-Carr,Atlanta,GA;例如，cat.#9010K11)的娃橡膠膜防溉板(1/32」厚度)。在膜中形成1」直徑的孔。玉米穗能夠通過該開口向下移動，也能夠通過它向上返回。圖9描述底部切斷的1升聚甲基戊烯量筒。3個流體噴射口穿入筒壁中的切孔。整個裝置可以在使用前高壓滅菌。為了進行操作，筒頂部可以安裝防濺板，且玉米穗可降入筒中以使得流體射流驅出各個玉米粒的內容物。驅出的材料然後落在筒底部之外以進行進一步處理。圖10描述玉米穗軸，顯示了胚在單個玉米粒中的位置。還顯示本發明的一種實施方式，其中，液體射流引向玉米粒的向基(basipetal)側，與胚所在的向頂(acropetal)側相反。圖11圖示說明本發明提供的培養基製備系統的實施方式。圖12圖示說明本發明提供的培養基製備系統的混合室的全圖。圖13圖示說明混合室下端的近視圖，具有定位板和快速連接裝配件。圖14描述混合室下端的近視圖，具有定位裝置和支撐板。圖15描述工作狀態的培養基製備系統下部的近視圖。圖16描述工作狀態的培養基製備系統上部的近視圖。圖17包括用於玉米胚的相分離的裝置的橫截面視圖。圖18圖示說明螺旋形椴木(limewood)泡分配裝置。圖19圖示說明漂浮在由螺旋狀椴木泡分配裝置產生的泡沫頂部的胚。圖20圖示說明通過使用浮選過程分離胚乳和胚。圖21描述用於在胚分離器的空氣_流體界面的表面從泡沫收穫胚的真空過濾裝置。圖22包括如實施例19所述的胚分離裝置的示意23描述如實施例20所述的用於通過浮選分離胚的替代裝置。圖24圖示說明與用於從組織培養提取和分離玉米胚組織的裝置組合的胚提取器的頂視圖。圖25描述用於旋轉多個穗並提取胚的提取器的端視圖。圖26圖示說明胚分離器的側視圖。圖27圖示說明示例性的液位調節器。圖28圖示說明用於種子和/或果實組織的示例性網狀或狹槽保持器。圖29描述種子或果實保持器的薄片和圓筒形的實施方式。圖30圖示說明包括壓力凸輪或螺杆的種子或果實保持器的實施方式。圖31圖示說明用於棉花胚發生組織分離的包括椴木泡分配裝置的外植體分離o圖32描述漂浮在如圖31所示的微泡分配裝置中產生的泡沫頂部的棉花外植體。圖33顯示經切除和篩選(左)或切除、篩選並另外使用微泡技術純化(右)產生的棉花外植體的純度比較。具體實施例方式除非另有規定，本文所用的所有科技術語在本說明書的上下文環境中出現時，具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同的意思。在說明書文字與通過引用併入材料不一致的地方，則採用本說明書提供的定義和意思。本文所使用的命名以及下文所述的生產或實驗室方法為本專業的技術人員公知和常用的。短語「充分分離的」或「提取的」指處理存在於較大組織複合體(例如，種子)中或形成為其部分的目標組織(例如，胚或其它組織外植體)以使得目標組織與較大複合體的至少一半物理分離。在某些實施方式中，充分分離的目標組織可能與較大複合體的至少大約20%、30%、40%、50%、60%、70%、85%、90%、95%、97%、98%或99%或其任何分數的部分分離。在其它實施方式中，目標組織與較大複合體的超過大約80%至大約100%、大約90%至大約100%、或大約99%至大約100%，或其間的任何分數的部分物理分離。在某些實施方式中，目標組織可以會與較大複合體的大約100%物理分離。雖然充分脫離的目標組織與較大複合體的某一百分比的部分物理分離，但是它不必從該複合體純化。換句話說，充分分離的目標組織可以與較大的組織複合體保持在一起，只要目標組織與複合體物理分離(如上所述)。然而，在某些實施方式中，可能需要從充分分離的目標組織中除去分離的複合體的一部分或全部。所有這些實施方式都在本發明的範圍之內。短語「目標植物組織」指打算充分分離的植物組織或種子的一部分。在本發明中，目標植物組織指可以充分分離並用於遺傳轉化或組織培養的植物或植物種子的任何部分。在某些實施方式中，目標植物組織是胚，例如單子葉植物如玉米的不成熟胚。在其它實施方式中，目標植物組織來自雙子葉植物如大豆(大豆屬(Glycinesp.)，包括大豆(Glycinemax))或棉花(棉屬(Gossypiumsp·),包括棉花(G.hirsutum))。短語「適於遺傳轉化」和「適於組織培養」指有能力分別在合適的植物培養條件下轉化或生長的植物組織。本領域的技術人員可以通過使用常規實驗很容易地確定特定的目標組織是否適於遺傳轉化或組織培養。例如，可以在合適的植物培養基(本領域的技術人員也已知)上培養來自一批充分分離的目標組織中的樣品以確定這些組織是否能夠生長和再生。相似地，充分分離的目標組織的樣品可以進行轉化，並篩選異源核酸分子的存在。這些技術是常規的，並且可以快速確認哪些組織能夠轉化或組織培養，以及哪些(如果有的話)不能。充分分離目標植物組織本發明提供了充分分離適於遺傳轉化和/或組織培養的目標植物組織的方法。在某些實施方式中，目標植物組織是胚。在一種實施方式中，胚是單子葉植物的胚，如來自玉米。在某些實施方式中，充分分離的目標組織可以整體或部分分離。例如，一批充分分離的不成熟胚的可以包括完整的胚、部分的胚或其混合物。優選地，該完整的和/或部分的組織適於遺傳轉化、組織繁殖、植物再生和其它組織培養應用。在組織正通過使用，例如選定的培養基流分離時，可以提供收集容器。在某些實施方式中，為了提高裝置效率，減少混亂，防止噴射流的不需要飛濺和/或限制提取的組織在收穫過程中的任何逸失，向這種收集容器提供覆蓋是有利的。可以使用任何合適的容器或容器蓋。在本申請的其它地方給出實例，且這些也是本領域技術人員已知的。容器的合適蓋子可以包括那些由金屬、木材、玻璃、絲網、織物、塑料、橡膠、膠乳、丙烯酸樹脂和功能上相當的材料製成的蓋子。在某些實施方式中，材料是柔性的以使得允許玉米穗的穿透和移除而同時在提取過程中保持玉米穗周圍基本的水密封。該材料可以提供允許玉米穗進入與移除的合適的開口。在某些實施方式中，該材料是固體，並包含用於在提取過程中接收和保持玉米穗的柔性孔。在其它實施方式中，該材料是柔性的。這種柔性材料可以在容器上拉伸以形成液密配合，但是允許玉米穗通過穿透該材料或通過提供接受玉米穗的開口插入。在更另外的實施方式中，該材料是絲網或具有柔性開口的篩網。蓋子可以是可移動的或半永久性連接的。在某些實施方式中，該材料由彈性帶或等同的固定裝置固定。在其它的實施方式中，蓋子通過重物、摩擦環、鉤、夾子或其它功能等同的固定裝置保持定位。蓋子可以由柔性材料製成，並且可以具有不同的厚度。這些因素可以變化以實現玉米穗的插入和提取的預期效果。下表(表1)說明某些矽樹脂蓋的一些硬度和厚度參數。但是，本發明決不限於這些少數的選擇。表1.蓋子的硬度和厚度參數。計示硬度膜厚度(英寸)IOA1/32IOA1/1620A1/3220A1/1640A1/3240A1/16在一種實施方式中，收集容器用略小於玉米穗和玉米穗所附著的手柄的直徑的軟質材料膜或薄片覆蓋。在一種可選擇的實施方式中，在膜上形成小切口以提供更高的柔性。膜可以通過諸如彈性帶或摩擦配合環(frictionfitcollar)等的裝置連接在筒上。圖8說明如上所述的蓋和連接裝置的實施方式。在某些實施方式中，材料是可高壓滅菌的。可高壓滅菌的材料是本領域技術人員公知的。例如，可以使用如軟矽橡膠片的軟質材料。本領域技術人員了解可在提供減少提取的組織逸失和防止不需要的飛濺的收集容器的同時允許進行提取的可能材料和物理配置。植物組織培養和再生的合適方法是本領域的技術人員公知的。參見，例如，Adams等人的美國專利5，550,318、Lundquist等人的美國專利5，780,708、Duncan等人的美國專利申請公開2004/0210958、Lowe等人的美國專利申請公開2004/0016030和Cai等人的美國專利申請公開2004/0244075，它們公開了可用於玉米的轉化方法，以及Cheng等人的美國專利申請公開2003/0024014，其公開了可用於小麥的轉化方法，本文通過完整引入所有這些文獻作為參考。組織培養應用可以包括選自轉化、愈傷組織形成、分化植物組織的形成、至少一種成熟植物的形成、至少一種可繁殖成熟植物的形成的至少一種方法及這些方法的組合。從提取的不成熟胚再生的植物可以例如，通過去分化組織(愈傷組織)的分化再生。再生植物可以生長到成熟以提供成熟的植物，包括可繁殖的成熟植物。提取的不成熟胚和提取的非胚組織也可以用於其它目的，例如但不僅限於，遺傳或生化分析。本發明的方法和裝置可以應用於任何目標單子葉植物。優選的單子葉植物包括但不限於禾本科的成員，包括穀類作物，諸如玉米(玉蜀黍)、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高粱、小米和水稻。尤其優選的單子葉植物包括玉米(Zea)種，包括玉米(Zeamays)和小米(如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、狼尾草屬(Pennisetumsp·)、狗尾草屬(Setariasp.)、黍屬(Panicumsp.))，其在穗中具有通常成排保持的多個籽粒(種子)。在一般情況下，目標組織與其充分分離的單子葉植物種子以任何合適的方式提供。例如，種子可以附著在種子在其上生長的穗或頭上；在某些實施方式中，單子葉植物的種子可以在充分純化目標組織之前從穗或頭上移除。在某些實施方式中，在單子葉植物種子的果皮或種皮中形成開口。這可以通過任何合適的技術完成，例如，但不限於，用針、錐，刀片或其它合適的工具形成孔、穿孔或切口。在本方法的某些應用中，不需要除去果皮組織；在其它實施方式中，果皮的開口可能包括除去果皮和可能的某些非胚組織(例如，胚乳)的至少一部分。優選地，開口足以從種子充分分離胚。在某些實施方式中，它可能只需要充分地弱化果皮(例如，通過磨損、或通過其它物理、化學或酶處理)，以使得施加到種子上的力導致目標組織如胚的充分分離。在這種方法中，一般向種子施加足以充分地分離目標組織(如不成熟胚)的力，其中，充分分離的目標組織適於遺傳轉化和組織培養。可以連續或同時地向多個種子施力。施加的力可以是連續或不連續的(例如，如脈衝式的或波浪式的力)，且一般機械地施加，也就是，通過使用器具或機器而非通過人手。施加的力的大小優選足以克服目標(例如，胚)和非目標(例如，非胚組織，如胚乳)彼此的粘附力，從而允許目標組織和非目標組織的分離。可以使用一個或多個任何合適的力從種子移除目標組織，且多個力可以組合、順序或同時應用。合適的力包括但不限於流體射流正壓、液體射流正壓、機械正壓、負壓、離心力、線性加速、線性減速、流體剪切力、流體湍流、吸力和流體層流。流體力可以通過任何流體施加，例如，氣體或液體或兩者的組合。由於玉米胚位於玉米粒的向頂側，有可能將液體射流引向玉米粒的向基側以(如果需要的話)成功地排出胚(參見，例如，圖10)。在這樣的配置中，射流的全部力一般不直接衝擊胚。而是，大部分的力只是間接地施加於胚自身。因此，裝置中可應用較強的力以加速胚的除去而基本上不增加對於除去的胚的破壞。可以通過迫使更大量的液體流過本發明的裝置來提供更大的衝擊力。然而，在某些實施方式中，可以產生更大的衝擊力而不需要更多的液體。例如，在某些實施方式中，減小噴射口的大小以使得可以以較高的速度使用相同體積的液體。由於運動物體的能量與速度的平方成正比，相同體積的射流可以具有大得多的能量。運動物體動能的一次方程等於(1/2)(m)(ν2)。液體射流的實際衝擊能量的計算也要考慮本領域技術人員已知的其它因素。此外，一些實施方式可以結合使用增加流體和改變噴射口大小的方式以達到預期的力或能量。例如，具有大約0.01至大約0.25、或大約0.01至大約0.2，或大約0.01至大約0.1，或大約0.01至大約0.09,0.08,0.07,0.06,0.05,0.04,0.03,0.02或0.015，或在這些數量之間的任何全整數或分數的gpm參數的噴嘴可以用於本發明中。在某些實施方式中，可以使用具有低gpm參數如0.033或0.021gpm的噴嘴。當在較高壓力下使用這種噴嘴，但引向玉米粒的與胚相反的一側時，可以在避免傷害胚的同時實現加速的胚收穫。在某些實施方式中，在本發明的裝置中提供多個射流。這種裝置可用於平衡流體射流施加的力，同時減少從玉米穗收穫胚所需的時間。在某些實施方式中，該裝置可按照需要具有2、3、4、6、8、10或更多的噴射口/噴嘴以用於傳遞流體力。在一種實施方式中，有三個開口。這種裝置如圖9中所描繪。在某些實施方式中，開口設置為水平定向的窄角平流噴射口。然而，在本申請的其它地方提供了噴射口的其它實施方式。直接連接到圖9所描述的聚甲基戊烯量筒內的不鏽鋼噴嘴組件如表2中所示表2.噴嘴組件tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14其餘部件主要是用於照片的右側(圖9)的流體源處具有凸式快卸配件的管件和配件。本發明的方法和裝置可以進一步用於從相關的非胚組織(如胚乳、穎片、種皮或果皮組織)分離充分分離的目標組織(如不成熟胚)。可以通過一種或多種合適的技術完成分離，包括但不限於，通過尺寸排阻分離(例如，通過一個或多個過濾步驟進行過濾)、基於疏水性、親水性或其它力的分離和通過質量或密度差異的分離(例如，通過離心、沉降和傾析的分離)。在例如用於組織培養中不需要另外對完整的或部分的胚進行分離的情況下，一個或多個分離步驟是任選的。本發明特別適合於其中必須提供大量目標組織的應用，例如，在高通量處理或篩選中，或遺傳轉化或組織培養的批處理中。該方法的自動化是可能的，例如，通過採用機械手或機械處理玉米穗或種子，打開果皮，對種子施加作用力，或任選的分離步驟。這種自動化可以使用光學或機械傳感器以幫助相對於一種或多種施加的作用力或在分離步驟中定位玉米穗或種子。在一種實施方式中，該方法以以下速度提供充分分離的胚每天大約250至50，000或更多的胚，或每天大約500至大約100，000，或大約250至大約50，000，或大約250至大約20，000,或大約250至大約10，000,或大約250至大約5000，或大約250至大約3000，或大約250至大約1000個胚；或每天大約1000至大約50000個胚等，包括如上所述任何範圍之間的任何分數或整數。如上面指出的，本發明克服了胚人工切除的明顯產量限制。用於充分分離目標植物組織的裝置本發明也提供了一種用於充分分離適於遺傳轉化或組織培養的目標組織(如玉米胚)的裝置。在一種用於分離玉米胚的實施方式中，這種裝置可以包括至少一個引導流體流的孔，其中，流體流接觸玉米穗上的玉米粒並從玉米粒充分分離胚。一般來說，優選流體流在給定的一定時期內儘可能方便地接觸儘可能多的玉米粒，以便更快地分離胚。所述孔可以包括單孔或多孔(例如，單個或多個噴嘴)，其可以包括產生扁平、圓形、橢圓形、扇形或其它形式的流體射流的噴嘴，和可調整的移動或固定噴嘴，並可以產生任何合適的類型和介質的流體流。流體可以是氣體，如空氣、氮氣或氣體混合物；液體，例如水、生理鹽水或各種培養基，如下所述的介質或組合。合適的流體流包括但不限於流體射流，如單個或多個柱狀射流；扁平的、錐形的或扇形的射流或噴霧；和片狀射流、層狀流體流和湍流流體流。合適的流體流可產生各種力以從其玉米粒除去胚，包括正壓或負壓或兩者；這些力可以是均勻或不均勻的、連續或不連續(如脈衝式或波浪式力)的，或其任何組合。本發明的裝置可以進一步包括相對地移動充分純化的目標組織和流體流的裝置。例如，可以移動含有種子的玉米穗或流體流，或兩者。裝置的各種實施方式可用於單個或多個完整或部分玉米穗。例如，一個或多個玉米穗可以固定於保持器或抓緊器上，其相對於流體流移動。但是，在其它實施方式中，一個或多個玉米穗不需要單個固定在保持器上，而是可以自由移動以使多個玉米粒被所用的力接觸而從玉米粒除去胚。用於相對於流體流移動至少一個玉米穗的裝置可以相對地旋轉玉米穗和孔，或可以沿著玉米穗的縱軸移動液體流，或可以提供玉米穗和孔相對於彼此的任何適當的三維運動，如旋轉和縱向運動的組合。本發明進一步提供了用於將目標組織與非目標組織分離的分離器。例如，胚可以與非胚組織分離，其中，分離的胚包含至少部分適於遺傳轉化或組織培養的玉米胚。分離器可以通過包括但不限於以下的機制工作通過尺寸排阻(例如，使用絲網、篩、穿孔表面或其能排除特定大小的物體的裝置)分離、基於疏水性或其它引力(例如，使用能夠吸引或排斥胚的固體或液體材料)的分離和通過質量或密度差異的分離(例如，使用離心機或使用用於差異沉澱的溶液)。在某些實施方式中，分離器可以是任選的，例如，在用於遺傳轉化或組織培養中不需要另外分離完整的或部分的胚的情況下。如上所述，充分分離的不成熟胚包括至少部分適於組織培養應用、轉化、愈傷組織形成、直接的胚形成、分化的植物組織的形成、至少一種成熟植物的形成、至少一種可繁殖成熟植物的形成，以及這些方法的組合的胚，例如不成熟的完整或部分的胚。充分分離的不成熟胚和非胚組織也可以用於其它目的，例如但不僅限於，遺傳或生化分析。本發明進一步提供了用於以機械方法從至少一個不成熟的玉米穗分離多個適於遺傳轉化或組織培養的玉米胚的裝置。在一種實施方式中，該裝置包括選自以下的至少一個組件(a)至少一個用於向不成熟玉米穗的玉米粒外部施加機械正壓的固體表面；(b)用於引導流體流的孔，其中，流體流與玉米穗上的玉米粒接觸；和(c)用於施加接觸玉米穗上的玉米粒的負流體壓的孔；其中，該組件施加足以從玉米粒充分分離適於遺傳轉化或組織培養的胚的力。可以以連續或非連續的方式順續或同時地向多個種子施加力，且通常機械地施加而非通過手動施加。多個力可順序地或同時組合使用。合適的力包括但不限於流體射流正壓、液體射流正壓、機械正壓、負壓、離心力、線性加速、線性減速、流體剪切力、流體湍流和流體層流。流體力可以通過任何流體(氣體或液體或兩者的組合)施加。本發明的組合裝置可以任選地包括用於相對於分離胚或其部分的一個或多個作用力源移動至少一個玉米穗的裝置。一個或多個穗可以相對於作用力源移動，以使得一個或多個力在一定時間內儘可能便利地接觸儘可能多的玉米粒，以便能更迅速地分離胚。本發明的組合裝置可以進一步包括至少一種用於進一步分離適於遺傳轉化或組織培養的充分分離的不成熟胚的裝置。分離器可以通過包括但不限於以下的機制發揮作用通過尺寸排阻分離、基於引力進行分離和通過質量或密度差異進行分離。用於切除玉米或者其它植物胚的液體培養基在一種實施方式中，本發明提供了用於充分分離適於遺傳轉化或組織培養的目標植物組織的培養基和方法。例如，流體噴射裝置利用液體切除胚，需要大量的液體用於切除。因此，例如，從一個玉米穗切除胚可能需要大約20L的液體培養基。因此，該培養基優選很容易製備(基本上由一種或兩種成分組成)、可滅菌(例如，通過在線過濾單位)，且可以流過在大約30-75psi(例如大約40-60psi)壓力下操作的流體噴射裝置。此外，優選在使用前不需要調節pH。為了節省資源和費用，也優選可重複使用。培養基如Lynx#1013接種培養基和Lynx#1902(半強度Lynx#1013)已成功地用於切除用於組織培養的玉米胚的自動化方法和裝置中。然而，這些培養基具有多種成分，並需要在使用之前調整PH。因此，本發明者已開發了優化可以用於組織培養胚的自動胚切除方法的效率的培養基。令人吃驚的是，本發明者特別發現基本上由水和/或具有大約OmOsm/kg至大約600m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度的滲透劑組成的培養基是有用的。在某些實施方式中，對滲透劑而言，優選大約OmOsm/kg至大約600m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度，包括大約7m0sm/kg至大約500m0sm/kg、大約13m0sm/kg至大約300m0sm/kg、大約25m0sm/kg至大約300m0sm/kg、大約50m0sm/kg至大約300m0sm/kg、大約13m0sm/kg至大約200m0sm/kg、大約13m0sm/kg至大約100m0sm/kg或大約100m0sm/kg至大約300m0sm/kg。在特定的實施方式中，提供的培養基基本上由無菌蒸餾水、稀釋氯化鈣(例如大約IOppm)、0·05%的MES，pH5.4-5.8、大約5%蔗糖+/-MS鹽或大約0.05-0.5M的甘露醇(包括0.1-0.2M的甘露醇溶液)組成。雖然通過使用部分這種液體培養基切除的植物胚的轉化頻率(TF)在某種程度上比使用例如Lynx#1013接種培養基時的轉化頻率降低，但由於使用較簡單的培養基產生的顯著的時間和成本效率可以通過使用相同量的資源產生較多的外植體勝過TF的任何降低。在本發明的特定實施方式中，切除培養基包括滲透劑甘露醇和/或蔗糖，例如基本由0.05-0.5M甘露醇組成的培養基。據發現，這種培養基能產生有活性的外植體。在特別的實施方式中，切除培養基基本上由大約0.1-0.2M的甘露醇組成。例如，0.2M的甘露醇水溶液的摩爾滲透壓濃度是例如大約225m0sm/kg。在其它實施方式中，也發現無菌蒸餾水以及5%的蔗糖(w/v)是適用於本發明的簡單而有效的培養基。培養基製備系統與流體噴射裝置一起使用的培養基製備系統(MPS)是本發明的另一種實施方式。例如，MPS可以用來提供上述的切除培養基。MPS可由外殼(MPSH)和混合室(MC)組成。MPS可由合適的材料製成，如鋁(如7075航空級鋁)或鋼。混合室一般包括具有上端和下端的罐，並可以包括凸緣和蓋板。蓋板一般具有一個或多個0形環或其它密封混合室的密封裝置。蓋板包括用於插入和除去液體和其它培養基成分的開口。液體和其它培養基成分可以通過混合室中包括的一個或多個入口加入，所述入口可與容納和/或傳輸成分供應源的室和/或管線相通。蓋板也可以包括用於感應製備的培養基的特定體積的電子傳感器。混合室可以定位於支撐板上，並通過保持裝置(如安裝銷和定位支架)固定於工作位置。支撐板可滑動地連接於MPSH。在某些實施方式中，混合室連接到流體噴射裝置，例如通過鋼或聚碳酸酯管。混合器組件可以連接到混合室的蓋板或其它部分。該組件可以包括安裝在懸掛裝置(如高溫滾珠軸承)上的葉輪和軸杆。混合器可在使用前高壓滅菌。MPS可以進一步包括與傳感器通訊的可編程邏輯控制器(ProgrammableLogicController)(PLC)以監測成分進入、培養基製備和隨後的培養基移除，例如通過連接到液體噴射裝置的流體流出管。一個或多個流體流入和流出管可以包括在線過濾單位以對製備的培養基除菌。用於胚的相切除的裝置用於製備多個適於組織培養的胚的方法和裝置是本發明的實施方式，其中，所述方法包括使用用於從種核充分提取胚和胚乳的至少兩個流體流，所述裝置包括用於引導從種核充分提取胚的第一流體流和第二流體流的至少一個孔。該裝置可以進一步包括用於相對於第一和第二流體流移動至少一個種穗的裝置。在某些實施方式中，種穗或種核是玉米穗或玉米粒。流體流可以是氣體流或液體流。在某些實施方式中，流體流包括液體，且在特定的實施方式中，液體基本上由蒸餾水、大約5%的蔗糖或大約0.05M-0.5M的甘露醇(例如大約0.1-0.2M的甘露醇)組成。流體流可以施加用於充分提取胚的力，包括一種或多種選自流體射流正壓、液體射流正壓、機械正壓、負壓、離心力、線性加速、線性減速、流體剪切力、流體湍流和流體層流的力。流體流可以是連續的或脈衝式的。在某些特定實施方式中，流體流是無菌的。為進行自動化處理，本發明的裝置可以進一步包括用於檢測切除的胚乳和胚組織的裝置以及用於為胚乳或胚提供通道的裝置。用於檢測的裝置和用於提供通道的裝置可以進行連接(例如電氣連接)以有助於自動化。本發明的裝置也可以包括用於從非胚組織分離胚的至少一個分離器，其中，分離的胚是適於組織培養的胚。分離器可以通過差別的疏水性、通過尺寸排阻、或通過差別的密度將胚與非胚組織分離。胚組織可以培養、轉化和/或再生以產生至少一個可繁殖的植物。在特別的實施方式中，胚是玉米胚，且植物是玉米植物。通過浮選法分離胚本發明進一步提供了基於選擇的試劑相對於非胚種子組織的差異親和力分離胚的裝置和方法。在某些實施方式中，胚(如通過流體射流切除方法產生的玉米胚)通過疏水作用接觸和附著於氣泡。在其它實施方式中，種皮接觸並附著於氣泡。氣泡可以包含選自下面的一種或多種氣體無機氣體，如氬氣、空氣、氧氣、氮氣；和共價有機氣體，如甲烷、乙烷或丙烷，它們對切除的胚的生存性和可轉化性不產生嚴重影響。據發現，泡的大小對分離過程的效率具有重要作用。在實踐中，可以產生表現出一定大小範圍的(氣)泡。然而，適用於附著到胚或種皮上並使它們上升到流體表面的任何泡大小屬於本發明的範圍。氣泡的大小分布可能隨許多因素而變化，例如玻璃料(frit)均勻性組成玻璃料的微粒之間的開口可能發生變化，使得形成各種大小的氣泡。氣流速度氣體通過產生氣泡的玻璃料的氣流速度也影響氣泡的大小_如快速氣體流產生較大的氣泡。表面活性劑及其濃度培養基添加劑(如甘露醇和PEG)以及從破壞的玉米粒中釋放的具有表面劑活性劑性能的蛋白質和其它物質可能會影響氣泡的大小。氣泡合併隨著氣泡上升到罐的頂端，其中某些氣泡與其它氣泡合併。靜水壓力在浮選罐的底部附近的氣泡由於槽底的較高壓力而平均略小，雖然鑑於浮選槽的尺寸，這種影響是微小的。此外，不需要單一氣泡攜帶單個胚或種皮一直到達表面。相反，胚或種皮可以僅僅被單一氣泡部分攜帶到表面，以進一步被其它氣泡的順次附著而攜帶。另外，胚或種皮可能不達到表面，而是第一次嵌入周圍泡沫中，但可以在到達空氣和液相(例如「泡沫」)界面前循環多次。例如，大約1毫米直徑(即，如果是球形，其為直徑；或如果是非球形，則其為最大尺寸)或更大的大氣泡由於幾個原因而不能得到很好的分離。舉例來說，這樣的氣泡移動足夠快以致於它們液動地將胚及碎片推開。因此，這樣的大氣泡往往不能充分接觸到胚。這種氣泡與胚或種皮也沒有足夠的接觸時間以實現有效的氣泡附著。最後，這樣的氣泡到達流體表面時會產生足夠大的剪切力，以致於附著於氣泡的任何胚往往在到達表面之前脫罔。小氣泡，如直徑是大約100微米或更小的氣泡，附著於碎片以及胚。這是因為氣泡穿過流體足夠慢地移動以致於它們不能把較小的材料(如胚乳碎片)推開。因此，這樣的氣泡接觸並附著於胚以及其它較小的碎片。最後，這樣的氣泡不能產生足夠的剪切力以有效地驅除附著的碎片。中等大小的氣泡(大小在ΙΟΟμπι和Imm之間)在實現胚純化中相對比較有效。這種氣泡明顯地產生足夠低的流體動力學位移，從而允許氣泡與胚接觸，因此發生附著。此夕卜，這種氣泡不產生足夠的剪切力以驅除附著的胚。分離過程的另一方面涉及到氣泡中存在的氣體的物理性質，即氣泡對於胚或種皮的選擇性。空氣是大約21%的氧和78%的氮。氧和氮都是共價鍵合的雙原子分子，並對於胚(如棉花胚)的類似地共價(非極性)蠟樣部分有強的親和力。相反地，這種氣體在與保持漂浮在培養基中的相對極性的胚乳碎片的附著方面效率較低。簡言之，該氣泡與水性流體(例如水或甘露醇/水)競爭附著到胚的蠟樣表面。因為氧和氮分子的共價性超過水分子，所以它們優先附著於胚表面。因此，氧氣和氮氣的相對親脂性和水性介質的相對親水性解釋了氣泡與例如，棉花胚表面的親脂性部分的結合。或者，據發現氣泡有效附著於上升到在液-氣界面的「泡沫」的大豆種皮上，而據發現大豆胚(包括大豆胚軸和子葉)保留在液相中。因此，差異性地附著於各種種子成分以及將它們引導到不同位置、相或部分的試劑可以用來在給定的位置、相或部分富集種子成分(如胚或胚的一部分)。在一種實施方式中，空氣用於製備氣泡。在實施本發明中可用的其它氣體包括氧氣或氮氣，以及除氧氣或氮氣以外的共價無機氣體，包括惰性氣體如氬氣。共價有機氣體，如甲烷、乙烷和丙烷，及其它不嚴重影響玉米胚的生存性和可轉化性的親脂性氣體或氣體混合物也可以使用。在最廣泛的意義上說，「氣泡」可以由任何對胚顯示優先結合的材料製成，包括選擇性地附著於胚表面的固體或液體或其混合物。可以利用胚選擇性附著的形狀，如移動的平面表面，例如帶或盤。在一種實施方式中，漂浮在液體培養基表面上的胚優先附著在疏水性濾紙(WhatmanPS水排斥相分離紙，用矽氧烷浸漬)片上。在另一種實施方式中，與胚和碎片懸浮液混合的菜籽油優先附著於胚上，並在油上升到表面時將它們攜帶至表面。彼此接觸的氣泡可以在毫秒時間內合併。在氣泡上升時穩定氣泡保持了合適的氣泡大小分布，並在浮選液體頂部產生穩定的泡沫。已證明幾種表面活性劑可以用於防止聚並和穩定氣泡。優選地，表面活性劑是離子表面活性劑或非離子表面活性劑，如聚醚。聚醚可以是PEG。PEG可以具有大約100、300、400、600、900、1000、1450、3350、4500、8000和9000的平均分子量。優選地，PEG具有大約8000的平均分子量。PEG以足以防止氣泡過早聚並的水溶液濃度使用。另一種合適的聚醚是PPG。PPG具有大約340至大約3500的平均分子量。優選地，PPG具有340的分子量。PPG可以足夠防止氣泡聚並的水溶液濃度使用。在一種實施方式中，可以通過燒結的細孔玻璃分散管(Chemglass，NJ,USA)產生氣泡，所述細孔玻璃分散管連接用於通過除菌過濾器泵送空氣並使空氣進入用於產生氣泡的玻璃分散管的潛水泵。分散管可以放置在含有懸浮的胚和碎片混合物的容器中，如量筒或燒杯。然而，由該設備所產生的大群氣泡所產生的強對流產生相當大的剪切力而降低胚與碎片分離的效率。或者，氣泡可通過另一種方法產生，例如多點源氣泡發生器(如，利用椴木碎片的泡沫分散裝置，或具有孔的陶瓷表面)。在某些實施方式中，表面活性劑可用於穩定氣泡並防止其聚並。表面活性劑可以是離子型或非離子型表面活性劑。表面活性劑以足以防止氣泡聚並的水溶液濃度使用。在某些實施方式中，表面活性劑是聚醚。在特定的實施方式中，表面活性劑可以是PEG或PPG。PEG表面活性劑的分子量可以是大約100至大約9000道爾頓，例如大約100、300、400、600、900、1000、1450、3350、4500、8000或9000道爾頓。或者，表面活性劑可以是PPG，且PPG的分子量可以是大約340至大約3500道爾頓，例如，大約340道爾頓。可以通過產生和分散氣泡的裝置產生氣泡。例如，細孔玻璃分散管或起泡裝置可以連接到潛水泵並放置在容納有懸浮的胚和碎片混合物的容器中。在某些實施方式中，氣泡產生和分散裝置包括多點氣泡源，如椴木的單個碎片。碎片可以插入到基質中，如矽樹脂管的長度，並任選地盤繞成螺旋和固定。當胚已被氣泡攜帶到液體界面時，它們可以通過合適的裝置從表面泡沫除去，例如通過重力溢流，或除沫器(skimmer)或真空裝置。該裝置可以是自動的。用於提取和分離胚的組合裝置和方法在進一步的實施方式中，本發明提供了用於提取和分離適於組織培養的胚的組合裝置。提取器可以與分離器連通，或者它們可以單獨操作。提取器包括一個或多個用於從種子提取胚(如玉米胚)的流體噴射口。種子可能是玉米穗軸上的玉米粒。一個以上液體噴射口可以指向單一穗軸，且一個以上穗軸可以同時放置在提取器中。從籽粒提取胚後，胚和碎片可能會落入或被轉送到胚分離器中，所述分離器包括，例如，浮選室。用於轉送到浮選室以及從浮選室輸出的裝置可以是一條或多條篩選傳送帶，或是可通過尺寸排阻將胚與碎片分離絲網。帶或絲網可以是編織的或模製的熱塑性塑料。在將胚加入浮選室後，胚優先與其它碎片分離，例如通過描述的氣泡法，並漂浮到它們可以經開口或斜槽除去的表面。因此，可以收穫玉米穗，且可以使用流體射流切除胚。為了有助於通過液體射流切除胚，可以除去玉米粒的頂端，且可以通過射流將玉米粒內容物從穗充分除去。流體射流可以是包括所描述的具有大約0-600m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度的切除培養基的液體射流。在特定的實施方式中，切除培養基是無菌溶液，例如0.1-0.2M的甘露醇。可以通過射流從穗軸和玉米粒提取胚以及非胚(如胚乳)組織。隨後，可從非胚組織充分分離胚，例如通過所公開的使用剪切力的分離方法和裝置，包括胚的浮選，以及通過篩分等。然而，即使是胚或胚組沒有與包括玉米粒的其它組織分離，也可以用於隨後的組織培養，包括轉化和轉基因植物的再生。如果浮選方法用於分離，可以將表面活性劑添加到分離胚的培養基中。表面活性齊U，如PEG或PPG，減少氣泡的聚並，從而保持有效的平均氣泡的大小以促進胚與非胚組織的有效分離和胚在氣液界面的沉積，胚可以在此處通過流體流、除沫器或真空裝置等收穫。通過這些方法，可以獲得適於產生轉化的組織和轉化的植物的充分切除和分離的植物胚。轉化的植物以及生產它們的方法本發明還提供通過以下步驟生產的轉化植物，如玉米、棉花或大豆植物(a)使用本文描述的一種或所有方法或裝置提供至少一種可轉化的目標組織；(b)將選擇的核酸分子引入可轉化的目標組織從而產生轉化的外植體；和(c)從轉化的外植體培養轉化的單子葉植物。本發明的優選的植物包括禾本科的成員，包括穀類作物，諸如玉米(玉蜀黍)、小米、小麥和水稻；以及轉化的雙子葉植物，如棉花或大豆植物。特別優選的單子葉植物包括轉化的玉米類，如玉米。轉化的玉米優選優選包含至少一種可以賦予轉化的玉米需要的性狀的異源核酸分子，如除草劑耐受性、抗蟲性、冷發芽耐受性、水分缺乏耐受性、高產率、高產量等等。以下文獻公開了用於產生本發明的轉基因單子葉植物的可行的轉化方法和材料(例如，各種培養基和接受體靶細胞，不成熟胚的轉化及可繁殖轉基因植物的隨後再生)，例如，McElroy等人的美國專利6，194，636、McElroy等人的美國專利6，232，526、Houmard等人的美國專利申請公開2004/0216189、Cai等人的美國專利申請公開2004/0244075，它們公開了可用於玉米的方法，和Cheng等人的美國專利申請公開2003/0024014，其中公開了可用於小麥的方法，本文通過引入所有這些文獻作為參考。單個或多個異源核酸分子可以用於轉化本發明的單子葉植物；例如，用於基因表達的協調減少和增加的構建體在VanEenennaam等人的美國專利申請公開2004/0126845中公開，本文引入該文獻作為參考。許多轉化其它植物(包括雙子植物)的方法是本領域的技術人員公知的。舉例來說，美國專利申請12/045，502或美國專利7，002,05描述了轉化大豆和棉花植物的方法，本文引入這二者作為參考。在某些實施方式中，例如，當利用土壤桿菌(Agrobacterium)-或其它細菌介導的遺傳轉化方法時，可以通過使用包含殺菌劑如羧苄青黴素和/或大約0.5-1.5mg/L的2，4-D的共培養培養基提高通過本發明的方法分離的胚發生組織的培養應答或轉化頻率。在特定的實施方式中，共培養培養基包含表9的培養基1898的成分。可以收穫所得到的本發明的轉基因可繁殖植物的種子和用於培養基因組中包含異源核酸分子的轉化植物的後代世代，包括雜種世代。因此，本發明包括原代轉化植物(「R0」植物，通過轉化按照本發明的方法提供的胚產生)及攜帶該異源核酸分子的其後代。這種後代轉基因植物可以通過將本發明的具有異源核酸分子的轉化單子葉植物與沒有該構造體的第二植物雜交而獲得。另外，本發明的轉化單子葉植物可與具有賦予另一種性狀的其它異源核酸分子的植物株系雜交以產生具有賦予多種性狀的異源核酸分子的後代植物。為了提供對於包括這些術語的給定範圍的說明書和權利要求的清晰和一致的理解，現提供下列定義。「胚」是種子的一部分，由葉、莖和根前體組織(分生組織)以及一個或多個子葉組成。一旦胚開始生長(發芽)，它成為幼苗植物。「分裂組織」或「分生組織」由未分化細胞(分生細胞)組成，分生細胞分化以產生多種植物結構，包括莖、根、葉、芽和種子。分生組織細胞是用於獲得轉基因植物的轉化的靶點ο「外植體」是用來指轉化的靶材料的術語。因此，在本文的實施方式中，它可與「分生組織」或「胚」互換使用。實施例本領域的技術人員可以理解本發明提供的方法和組成(compositions)的許多優勢。下面的實施例用來說明本發明的優選的實施方式。本領域的技術人員應該理解實施例中公開的技術遵循本發明者發現在實施本發明時運行良好的代表技術，因而可以認為構成其實施的優選方式。然而，本領域的技術人員在參照本公開的情況下可以理解可以在公開的具體實施方式中進行許多變化並仍然獲得同樣或類似的結果而不背離本發明的精神和範圍。本文提到的文獻通過引用引入本文從而它們補充、解釋本發明採用的方法、技術或組成、為其提供背景或教導。實施例1壓出多個玉米胚的方法本實施例描述使用來自擠壓裝置的機械正壓產生適於組織培養和遺傳轉化的胚的方法。用蔬菜去皮器(vegetablepeeler)從玉米(zeamays)的不成熟穗無菌除去玉米粒的頂部。使用輕微的鋸式運動將去皮器從玉米穗基端推向頂端，以實現玉米粒的快速、明確的截斷。雖然在這個例子中，單個玉米粒被截斷而暴露其內部組織，但在其它的實施方式中，可能只需要確保在果皮中形成開口(如穿刺或切開或磨損)而不實際去除果皮材料。在需要完整胚的情況下(例如，用於轉化的完整胚)，優選任何開口的大小足以允許除去胚而不破壞它。可以通過使用任何合適的裝置(包括但不限於刀片和研磨材料)實現果皮的開口。例如，蔬菜去皮器設計為相對安全和快速地使用；它具有調整的切削深度，且比用手術刀需要更少的技能。可以採用具有類似功能的其它工具。打開果皮的裝置優選是滅菌的，例如通過高壓滅菌或加熱或通過化學滅菌。這些果皮處理過程可以自動實現，例如，可以使一個或多個刀片或者研磨機電動化。對著截斷的玉米粒的基部推動滅菌擠壓器(在這種情況下，4mm直徑的杆)。可以採用其它合適的擠壓設備。優選地，這種裝置應該具有能夠向截斷的玉米粒基部施加相對局部力的大小和形狀，以排出胚和胚乳。優選地，施加的力量具有足夠的強度，並以適當的方向施加，從而使得推進擠壓裝置不會「騎到」前方玉米粒上。擠壓裝置的後緣優選還具有排出的胚和胚乳積累於其上的表面；例如，可以使用具有圓形前沿的不鏽鋼平板。在本實施例中，從果皮輕輕地擠出胚，隨後是胚乳。壓出的胚和胚乳留置在前進的擠壓杆的頂部，並在此過程中不被碾碎。胚和胚乳混合物用水性流體介質(例如水、液體培養基或鹽水)清洗到具有菱形開口(大約2x3mm)的絲網上。觀察到胚乳大部分保留而將較小的胚及一些較小的胚乳碎片通過篩網清洗到收集容器中。收集的胚清洗兩次以除去小碎片。清洗的胚通過浮選過程進一步純化。在浮選過程的第一步中，從收集容器徹底排出水性流體介質以使其簡短乾燥(例如，大約1分鐘)，這樣使得殘留的水性介質與胚的蠟質表面分離，使它們直接暴露在空氣中。加入新的水性介質，且大多數胚因為它們的蠟質表面沒有被液體再溼潤(rewet)而漂浮。非胚組織(如胚乳碎片)保持浸沒在介質中，因而獲得胚和非胚組織的清晰的分離。可以通過更迅速、完全或可重複在排出水性介質(如通過使用抽吸)或通過毛細管作用(例如，使用置於收集容器中的滅菌的吸收劑以將流體吸離壓出的胚)改善壓出胚的浮選。在初步實驗中分離大約100個胚的產量，其中，只處理了來自完整穗的胚-胚乳材料的一部分。這些結果表明，本發明的方法對於從玉米穗軸收穫大量不成熟胚是實用和方便的。通過本發明的方法分離的胚然後可以用於組織培養過程，例如，產生轉基因玉米植物的再生方法。通過以下步驟很容易將分離的胚轉移到培養基上把尖端閉合的鑷子放在漂浮的胚下方，用鑷子將沒有液體的胚舉起並將它們放置在培養基上。另一種技術是可以用具有疏水表面的工具拾取分離的胚。另外的技術是通過疏水性轉移胚，例如，通過小的空氣氣流或突然的機械運動使得它們的動能超過將它們保持在工具上的疏水力而將它們轉移到培養基表面。實施例2胚大小的目視判定本實施例描述如實施例1所述的本說明方法的一種實施方式的改進。使用如實施例1所述的方法，未成熟的玉米胚需要接近玉米粒的截斷部分，以便最大量地排出。未成熟玉米胚的大小的差異是確定待去除的玉米粒頂部量的重要考慮因素。胚在穗的中間部分往往最大，向末端則稍小。較小的胚，例如長度小於大約1.5mm，更難以取出，除非它們接近截斷部分。確保從不同大小的胚上方切除足夠的玉米粒部分的一種方法是在截斷過程中在低放大倍率下觀察穗軸。例如，使用低放大倍率護目鏡(例如，配有7號透鏡的DoneganOpti-VISOR雙眼頭戴放大鏡，其提供2.75X的放大倍率)來幫助目視判定胚的大小和果皮的適當截斷。如果第一次切割沒有除去足夠的玉米粒頂點，可以進行第二次切割。可以使用其它具有相同或類似的放大倍率的低放大倍率裝置。例如，Opti-VISOR的可用透鏡提供從1.5至3.5X的放大倍率。實施例3胚和胚乳的壓出本實施例描述如實施例1所述的本說明方法的一種實施方式的改進。動力裝置可用於幫助胚和胚乳的壓出。例如，配備有圓形擠壓裝置的電動鏟刀如WeCheer320電動鏟刀(WeCheerIndustrialCo.，TaichungHsien,Taiwan,R.0.C)可以用來減少個人用於排出胚和胚乳所需要的力。可以獲得和類似地使用其它的動力裝置。優選地，這種工具的「鏟刀」部分(或該工具的任何可以接觸胚的部分)可以方便地滅菌，例如，通過插入到珠滅菌器(beadsterilizer)中。在一項實驗中，不鏽鋼稱量鏟(weighingspatula)的刀片朝向其自身彎曲以提供具有圓形前緣的擠壓裝置。在插入WeCheer320電動鏟刀中後，大約10釐米長的部分從電動鏟刀的夾具伸出。該組件用來從截斷的玉米粒的單排排出胚和胚乳。隨著擠壓裝置(改進的鏟)沿玉米粒的排向下移動，觀察到鏟向左或向右滑離中心的輕微傾向；但是，這一趨勢可以通過在各外緣上包括鏟的小型龍骨樣延伸部分來校正。實施例4機械化的胚壓出本實施例描述如實施例1所述的本說明方法的一種實施方式的改進。胚壓出過程的機械化可以通過合適的裝置實現，例如但不限於本文中所描述和圖1中示意性描繪的裝置。該裝置包括兩個電動機。第一電動機(D)是步進電動機，其可以旋轉玉米穗(A)以使得新的玉米粒排暴露於兩個壓出杆(G)，壓出杆(G)施加作用力以將胚和胚乳擠壓出其果皮。杆(G)方便地位於穗的相對側以平衡相對於穗的縱軸施加於穗的壓力。但是，可以使用單個杆或兩個以上的杆；在使用多個杆時，優選它們定位以使得將產生的機械壓力均勻分布在穗周圍。杆不需要是直杆；在該裝置的一種實施方式中，使用圍繞穗周的柔性「環(collar)」而不是剛性杆。在另一種實施方式中，多個短杆或輥以可以沿穗的縱軸滑動的靈活的圓形配置排列，從而同時向許多或所有玉米粒排施加機械壓力。第二電動機連接到與齒條(rack)(F)連接的小齒輪(piniongear)(E)上以使得穗可以上下直線運動。穗的基部通過從手柄向下延伸進入穗的基部的螺杆牢固地保持在手柄(B)上。手柄的窄的中部是方的以使得它不會旋轉，除非它所附著的保持器(C)由步進電動機⑶旋轉。在插入到機器之前，如實施例1所述截斷玉米粒的頂部以使得胚和胚乳可以被擠出。要啟動這一過程中，降低穗到直至2個杆(G)靠近恰好在手柄(B)下方的穗基部。然後杆壓靠穗的兩側，並且齒條和小齒輪組牽引穗向上。出現這種情況時，胚和胚乳從一對玉米排中取出，向下落入停在基部(I)上的收集盤(H)，並收集成堆(J)。當杆接近穗軸的頂端時，穗軸向上撤回到原來的起始位置，並由步進電動機稍稍旋轉直至新的玉米粒的排進入位置。本機器的各種程度的自動化是可能的，包括傳感器以自動調節垂直起點及終點位置以及旋轉的開始和結束位置。齒條和小齒輪並不是可以獲得直線運動的唯一方法。對於某些應用優選使用氣動裝置或液壓裝置。可以通過適當的機構自動打開杆(G)。當負載新的穗時，優選將穗升到足夠高的位置以清潔杆。實施例5胚的疏水分離本實施例描述如實施例1所述的本說明方法的一種實施方式的變型。在分離應用中，目標材料經常出現在不同相(例如，在水性和親脂溶劑之間)的界面處。從這樣的界面除去目標材料可能會產生問題，且在過去一直是涉及提取劑和待提取材料密封接觸的手工過程。通常成功分離出組分的唯一途徑是使用相同極性或疏水性/親水性的材料。在通過本發明的方法壓出的不成熟玉米胚的情況下，胚在水性/空氣界面處存在。玉米胚的表面是蠟性的，即親脂或疏水的，且當胚表皮與具有類似的疏水性的物質接觸時，胚往往會粘附到疏水性表面上。胚的疏水性降低了它周圍水的表面張力，這有助於胚「漂浮」在水性/空氣界面的表面上。利用這些物理特性的優勢的一種方法是，使漂浮的胚與疏水性材料如疏水濾紙(WhatmanNo.IPS紙)接觸，其是用矽氧燒(Whatmanpic,Brentford,Middlesex,U.K.)浸漬的水排斥相分離紙。在一種實施例中，一片滅菌的疏水濾紙可以下降到漂浮胚的整個容器上，並將它們一次性取出。在另一種實施例中，小片的疏水濾紙可以用來依次取出許多胚，並將它們轉移到下一個容器。在第三種實施例中，小片疏水性紙或疏水吸量管尖端可以用於接觸和取出單獨的胚，然後用來自吸移管管理器(pipettor)的氣流分配它們。還可以通過將吸量管插入一小段疏水管(例如矽橡膠管)來修飾普通吸量管以用於這樣的用途；胚然後可以通過疏水吸引到疏水管遠端而取出，接著通過分配來自吸移管的空氣流而釋放。疏水胚周圍降低的表面張力有助於它們浮在水性表面上，而漂浮的胚也可以通過在水性表面上移動(例如，通過指向胚的空氣射流)來轉移。可以使用已有裝置(如設計用於挑取菌落或在染色的二維蛋白質凝膠上回收蛋白點的機器)的改進使胚的獲得和分配自動化。實施例6排出或壓出胚的進一步的方法本發明的方法包括使用各種類型的力或力的組合將胚與種子分離。本實施例描述了進一步的實施方式。在如實施例1所述的一種基本方法中，向截斷的種子(如玉米粒)的基部施加機械正壓以通過截斷的種子頂部排出胚。在另一種實施方式中，離心力可以用來排出胚。例如，玉米穗(其玉米粒已經被預先截斷)可以繞其縱軸以足以沿徑向軌跡排出胚和/或胚乳的速度旋轉。可以通過任何適當的技術實現旋轉，例如但不限於，使玉米穗頂端接觸自由旋轉的錐體，其中穗的旋轉保持在有限的縱向範圍內，例如，通過穗的基端連接到手柄上，手柄隨後插入其可以在其中旋轉的保持器內。在一種使用離心力的示例性實施方式中，用手術刀除去玉米穗上各個玉米粒的頂端的大約三分之一，並且穗在表面上滾動以使玉米粒中的胚和胚乳鬆弛。穗被折斷成為兩段，各大約750mm長。將各段放置於具有大約100毫升水的250毫升離心瓶中。以5000rpm離心15分鐘以排出胚。離心後檢查穗表明，在穗的某些部分已通過離心除去所有的胚，而在其它區域，很少或根本沒有胚除去。排出的材料進行離心，並去除上清液以留下漿體，其包含完整的胚(估計包括胚總數的大約20%)。在另一個實施例中，收穫不成熟的玉米穗(通常是授粉後大約10至大約14天)。對穗除蟲，並在無菌條件下切去各個玉米粒的頂部。將穗安置在電鑽(或類似裝置)的鑽頭上，且穗被大的無菌收集容器(例如，大玻璃燒杯)環繞。以足以排出不成熟胚的轉動速度旋轉穗，且由無菌容器收集排出的組織。收集不成熟胚，例如，通過人工收集，或通過用無菌組織培養基清洗容器並回收含有胚的富集部分(例如，通過篩分，通過使用液體密度梯度，或通過本公開中的其它地方所描述的將胚與非胚組織分離的其它方法)。不成熟胚(或源於不成熟胚的愈傷組織)可以隨後用於轉化。可以通過常規試驗確定優選的離心時間和速度獲得使用這些和其它離心方法的改善的結果。另一種實施方式採用玉米粒大塊浸漬。收穫不成熟的玉米穗(通常是授粉後大約10至大約14天)。對穗除蟲。在無菌條件下打開果皮或玉米粒可以保持完整。通過任何合適的方法從穗軸除去玉米粒，包括但不限於，使用手術刀或其它刃狀工具。該玉米粒一旦與穗軸分離，就被放置在組織培養培養基中。可以使用合適的切割設備(例如但不限於，攪拌器)對玉米粒-培養基混合物進行進一步的組織破壞。收集不成熟胚，例如，通過人工收集，或通過用無菌組織培養基清洗容器並回收含胚的富集部分(例如，通過篩分，通過液體密度梯度，或通過本公開中其它地方所描述的將胚與非胚組織分離的其它方法)。不成熟胚(或源於不成熟胚的愈傷組織)可以隨後用於轉化。在進一步的實施方式中，流體射流(氣體或液體或其組合的射流)可以用來驅去胚。該方法的一個例子是以逐步或連續的方式自動旋轉玉米穗經過固定的噴射口，收集含有胚的排出的材料，且必要時，進一步在絲網或篩網等上通過粒析分離胚。在玉米穗垂直取向(相對於其縱軸)時，可能優選以向上的螺旋方向旋轉穗，或以其它方式相對於噴射口移動穗以使得提取的胚傾向於衝洗向下。在再另一種實施方式中，線性減速或線性加速可以用來驅去或排出胚。例如，可以給予玉米穗平行於穗的縱軸方向且具有足以排出胚和胚乳的力的衝擊。玉米穗可以封閉在合適的無菌、高抗衝擊的保持器中，所述保持器可以產生突然加速或減速，例如，通過強烈的碰撞(例如，來自錘)。另一項對該方法的改進是幫助胚從截斷的種子排出或壓出。例如，可以通過向完整的種子的頂部施加作用力(例如，通過應用向完整穗中成排玉米粒的頂部施力的輥或其它裝置或在截斷玉米粒的頂部之前在表面上滾轉或按壓穗本身)使胚鬆動或驅出其在種子中的原始位置。也可以通過應移置振動(例如通過超聲)使胚在種子中鬆動。另一種方法是在胚排出或壓出之前除去其它的非胚組織，如另外的側壁(果皮)材料。例如，V形刀或其它工具可用於除去穗中的成排玉米粒的部分側壁。實施例7使用流體射流正壓的自動胚分離本實施例描述了本發明的進一步的實施方式。在本實施例中，自動設備使用流體射流正壓從種子驅出胚。參考圖2，自動抓緊器C(優選能夠通過機械手A和電動機B或通過等效的工具進行三維運動)在對於機械手平臺上的齒條的規定位置拾取玉米穗I(通過具有擋板E的手柄D)。機械手將玉米穗插入在低於凸緣F的起始位置的管H(任選地由便於目測的透明材料製成)。通過孔G引入流體射流正壓，且穗同時上升(沿Y維度)和分別通過機械手A和電動機B旋轉，優選導致各個玉米粒被流體射流衝擊，使得胚和胚乳被驅出。流過孔G的流體可以是至少一種氣體、至少一種液體或其任何組合。流體射流可以連續或不連續地(例如，脈衝式)施加作用力。由於胚和胚乳被來自孔G的流體射流正壓驅出，它們落向震動篩J，其保留胚乳而允許胚通過下落到達下面的收集表面K(例如，無菌乾酪包布)。過量的流體可以任選地收集在廢物或回收容器L中。在對於各玉米穗完成胚除去過程後，可以手動或通過凸緣F上方或下方的自動噴射口短時地衝洗管的內部。實施例8處理粗胚製品的方法通過如實施例1至7所述的方法獲得的胚製品可能包括完整的胚和部分的胚，其可能伴有非胚組織，如胚乳和穎片。某些應用可能不需要進一步的處理或分離步驟，例如，在這樣「粗」胚製品的大量轉化中，其中胚(完整或部分)不需要與非胚組織分離。例如，源自完整或部分不成熟玉米胚的愈傷組織可以用於可繁殖轉基因植物的轉化、再生和生產。因此，完整和部分胚可作為轉化外植體發揮功能而不需要彼此分離。但是，在其它情況下，可能需要從粗的胚製品進一步純化胚。其中在處理粗胚製品中可能遇到一些困難的程序包括(1)清洗掉非胚組織(例如，細胞碎片、澱粉粒、不需要的蛋白質)，(2)在使用液體壓出或清洗後，有效地從胚除去過量的液體，和(3)加入具有最小湍流的液體以使得胚漂浮而不被淹沒。多孔材料用於將胚與非胚組織分離。可以採用任何合適的多孔材料，優選具有足夠小的網眼或孔大小以保留胚但讓較小的非胚組織或碎片通過，並能夠進行滅菌(例如，通過高壓滅菌、熱、輻射、或化學滅菌)。材料的適用性很容易由本領域的技術人員通過簡單的實驗判斷或測試。合適的材料的例子包括包幹酪布或其它織物材料，以及其它絲網或篩網。在某些實施方式中，可以使用穿孔固體材料中，包括穿孔的陶瓷、聚合物、金屬或玻璃(例如，布氏(BUchner)或類似的分液漏鬥的形式)。例如，適當規格的包幹酪布具有足夠小的網眼大小以保留胚但允許較小的碎片通過並且它是耐高壓加熱的。包幹酪布可以附著到框架或環(例如，圖2中和實施例7中所描述的保持胚收集表面K的框架)上，以使包幹酪布和所有保留的胚同時浸沒而便於衝洗。例如，包幹酪布可以很容易地通過彈性帶等(如矽膠管)連接到框架；例如，這樣的框架很容易由切成段的由耐高壓加熱材料(例如，聚丙烯、聚甲基戊烯、聚碳酸酯或耐高壓加熱玻璃)製成的燒杯或量筒製造。包幹酪布具有強的毛細作用，從而使液體有效地吸離胚，因而使它們的蠟性表皮在浮選前暴露於空氣中。在浮選步驟，包幹酪布只是浸沒在水性液體中，從而使胚浮起。實施例9使用流體射流充分分離胚本實施例描述了本發明的進一步的實施方式。在本實施例中，通過流體射流正壓從種子驅出多個胚。在最簡單的實施例中，200微升的吸量管尖端連接具有Parafilm的垂直水槽噴嘴(verticalsinknozzle)。當打開自來水時，具有相當大力量的射流從吸量管尖端形成。自來水壓力估計為大約每平方英寸60磅。這種流體(液體)射流瞄準不成熟的玉米穗(包含在燒杯中)，其中玉米粒如實施例1中所述已被截斷。由於射流衝擊各個玉米粒，胚乳和胚排出並在燒杯中收集。由於這個階段的胚乳是相對軟的組織，它可以被碎裂成許多更小的碎片，而胚似乎保持完整。直接將射流驅出的胚乳和胚組織倒於60號包幹酪布(可以用其它合適的多孔材料取代，如具有適當網眼大小的親水性絲網)上。可以獲得不同「等級」的包幹酪布(例如，10、20、30、40、50、60、70、80和90級，其中，網開口隨等級升高而減小)，且很容易通過簡單的實驗選擇適於給定類型的胚的平均大小和形狀的等級和網眼大小。胚和較大的胚乳碎片保留在包幹酪布上表面上。在下一步驟前，通過芯吸掉過量的流體使得包幹酪布部分乾燥。這將液體從組織吸除並將胚表面暴露於空氣中。當降低包幹酪布到水性液體中時，因為胚的蠟樣表皮沒有再溼潤，所以胚漂浮起來。在簡單的設置中，在將包含粗胚製品的液體通過包幹酪布傾倒時，包幹酪布(或其它合適的多孔材料)可以手動拉伸或保持在容器或廢物容器上。對於滅菌工作，包幹酪布可以附著到剛性框架上，該剛性框架可以在使用前高壓滅菌。也可以在本方法中使用具有手柄的搭扣連接(snap-together)的篩網，例如在廚房設備商店出售的那些。實施例10使用流體射流提取胚的裝置本實施例描述用於機械地製備適於組織培養的多個玉米胚的裝置的各種實施方式。一種實施方式包括使用流體射流製備多個玉米胚的裝置，一般類似於圖2所示的裝置。通過切除耐高壓加熱的聚甲基戊烯(PMP)I升量筒的末端得到透明的、末端開放圓筒。吸量管尖端(例如1250微升GilsonDistriTip，逐漸變細以避免形成反壓力)固定到圓筒的側面並用作用於引導作為射流的流體流通過圓筒壁中形成的孔的孔隙。將流體(在這種情況下是水)從PharMed⑧高壓耐高壓加熱的蠕動泵管通過吸量管尖端輸送。水從實驗室水槽水龍頭輸送，但可能是從泵或其它來源輸送的水性流體。當例如發現滅菌培養基或滅菌鹽溶液作為用於充分分離胚的液體優於水時，優選使用能夠輸送滅菌流體的泵。合適的泵的例子是具有高壓L/S泵頭(Cole-ParmerInstrumentCo.,VernonHills,IL)的Masterflex泵，其在使用高壓管時可以輸送高達IOOpsi的滅菌液體。手動將具有預先去頂的玉米粒的玉米穗定位於圓筒內。一旦穗適當地定位於圓筒內，各個玉米粒受到來自水射流的正壓。這導致胚和非胚組織從玉米粒壓出。這一處理後對穗的檢查表明胚從玉米粒有效地去除。將壓出的材料沿著圓筒的內壁衝洗到位於圓筒下方的胚收集器中。胚收集器包括(1)熱融合到上述的Tri-Pour塑料燒杯的切斷的頂部並堆疊於其上的粗塑料篩網(較大的碎片被截留在其上)，(2)用彈性帶固定到第二Tri-Pour塑料燒杯的切斷的頂部並堆疊其上的較細篩網(60級包幹酪布，壓出的胚被截留在其上)，(3)廢料收集燒杯或其它容器(其中收集細碎片、非胚組織和廢液)。本領域的技術人員很容易修改這些及類似的實施方式。例如，對於定位玉米穗或種子以施加流體射流，可以手動地保持穗定位，或優選通過能夠三維移動穗的可移動支架牢固地安置在圓筒內。例如，穗可以安置在螺紋金屬或聚合物杆(如聚丙烯杆)上，其可用於沿其縱軸移動穗以及旋轉穗。圖3描繪了安置機制的另一種實施例，其說明了磁性「手柄」，穗可以通過所述磁性「手柄」固定在機械臂上。但是在其它的實施方式中，一個或多個玉米穗不需要單獨固定到保持器上，而是可以自由移動，以使得多個玉米粒可以被用於從玉米粒去除胚的力接觸。例如，至少一個穗或多個穗可以承載或保持在至少一個支架上，例如但不限於，至少一個平面、框架、格柵、篩網、絲網、平臺、輥、導引線或杆，及帶式、輪式或輥式輸送器。這種支架可以是可移動的或可以導致一個或多個穗移動，例如，通過振動、滾動、重力或其它機制。如果平臺是多孔的(如，由絲網製成的)，充分分離的胚可以通過平臺本身。一個或多個穗也可以以允許每個穗在漂流時轉動或以其它方式自由移動的方式漂浮在流體中。流體，如含有充分分離的胚的液體，可以任選地通過過濾或沉澱裝置連續排出，或收集用於離心。用於獲得沿玉米穗縱軸的運動的裝置包括但不限於，滾珠螺杆驅動的滑塊(slides)或皮帶驅動的滑塊，例如可從各生產商如Techno，Inc.(NewHydePark,NY;techno_isel.com)購得的裝置。要獲得旋轉玉米穗的旋轉運動，可以使用步進電動機，例如，連接到滑板的步進電動機。旋轉運動也可以由滾動裝置提供，例如，通過平行的圓形或管狀輥輪，玉米穗保持在其間並旋轉。流體射流的形狀可以根據需要的應用有利地進行改變。例如，具有均勻直徑的窄柱狀射流用於一次從一個種子除去胚。需要提高胚充分分離的速度時，可以通過流體射流同時從多個種子中除去多個胚；例如，可以通過使用覆蓋較大面積的至少一個單流體射流，通過同時使用多個射流做到這一點。在一種實施方式中，多個射流，例如多個平行的、窄的柱形射流(例如，由類似於實施例9中使用的噴嘴的並任選地通過總管相連的多個噴嘴產生的)用於引導流體射流正壓到多個種子上以幾乎同時充分分離它們的胚。這些和其它設備的自動化可以進一步包括光學或質量傳感器以幫助穗和流體射流相對於彼此定位。在另一種實施方式中，可以使用至少一個覆蓋較大面積的流體射流(例如，其中，流體射流同時衝擊多個玉米粒或玉米穗上的多排玉米粒)。這種射流的規格優選允許射流進入玉米粒並衝洗出胚。通常情況下，用於遺傳實驗的玉米胚是不成熟的，且一般是在大約1.8至大約2.2mm的長度範圍內；含有這些不成熟胚的玉米粒一般是大約4至大約5mm寬度的大小範圍內。對於這種大小的胚，適當的流體射流可以是，例如寬度大約0.5至大約1mm。可以使用任何用於生產這種較大的流體射流的適當裝置，例如，但不限於產生非柱狀流體射流的噴嘴。合適的噴嘴的例子包括但不限於，產生扁平噴霧模式的噴嘴和產生扇形或錐形噴霧模式的噴嘴。在一個實施例中，使用市售的具有Masterflexl/s泵(型號77250-62)的扇形噴霧噴嘴(編號23990-1/4-04，SprayingSystemsCo.,Dillburg,PA)以1升/分鐘和30psi泵送液體；在這些條件下從玉米穗切除胚。優選的噴嘴的另一個例子是以扁平的流體「片」形式產生流體射流的噴嘴，如圖4中所描述。這種噴嘴優選能夠產生均勻的扁平流體射流，其在至少足以允許流體流同時接觸多個種子(優選幾個種子)的距離內維持連貫的、均勻的片狀流。圖4中描述的新型噴嘴設計為產生均勻的平片式射流，其厚度為大約0.5至大約1mm、寬度大於20mm，且在距噴嘴的孔大約15至大約30mm的距離內保持平片狀流。後一距離使得射流針對玉米粒表面和噴嘴的孔之間的距離差異僅需要最小的調整而沿玉米粒排移動。無論液體流過的噴嘴或孔產生的射流或噴霧的面積或形狀如何，噴嘴或孔優選使用足以產生足以從種子驅出胚而不破壞胚的流體力的流速和壓力。在某些實施方式中，優選使用較低的流速和可能的較大壓力，以最小化流體(例如培養基)的消耗以及最小化廢物產生。實施例11使用氣體射流以充分分離胚本實施例描述用於機械製備多種適於遺傳轉化或組織培養的玉米胚的方法和設備的進一步實施方式。如實施例6所述，氣體射流也可用於充分分離多個胚。改造類似於實施例10中所述的裝置以使其使用氣體。將1毫升吸量管尖端(MarshBioProducts-ABGene,Rochester,NY；目錄編號TN1300RS)固定在1升聚甲基戊烯量筒的側面，且吸量管用作引導作為射流的氣體流通過圓筒壁中形成的孔的孔隙。由壓縮機供應的空氣加壓到大約60至大約lOOPsi。為了方便，空氣閥定位在壓縮機和吸量管之間的管線上。這一吸量管尖端形成的空氣射流用於從製備好的玉米穗驅出胚。對經受空氣射流的玉米粒的檢查表明，厚的果皮仍然保持在原位，且被紙樣穎片包圍，而果皮內含物(胚和胚乳)已被除去。對等級60包幹酪布保留的組織的檢查表明，其包括驅出的胚以及高壓空氣射流驅出的一些穎片。玉米的穎片具有像胚的蠟樣表面，且也按照浮選過程漂浮。使用較低的空氣壓力可減少穎片汙染。實施例12使用其它流體力充分分離胚本實施例描述用於機械製備適於遺傳轉化或組織培養的多個玉米胚的方法和設備的進一步實施方式。除了流體射流的正流體壓力以外的流體施加的力可以用來充分分離胚。在一項實驗中，從放置在包含無菌蒸餾水的瓶中並用手劇烈搖晃的玉米穗上除去玉米粒的頂部。這導致從穗的200個胚中充分分離出90個。另一項實驗重複上述程序，除了搖動是在機械塗料混合器中進行。在這項實驗中，從穗的190個胚中充分分離出56個。在第三項實驗中，進行類似的程序，除了在211培養基(1升來自Duchefa的N6基礎鹽混合物Ipkg(即3.952g)(GoldBiotechnologyInc,St.Louis,MO,U.S.A.)；2，4_D(lmg/ml):1毫升；硫胺素(0.5mg/ml):2毫升；煙酸(0.5mg/ml):1毫升；L-天冬醯胺一水合物0.91g；肌醇IOOmg；MES0.5g；MgCl26H201.6g；酪蛋白水解物IOOmg；脯氨酸0.69g；蔗糖:20g；瓊脂2g，pH5.8)中預先浸泡玉米穗，且搖動在塗料混合器中進行。在這項實驗中，從穗的210個胚中充分分離出109個。在這些情況下，來自玉米穗周圍的液體運動的非射流流體力導致胚的充分分離；流體力可以包括流體湍流、流體層流、流體流的剪切力、負流體壓力(例如，導致氣蝕)或其組合。作用力還可以包括通過聲學技術產生的力，如在氣相或液相中的一種或多種聲波(脈衝或連續)產生的力。前述實施例(包括實施例9-11)描述了流體射流用於從不成熟的穗除去胚。在這些程序中，觀察到流體射流一般還導致至少部分胚乳從玉米粒釋放。觀察到胚乳組織比胚更柔軟、易碎，而且往往不同程度地碎裂(與胚相反，胚往往保持完整)。有可能胚乳在暴露於流體射流產生的剪切力時碎裂。據信這種剪切力是不均勻，導致觀察到的碎裂程度的差異，然而，大部分充分碎裂的胚乳材料通過包幹酪布，留下由胚的半純製品組成的滯留物。當將普通的實驗室噴瓶產生的低壓射流對準包幹酪布滯留物時，更多的殘留胚乳組織進一步碎裂，並被衝洗通過包幹酪布，留下相對更純的胚製品。因此，可以合理地預測，如果滯留物均勻地暴露於適當強度的剪切力，全部或絕大部分殘留的胚乳都應該碎裂並通過包幹酪布。這樣的剪切力可以由任何適當的工具產生，例如但不限於單射流、多射流、片狀或簾狀射流、快速移動的射流和胚乳的加速或減速。此外，如果將用於最初釋放玉米粒內容物的射流設計為在排出過程中接觸較大比例的待剪切的胚乳，那麼可以獲得最初的較高純度的胚製品。應用剪切力以進一步純化胚的非限制性的實施方式如下。一旦胚和部分碎裂的胚乳從穗軸釋放，其餘的胚乳可以由均勻且同時衝擊胚乳的流體流快速粉碎，例如，來自噴嘴的流體流。噴嘴的一種合適的類型是全錐形噴嘴。全錐形噴嘴產生完全充滿液滴的射流模式。噴嘴內的內部葉片在液體離開孔之前賦予液體可控的湍流，使形成該噴霧模式。可商購的噴嘴具有圓形、方形或橢圓形的噴霧模式。適合的全錐形噴嘴的例子已知為「UniJet噴嘴，標準噴嘴，小容量」(SprayingSystemsCo.,Wheaton,IL；partnumberTG-SSO.3)。實施例13使用組合力的設備本實施例描述本發明的方法的一些另外的實施方式，其使用組合力以從種子充分分離多個胚。圖5說明使用較大的流體射流(如實施例10所述)的設備。該設備包括產生如較大的流體射流(例如扁平流體射流)的流體流的噴嘴，和任選地包括吸入頭或施加負流體壓力(例如，通過真空或抽吸)的組件，以用於驅出胚和/或收集脫落的胚。圖5A(上)描述了這種設備的實施例的橫截面圖，顯示了噴嘴、任選的吸入頭和玉米穗如何相對於彼此定位。玉米穗、噴嘴和任選的吸入頭可以相對於彼此移動；例如，玉米穗可以是固定的，而噴嘴和任選的吸入頭移動，或噴嘴和吸入頭可以是固定的，而玉米穗移動。圖第5B(下)示意性地描述定位於設備中的玉米穗，且顯示噴射定位以產生扁平流體射流，其中射流衝擊成排的多個玉米粒。圖6描述合適的吸入頭或施加負流體壓力(例如，通過真空或抽吸)的組件的實施方式，例如，其任選地用於圖5的設備中，且其也可以單獨使用以充分分離胚。吸入頭可以包括應用負流體壓力的一個或多個孔。吸入頭還可以包括分配流體(如氣體或液體，例如水或培養基)的裝置，例如，吸入頭中的多個孔。為用於玉米，吸入頭優選成形為遵循典型的玉米穗的輪廓，且優選能夠從多個玉米粒或多排玉米粒捕獲胚。可以預見，吸入頭可以由剛性材料(如不鏽鋼或其它金屬)製造，或由柔性材料製造以允許吸入頭更容易地配合玉米穗的輪廓，或由其組合製造。可以通過機械正壓(例如，由吸入頭的前緣施加)、負流體壓力(例如，吸入或真空)和流體力(例如但不限於，從玉米粒的內部捕獲材料的流體射流、流體湍流和流體層流的正壓)的任何組合充分分離胚。用於應用充分分離胚的力的設備，例如，如實施例1、3、4、6、7、9、10和本實施例(包括但不限於圖5和6所示的設備)中所述，可以相對於玉米穗移動。穗可以是固定的，或者設備可以是固定的，或兩者都可以移動。由於玉米種子通常以平行於玉米穗的縱軸排列的相對均勻的排的形式出現，設備通常移動(相對於穗)以使得設備平行於玉米穗的縱軸並沿一排或多排的玉米粒運行。不過，這種設備相對於穗的運動可以沿穗的圓周，或可以是隨機的，或可以是合適的運動的任何組合。圖7A至7C描述使用力的組合以從種子(在本實施例是玉米)充分分離多個胚的裝置的實施方式的不同視圖。該裝置包括具有能夠向之前已打開或截斷果皮的玉米粒的基部施加預定量的機械壓力的前緣的頭部，以使得以類似於實施例1、3和4所述的方式從玉米粒壓出胚。該裝置進一步包括用於施加驅出胚和/或收集脫落的胚的負流體壓力(例如，通過真空或抽吸)的部件。壓出的胚(和伴隨的非胚組織)因而與玉米穗分離，且可以通過施加負流體壓力來收集。如果需要，收集的胚和非胚組織可以進一步通過適當的方法分離，如通過大小分離、疏水性分離或差速離心。這種裝置的變化可以包括用於分配流體(如液體，例如水或培養基)的工具，例如，在吸入頭中的多個孔。如圖5、6和7所示的胚提取裝置是示例性的實施例而非限制性的。這些及其它這樣的設備可以包括其它組件，例如，用於將胚與非胚組織或在充分分離的過程中使用的流體分離的裝置。實施例14生存力數據通過使用本發明的方法和設備提供的多個單子葉植物胚最優選是適於遺傳轉化或組織培養應用(如植物的轉化和再生)的胚。本實施例進一步說明本發明方法在提供多種可生存且適於遺傳轉化或組織培養的單子葉植物胚方面的用途。在本實施例中，通過不同的切除方法獲得的不成熟玉米胚的質量在它們對於根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)轉化的反應方面進行比較。使用玉米轉化的領域已知的標準方法(例如，Cai等人，美國專利申請公開2004/0244075)轉化使用這種裝置和方法切除的玉米胚。進行了四個實驗(分別指定為A、B、C和D)。各個實驗胚比較通過手工切除獲得的胚和通過本發明的方法獲得的胚通過液體射流切除(實驗A、B和D)或通過氣體射流切除(實驗C)。實驗A和B中的液體射流使用普通自來水和由吸量管尖端製成的噴嘴。實驗C測試使用來自壓縮空氣泵的空氣的氣體射流和由吸量管尖端製成的噴嘴。實驗D中的液體射流使用1/2強度MSPL培養基(參見Cai等人的美國專利申請公開2004/0244075的表1)作為液體和具有0.020英寸等效孔徑的固體流噴嘴(目錄編號TP000050，AgriculturalDivisionofSprayingSystemsCo.,Wheaton,IL)。授粉後12天收穫玉米穗，並通過在80%乙醇的1升瓶中浸泡3分鐘滅菌。通過用手術刀切斷玉米粒的三分之一頂部並使用窄鏟從玉米粒除去胚來手動切除胚。將收集的胚切入單個微量離心(Eppendorf)管中的1毫升1/2MSPL培養基中。除去培養基，並用1毫升如下所述製備的根瘤土壤桿菌取代。也按照類似於實施例10和11所述的程序使用流體(液體或氣體)射流充分分離胚。流體射流用於在用手術刀除去玉米粒的三分之一頂部後切除在穗上剩餘的胚。穗定位以使得流體射流瞄準相繼的切割玉米粒，以驅出胚和非胚組織(胚乳)。將從穗中除去的玉米粒內容物通過粗篩，以除去大塊的胚乳，並在滅菌包幹酪布上收集胚。使用小鏟將胚從包幹酪布轉移到含有1毫升1/2MSPL培養基的微量離心管中。在收集所有的胚之後，除去1/2MSPL培養基，並由1毫升根瘤土壤桿菌接種液取代。由不同切除方法製備的胚進行同樣的接種、選擇和再生程序。對於使用草甘膦選擇和GFP作為報導分子進行植物轉化的合適的程序(包括培養基和試劑的描述)已在Cai等人的美國專利申請公開2004/0244075中披露。用1.0毫升的根瘤土壤桿菌接種胚5分鐘。將微量離心管的內容物傾倒在共培養培養基平板上，用吸量管除去過量的土壤桿菌，並在23攝氏度共培養內容物18小時。將胚轉移到誘導MS培養基上，並在30攝氏度培養13天。再生前，在27攝氏度培養來自轉化的愈傷組織11天。此時，使用螢光顯微鏡對GFP陽性的部分計數。為了進行再生，將來自各胚的愈傷組織單獨轉移到MS/6BA培養基中，並光照室中培養7天，之後，將各個發綠愈傷組織轉移到MSOD培養基中，並送回到光照室中培養另外的17天。將產生的嫩芽(shoot)轉移到含有Phytagel的再生培養基(由在水中製成1升的2.165gMS基礎鹽、5毫升100XMS維生素和20g蔗糖組成，並高壓滅菌，用KOH調節pH至5.8，通過與3gPhytagel一起高壓滅菌固化，並加入0.75毫升的1毫克/毫升的吲哚-3丁酸、0.51毫升的1毫克/毫升的1-萘乙酸和0.2毫升的0.5摩爾草甘膦)中。大約3周後，通過將生根的枝移栽到含有土壤混合物的泥炭盆中使轉基因植物轉移到露天並在攝氏26度生長。表3總結這些實驗的結果。由GFP陽性胚的數量估計可轉化的胚的數量。表3.切除的胚的生存力和轉化頻率tableseeoriginaldocumentpage31n/a:沒有數據。給出作為由接種的胚再生的GFP陽性植物的百分比的總轉化和再生頻率。這些結果表明，本發明的各種方法和設備可用於提供多種適於遺傳轉化或組織培養的多個單子葉植物胚。實施例15.用於切除玉米胚的液體培養基的開發流體射流裝置需要大約為20L液體用於從一個穗切除胚，因此需要開發易於製備的切除培養基其製備簡單(即，只包含一種或兩種成分)，優選可通過在線過濾裝置過濾滅菌，可以在優選的40-60psi操作壓力下流過流體射流裝置，而且不需要在使用前調整PH0這種培養基及其製備會降低成本，減少培養基的製備時間，並允許自動化。本實施例提供了一些這樣的培養基。培養基，如Lynx1013(接種培養基)和Lynx1902(半強度Lynx1013)已成功地用於使用流體射流裝置切除用於轉化的玉米胚。Lynx1013包含(每升)MS基礎鹽(Phytotech；PhytoTechnologyLaboratories,ShawneeMission,KS):2·165g；MS維生素(100X；Phytotech)10毫升；葡萄糖(Phytotech):36g；蔗糖(Phytotech)68.5g；脯氨酸(Fisher):0.115g。用KOH調節該培養基至pH5.4，然後過濾滅菌。儘管這些培養基運作良好，它們含有許多成分，其中一些必須過濾滅菌。這些培養基還需要在使用前調整PH。測試了一些其它的液體培養基(表4)用於從玉米穗切除可轉化的玉米胚。然後根據說明書中其它地方所述的方法，切除的胚用於轉化，並確定各測試的切除培養基的轉化頻率(TF)。TF定義為再生成為植物的獨特轉化事件的數目除以用土壤桿菌接種的胚的數目。所有測試的培養基(包括水)能夠產生可轉化的玉米胚(見表4)。然而，包含甘露醇的培養基產生與對照培養基Lynx1902相當的TF。甘露醇培養基是只有兩種成分(甘露醇和水)的簡單培養基，不需要在使用前調整PH，且可以過濾滅菌，從而使之更具成本效益且使用方便..培養基中的甘露醇濃度是大約0.05M至大約0.5M。優選地，培養基中的甘露醇濃度是大約0.IM0最優選，培養基中的甘露醇濃度是大約0.2M。但是，用於切除培養基的甘露醇的合適的濃度可以由植物組織培養領域的技術人員通過簡單地改變甘露醇濃度來確定。在表4可以發現選定的培養基的代表性的滲透勢測量值。使用Wecor5100C蒸汽壓滲透儀(Wecor，Logan，UT，USA)讀數，使用100、290和1000m0sm/k的標準溶液校準。具有大約OmOsm/kg到500m0sm/kg的滲透勢(即重量摩爾濃度)的培養基適於切除用於組織培養的玉米胚，包括例如大約7m0sm/kg至大約300m0sm/kg。例如，0.2M的甘露醇水溶液具有222-230m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度，而0.05%MES的水溶液具有大約7m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。這種滲透勢範圍優選通過添加一種或兩種化合物以製備培養基，如Lynx培養基#1937、#1932和#1162而獲得。優選地，這些化合物對於切除的胚的組織培養性和可轉化性沒有明顯的不利影響。表4.用於分離胚的示例性溶液的滲透勢測量值tableseeoriginaldocumentpage32tableseeoriginaldocumentpage33n/a=沒有進行實施例16用於流體射流切除的培養基製備系統的構建本實施例描述用於流體射流裝置的培養基製備系統(MPS)。測試的流體射流裝置需要大約20升培養基，這需要時間和勞動來製造和使用。本發明的MPS可以快速製備大量培養基。它也允許製備用於特定大小的玉米穗的指定體積的培養基。MPS包括混合室(MC)和MPS外殼(MPSH)。MC設計為使得能夠容易地與MPSH脫離而便於高壓滅菌。MC和MPSH都可以由任何合適的材料製成。優選地，它們由如鋼或鋁的材料製成。如圖11和12所示，MC包括具有上端和下端的槽、附著到槽的上端的凸緣和覆蓋上端和密封混合室的蓋板。優選地，槽通過凸緣提供的0形環用蓋板密封。蓋板優選由7075航空器級、耐腐蝕鋁製成，以減輕混合室的重量。在一種實施方式中，槽在低端具有3個銷，各如圖12所示在三個側面上，用於槽在混合室支撐板上定向和定位。在工作位置中，如圖12和14所示，三個銷與在支撐板上提供的定位支架嚙合。也在槽底(前側)提供定位板(圖12，13)，用於保持槽在混合室支撐板上的工作位置中。優選地，定位板具有用於安裝攜帶具有手柄的定位臂的快速連接器的1/4」NPT螺紋(圖14)，以在支撐板上固定混合室(例如，圖13)。蓋板具有用於插入引進用於製備培養基的液體(如水，)的管的開口、用於插入引出製備的培養基並與流體射流裝置連接的管的開口、用於插入添加培養基成分到混合室中的管(優選是不鏽鋼製成)的開口(例如圖12)。在工作位置中，單獨的0型環密封各種管和開口。蓋板還具有用於插入包含用於感應需要製備的特定體積培養基的超聲波傳感器的外殼的開口。優選地，在蓋板的一側提供用於超聲波傳感器外殼的開口。在工作位置中，混合室蓋板上提供的各種開口連接到外殼的上平臺的下表面提供的相應的管上(圖11)。這些管子優選由鋼製成。各種開口連接混合室，如圖11所示，例如通過連接管。管道系統優選由聚碳酸酯製成。培養基混合組件連接到蓋板下端，使得組件懸掛在優選槽的中心。組件包括兩刃摺疊葉輪、由蓋板中的0形環密封的不鏽鋼軸杆、適於在高壓滅菌過程中出現的高溫下(如400°F以上)運轉的高溫滾珠軸承和用於在MPSH中結合具有電動機的組件的輻式連接器(spidercoupler)(圖16)。滾珠螺母安裝塊安裝在混合室支撐板的下側，並可連接在外殼下平臺的上表面提供的滾珠軸承中安裝的滾珠螺杆。支撐板也可通過四個輪滑動連接如圖15所示的MPS外殼的4個腿。輪沿4個腿的t形狹槽滾動，以便於混合室在MPSH下平臺的下表面提供的步進電動機打開時上下移動。高壓滅菌後，混合室通過三個銷和定位板定位在支撐板上。將具有手柄的定位臂插入快速連接器。推下臂並在手柄的幫助下順時針轉90度，以定位和固定混合室在支撐板上。定位臂連接凸輪，和安裝在焊接到支撐板的彈簧上。彈簧推動臂和凸輪向上。當放置於合適的位置時，混合室的後銷推動電開關，它向可編程序邏輯控制器(PLC)發出信號。該信號通知PLC混合室定位於混合室支撐板上。外殼的下平臺上提供的步進電動機然後向推動混合室，其中，在工作位置中，混合室的蓋板上提供的各種開口在外殼的上平臺處與外殼的上平臺的下表面提供的相應的管連接(圖16)。在收到操作者的信號後，PLC打開連接水系統的電磁閥以用水填充混合室。超聲波傳感器監測混合室中的水位。當水位達到混合室中的指定水平時，PLC關閉水電磁閥，並等待來自操作員的表明切除培養基的成分在混合室中的信號。當PLC收到該信號時，它開動在MPSH的上平臺上表面上提供並可操作地連接到混合器組件的電動機。因此，混合器組件開始混合培養基。一旦培養基預備好，根據PLC程序使用齒輪泵通過培養基出口管向流體射流裝置泵送培養基。在一種實施方式中，連接到流體射流裝置的製備培養基出口/供應裝置具有在培養基用於切除胚的流體射流裝置中之前對培養基滅菌在線過濾單元如0.2微米的ifeFiberFloΦ2S^ii(MinntechFiltrationTechnologiesGroup,Minneapolis,MN)。實施例17通過相切除分離胚本實施例描述用於從玉米穗上的玉米粒製備多個適於組織培養的多個玉米胚的裝置，包括至少一個用於在第一時間點引導用於從玉米粒充分提取胚乳的第一流體流和在第二時間點引導用於從玉米粒充分提取胚的第二流體流的孔，所述提取的胚適於組織培養。該裝置進一步包括用於相對於第一和第二流體流移動至少一個玉米穗的裝置。用於相對於第一和第二流體流移動至少一個玉米穗的裝置相對地旋轉至少一個玉米穗和至少一個孔。用於相對於第一和第二流體流移動至少一個玉米穗的裝置沿至少一個玉米穗的縱軸移動流體流。在裝置的這個特定的實施方式中，各流體流是液體流。例如，液體流可以基本上由甘露醇和水組成，甘露醇濃度為大約ο.05M至大約0.5M。或者流體流可以是氣體流。該裝置可以進一步包括用於檢測切除的胚乳和胚的工具。該裝置也可進一步包括用於引導切除的胚乳或胚的工具，以使得胚與胚乳分離。該裝置進一步包括電氣連接用於檢測切除的胚乳和胚的工具和用於引導切除的胚乳和胚的工具的裝置以實現自動化。該裝置可以進一步包括至少一個用於從非胚組織分離胚的分離器，其中，分離的胚包括適於組織培養的玉米胚。分離器可以包括尺寸排阻設備。另外，分離器可以通過差別的疏水性或密度差從非胚組織分離胚。本實施例還描述提供適於組織培養的單子葉植物胚的方法，包括(a)提供在種子果皮中具有開口的含有胚的單子葉植物種子；和(b)在第一時間點施加第一作用力以用於從種子充分提取胚乳，並在第二時間點施加第二作用力以用於從種子充分提取胚，所述提取的胚適於組織培養。作用力包括一個或多個選自流體射流正壓、液體射流正壓、機械正壓、負壓、離心力、線性加速、線性減速、流體剪切力、流體湍流和流體層流的力。該方法進一步包括通過選自尺寸排阻、疏水性分離和密度差分離的方法從非胚組織分離胚。單子葉植物種子在至少一個穗上提供。單子葉植物可以禾本科，如玉米種(如玉米)。組織培養的步驟可以包括一個或多個轉化和再生的步驟，產生至少一個可繁殖的轉化植物。如圖17所示，裝置具有用於產生扁平層流(6)的扁平射流噴嘴(1)、兩個由可編程序邏輯控制器(PLC)控制的步進電動機和數字齒輪泵。步進電動機旋轉穗(2)，使得其中已除去冠以利於切除的玉米粒安置在密封室(3)中的軸上，且第二電動機沿軸輸送穗以使得流作用於各個玉米粒上基本上相同的時間。數字式齒輪泵按照PLC速度和壓力迫使液體培養基通過噴嘴。噴嘴(1)產生大約0.003「寬和大約1」高的液體流。一般來說，流的寬度小於玉米粒的寬度。在30-75PSI的測試壓力範圍中，層流在距離噴嘴(1)達2.5-3」處是穩定的，且不會在到達穗之前散開。穗(2)可以定位於離開噴嘴(1)13/4」-2」處，使得液體流以基本上同樣的力作用於成排的各個玉米粒。可以通過改變噴嘴中的液體的壓力、通過調整穗和噴嘴的距離和噴嘴板之間的空隙以及其它參數(如液體流進入玉米粒的入角和穗旋轉的速度)控制力的大小和持續時間。在第一階段中，根據PLC的程序，PLC為了通過胚乳收集閥門(5)打開通道(4)，並通過向數字齒輪泵發送控制信號設置通過噴嘴(1)的壓力和流速，並通過兩個步進電動機旋轉和推進穗(2)。PLC控制的液體流(6)首先衝洗出玉米粒(7)的胚乳(8)，留下附著於玉米粒(7)的胚(9)。可以根據胚乳大小、在玉米粒冠中的切割程度及穗和玉米粒的大小差異以及其它參數調整衝洗出胚乳所需的時間和力量。和通道(4)中收集的液體培養基和胚乳的混合物可以通過過濾系統泵送。過濾後，液體培養基可以在切除過程重複使用。在第二階段中，根據PLC程序，PLC通過胚乳收集閥門(5)關閉通道⑷並打開通道(10)，設置通過噴嘴(1)的壓力和流速，並旋轉和推進穗。液體流(6)從玉米粒(7)衝洗出胚(9)和剩餘的胚乳(8)。如果需要，可以使用其它地方描述的分離器進行進一步的胚分離。可以根據胚大小、在玉米粒冠中的切割程度及穗和玉米粒的大小差異以及其它參數調整衝洗出胚所需的時間和力量。通道(10)中收集的液體培養基和胚的混合物送到分離設備(如實施例18)，以將胚與碎片和液體分離，且液體可以通過過濾系統泵送，以在切除過程重複使用。室(3)可以任選地隨意具有發射器(11)和通過用於在切除後檢測排出的液體培養基中的胚的通過光束傳感器(throughbeamsensor)(12)0在第一階段中，確認排出培養基中胚出現的信號指示PLC完成第一階段。在第二階段中，確認排出培養基中胚消失的信號提示PLC完成第二階段，並可進一步指示PLC關閉裝置。使用玉米轉化的領域已知的標準方法(例如Cai等人，美國專利申請公開2004/0244075)轉化使用這種裝置和方法切除的玉米胚。對於切除胚，所有處理使用Lynx#1986(0.2M甘露醇，未滅菌)。代表性的轉化頻率(TF)列於表5中，表明通過該裝置和方法產生的胚是可轉化的，並獲得轉基因植物。表5.通過階段流體射流裝置和方法切除的玉米胚的轉化tableseeoriginaldocumentpage36「FJ(流體射流)階段w/胚乳」指收集後與胚乳一起接種並留在同一培養板中(胚和胚乳一起)的胚。「FJ階段w/o胚乳」指收集後轉移到新的培養板的胚，而不帶胚乳。實施例18胚分離程序本實施例描述用於從通過流體射流切除程序產生的混合物分離胚的浮選程序。本文描述有效分離的參數。在這個過程中，氣泡在流體中產生，並附著到流體中存在的切除玉米胚上。氣泡浮到表面(即流體-空氣界面)，使胚被優先收集，並留下胚乳物質和其它碎片。為了減少每單位體積的氣泡數量並產生更均勻的氣泡場以使得產生更小的剪切力，構建了包含多個氣泡點源的裝置。通過將各個椴木碎片插入一段矽膠管(MasterflexSiliconetubingC-96400-16，Cole-Parmer)的預衝壓孔中構建該裝置。將椴木碎片插入矽膠管後，管的一端塞入不鏽鋼軸承。然後，將管盤繞為螺旋，並如圖18所示用金屬絲固定。螺旋形椴木空氣分散裝置與使用PEG作為表面活性劑結合已經表明如圖19所示從幾乎全部胚乳純化了95%的胚。圖20說明通過使用螺旋形椴木空氣分散裝置和PEG的氣泡浮選從胚部分分離的胚乳的量。可以構建或從例如水族館供應商購買其它椴木基氣泡器。在圖20左側的培養皿顯示，當沒有使用浮選程序時，大量胚乳與胚混合。相比之下，右側的培養皿顯示當使用本發明的浮選程序時，與胚共分餾(co-fractionating)的胚乳的量減少。氣泡也可以由具有各種孔徑的陶瓷材料製成。為了從產生它們的源材料脫離氣泡，需要源材料在極性度方面(即疏水性)具有與泡沫相反的性質。由於氣泡是共價性質的，它們將傾向於容易地與極性材料分離。相反，從共價性質的表面(像多孔塑料起泡裝置)產生的氣泡往往會附著到該表面，並聚並和在分離前生長到較大的尺寸。在這方面，Chemglass起泡裝置、椴木陶瓷都是理想的選擇。椴木的表面由纖維素、半纖維素和木質素組成，它們是極性的，因此是親水性的，燒結玻璃起泡裝置和陶瓷材料也是這樣的。在一個例子中，一旦胚由氣泡攜帶到表面並沉積在泡沫中，通過撇去泡沫收穫它們，然後衝去泡沫。在另一項實驗中，真空過濾裝置(如圖21)用於從泡沫表面收穫胚。在一項實驗中，使用流體射流(FJ)裝置從供體穗切除胚和胚乳，並用包幹酪布(CC)收集。然後將胚和胚乳的混合物置於填充Lynx1013和20μ1的20%PPG(聚丙二醇單丁醚-平均分子量340；AldrichCat.No.438103；SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO)的量筒中，並由潛水泵(起泡器)泵送通過燒結的細孔玻璃分散管(Chemglass)的空氣產生泡沫。如上所述收集分離的胚，基本沒有胚乳材料和其它碎片。通過使用如上所述的玉米轉化領域已知的標準方法，分離的胚用於玉米的土壤桿菌介導轉化。轉化頻率如表6所示。表6.通過使用由PPG穩定的氣泡浮選分離的玉米胚的轉化tableseeoriginaldocumentpage37在另一項實驗中，基於椴木的起泡器用於從由流體射流裝置切除的胚乳分離胚。一般來說，將基於椴木的起泡器放置在滅菌層流淨化罩中的燒杯中。起泡器的管在一端連接空氣過濾器。空氣過濾器的另一端是連接到潛水泵。然後將分離培養基(具有20μ1的20%PEG(平均分子量8000，SigmaNo.P21390)的0.2M甘露醇)加到起泡器上的燒杯中。從流體射流裝置收集胚和胚乳，並轉移到燒杯中。空氣通過起泡器產生氣泡。將漂浮的胚轉移到小培養皿中，並使用如上所述的玉米轉化領域已知的標準方法進行轉化。轉化頻率如表7所示。表7.通過使用由PEG穩定的氣泡浮選分離的玉米胚的轉化tableseeoriginaldocumentpage38實施例19通過浮選分離胚的裝置圖22顯示用於通過浮選分離胚的裝置，包括浮選柱(E)，浮選柱(E)連接位於柱的上端的用於加入胚、胚乳和其它碎片的混合物的入口管(A)，位於柱的下端的用於產生提升胚的氣泡的空氣擴散管(G)和也位於柱的下端用於調節液位和用於從柱的底部除去碎片的出口管(H)。柱的底部優選傾斜，以促進除去不漂浮的碎片。浮選柱還具有用於收集含有胚的泡沫的溢流槽(C)。空氣擴散管還具有閥(F)，以防止柱液體回流進入空氣擴散管。為操作該裝置，浮選柱填充與隨後的胚轉化和組織培養相容的液體培養基，直到液面達到溢出管(D)。溢出管具有頂部對空氣開放的抗虹吸管(B)。向液體培養基中加入表面活性劑以防止氣泡過早聚並，並穩定泡沫以附著胚、將胚提高到浮選柱的頂部。裝置的操作中的下一步是打開向空氣擴散管的空氣供應。擴散管中的小孔足夠小以產生足夠緩慢地上升的氣泡，以至於它們與胚的疏水表面接觸時間足夠長而使氣泡附著於胚。接下來，由流體射流裝置產生的包含所需濃度的表面活性劑(如百萬分二十的濃度的PEG)的胚、胚乳和碎片的混合物被送入入口管。由於漿液進入浮選柱，懸浮微粒遇到來自空氣擴散設備的氣泡柱。氣泡首先附著在胚上，且優先提高胚到浮選柱的表面，它們在此處成為泡沫的一部分。隨著泡沫累積，它通過出口槽(C)離開浮選柱。在操作過程中，浮選柱可以以小角度偏離垂直而朝向開口槽傾斜，使得上升的氣泡集中在柱的後壁處，並傾向於推動泡沫向前並推出到出口槽外。另外，以朝向出口槽的向上角度傾斜的蓋可以引導泡沫到出口槽。不漂浮的富含胚乳的碎片下降到浮選柱底部，並在傾斜底部的低點積累。當在操作開始時胚和胚乳碎片的漿液最初送入進料漏鬥時，這些碎片在柱的自動液位調整過程中被轉移出柱，或可能在浮選柱操作結束時除去。在另一種實施方式中，浮選槽中的液位保持與出口槽的水平一致，且上升到表面的泡沫不斷掃入槽中。通過使更多的氣泡上升到浮選槽中遠離出口槽的一側有助於這一作用，以便產生在遠離出口槽的一側升起而在出口槽的同一側沉下的循環。在另一種實施方式中，可以保持浮選槽中的液位低於出口槽的水平，直至積累足量的泡沫和胚，然後提高液位以使泡沫和胚溢流到出口槽中。實施例20通過浮選分離胚的替代裝置本實施例描述設計為通過使用氣泡和表面活性劑的浮選程序用於從玉米胚乳分離玉米胚的裝置的另一種實施方式。該裝置可以與胚切除的裝置，如本申請的其它地方描述的流體射流裝置一起使用。在這一裝置中(圖23)，胚和胚乳流入提供有用於產生氣泡的裝置的室中。氣泡可以通過強制空氣通過起泡裝置產生。優選氣泡大小(直徑)為大約ΙΟΟμπι至500μπι。也可以加入濃度為大約1至大約lOOppm、例如20ppm的氣泡穩定劑，如聚乙二醇(PEG)。胚優先通過疏水相互作用附著到氣泡上，且泡沫將附著的胚提升到室的表面。PEG的加入使氣泡能夠攜帶它們的胚「負載」到表面。PEG也有助於在表面的頂部產生泡沫層，且胚在泡沫層的頂部收集，它們在泡沫層的頂部被攜帶進入溢流出口。機動化的除沫器裝置可用於進一步幫助含有胚的泡沫流入出口，在那裡它們通過成像位置或用於計算胚的數量的計數裝置並按需要收集在容器中。可以提供可操作地與成像位置或計數裝置連接的開關臂以分配所需數量的胚進入不同的容器。這些容器可以連接到真空歧管裝置以除去液體而留下進一步使用的胚。該裝置還提供了用於將液體引入和引出室的工具。室中的液位可以通過液位調節裝置控制。非選擇性地附著到氣泡上的胚乳和其它碎片可以通過在容器的底部提取液體的裝置(如廢物流出管)丟棄。用於切除胚的同種液體培養基可以用於填充用於分離胚的室。從該裝置流出的培養基可以再循環用於切除和分離過程中。實施例21用於切除和分離用於組織培養的玉米胚的組合設備本實施例說明組合設備或集成設備，包括如圖24-25所示的胚提取器和如圖26所示的胚分離器。優選地，胚提取器與分離器連通。但是，胚提取器或分離器可以單獨操作，且胚提取器的輸出可以是胚分離器的輸入。參考頂視24，胚提取器具有至少一個用於從各穗軸(B)提取胚的流體噴射口(C)0多個流體射流可以指向單個穗軸。通過在穗軸一端的彈簧加載的固定器(A)和在另一端的由皮帶機構(E)驅動的動力固定器(D)將圖24中的各穗軸保持定位。裝置的側視圖如圖25所示。通常情況下，穗軸上的玉米粒的冠已部分或全部除去以利於胚提取。任何液體培養基可用於產生例如如實施例15所述的射流(C)。因為胚開始與水接觸和浸泡在浮選槽中的培養液中這二者之間的時間很短，無菌水可用於切除。過濾器可以用來對水滅菌。或者，液體培養基包括甘露醇或其它如上所述的具有合適的滲透強度的溶質。如圖26所示，在從玉米粒提取胚之後，胚和碎片任選地落在或加到包括連接到浮選室的雙篩輸送帶系統的胚分離器上。雙篩輸送帶具有捕捉粗材料的移動的粗篩(A)，但允許胚和其它細小的材料通過到達保留胚和類似大小的材料的細篩(H)，但細篩允許非常細的材料和液體通過到達廢液槽(W)。在粗篩上收集的材料在粗篩洗槽(F)中清洗鬆散，由液流幫助洗到廢液槽(W)中，並通過粗篩洗槽溢流(E)和洗槽排水管(G)流出排水管。在細篩(H)上收集的材料在新鮮培養基的幫助下在優選具有發泡劑通過入口(M)的細篩洗槽(N)中清洗鬆散。如果胚沒有從細篩(H)驅動進入細篩洗槽(N)，可以使用攪拌。例如，細篩捕捉的胚被驅動進入浮選培養基中，由於它們通過輥(K)周圍且也受通過(M)添加的組成培養基的衝擊。調節新鮮培養基和起泡劑的輸送以使得在浮選室中積聚的碎片通過液位調節進口⑶和出口管(V)連續地除去。非編織的模製熱塑性塑料網可以優選在該裝置中使用，因為它們不會散開。可以獲得具有各種篩網(股線)厚度、股線寬度和網開口大小的這種網(如McMaster-Carr，Atlanta,GA)0也優選聚丙烯製成的網，因為它們可以高壓滅菌。可以由操作者憑經驗根據弓丨入分離器的胚和碎片的預期大小選擇精確的網尺寸。參考圖26，粗篩㈧和細篩(H)可以由輥支持。優選地，粗篩(A)由動力輥(B)、從動輥(C)和洗輥⑶支撐。細篩(H)可以由動力輥(I)、從動輥(J)、洗輥(KD)和提升輥(L)支撐。輥可以是直圓柱，或非直圓柱，優選凹圓柱，因為它們允許使用通常比平帶具有較少的沿其邊緣的產品損失的槽(troughed)帶。槽帶可以允許更高的帶速和斜度。一個或多個輥可能是裝有動力的，例如輥(B)，並且可以使其表面帶有織紋以更牢固地抓住篩網。可能只需要直接動力驅動一個輥，而使其它輥，例如輥(C)，通過皮帶或齒輪從第一個輥獲得動力。可能需要在粗篩和細篩下的側面和中心支架或引導裝置以防止液體沿著篩邊緣的流掛和損失。附加的支持輥可能也是需要的。細篩(H)上收集的材料在細篩洗槽(N)中驅出後，它越過氣泡偏轉器(0)落下並進入浮選室(P)，在其中它遇到由例如空氣分散管(T)產生的上升氣泡(S)。在這一點上，氣泡優先附著到胚的疏水性表面，從而攜帶它們到達表面，在那裡它們沉積在通過浮選室側開口(Q)和胚輸送(泡沫)槽(R)的泡沫中。如果在浮選室(P)中下降的胚沒有充分接觸氣泡，可以在室(P)的下部提供混合設備如磁力攪拌器，以改善接觸。通過從入口(M)輸入新鮮培養基和發泡劑和通過包括入U口管和出口管(V)的液面調節系統(例如圖27)調節浮選室中的液位，其中，過量的液體連同碎片進入管U並排出管(V)。U形管連接(U)和(V)以使得管中的最高水平達到液體需要保持的水平。U形管的頂部也提供了抗虹吸開口。可以設想其它液面調節裝置，如那些基於浮標的、基於光學裝置的、基於電導率的和基於電的裝置，來調節該設備中的液體水平。實施例22用於從種子和果實分離可轉化組織的裝置本發明的組成、方法和裝置可以用來分離可轉化的組織，例如，來自其它單子葉和雙子植物(包括但不限於，玉米、小麥、大麥、大豆、向日葵、棉花、油菜、胡椒、西紅柿、樹莓和草莓等)的種子和果實的胚。本發明提供了合適的保持器，例如，具有適於保持各種形狀和大小的種子或果實的孔和/或狹槽的薄片(例如圖28)。保持器可以由合適的材料如塑料或金屬製成。保持器可以是平板或捲成如圖29所示的圓筒，且可以懸置在氣相(如空氣)或液相中，或可以部分懸置在氣相和液相中。可以通過合適的力(如機械力和/或吸力)保持種子和果實在保持器上。保持器可以相對於流體力(如實施例15所述的培養基液體流)固定，或可相對於流體力移動。在圖30所示的另一實施方式中，在圓筒的一端插入壓力凸輪或螺杆例如鑽頭以在種子和果實上施加壓力以進一步促進胚分離。可以通過本說明書的其它地方描述的一些方法將分離的胚與碎片分離。在本發明的另一種實施方式中，可以在容器中離心薄片或圓筒以在保留的種子或果實施力，從而分離胚。可以如實施例18-20所述將胚與其它組織分離，並用於轉化和再生各種植物物種。例如，使用美國專利7，002，058描述的方法可以轉化大豆胚。其它植物的轉化方法是本領域已知的。實施例23用於分離棉花和大豆胚的方法本實施例說明本發明從種子組織分離棉花和大豆胚的組合物、方法和裝置的用途，從而表明更廣泛的實用性。通過2008年3月10日提交的美國專利申請12/045，502和美國專利申請公開20050005321所描述的方法和裝置破碎棉花和大豆種子，並使用如圖31所顯示的裝置將它們加入到具有用於分離棉花胚的0.0012%PEG8000和用於分離大豆胚的大約0.003%PEG8000的0.2M甘露醇溶液中。例如，如實施18例所述產生氣泡。如圖32-33所示，發現大部分棉花胚軸與氣泡聚積在一起。使用美國專利申請12/045，502中所描述的方法製備用於轉化的棉花胚。在大豆的情況下，發現破碎的胚(胚軸和子葉)在容器底部，而大部分種皮隨氣泡上浮到頂部。然後通過密度差異方法進一步分離胚軸和子葉。例如，在20%蔗糖的6.5%水溶性聚蔗糖(Ficoll)溶液中，胚軸上升到表面而子葉沉入容器底部。可以使用美國專利7，002,058所描述的方法轉化大豆胚。實施例24用於提高轉化頻率的共培養培養基的開發在一些實驗中，在利用通過流體射流方法製備和通過浮選法分離的胚的玉米轉化過程中使用共培養培養基1233(美國專利申請公開2004/00244075)導致轉化頻率(TF)的較低。為了保持或提高轉化頻率，測試了稱為「1898」的新的共培養培養基，並意外地發現TF提高。進行了幾組實驗以比較共培養培養基1233和共培養培養基1898。除了其它成分差異(見表9)，共培養培養基1898特別具有較低水平的2，4-D，且具有羧苄青黴素。如上面的實施例所述從玉米穗切除和分離不成熟胚。將分離的胚分成兩組處理。用包括gus和CP4表達盒的植物轉化載體pM0N97367接種兩種處理的胚。處理1的胚在培養基1233上共培養，處理2的胚在培養基1898上共培養。經過過夜共培養，通過美國專利申請公開2004/00244075所述的方法處理胚。表8顯示使用共培養培養基1898導致與使用共培養培養基1233相比，所有關鍵性能指標(如培養響應、產生的事件、轉移到phytatray的事件、轉移到土壤的事件都得到改善。表9給出所用的培養基的組成。表8.共培養培養基1898對轉化頻率的提高tableseeoriginaldocumentpage42表9.本發明中使用的培養基組成。培養基1233、1278、1073、1071、1084來自Cai等人；美國專利申請公開2004/00244075。培養基1898來自美國專利申請公開2008/0124727。tableseeoriginaldocumentpage42tableseeoriginaldocumentpage43*包含1250mg/L的煙酸(Sigma)、250mg/L的鹽酸吡哆醇(Sigma)、250mg/L的鹽酸硫胺素(Sigma)和250mg/L的泛酸鈣(Sigma)。氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺本領域的技術人員按照上述公開的指示可以製造和使用本文公開和要求保護的所有材料和方法而不需過度的實驗。雖然已根據優選的實施方式和示例性的實施例描述了本發明的材料和方法，但以下對於本領域的技術人員是顯而易見的在不背離本發明的概念、精神和範圍的情況下，可以對本文所述的材料和方法進行變化。所有對於本領域的技術人員明顯的這些類似的替換和修改被認為在附加的權利要求進一步限定的本發明的概念、精神和範圍之內。參考文獻本文特別引入以下文獻作為參考，它們對本文提出的方法提供補充性的示例性的程序或其它細節。美國專利5，550，318美國專利5，780，708美國專利6，194,636美國專利6，232，526美國專利7，002，058美國專利7，150,993美國專利申請10/710,067美國專利申請11/613,031美國專利申請12/045，502美國專利公開2003/0024014美國專利公開2004/0016030美國專利公開2004/0126845美國專利公開2004/0210958美國專利公開2004/0216189美國專利公開2004/0244075美國專利公開2005/0246786美國專利公開2008/0124727美國臨時專利申請60/894，096美國臨時專利申請60/915，06權利要求一種獲得適於組織培養和/或遺傳轉化的胚的方法，包括在基本上由水和/或具有大約0mOsm/kg至大約600mOsm/kg的摩爾滲透壓濃度的滲透劑組成的液體培養基中從植物種子至少部分地切除胚，其中，在從植物種子切除胚後，所述胚仍然保持進行組織培養和/或遺傳轉化的活性。2.如權利要求1所述的方法，其中，所述滲透劑選自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖。3.如權利要求2所述的方法，其中，所述培養基基本上由水和濃度為大約0.05M至大約0.5M的甘露醇組成。4.如權利要求2所述的方法，其中，所述培養基基本上由水和濃度為大約0.05M至大約0.5M的蔗糖組成。5.如權利要求1所述的方法，進一步包括遺傳轉化所述胚的步驟。6.如權利要求5所述的方法，其中，所述遺傳轉化步驟包括使用包括殺菌劑的共培養培養基。7.如權利要求6所述的方法，其中，所述殺菌劑是羧苄青黴素。8.如權利要求5所述的方法，其中，所述遺傳轉化步驟包括使用包含大約0.5-1.5mg/L的2，4-D的共培養培養基。9.如權利要求5所述的方法，進一步包括從轉化的胚再生轉基因植物。10.如權利要求1所述的方法，進一步包括在液體培養基中從植物種子或穗的群體至少部分地切除多個胚。11.如權利要求1所述的方法，其中，所述胚是玉米胚、小米胚、大豆胚或棉花胚。12.如權利要求1所述的方法，包括在包括以下部分的培養基製備系統中製備液體培養基(a)水的入口；(b)滲透劑的入口；和(c)用於混合水和滲透劑以產生液體培養基的室，其中，所述水的入口和所述滲透劑的入口與混合室連接，以使水和滲透劑輸送到混合室。13.如權利要求12所述的方法，其中，所述入口中的一個或多個接收來自容納水的室或容納滲透劑的室的水和/或滲透劑。14.如權利要求13的方法，進一步包括測量容納水的室、容納滲透劑的室或混合水和滲透劑的室中的一個或多個的填充水平。15.如權利要求12的方法，進一步包括將所述混合室與流體噴射裝置連接。16.如權利要求12所述的方法，進一步包括用選自過濾器、紫外輻射源或γ輻射源和滅菌熱源的滅菌器對液體培養基進行滅菌。17.如權利要求16所述的方法，其中，所述滅菌器在水和/或滲透劑進入混合室之前對其進行滅菌。18.如權利要求16所述的方法，其中，所述滅菌器在水、滲透劑和/或液體培養基進入混合室的同時和/或之後對其進行滅菌。19.如權利要求12所述的方法，其中，在所述液體培養基離開混合室後對其進行滅菌。20.如權利要求12所述的方法，進一步包括控制水和滲透劑向混合水和滲透劑的室的輸送。21.如權利要求20所述的方法，其中，控制輸送包括電子感應水和/或滲透劑的輸送。22.一種用於製備適於組織培養和/或遺傳轉化的植物胚的方法，包括(a)將包括種皮和植物胚的植物種子組織置於水性環境中；(b)將所述組織與選擇性地附著到胚或種皮的試劑接觸；和(c)根據試劑對胚或種皮的選擇性附著分離至少第一胚。23.如權利要求22所述的方法，其中，所述試劑包括氣泡。24.如權利要求23所述的方法，其中，所述氣泡具有大約100微米至大約Imm的最大平均尺寸。25.如權利要求24所述的方法，其中，所述氣泡包含選自空氣、氧氣、氮氣及其組合的氣體。26.如權利要求22所述的方法，其中，所述步驟(c)包括根據胚的浮力分離第一胚。27.如權利要求24所述的方法，包括在所述水性環境中包含減少氣泡彼此之間的聚並的表面活性劑。28.如權利要求27所述的方法，其中，所述表面活性劑選自聚醚、PPG(聚(丙二醇))和PEG(聚(乙二醇))。29.如權利要求28所述的方法，其中，所述PPG具有大約340至大約3500道爾頓的分子量。30.如權利要求28所述的方法，其中，所述PEG具有大約100道爾頓至大約9000道爾頓的分子量。31.如權利要求22所述的方法，其中，所述試劑包括與所述水性環境不混溶的第二液體。32.如權利要求31所述的方法，其中，所述第二液體選自與胚的存活和轉化相容的植物油、礦物油或其它疏水液體。33.如權利要求22所述的方法，其中，所述植物種子組織包括按照權利要求1所述的方法產生的胚。34.如權利要求22所述的方法，其中，所述水性環境基本上由包括水和/或具有大約OmOsm/kg至大約600m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度的滲透劑的培養基組成。35.如權利要求34所述的方法，其中，所述滲透劑選自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖。36.如權利要求35所述的方法，其中，所述培養基基本上由水和濃度為大約0.05M至大約0.5M的甘露醇組成。37.如權利要求35所述的方法，其中，所述培養基基本上由水和濃度為大約0.05M至大約0.5M的蔗糖組成。38.如權利要求22所述的方法，包括將植物種子組織置於所述水性環境中而不先分離胚和非胚組織。39.如權利要求22所述的方法，其中，所述植物種子組織是玉米植物種子組織、棉花植物種子組織或大豆植物種子組織。40.一種用於製備適於組織培養和/或遺傳轉化的植物胚組織的裝置，包括(a)用於保持包括多個植物胚的植物種子組織在水性環境中的容器；和(b)用於向所述水性環境遞送選擇性地附著到胚的試劑的至少第一噴嘴，其中，所述噴嘴產生具有大約100微米至大約Imm的平均直徑的氣泡。41.如權利要求40所述的裝置，其中，所述容器填充培養基和包括胚和非胚組織的植物種子組織。42.如權利要求40所述的裝置，進一步包括用於根據胚在所述水性環境中的浮力分離胚組織的收集器。43.如權利要求40所述的裝置，其中，所述氣泡包含選自空氣、氧氣、氮氣及其組合的氣體。44.一種製備適於組織培養和/或遺傳轉化的玉米胚的方法，包括(a)將第一液體培養基流引到玉米粒上，以從玉米粒提取胚乳；和(b)將第二液體培養基流引到玉米粒上，以從玉米粒提取胚。45.如權利要求44所述的方法，其中，所述液體培養基基本上由水或具有大約OmOsm/kg至大約600m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度的滲透劑組成。46.如權利要求45所述的方法，其中，所述培養基包括選自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的滲透劑。47.如權利要求46所述的方法，其中，所述培養基基本上由水和濃度為大約0.05M至大約0.5M的甘露醇組成。48.如權利要求46所述的方法，其中，所述培養基基本上由水和濃度為大約0.05M至大約0.5M的蔗糖組成。49.如權利要求44所述的方法，其中，所述玉米粒包括在玉米穗上。50.如權利要求44所述的方法，包括相對於第一和第二流移動玉米穗，以從玉米粒連續地除去胚乳和胚。51.如權利要求44所述的方法，其中，所述第一和/或第二流構成小於玉米粒寬度的寬度。52.如權利要求44所述的方法，其中，所述第一和/或第二流構成大約0.003」的寬度和大約1」的高度。53.如權利要求44所述的方法，其中，所述第一和/或第二流在大約30PSI至大約75PSI的壓力下產生。54.如權利要求44所述的方法，其中，所述第一和/或第二流由產生在離噴嘴至少2.5」的距離處穩定的層狀流體流的噴嘴引出。55.如權利要求44所述的方法，其中，所述玉米粒位於距噴嘴尖端大約13/4-2」處。56.如權利要求44所述的方法，其中，所述第一和/或第二流以基本上同樣的力量接觸在玉米穗上一排玉米粒中的各個玉米粒。57.一種製備適於組織培養和/或遺傳轉化的植物胚的方法，其中，用於保持籽粒或其它組織的裝置在容器中離心，以向籽粒或其它組織施力。58.一種獲得適於組織培養和/或遺傳轉化的植物胚的裝置，包括(a)用於將培養基引到玉米粒或含有植物胚的其它組織之上的至少第一流體噴射口；和(b)用於保持玉米粒或其它組織在培養基的路徑中的裝置。59.如權利要求58所述的裝置，其中，所述胚包含在玉米粒中。60.如權利要求59所述的裝置，其中，所述玉米粒包含在玉米穗上。61.如權利要求58所述的裝置，其中，所述裝置進一步設計為包括第一和第二流體噴射口。62.如權利要求60所述的裝置，其中，所述用於保持玉米粒的裝置包括用於相對於第一和第二流體流移動玉米穗以控制第一和第二流體流與玉米粒之間的接觸角的裝置。63.如權利要求58所述的裝置，進一步包括檢測器以鑑別切除的胚乳組織和胚。64.如權利要求58所述的裝置，進一步包括至少第一分離器以將胚與非胚組織分離。65.如權利要求58所述的裝置，其中，所述用於保持玉米粒或其它組織的裝置包括薄片或圓筒形薄片。66.如權利要求58所述的裝置，其中，所述用於保持玉米粒或其它組織的裝置包括網狀物或多個狹槽；或向所述組織施力的壓力凸輪或螺杆。67.如權利要求58所述的裝置，其中，所述種子或果實組織通過機械力、摩擦力、離心力或吸力保持在用於保持玉米粒或其它組織的裝置上。68.如權利要求58所述的裝置，其中，所述用於保持玉米粒或其它組織的裝置懸置在氣相中、液相中或部分地懸置在氣相和液相中。69.如權利要求58所述的裝置，其中，所述用於保持玉米粒或其它組織的裝置相對於流體力固定。70.如權利要求58所述的裝置，其中，所述用於保持玉米粒或其它組織的裝置可相對於流體力移動。71.如權利要求64所述的裝置，其中，所述分離器通過選自尺寸排阻、差別密度和差別疏水性的方法將適於組織培養的胚與非胚組織分離。72.如權利要求71所述的裝置，進一步設計為包括根據大小將胚與非胚組織分離的篩子。73.如權利要求60所述的裝置，其中，所述用於保持玉米粒的裝置包括用於相對於流體噴射口移動玉米穗的第一電動機。全文摘要本發明提供了用於快速分離適於轉化或組織培養的單子葉植物胚的方法和裝置。本發明包括充分分離用作可轉化外植體的植物胚的機械裝置。本發明還提供適於分離植物胚的培養基及其製備方法。文檔編號A01H4/00GK101808505SQ200880108777公開日2010年8月18日申請日期2008年8月29日優先權日2007年8月31日發明者B·洛韋,B·瑪爾蒂內爾,B·達維斯,J·羅宇特,L·庫徹爾,W·R·阿達姆斯申請人:孟山都技術公司