用於差分細胞計數的方法以及用於執行該方法的相關裝置和軟體的製作方法

2023-07-28 01:16:51

專利名稱：用於差分細胞計數的方法以及用於執行該方法的相關裝置和軟體的製作方法
技術領域：
本發明涉及信號探測裝置、數據處理方法和相關計算機軟體及化驗算法(assay algorithms)。本發明更特別地致力於成像生物樣品，例如細胞樣品，並分析所收集的數據。更特別地，但不僅限於下文根據實踐的最佳模式說明的特殊實施例，本發明涉及用於差分細胞計數(differential cell counting)的方法，包括白細胞，以及用於執行該細胞計數的光生物盤的使用。
背景技術：
大量的研究和診斷情況都需要從細胞混合物中分離和分析特殊的細胞。這種混合物的來源可以包括血液、脊髓液、骨髓、腫瘤勻漿、淋巴組織和其它含有細胞物質的樣品。
完全血細胞計數(complete blood count)(CBC)是檢測包括血紅蛋白、血細胞比容、平均血細胞血紅蛋白、平均血細胞血紅蛋白濃度、平均血細胞體積、血小板總數和白細胞總數的集合。最常用的臨床檢測是總CBC計數，其常規地用於評估健康狀況和臨床診斷、治療及跟蹤調查(follow-up)。
白細胞(WBC)通過抵抗感染和攻擊外來物質(foreign material)保護肌體。差分白細胞計數確定白細胞的數量和人血中每種類型白細胞的百分比。WBC或白細胞計數提供了疾病存在的線索。這些檢測包含在通常的健康檢測之中，並有助於調查各種疾病，包括感染、過敏症和白血病。在需要額外的白細胞時，骨髓將增加產量。
有五種類型的白細胞，每一種具有不同的功能嗜中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜伊紅細胞和嗜鹼細胞。差分顯示出這些細胞是否以正常的分布存在，或者是否有一種細胞類型增加了或減少了。在正常健康人中，典型的WBC總數為每微升(μl)4,000-10,800個細胞。如下因素，例如鍛鍊、應激(stress)和疾病等能夠影響這些數值。這一信息有助於診斷特殊類型的疾病。高WBC可能表明感染、白血病或組織損傷。如果降到每微升低於1,000個細胞，則感染的危險增加。減弱免疫系統的疾病(condition)和藥物，例如AIDS或化療，會導致白細胞減少。從疾病中恢復可以通過白細胞加以監測。總數持續增加或降低到異常的水平表示疾病正在惡化；總數返回到正常表示狀況改善。
白細胞差分檢測(differential testing)是收集超出可以從白細胞計數自身獲得的信息之外的信息不可或缺的。白細胞差分計數用於評估新近的疑似感染或感冒(如果CBC正常)、伴隨異常的疑似紊亂、白細胞總數異常、疑似白血病和其它異常，例如嗜酸粒細胞增多、單核細胞增多、嗜鹼細胞增多。白細胞或白細胞差分的重複測試可以在出現嚴重白血球減少症的情況下進行(例如在藥物治療之後)。在治療期間，例如化療或放療，血液計數對於確定治療是否除了消滅了癌細胞之外也消滅了正常的血細胞是非常重要的。
差分白細胞計數通過計算機細胞計數設備加以確定。機器確定五種主要白細胞類型的總數和百分比。在正常個體中，大多數是嗜中性粒細胞(50-60％)，其次是淋巴細胞(20-40％)，然後是單核細胞(2-9％)，有少量的嗜伊紅細胞(1-4％)和嗜鹼細胞(0.5-2％)。
在淋巴細胞分類中，有進一步的細胞亞型。例如，淋巴細胞能夠廣義地分為T細胞(胸腺產生的淋巴細胞)和B細胞(囊等同物淋巴細胞(bursal-equivalent lymphocyte))，它們分別大量響應細胞介導的免疫和體液免疫。儘管形態學特徵已經用於劃分白細胞的類群，但是已經證明，形態學自身不足以區分淋巴細胞亞型的許多功能。為了區分具有各種功能的淋巴細胞，已經開發出了許多技術，包括玫瑰花結分析(analysis by rosetting)、免疫螢光顯微鏡、酶組織化學和最近的抗獨特細胞表面標記物的單克隆抗體。
嗜中性粒細胞對於抗擊感染很重要。當嗜中性粒細胞數目下降到低於每微升1,000個細胞時，該狀況稱為嗜中性白血球減少症。淋巴瘤治療能夠導致嗜中性白血球減少症。肥胖和吸菸會增加嗜中性粒細胞總數。淋巴細胞分為B淋巴細胞(骨髓中化膿)和T淋巴細胞(胸腺中化膿)。當成年人的淋巴細胞總數下降到低於每微升1,500個細胞，或者在兒童體內低於每微升3,000個細胞時，該狀況稱為淋巴細胞減少症。淋巴瘤能夠導致淋巴細胞減少症。
血小板(凝血細胞)是類似細胞的顆粒，其通過聚集在發生出血的部位而停止出血。然後，它們激活並凝集在一起，以停止出血和促進凝血。如果患者患有骨髓增殖紊亂(myleoproliferative disorder)，包括感染、炎症、惡性腫瘤，以及如果切除了脾，則在劇烈激活期間，血小板數量增加。血小板數量過多稱為血小板增多症。
標準血液樣品內血小板的數量典型地為每微升(μl)133,000-333,000個血小板。血小板數量過高稱作血小板增多症(thrombocythemia)。高於正常的血小板總數可能是由於反應性響應(reactive response)或骨髓衰竭(bone marrow failure)。反應性響應典型地由出血、感染、腫瘤形成和骨髓增生紊亂(myleoproliferative disorder)導致。骨髓衰竭通常涉及血細胞損失，稱作全血細胞減少症。另一方面，血小板總數的減少是因為免疫血小板減少症。如果血小板總數下降到低於30,000則發生血小板減少症，其會導致異常出血。總數低於5,000則認為有生命危險。
CBC可以通過商業上可獲得的手動或電子儀器執行，它們測量血紅蛋白水平、血細胞比容、總白細胞和紅細胞總數。變化可以包括血小板計數、白細胞差分計數和細胞指數(cell indices)。血液分析儀完全自動化，且細胞計數、體液中的細胞類型和胃排空(gastricaspiration)的結果精確，其中體液包括例如CSF、胸腔液、禁慾液(ascetic fluid)、心包液。
與先前的方法和系統相比，我們開發出了一種用於對成像和分析細胞及其成分的簡單、微型、極其靈敏、低廉的系統。該系統使用光學光生物盤、相關探測組件以及信息和信號的處理方法和軟體。

發明內容
本發明涉及用於成像和計數實驗室樣品中細胞物質的方法、裝置和軟體。本發明的實施例生成樣品中細胞的數字圖象，並對圖象進行計算機分析。本發明成像細胞，特別是血細胞，包括在血液和其它生物液中滋生的寄生蟲和病原體。在其它化驗中，對珠子(bead)(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記(biologicalreporters)進行成像。該系統使用光學光生物盤、相關探測組件，以及信息和信號處理的方法和軟體。
本發明還致力於光生物盤、生物驅動和相關方法。本發明或其不同的方面可以容易地在如下的光碟、化驗和系統中實現，或者能夠容易地適用於或與它們結合使用，這些光碟、化驗和系統在如下共同轉讓的並且同在審理中(commonly assigned and co-pending)的專利申請中公開，這些專利申請包括美國專利申請序列No.09/378,878，題目為「用於分析從光碟獲得的可操作和非可操作數據的方法和裝置」(Methods and Apparatus for Analyzing Operational andNon-operational Data Acquired from Optical Discs)，其於1999年8月23日提出申請；美國臨時專利申請序列No.60/150,288，題目為「用於使用物理同步化標記物獲取光碟數據的方法和裝置」(Methods andApparatus for Optical Disc Data Acquisition Using PhysicalSynchronization Markers)，其於1999年8月23日提出申請；美國專利申請序列No.09/421,870，題目為「具有並發可讀分析物材料的可跟蹤光碟」(Trackable Optical Discs with Concurrently ReadableAnalyte Material)，其於1999年10月26日提出申請；美國專利申請序列No.09/643,106，題目為「用於使用物理同步化標記物獲取光碟數據的方法和裝置」(Methods and Apparatus for Optical Disc DataAcquisition Using Physical Synchronization Markers)，其於2000年8月21日提出申請；美國專利申請序列No.09/999,274，題目為「具有反射層的光生物盤」(Optical Biodiscs with Reflective Layers)，其於2001年11月15日提出申請；美國專利申請序列No.09/988,728，題目為「使用光生物盤探測和定量淋巴細胞的方法和裝置」(Methods andApparatus for Detecting and Quantifying Lymphocytes with OpticalBiodiscs)，其於2001年11月20日提出申請；美國專利申請序列No.09/988,850，題目為「使用光生物盤進行血液分類的方法和裝置」(Methods and Apparatus for Blood Typing with Optical Bio-discs)，其於2001年11月19日提出申請；美國專利申請序列No.09/989,684，題目為「用於分離粘聚物和分散顆粒的裝置和方法」(Apparatus andMethods for Separating Agglutinants and Disperse Particles)，其於2001年11月20日提出申請；美國專利申請序列No.09/977,741，題目為「包括光生物盤的雙珠化驗及其相關方法」(Dual Bead AssaysIncluding Optical Biodiscs and Methods Relating Thereto)，其於2001年11月27日提出申請；美國專利申請序列No.09/977,895，題目為「用於分離特殊懸濁液組分的裝置和方法」(Apparatus and Methods forSeparating Component of Particulate Suspension)，其於2001年11月30日提出申請；美國專利申請序列No.10/005,313，題目為「用於測量分析物的光碟」(Optical Discs for Measuring Analytes)，其於2001年12月7日提出申請；美國專利申請序列No.10/006,371，題目為「使用光碟和光碟閱讀器探測分析物的方法」(Methods for DetectingAnalytes Using Optical Discs and Optical Disc Readers)，其於2001年12月10日提出申請；美國專利申請序列No.10/006,620，題目為「用於探測分析物的多數據層光碟」(Multiple Data Layer Optical Discsfor Detecting Analytes)，其於2001年12月10日提出申請；美國專利申請序列No.10/006,619，題目為「用於執行化驗的光碟組件」(Optical Disc Assemblies for Performing Assays)，其於2001年12月10日提出申請；美國專利申請序列No.10/020,140，題目為「用於基於光碟的實驗室的探測系統和包括該系統的改良光生物盤」(Detection System For Disk-Based Laboratory and ImprovedOptical Bio-Disc Including Same)，其於2001年12月14日提出申請；美國專利申請序列No.10/035,836，題目為「用於固定DNA捕獲探針的表面組件和包括光生物盤的基於珠子的化驗及其相關方法」(SurfaceAssembly for Immobilizing DNA Capture Probes and Bead-BasedAssay Including Optical Bio-Discs and Methods Relating Thereto)，其於2001年12月21日提出申請；美國專利申請序列No.10/038,297，題目為「包括用於改進特異性的共價鍵合的雙珠化驗及相關分析光碟」(Dual Bead Assays Including Covalent Linkages for ImprovedSpecificity and Related Optical Analysis Discs)，其於2002年1月4日提出申請；美國專利申請序列No.10/043,688，題目為「光碟分析系統及用於生物學和醫學成像的相關方法」(Optical Disc AnalysisSystem Including Related Methods for Biological and MedicalImaging)，其於2002年1月10日提出申請；美國臨時專利申請序列No.60/348,767，題目為「光碟分析系統及相關信號處理的方法和軟體」(Optical Disc Analysis System Including Related Signal ProcessingMethods and Software)，其於2002年1月14日提出申請；美國專利申請序列No.10/086,941，題目為「用於將DNA結合在固相上的方法及相關光生物盤和光碟機系統」(Methods for DNA Conjugation OntoSolid Phase Including Related Optical Biodiscs and Disc DriveSystems)，其於2002年2月26日提出申請；美國專利申請序列No.10/087,549，題目為「用於減少雙珠化驗中珠子非特異鍵合的方法及相關光生物盤和光碟機系統」(Methods for Decreasing Non-SpecificBinding of Beads in Dual Bead Assays Including Related OpticalBiodiscs and Disc Drive Systems)，其於2002年2月28日提出申請；美國專利申請序列No.10/099,256，題目為「使用可斷開連接臂和/或結紮以提高特異性和敏感性的雙珠化驗及相關方法和裝置」(Dual BeadAssays Using Cleavable Spacers and/or Ligation to ImproveSpecificity and Sensitivity Including Related Methods andApparatus)，其於2002年3月14日提出申請；美國專利申請序列No.10/099,266，題目為「使用限制性酶和其它化學方法減少雙珠化驗中的非特異鍵合及用於探測藥物靶標的相關光生物盤、方法和系統裝置」(Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methods toDecrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and RelatedBio-Discs，Methods，and System Apparatus for Detecting MedicalTargets)，其也於2002年3月14日提出申請；美國專利申請序列No.10/121,281，題目為「多參數化驗及其相關分析光碟和方法」(Multi-Parameter Assays Including Analysis Discs and MethodsRelating Thereto)，其於2002年4月11日提出申請；美國專利申請序列No.10/150,575，題目為「用於在光生物盤組件內提供分析結果像素的可變取樣控制及其相關裝置」(Variable Sampling Control forRendering Pixelization of Analysis Results in a Bio-Disc Assembly andApparatus Relating Thereto)，其於2002年5月16日提出申請；美國專利申請序列No.10/150,702，題目為「在使用酶反應在光生物盤內產生信號的基因化驗中用於固定DNA探針的表面組件及其相關方法」(Surface Assembly for Immobilizing DNA Capture probes in GeneticAssays Using Enzymatic Reactions to Generate Signals in OpticalBio-Discs and Methods Relating Thereto)，其於2002年5月17日提出申請；美國專利申請序列No.10/194,418，題目為「用於分析顯微結構的光碟系統及相關探測和解碼方法」(Optical Disc System andRelated Detecting and Decoding Methods for Analysis of MicroscopicStructures)，其於2002年7月12日提出申請；美國專利申請序列No.10/194,396，題目為「用於指導化驗的多目的分析光碟及用於使用該光碟的各種指示劑」(Multi-Purpose Optical Analysis Disc forConducting Assays and Various Reporting Agents for UseTherewith)，其於2002年7月12日提出申請；美國專利申請序列No.10/199,973，題目為「用於執行體質測量的可傳送光碟組件及其相關方法」(Transmissive Optical Disc Assemblies for Performing PhysicalMeasurements and Methods Relating Thereto)，其於2002年7月19日提出申請；美國專利申請序列No.10/201,591，題目為「用於執行反應離心的分析光碟及相關驅動組件」(Optical Analysis Disc andRelated Drive Assembly for Performing Interactive Centrifugation)，其於2002年7月22日提出申請；美國專利申請序列No.10/205,011，題目為「用於光生物盤鍵合流體線路的方法和裝置」(Methods andApparatus for Bonded Fluidic Circuit for Optical Bio-Disc)，其於2002年7月24日提出申請；美國專利申請序列No.10/205,005，題目為「使用光碟驅動的磁珠磁輔助探測」(Magnetic Assisted Detection ofMagnetic Beads Using Optical Disc Drives)，其也於2002年7月24日提出申請。本文全文引用所有這些專利申請作為參考。因此，它們提供了背景和相關公開，作為本文所重複內容的支持。
本發明用於執行化驗的一個方法是基於位於在光生物盤特殊溝道內的血細胞的光學成像原理。大約數微升的全血注射到光碟上特殊設計的溝道內。使用細胞識別軟體分析圖象，辨認各種白細胞亞型並生成白細胞差分計數。該方法以使用抗特定細胞的細胞特異抗體捕獲特定細胞為基礎。在特殊實例中，抗體定向地抗淋巴細胞(CD2、CD19)、單核細胞(CD14)、嗜伊紅細胞(CD15)等。這些白細胞亞型特異抗體組裝並附著在光生物盤內的固體表面上，該光生物盤包括流動室(flow chamber)。
光生物盤驅動組件用於旋轉光碟，閱讀和處理任何存儲在光碟內的編碼信息，並分析光生物盤流動室內的細胞捕獲區。光生物盤驅動安裝有用於旋轉光生物盤的馬達，用於控制光碟旋轉速度的控制器，用於處理從光碟返回的信號的處理器，和用於分析已處理信號的分析器。旋轉速度可變，並可以密切地控制速度、方向和旋轉時間。光生物盤也可以用於將信息寫入到光生物盤上，其可以發生在利用驅動的閱讀波束詢問流動室和靶區內的檢測材料之前、之中或之後，並用分析器加以分析。光生物盤可以含有用於控制光碟旋轉的編碼信息，提供特定於(specific to)待執行免疫分類化驗類型的處理信息，和用於在與生物驅動關聯的監視器上顯示任何期望的結果。
差分細胞計數方案(protocol)，通常上且特別地，差分白細胞計數方案是為CD、CD-R或DVD格式、這些格式的修改版本及其替代物開發的。驅動的閱讀或詢問波束探測分析樣品中的各種細胞，並產生能夠用差分細胞計數器軟體加以分析的圖象。
顯微方法或精緻的細胞計數器對於執行這些費事的細胞計數化驗是至關重要的。在其它根據本發明進行的化驗中，細胞能夠替換為珠子(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)，或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。
本方法使用光生物盤和相關的光碟組件。通過細胞識別軟體程序產生和分析在分析室內游離的或者通過特異抗體方法捕獲的各種白細胞亞型的光學圖象，該程序通過它們的光散射性鑑別血液或其它體液中的各種細胞基本組分(cellular element)。本發明在分析之前不需要對樣品進行任何的處理，例如細胞染色、RBC清除和其它艱苦的規程。這些方法包括在CD型閱讀器、DVD型閱讀器或其它光碟閱讀器中使用頂部探測器(top detector)、底部探測器(bottom detector)、事件計數器(event counter)或細胞計數器(cell counter)進行顯微分析或細胞探測。
下述關於聚類指示分析(cluster designation analysis)，例如獲得CD4/CD8比率代表了能夠應用本方法、裝置、系統和光碟系統的相關化驗的特定組群。
光碟製備金反射光碟或透射光碟用空氣槍(air gun)清潔用以除去任何的灰塵顆粒。使用旋轉塗布機(spin coater)用異丙二醇漂洗光碟兩次。將2％聚苯乙烯旋轉塗布在光碟上從而提供相對厚的塗布(coating throughout)。
化學沉積一個實施例包括三步培育(incubate)沉積方案鏈黴素(streptavidin)，培育30分鐘；生物素標記的(biotinylated)第一抗體，培育60分鐘；和第二捕獲抗體，培育30分鐘。所有的步驟都適宜在潮溼箱(humidity chamber)內在室溫下進行，在沉積之間進行嚴格的衝洗和乾燥步驟。
簡而言之，磷酸鹽緩衝液中1μl 1mg/ml的鏈黴素層積(layered)在每個窗口上，並培育30分鐘。用蒸餾水衝洗掉多餘的鏈黴素，並乾燥光碟。通過合併等體積的生物素標記的lgG(125μg/ml置於PBS中)和乙醛激活的葡聚糖(200μg/ml)製備生物素標記的lgG-葡聚糖複合物。葡聚糖-乙醛生物素標記-lgG複合物層積在每個捕獲窗口中的鏈黴素上，並培育60分鐘或者在冰箱中過夜。衝洗掉多餘的試劑並旋轉乾燥光碟。通過在光生物盤狹槽上的指定點上層積捕獲抗體產生特殊的條碼捕獲模式。為了差分計數，抗嗜中性粒細胞(CD128或其它)、抗淋巴細胞(CD2、CD19、CD56及其它)、抗嗜伊紅細胞(CD15)、抗單核細胞(CD14)、抗嗜鹼細胞(CD63)和抗血小板(CD32和CD151)的抗體層積在每個狹槽的指定點內。下面的表1列舉了用於捕獲層組件的各種捕獲模式的實例。培育30分鐘或在冰箱中過夜。組裝光碟使用25μm、50μm或100μm(50μm溝道需要的樣品體積是25μm室所需要的2倍)、直的、U形的或其它的溝道格式，以及透明(用於頂部探測器)或反射(用於底部探測器)頂蓋光碟(cover disc)。
表1捕獲層組件及變型

光碟洩漏檢查因為典型分析的是血液，一種生物危害性物質，所以這些光碟要進行洩漏檢查以保證含有樣品的光碟在原位旋轉期間，沒有室發生洩漏。每個溝道用阻塞劑(blocking agent)StabilGufard填充，並阻塞一小時。光碟以5,000rpm旋轉5分鐘，並檢查洩漏和光碟穩定性。檢查洩漏之後，光碟在真空室內放置24小時。抽真空之後，充滿磷酸緩衝鹽(PBS)緩衝液的，或者選擇地，空的室放置在真空袋內，並冷凍保存直至使用。
從全血中分離血沉棕黃層(buffy coat)通過在1,500xg下離心離心管內的靜脈血15分鐘製備血沉棕黃層，該靜脈血含有抗凝劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)或酸性檸檬酸葡聚糖(acid citrate dextran)(ACD)。白細胞在血漿與紅細胞之間形成層，稱為血沉棕黃層。用精確的移液管小心地除去血漿，然後收集血沉棕黃層。一種無離心地從血液中獲得血沉棕黃層的可選擇方法是允許血液與沉澱作用增強劑，例如纖維蛋白原、葡聚糖、阿拉伯樹膠、Ficoll或甲基纖維素，一起沉澱。Boyum試劑(甲基纖維素和甲泛影酸鈉)特別適合於獲得沒有任何紅細胞汙染的白細胞製品。
光碟上化驗——基本技術說明差分白細胞計數光碟檢測的一個優選實施例包括三個單獨的部件，(1)含有化學試劑的基礎光碟(basedisc)，(2)溝道層，和(3)頂蓋光碟(cover disc)。
血沉棕黃層或白細胞(7微升置於PBS中)注射到光碟室內，室的入口和出口部分用封閉標籤密封，並且光碟在室溫下培育15分鐘。對於第一方法，光碟上的給定區域(例如1平方毫米的面積)用具有頂部或底部探測器的光碟機動器的標準780nm雷射加以掃描。根據本發明的細胞識別軟體自動地從1平方毫米的捕獲圖象中給出差分總數，並且外推所獲得的值確定每毫升全血的總數。對於第二條形碼方法，用標準780nm雷射掃描光碟以成像捕獲區(淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼細胞、嗜伊紅細胞、單核細胞和血小板)。本發明的細胞識別軟體除其他事務之外執行如下程序(a)離心光碟以旋出多餘的未鍵合細胞，(b)成像每個特定細胞捕獲區內的限定區域，(c)處理數據，其包括計數每個捕獲區中特定的捕獲細胞，和(d)獲得每毫升全血中不同亞型白細胞的數量。
根據本發明的一個方面，在處理步驟期間，識別軟體通讀每一個捕獲區，並在遇到細胞的時候標記細胞。在其它化驗中，細胞能夠替換為珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。隨後處理來自每個捕獲區的數據，軟體顯示每微升或毫升血液體積中淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼細胞、嗜伊紅細胞、單核細胞和血小板區的數量。從將光碟插入光碟機動器到獲得並顯示期望的總數或比率，整個處理花費大約10-15分鐘。在本發明這一方面的另一個實施例中，從捕獲區讀出電響應(electrical response)，並存儲在光碟上或存儲器內，形成可以進行後處理的數據文件以實現在下文中更詳細說明的識別目的。
光碟詳細說明下面的分部(subsection)用於概述某些光生物盤的特殊實施例，其可以有利地與本發明一起使用。
(A)跟蹤設計(tracking design)在本發明的一個優選實施例中，光碟是塗布有300nm的金的前擺動序列(forward Wobble Set)FDL2113707或FDL211270。在該反射光碟上，通過平版印刷術(lithography)腐蝕出尺寸為2×1mm的橢圓形數據窗口。U-形溝道用於產生高度為25-100微米的室。充滿整個室，包括入口和出口部分，需要大約7μl的樣品。可以優選地使用4窗口/4溝道格式。然而在透射光碟上不腐蝕數據窗口，並且整個光碟都可以使用。
(B)粘著與鍵合使用磨損鎖定U-形粘合劑(Fraylock U-shapedadhesive)DBL 201 Rev C 3M94661或直溝道形成室。
(C)頂蓋光碟使用乾淨光碟(clear disc)，其完全反射，具有48個直徑為0.040英寸的在半徑26mm上等距離放置的樣品入口。
數據捕獲與處理用本發明的軟體使用特定細胞識別方法以x4的速度和2.67MHz的取樣速度掃描和閱讀數據光碟。
軟體本發明進一步包括處理方法和相關細胞識別和成像的軟體。該軟體致力於實施和顯示細胞計數和差分細胞計數。在其它化驗中，細胞能夠替換為珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。本軟體可以存儲在光碟驅動閱讀器中的光生物盤上，或者選擇地，只能夠通過可靠伺服器上的光學閱讀器加以訪問。該伺服器可以在計算網絡，例如區域網(LAN)、廣域網(WAN)，中實現，或者可以在指定的期限和條件下在整個網際網路上都能夠獲得。該分配方法在如下專利申請中公開，即共同轉讓的美國臨時專利申請No.60/246,824，題目為「用於分析生物樣品的交互方法和系統和使用專門製備的光生物盤、光碟驅動和網絡連接處理相關的醫學信息」，其於2000年11月8日提出申請，並對應於美國專利申請序列No.09/986,078。
用於實踐本文所公開的不同優選實施例的材料包括前擺動金噴塗光致抗蝕劑光碟(forward wobble gold metalized photo-resist disc)，a_透射金噴塗光碟(a_transmissive gold metalized disc)，移液管和吸頭(tip)，旋轉塗布器、離心機、迴旋轉子(swing-out rotor)，含有抗凝劑，例如檸檬酸鈉或乙二胺四乙酸(EDTA)，的VacutainerTMCPT管，潮溼室，絞乾機(wringer)，粘合劑，頂蓋光碟，乾淨頂蓋光碟，磁帶或等價物，真空裝置，黃吸頭和真空室。
在本發明的一個實施例中，含有血細胞的實驗室樣品沉積在光生物盤上或者沉積在形成於光碟組件內的流體溝道內。在其它化驗中，細胞能夠替換為珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。光生物盤是專門製造的CD尺寸的光碟，具有流體溝道和/或混合室，其含有特效的用於原位鎖定血細胞成分的抗原。因為它們用仔細層積(layered)的金屬和物質製成，所以光生物盤具有特殊的光學性能，其允許電磁波束與沉積的測試樣品相互作用。一旦光生物盤插入到光碟機動器內，驅動便旋轉光碟，並且在一些實施例中可以將樣品和其它所需溶液混合在一起。電磁波束被導向到驅動內的光生物盤上。在一個稱作反射光碟的實施例中，波束從光生物盤的反射表面上反射，且光碟機動器內的探測器收集反射的波束。在另一個稱作透射光碟的實施例中，部分波束通過光生物盤，並透射到光碟機動器內的另一類型探測器上。在上述任一實例中，探測器收集的波束都含有關於光生物盤上實驗室樣品的信息。然後將該信息發送到模擬-數字處理器，在該處產生表示來自探測器的電信號的數字數據。該數字數據可以實時地加以處理，存儲在存儲器內或光碟上，然後整體地或部分地作為粗數據加以處理，或者輸出成各種格式，包括圖象格式。這些格式的任何一種都可以進一步通過其它裝置或設備加以處理從而生成預期的結果。該數字數據對於自動的、電的、計算機控制的，和/或機械的計數或分析是有用的。該數字數據也可以用於產生適合於熟練手工計數(experthand counts)、識別或其它手動分析的可視圖象。在本發明的另一個實施例中，粗數據、數字數據、可能含有圖象的輸出數據存儲在存檔(archive)中。這樣，本發明的方法通常可以應用於如本文所使用的「調查數據」(investigational data)，其包括但不僅限於，粗探測器輸出數據、粗信號數據、數字數據、輸出數據、或含有圖象或圖象數據的輸出數據。存檔提供一個位置，在該處調查數據能夠被分類，並且如果期望的話，與其它辨識信息，諸如例如人口統計學、地理學、醫學、歷史學或個人數據相結合。隨後，能夠分析調查數據的組從而進行例如不同人群的健康趨勢研究。
本發明的一個實施例致力於計數血細胞的需要。本發明包括處理方法和相關細胞識別和成像的軟體。該軟體致力於執行細胞計數和顯示相應的結果。在本發明的一個實施例中，執行各種圖象處理方法，例如二值化(binarization)、背景均勻化、標準化(normalization)和過濾，以強化調查數據(investigational data)中細胞的顯現，從而輔助細胞計數的處理。執行其它的技術以修正細胞計數的不規則，例如調查數據中的截留氣泡、裂縫和模糊細胞(dim cell)。
本發明的實施例將軟體存儲在光生物盤上、光碟驅動閱讀設備內，或者選擇地，僅能通過可靠伺服器的光學閱讀器加以訪問。該伺服器可以在計算機網絡中實現，例如區域網(LAN)、廣域網(WAN)或者整個網際網路在特定期限和條件下都可以獲得。該分配方法在如下專利申請中公開，即共同轉讓的美國專利申請No.09/898,078，題目為「用於分析生物樣品和處理相關信息的交互系統及其使用」，其於2001年11月7日提出申請，在這裡引用作為參考。
更特別地，本發明涉及計數細胞或其它調查特徵(investigationalfeature)的方法。該方法包括如下步驟獲得含有細胞的樣品的調查數據，在調查數據中選擇估計矩形(evaluation rectangle)，強化估計矩形內的調查數據，和計數估計矩形中顯示的細胞。在本發明的一個特殊實施例中，細胞計數通過識別明亮中心或者選擇地黑暗邊緣加以執行。
本發明的另一個方面致力於為估計矩形選擇自定義尺寸(customsize)的方法。
本發明的再一個方面致力於選擇多個估計矩形的方法。
本發明進一步的方面致力於通過如下步驟強化估計矩形內的調查數據，即對調查數據執行背景照明均勻化，對調查數據執行標準化，和過濾調查數據。
本發明附加的方面致力於通過如下步驟對調查數據執行背景照明均勻化，即為相鄰矩形(neighborhood rectangle)選擇一個尺寸，在調查數據中選取一個點，執行水平掃描以便為定位在將中心定於該點的相鄰矩形內的所有相鄰點計算第一滑動平均值(sliding average)，執行垂直掃描以便為定位在將中心定於該點的相鄰矩形內的所有相鄰點計算第二滑動平均值，組合第一滑動平均值與第二滑動平均值產生整體平均值，將點的原始值再分配為通過獲得整體平均值與原始值之間的差值並將該差值加和到背景值上計算出來的結果值(resultantvalue)，和重複執行水平掃描、執行垂直掃描、組合兩個平均值和為調查數據內的所有點再分配原始值的步驟。
在本發明的另一個方面中，對調查數據執行標準化的步驟進一步包括如下步驟計算調查數據中所有點的數值的平均值和標準偏差，使用該平均值和標準偏差使調查數據中所有點的數值標準化，和如果需要的話，截去一些點的數值。
根據本發明的另一個方面，提供了一種過濾調查數據的方法，其包括如下步驟為相鄰矩形選擇尺寸，在調查數據中選取一個點，發現所有定位在將中心定於該點的相鄰矩形內的足夠區別的點，如果足夠區別點的數量大於預先確定的標準則再分配點的值，和重複發現所有足夠區別的點和為調查數據內的所有點再分配數值的步驟。
根據本發明更進一步的方面，提供了一種處理方法，包括如下步驟從調查數據中除去不合需要的成分，該步驟包括如下步驟選擇閾值，使用閾值對調查數據執行二值化，對調查數據執行規則化(regularization)，提取關聯成分(connected components)，選擇尺寸閾值(size threshold)和除去不能滿足尺寸閾值的成分。
本發明的另一個附加方面致力於通過明亮中心計數調查數據內的細胞的方法。該方法包括如下步驟對調查數據進行卷積，尋找多個局部最大值，從多個局部最大值中除去冗餘的局部最大值，斷言(declaring)剩餘的最大值為細胞中心，和計數細胞中心。
根據本發明另一個方面，提供了另一種通過明亮中心計數調查數據中的細胞的方法。這種可選擇的方法包括對所述調查數據進行反轉(inversion)，進行多次使用移動環(shifted rings)的卷積，總計所述多次卷積的結果，發現局部最大值，斷言局部最大值為細胞中心，和計數所述細胞中心。
進一步，本發明的另一個實施例致力於一種方法，其包括如下步驟從已經通過明亮中心加以計數的調查數據中除去已計數的細胞，通過它們的黑暗邊緣計數細胞，和將通過識別明亮中心計數細胞的步驟的總數加和於通過識別黑暗邊緣計數細胞的步驟的總數。
本發明的再一個方面包括通過調查數據中的黑暗邊緣計數細胞的方法。該方法包括如下步驟對調查數據進行反轉，執行多次使用移動環的卷積，總計該多次卷積的結果，斷言最大值是細胞中心，和計數細胞。
在本發明的另一個實施例中，出於細胞計數的目的強化調查數據的方法進一步包括如下步驟對調查數據進行標準化，對調查數據進行過濾，選擇閾值數量，通過用該閾值數量確定調查數據是否與已設定的背景值不同對調查數據進行二值化，對調查數據進行規則化，在調查數據中提取一個像素寬度的邊界，填充由一個像素邊界限定的區域，和在所填充區域內進行卷積。
本發明的另一個方面涉及獲得含細胞樣品數字數據的方法。該方法包括如下步驟(1)在光碟表面提供血液樣品，(2)將光碟裝載到光學閱讀器內，(3)旋轉光碟，和(4)將電磁輻射的入射波束導向到光碟上的一個捕獲區。該表面上設置有具有一種或多種捕獲劑的一個或多個捕獲區。該方法接著包括步驟(5)用探測器(detector)探測與光碟在捕獲區相互作用之後形成的電磁輻射波束，(6)將探測到的波束轉換為模擬輸出信號，和(7)將模擬輸出信號轉換為含有在捕獲區捕獲到的細胞的數字數據。
根據本發明的另一個方面提供了一種將模擬輸出轉換為數字數據的方法。該轉換方法包括如下步驟以固定的間隔採樣模擬信號的振幅，將採樣振幅記錄在一維陣列內，利用採樣和記錄步驟產生多個一維陣列，和組合該多個一維陣列生成含有樣品的數字數據的二維陣列。
本發明再一個方面涉及獲得含細胞樣品的數字數據的方法。該方法包括如下步驟在光碟表面上提供血液樣品(該表面包括含有一種或多種捕獲劑的一個或多個捕獲區)，將光碟裝載到光學閱讀器內，旋轉光碟，將電磁輻射的入射波束導向到光碟的一個捕獲區上，用探測器探測與光碟在捕獲區相互作用之後形成的電磁輻射波束，和將探測到的波束轉換為模擬輸出信號。本發明的該特殊實施例包括如下步驟將模擬輸出信號轉換成含有在捕獲區內捕獲的細胞的數字數據。該光碟用反射層構建，從而導向到捕獲區的光線被反射到探測器，且探測器是底部探測器。在本發明的另一個方面中，使用頂部探測器或分波探測器(split detector)。
本發明的另一個方面致力於選擇估計矩形的方法。該方法包括如下步驟(1)在調查數據中發現多個窗口中的一個，和(2)在窗口內修剪(cropping)標準尺寸的估計矩形，該步驟包括(a)對調查數據進行壓縮，(b)對圖象進行閾值估計，(c)對調查數據進行二值化，(d)對調查數據進行規則化，(e)從調查數據中提取關聯成分，和(f)從相應於窗口的關聯成分中發現成分。
本發明再進一步的方面致力於從調查數據中提取關聯成分的方法。該方法包括如下步驟向調查數據上所有黑色點(black point)的成分分配初始成分數目，設定初始掃描方向，和掃描調查數據重新分配成分數目，從而使關聯黑色點的成分數目相同。
且本發明再附加的一個方面致力於在從使用暗點的光碟實施例中獲得的調查數據中選擇估計矩形的方法。該方法包括如下步驟在調查數據中發現至少一個暗點，和生成標準尺寸的估計矩形，其中心定位在通過從暗點移動預先確定的距離所發現的點處。
根據本發明的顯示方案，提供了一種強化調查數據圖象顯示的方法。該方法包括如下步驟對調查數據進行快速傅立葉變換，除去頻域(frequency domain)中數據頻譜的一些部分，和執行逆變換以恢復調查數據的已修改版本。
同樣根據本發明的顯示方案，提供了另一種強化調查數據圖象顯示的方法。該方法包括如下步驟確定圖象是否歪斜(skewed)，發現歪斜方向，和修正圖象的歪斜。
本發明的另一個方面涉及從存檔中獲取先前存儲的調查數據並對調查數據進行分析的方法。該存檔能夠根據提供檢驗樣品的患者的特徵對存儲的調查數據進行分類。在本發明的一個方面中，符合從患者特徵中選擇出的多個標準的樣品被選擇進行人口健康趨勢研究。
本發明的另一個方面涉及在白細胞計數中計數不同的組分，並顯示CD4+細胞和CD8+細胞的數量和CD4與CD8細胞的比率。


本發明進一步的目的、方面和方法以及有助於它的附加特點及由其產生的優點，從下文對附圖所顯示的本發明優選實施例的說明中將顯而易見，其中圖1是根據本發明的光生物盤系統的圖示；圖2是結合本發明使用的反射光生物盤的分解透視圖；圖3是圖2所示光碟的頂視平面圖。
圖4是圖2和3所示出的光碟的透視圖，其具有顯示光碟不同層的切除部分；圖5是結合本發明使用的透射光生物盤的分解透視圖；圖6是圖5所示光碟的頂視平面圖；圖7是圖5和6所示出的透射光碟的透視圖，其具有顯示光碟不同層，包括圖8所示半反射層類型，的切除部分；圖8是描繪圖7所示光碟的透視圖，其具有示出光碟半反射層功能方面(functional aspect)的切除部分；圖9是顯示薄金膜厚度與透射性之間關係的圖示；
圖10A是示出根據本發明一個實施例的系統操作的透視圖和框圖；圖10B顯示了分波探測器(split detector)和根據本發明一個實施例的透射光生物盤的橫截面；圖11是垂直於圖2、3和4中示出的反射光生物盤的半徑獲得的部分剖面圖，其顯示了在其中形成的流動溝道；圖12是垂直於圖5、6和7中示出的透射光生物盤的半徑獲得的部分剖面圖，其顯示了在其中形成的流動溝道和單一的頂部探測器；圖13是圖2、3和4中顯示的反射光生物盤的部分縱向剖面圖，其示出了在其中形成的擺動凹槽(wobble groove)；圖14是圖5、6和7中顯示的透射光生物盤的部分縱向剖面圖，其示出了在其中形成的擺動凹槽(wobble groove)和頂部探測器；圖15是類似於圖11的簡圖，顯示了反射光碟的全部厚度及其初始折射性能；圖16是類似於圖12的簡圖，顯示了透射光碟的全部厚度及其初始折射性能；圖17是顯示使用本發明的方法處理從光生物盤上收集的信息的流程圖；圖18是將取樣模擬信號轉變為存儲成一維陣列的相應數位訊號的圖示；圖19是光碟的透視圖，其具有象徵性顯示相對於光生物盤軌道定位的被捕獲白細胞的放大細節圖，該光生物盤在與入射波束相互作用之後產生含有信號的波束；圖20A是根據本發明相對於光生物盤軌道定位的白細胞的圖示；圖20B是根據本發明從圖20A的白細胞獲得的一系列信號跡線(trace)；圖21是示出圖21A、21B、21C和21D之間關係的圖示；圖21A、21B、21C和21D組合在一起是將圖20B的信號跡線轉變為數位訊號的圖示，其中數位訊號存儲成一維陣列並組合成用於數據輸出的二維陣列；圖22是描述用於根據本發明的處理方法和計算法則進行數據估計的步驟的流程圖；圖23是顯示在根據本發明的一個實施例選擇估計矩形時所含步驟的流程圖；圖24是具有如根據本發明一個特殊實施例的軟體所顯示的窗口的光生物盤的圖示；圖25是示出根據本發明一個實施例在從具有窗口的光生物盤上收集的調查數據中發現窗口時所含步驟的流程圖；圖26顯示了調查數據陣列的一個示例行，該調查數據陣列出於根據本發明的一個方案發現閾值的目的進行了掃描處理；圖27是顯示在根據本發明的另一個方案從調查數據中提取關聯成分時所含分步的流程圖；圖28描述了根據本發明的一個實施例在軟體顯示上發現窗口之後修剪估計矩形的結果；圖29顯示了無窗口光碟上的示例暗點和含有被捕獲細胞的靶區；圖30是類似於圖29的簡圖，其顯示了如何根據本發明的一個實施例在無窗口的光碟中利用示例暗點發現細胞；圖31是顯示根據本發明的某個方案對調查數據進行背景照明均勻化時所含步驟的流程圖；圖32顯示了在進行背景照明均勻化之前調查數據的實例，如本發明的軟體所顯示；圖33顯示了在進行背景照明均勻化之後調查數據的實例，如本發明的軟體所顯示；圖34是示出根據本發明的特殊執行對調查數據進行標準化時所含步驟的流程圖；圖35顯示了逐步標準化期間如軟體所顯示的示例調查數據的圖示；圖36顯示了在標準化之後示例調查數據的圖示，如本發明的軟體所顯示；圖37是顯示根據本發明的優選實施例對示例調查數據進行過濾時所含步驟的流程圖；圖38顯示了在過濾步驟之後示例調查數據的圖示，如本發明的軟體所顯示；圖39是圖38所示圖示的近視圖(close-up view)，其具有相應的點值圖跡線(point value graph trace)；圖40是顯示在根據本發明某些方案的特殊實施例從調查數據中除去不需要的成分時所含步驟的流程圖；圖41顯示了在除去裂縫之前示例調查數據的圖示，如本發明的軟體所顯示；圖42是在除去裂縫之後圖41中示例調查數據的圖示，如本發明的軟體所顯示；圖43是顯示在根據本發明的明亮中心法標記和計數細胞時所含步驟的流程圖；圖44顯示了充滿由明亮中心法計數的細胞的示例調查數據的圖示；圖45顯示了圖44所示圖示一部分的近視圖(up-close view)和數值跡線圖；圖46A是顯示在根據本發明的黑暗邊緣法標記和計數細胞時所含步驟的流程圖；圖46B是使用移動環的卷積的圖示；圖47是示例調查數據的圖示，該調查數據中已計數細胞用十字標記，如本發明的軟體所顯示；圖48提供了顯示在使用本發明不同方法所利用的算法提取紅細胞時所含步驟的示例流程圖；圖49顯示了在執行圖48所概述的算法之前含有紅細胞的調查數據的圖示；圖50示出了在執行了圖48所概述算法的第一步之後圖49的示例調查數據的圖示；圖51描述了在應用了圖48所概述算法的第二步之後圖49的示例調查數據的圖示；圖52可視地提供了在執行了圖48所概述算法的第三步之後圖49的示例調查數據；圖53顯示了在執行了圖48所概述算法的第四步之後圖49的示例調查數據的圖示；圖54示出了在應用執行了圖48所概述算法的第五步之後圖49的示例調查數據的圖示；圖55是顯示用圖48所概述的算法計數的紅細胞的近視圖；圖56A是在使用本發明的絕對值計數法計數分散細胞(discretecells)之前它們的圖示屏幕拍攝(pictorial screen shot)；圖56B是顯示在利用本發明絕對值計數法的一個實施例計數細胞時所含步驟的流程圖；圖57是在執行了根據本發明絕對值計數法的該實施例的標準化和過濾步驟之後最初在圖56A中顯示的分散細胞的圖示屏幕拍攝；圖58是在應用了根據本發明絕對值計數法的背景去除和二值化步驟之後最初在圖56A中顯示的分散細胞的圖示屏幕拍攝；圖59是在執行了根據本發明絕對值計數法的規則化步驟之後最初在圖56A中顯示的分散細胞的圖示屏幕拍攝；圖60是在應用了根據本發明絕對值計數法的所示出實施例的一個象素寬度邊界提取(one-pixel wide boundary extraction)步驟之後最初在圖56A中顯示的分散細胞的圖示屏幕拍攝；圖61是在執行了根據本發明絕對值計數法的填充成分步驟之後最初在圖56A中顯示的分散細胞的圖示屏幕拍攝；圖62是在應用了根據本發明絕對值計數法的該特殊實施例的填充調查數據步驟之後最初在圖56A中顯示的分散細胞的圖示屏幕拍攝；圖63是在根據本發明的方法對分散細胞進行計數並用十字標記之後最初在圖56A中顯示的分散細胞的圖示屏幕拍攝；圖64顯示了用於計數凝集和分散紅細胞的絕對值計數法的結果；圖65是顯示在根據本發明的可選擇實施例對圖象進行快速傅立葉變換時所含步驟的流程圖；圖66是在根據本發明進行快速傅立葉變換之前示例調查數據的圖示；圖67顯示了在執行了快速傅立葉變換之後圖66的示例調查數據的圖示；圖68示出了在重新對準(realignment)之前調查數據歪斜圖象表示(skewed graphical representation)的實例；圖69描述了圖68所示圖象表示的歪斜方向；圖70顯示了在重新對準之後圖68的圖象表示；圖71A是描述在為氣泡痕跡情況修正細胞計數時所含步驟的流程圖；圖71B是根據本發明的另一個方案為氣泡痕跡情況修正細胞計數的圖象表示；圖71C是通過被捕獲紅細胞靶區的氣泡痕跡的實例，如在5X顯微鏡下所見到的；圖71D是圖71中的氣泡痕跡和被捕獲紅細胞周圍的放大圖，如在40X顯微鏡下所見到的；和圖72是顯示使用本發明的方法分析血液樣品的圖示流程圖。
具體實施例方式
本發明致力於成像和計數實驗室樣品中的細胞物質的方法和裝置。這些方法和裝置可以用於成像和計數光碟上或光碟內的目標(interest)的任何類型調查特徵。本發明的實施例產生樣品中調查特徵或細胞的調查數據，並對調查數據進行計算機分析。在其它化驗中，細胞能夠替換為珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。
在隨後的描述中，提出了大量的特殊細節以便為本發明的實施例提供更完全的說明。然而本領域的技術人員應當意識到，本發明的實現可以沒有這些特殊細節。在其它的例子中，沒有詳細描述眾所周知的特徵以便不掩蔽本發明。
這裡更詳細地討論使用光碟數據進行白細胞計數的大量實施例。這些實施例並不僅限於成像和計數白細胞，而是可以容易地用於進行任何類型細胞物質的計數。這可以包括，但不僅限於，紅細胞、白細胞、珠子和任何其它產生類似的能夠被光學閱讀器探測的光學信號的物質，包括生物的和非生物的。在其它化驗中，目標的調查特徵，除了細胞以外，可以替換為珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。下面在討論細胞計數時進一步詳細說明了將本發明用於除白細胞之外的物質所需要的一些修改。
在下面的討論中，提供了兩個主要部分，用於示出關於本發明的數據收集和數據分析方案。第一部分提供了用於從實驗室樣品中收集調查數據並將該調查數據轉換成基於陣列的存儲裝置、方法和算法的詳細說明。第二部分提供了用於分析調查數據的方法和算法的詳細說明。這兩個部分之後，提供了關於執行白細胞計數化驗的方法的部分。
1.數據收集本發明的實施例包括檢索(retrieval)調查數據，該調查數據來自實驗室樣品中的細胞物質。圖1是根據本發明的光生物盤110的透視圖。本光生物盤110結合光碟驅動112和顯示器114一起顯示。測試樣品沉積在光生物盤110的指定區域上。一旦光生物盤插入到光碟驅動112中，光碟驅動便使用電磁輻射波束從樣品收集信息，該波束通過與測試樣品相互作用被調整或調製。在對信息進行分析和處理之後，計算機監視器114顯示結果。
能夠在本發明中使用的光生物盤110有兩個主要的實施例。圖2、3和4示出了光生物盤110的反射實施例，而圖5、6和7示出了光生物盤110的透射實施例。
A.反射實施例圖2是光生物盤110一個實施例的結構元件的分解透視圖。圖2是可以在本發明中使用的反射區光生物盤110(下文稱為「反射光碟」)的實例。結構元件包括帽部分(cap portion)116、粘合劑或溝道部件118和基片120。帽部分116包括一個或多個入口122和一個或多個出口(vent port)124。帽部分116可以由聚碳酸酯形成，並優選地在其底部上塗布反射表面146(如圖4中更詳細示出的)，如透視圖2所示。在優選實施例中，在反射層142的表面上含有觸發標記(triggermarking)126，見圖4。觸發標記126可以包括位於光生物盤所有三個層內的乾淨窗口(clear window)、不透光區域、或者用信息編碼的反射或半反射區域。編碼信息用於向處理器166(如圖10A所示)發送數據，處理器166順次與圖8和10A所示的詢問或入射波束152的操作功能相互作用。圖2所示的第二元件是粘合劑或溝道部件118，在其中形成了流體線路128或U形溝道。流體線路128優選地通過衝壓或切除膜以除去塑料膜並形成所示的形狀而形成。每個流體線路128都包括流動溝道130和返回溝道(return channel)132。圖2中示出的一些流體線路128包括混合室134。示出了兩種不同類型的混合室134。第一種是對稱混合室136，其相對於流動溝道130對稱地形成。第二種是偏置混合室138。偏置混合室138形成於圖示流動溝道130的一側。圖2中示出的第三元件是基片120，其包括靶或捕獲區140。基片120優選地用聚碳酸酯製成，並在其頂部沉積有反射層142，見圖4。靶區140通過除去呈圖示形狀或者選擇地呈任何期望形狀的反射層142而形成。選擇地，靶區140可以通過掩模技術形成，該技術包括在施加反射層142之前掩蔽靶區140。反射層142可以由金屬例如鋁或金形成。
圖3是圖2中示出的光生物盤110的頂視平面圖，其在帽部分116上具有反射層142，帽部分116被透明地顯示以顯現位於光碟內的流體線路128、靶或捕獲區140和觸發標記126。因為每個捕獲區都具有一種或多種特異抗原以鎖定(lock down)樣品中的不同組分(或不同細胞)，所以在化驗處理之後，室內的每個捕獲區都含有一類細胞或細胞組分。鎖定或捕獲通過使一種或多種抗原具有能夠「鎖定」在血細胞的特定組分上從而捕獲特定細胞的化學結構而實現。分離細胞組分對於對血細胞，例如白細胞，進行差分計數是至關重要的。在其它化驗中，除了細胞以外，調查特徵能夠是珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。靶或捕獲區140限定了電磁詢問波束與測試樣品相互作用的位置。
圖4是根據本發明一個實施例的反射區類型光生物盤110的放大透視圖。該圖包括其各種層的部分，並經過切除從而示出每個層、基片、塗層或膜的部分剖面圖。圖4顯示了塗布有反射層142的基片120。活性層(active layer)144施加在反射層142上面。在優選實施例中，活性層144可以由聚苯乙烯製成。選擇地，可以使用聚碳酸酯、金、活化玻璃、經過改性的玻璃、或者經過改性的聚苯乙烯例如聚苯乙烯交聯順丁烯二酸酐(polystyrene-co-maleic anhydride)。此外，能夠使用水凝膠。如本特殊實施例所例證的，塑料粘合劑部件118施加在活性層144上。塑料粘合劑部件118的暴露部分示出了被切除或衝壓的U形形狀，其產生了流體線路128。本光生物盤該反射區實施例中的最終結構層是帽部分116。帽部分116包括在其頂部上的反射表面146。反射表面146可以由金屬如鋁或金製成。
B.透射實施例圖5是根據本發明的透射類型光生物盤110結構元件的分解透視圖。透射型光生物盤110的結構元件類似地包括帽部分116、粘合劑或溝道部件118和基片120層。帽部分116包括一個或多個入口122和一個或多個出口124。帽部分116可以由聚碳酸酯層形成。可選擇的觸發標記126可以包含在薄半反射層143的表面上，如圖7和8所詳細示出的。觸發標記126可以包括位於光生物盤所有三個層內的乾淨窗口、不透明區、或者用信息編碼的反射或半反射區。編碼信息用於向處理器166(圖10A所示)發送數據，處理器166然後與圖8和10A所示的詢問或入射波束152的操作功能相互作用。
圖5所示的第二元件是粘合劑或溝道部件118，在其中形成了流體線路128或U形溝道。流體線路128通過衝壓或切除膜以除去塑料膜並形成所示的形狀而形成。每個流體線路128都包括流動溝道130和返回溝道(return channel)132。圖5中示出的一些流體線路128包括混合室134。示出了兩種不同類型的混合室134。第一種是對稱混合室136，其相對於流動溝道130對稱地形成。第二種是偏置混合室138。偏置混合室138形成於圖示流動溝道130的一側。
圖5中示出的第三元件是基片120，其包括靶或捕獲區140。基片120優選地用聚碳酸酯製成，並在其頂部沉積有反射層143，見圖8。與圖5中示出的光碟110的基片120連接的半反射層143顯著薄於圖2、3和4中示出的反射光碟110基片120上的反射層142。更薄的反射層143允許一些詢問波束152透射通過透射光碟的結構層，如圖11所示。薄半反射層143可以由金屬如鋁或金形成。
圖6是圖4中示出的透射型光生物盤的頂視平面圖，其具有顯示位於光碟內的流體溝道、觸發標記126和靶或捕獲區140的透明帽部分116。靶或捕獲區140是電磁波束與測試樣品相互作用的位置。在光碟旋轉之後，樣品內細胞的特定組分被預先裝載在室內的各種捕獲劑或抗原捕獲在不同捕獲區內。
圖7是根據本發明透射光碟的光生物盤110的放大透視圖。光碟110示出了具有各種層的部分，它們被切除掉以顯示每個層、基片、塗層或膜的部分剖面圖。圖7示出了具有透明帽部分116、位於基片120上的薄半反射層143和觸發標記126的透射光碟格式。觸發標記126包括布置在帽頂部上的不透明材料。選擇地，觸發標記126可以由乾淨的、在光碟的薄反射層143上被腐蝕的非反射窗口，或者任何吸收或不反射來自觸發探測器160的信息的標記形成，見圖10A。圖7還顯示，靶區140通過標記呈圖示形狀，或者選擇地呈任何期望形狀的指定區域形成。指示靶區140的標記可以在位於基片120上或者位於基片120底部上(在光碟下)的薄半反射層143上製成。選擇地，靶區140可以通過掩模技術形成，該技術包括掩蔽除了靶區140之外的整個薄半反射層143。在這一實施例中，靶區140可以通過絲網油墨(silk screening ink)建立到薄半反射層143上產生。活性層144施加在薄半反射層143上。在優選實施例中，活性層144是40-200μm的2％聚苯乙烯厚層。選擇地，可以使用聚碳酸酯、金、活化玻璃、經過改性的玻璃、或者經過改性的聚苯乙烯例如聚苯乙烯交聯順丁烯二酸酐(polystyrene-co-maleic anhydride)。此外，能夠使用水凝膠。如本實施例所示出的，塑料粘合劑部件118施加在活性層144上。塑料粘合劑部件118的暴露部分示出了產生流體線路128的被切除或衝壓掉的U形形狀。本光生物盤110的這一透射實施例的最終結構層是乾淨、非反射帽部分116，其包括入口122和出口124。
C.光碟實施例的光學性能兩個光碟實施例之間的主要差異之一是光碟頂層塗層的厚度。在透射光碟的實例中，在基片層120的頂部上沉積薄的半反射層143。在反射光碟實例中，在其基片層120的頂部上沉積基本上更厚的半反射層。在圖8中示出的優選實施例中，透射光碟的薄半反射層143的厚度大約為100-300，不超過400。這是因為金膜層在厚度大於800時完全反射，而在厚度低於大約400時允許光線透過金膜。如下所示，表2提供了金膜相對於膜厚度的反射和透射性能。
表2 Au膜反射率和透射率(絕對值)

光線透過金膜的閾值密度大約是400。除表2之外，圖9提供了薄半反射層143根據金的厚度其反射和透射性質成反比例圖示。圖9中示出的曲線圖所使用的反射和透射值是絕對值。如圖8所示，更薄的半反射層143允許部分的入射或詢問波束152穿透和通過。從而入射或詢問波束152能夠由如圖10A所示的頂部探測器158加以探測。
在反射光生物盤的實例中，返回波束154攜帶關於生物樣品的信息。如上面所討論的，基本上只有在入射波束處於流動溝道130或靶(或捕獲)區140內從而與樣品接觸時，該關於生物樣品的信息才包含在返回波束中。返回波束154也可以攜帶編碼在反射層142內或上或者編碼在擺動凹槽170內的信息，如圖13和14所示出的。正如對於本領域技術人員所顯而易見的，只有在相應的入射波束與反射層142接觸時，預先記錄的信息才包含在具有靶或捕獲區的反射光碟的返回波束154中。當入射波束152位於除去了或者不存在信息攜帶反射層(information bearing reflective layer)142的區域內時，該信息不包含在返回波束154中。
本發明的方法也可以容易地用於包括等半徑溝道(equi-radiochannels)的光生物盤，例如在共同轉讓的美國臨時專利申請序列No.60/353,014中所公開的，其題目為「包括等半徑和/或螺旋分析區的光碟及相關的光碟驅動系統和方法」(Optical Discs IncludingEqui-Radial and/or Spiral Analysis Zones and Related Disc DriveSystems and Methods)，其於2002年1月29日提出申請，在這裡引用作為參考。
D.系統裝置圖10A是示出系統裝置操作的透視圖和框圖，該系統裝置包括光學組件148，和產生入射或詢問波束152、返回波束154和透射波束156的光源150。在反射光生物盤實例中，返回波束154從光生物盤110帽部分116的反射表面146反射。在本光生物盤110的該反射實施例中，返回波束154由底部探測器157加以探測和用於分析信號媒介的存在。在透射光生物盤實施例中，透射波束通過頂部探測器158加以探測，也用於分析信號媒介的存在。在透射實施例中，光電探測器可以用作頂部探測器158。
圖10A還顯示了硬體觸發機構，其包括光碟上的觸發標記126和觸發探測器160。硬體觸發機構在反射光生物盤和透射光生物盤中都使用。觸發機構允許處理器166隻有在詢問波束152處於各自的靶或捕獲區140上時收集數據。而且，在透射光生物盤系統中，還使用軟體觸發器。軟體觸發器使用底部探測器向處理器166發送信號以便在詢問波束152到達各自靶或捕獲區140的邊緣時收集數據。圖10A還示出了驅動馬達162和用於控制光生物盤110旋轉的控制器164。圖10A進一步顯示了在可選擇實施例中實現的處理器166和分析器168，它們用於處理返回波束154和與透射光生物盤相伴的透射波束156。在透射光生物盤的例子中，透射波束156攜帶關於生物樣品的信息。在該實施例中，光碟上有預先記錄的信息。探測器158收集該波束。
在本發明的另一個實施例中，分波頂部探測器用於收集透射波束156。圖10B顯示了根據本發明一個實施例的分波探測器。探測器170具有兩個探測器組件172和174。這兩個探測器組件收集被物體186(例如細胞)折射的透射波束156並產生兩個信號A和B。物體186能夠是調查特徵，例如生物細胞如紅或白細胞。通過從一個信號中減去另一個信號(也就是A-B或B-A)能夠獲得差分信號。當探測器組件位於含有散射入射波束152的物體的區域上方時，它們探測信號中的變化。每個探測器察看到與另一個探測器的所見相反的變化。換言之，當光線向一個探測器彎曲時，它看到信號增加，而另一個探測器看到信號減小。由於這個性質，能夠通過產生如下信號顯著地增加信噪比，該信號是兩個探測器的每一個所產生信號的差分。該差分信號具有兩個優點。第一，差分信號中消除了系統中的任何等量影響兩個探測器的噪音。第二，光碟上能夠折射光線而不只是吸收光線的目標物體會在差分信號中引起較大而且容易探測的變化。這有助於分析任務，其需要分離從背景噪音中由目標物體產生的信號。
分波探測器更全面的討論存在於共同擁有的美國臨時專利申請No.60/355,090中，其於2002年2月14日提出申請，題目為「用於生物驅動的分割區域探測器及其相關方法」(Segmented Area Detectorfor BioDrive and Methods Relating Thereto)，和相同題目的相關臨時專利申請中，其序列編號為No.60/335,123；60/352,649；60/353,739和60/355,090，它們分別於2001年10月10日；2002年1月28日；2002年1月30日和2002年4月7日提出申請，它們全部引用在這裡作為參考。能夠與本發明聯合使用的不同類型探測器更全面的討論存在於共同擁有的美國專利申請No.10/043,688，其與2002年1月10日提出申請，題目為「光碟分析系統及用於生物和醫學成像的相關方法」(optical Disc Analysis System Including Related Methods ForBiological and Medical Imaging)，其也在這裡引用作為參考。
圖11-16顯示了反射和透射實施例的剖面圖，用於示出光碟的光學性質和探測器如何用於從光碟收集攜帶信息的波束。
現在更詳細地參考圖11，其顯示了根據本發明的光生物盤110反射光碟實施例的部分剖面圖。圖11示出了基片120和反射層142。如上所示，反射層142可以由材料例如鋁、金或其它合適的反射材料製成。在該實施例中，基片120的頂表面光滑。圖11還顯示了施加在反射層142上的活性層144。如圖11所示，靶區140通過除去反射層142期望位置處的區域或部分而形成，或者選擇地，通過在施加反射層142之前掩蔽期望區域而形成。如圖11進一步示出的，塑料溝道部件118施加在活性層144上。圖11還顯示了帽部分116和與之連接的反射表面146。這樣，當帽部分116施加在含有期望切除形狀的塑料溝道部件118上時，藉此形成流動溝道130。如圖11顯示的箭頭所示，入射波束152的路徑從光碟110的下方朝基片120初始導向。然後入射波束聚焦在緊鄰反射層142的點處。因為這一聚焦發生在靶區140內，在該處除去了反射層142的一部分，所以入射波束繼續沿著路徑通過活性層144並且進入到流動溝道130內。然後入射波束152繼續向上傳播通過流動溝道最終入射(fall incident)到反射表面146上。在該點處，入射波束152沿著入射路徑返回或反射從而形成返回波束154。
圖12是根據本發明的光生物盤110透射實施例的部分剖面圖。圖12示出了具有乾淨帽部分116和位於基片120上的半反射層143的透射光碟格式。圖12還顯示了施加在薄半反射層143上的活性層144。在優選實施例中，透射光碟具有用金屬例如鋁或金製成的薄半反射層143，其厚度為大約100-300埃，優選地不超過400埃。該薄半反射層143允許部分來自光碟150(見圖10A)的入射或詢問波束152穿過並向上通過待被頂部探測器158探測的光碟，同時一些光線被沿著與入射波束相同的路徑但沿著相反的方向反射回來。在這一布置中，返回或反射波束154從半反射層143反射。這樣在該方式中，返回波束154不進入流動溝道130。反射光線或返回波束154可以用於跟蹤預先記錄信息軌道上的入射波束152，預先記錄信息軌道形成於半反射層143內或上，如圖13和14更詳細描述的。在圖12示出的光碟實施例中，可以存在或者可以不存在所限定的靶區140。靶區140可以由在基片120的薄半反射層143上製成的直接標記產生。這些標記可以使用絲網印刷或者任何等效的方法實現。在可選擇實施例中，其不使用物理標記限定靶區，流動溝道130有效地用作受限制的(confined)靶區域，在其中對調查特徵進行檢查。
圖13是根據本發明的光生物盤110反射光碟實施例軌道的縱向(taken across)剖面圖。該圖是縱向沿著光碟的半徑和流動溝道獲取的。圖13包括基片120和反射層142。在該實施例中，基片120包括凹槽170系列。凹槽170呈從光碟的中心附近向外周延伸的螺旋形狀。實現凹槽170使得詢問波束152可以沿著光碟上的螺旋凹槽尋軌(track)。這種類型的凹槽170稱作「擺動凹槽」。具有波浪或波形側壁的底部分形成凹槽170，同時被提高或提升的部分隔離螺旋中的相鄰凹槽170。施加在本實施例中的凹槽170上的反射層142，如圖所示，實際上(in nature)是共形的(conformal)。圖13還顯示了施加在反射層142上的活性層144。如圖13所示，靶區140通過除去反射層142期望位置處的區域或部分形成，或者選擇地，通過在施加反射層142之前掩蔽期望區域形成。如圖13中進一步示出的，塑料粘合劑或溝道部件118施加在活性層144上。圖13還顯示了帽部分116和與之連接的反射表面146。這樣，當帽部分116施加在含有期望切除形狀的塑料粘合劑部件118上時，藉此形成流動溝道130。
圖14是根據本發明的光生物盤110透射光碟實施例，如圖12所描述的軌道的縱向(taken across)剖面圖。該圖是縱向沿著光碟的半徑和流動溝道獲取的。圖14示出基片120和薄半反射層143。該薄半反射層143允許來自光源150的入射或詢問波束152穿過和通過待被頂部探測器158探測的光碟，同時一些光線以返回波束154的形式反射回來。薄半反射層143的厚度由光碟閱讀器維持其尋軌能力(trackability)所需的最小量反射光線決定。本實施例中的基片120與圖13中所討論的相似，包括凹槽170系列。本實施例中的凹槽170也優選地呈從光碟的中心附近向外周延伸的螺旋形狀。實現凹槽170使得詢問波束152可以沿著凹槽尋軌。圖14還顯示了施加在薄半反射層143上的活性層144。如圖14中進一步示出的，塑料粘合劑或溝道部件118施加在活性層144上。圖14還顯示了無反射表面146的帽部分116。這樣，當帽部分116施加在含有期望切除形狀的塑料粘合劑部件118上時，藉此形成流動溝道130並允許部分入射波束152基本上無反射地通過其間。
圖15是與圖11類似的簡圖，顯示了反射光碟的全部厚度及其初始折射性能。圖16是與圖12類似的簡圖，顯示了透射光碟的全部厚度及其初始折射性能。凹槽170在圖15和16中沒有顯示，因為這些部分是沿著凹槽170切割的。圖15和16顯示了狹窄流動溝道130的存在，其在這些實施例中垂直於凹槽170定位。圖13、14、15和16顯示了各自反射和透射光碟的全部厚度。在這些圖中，入射波束152被示出與基片120初始相互作用，基片120具有改變入射波束路徑的折射性能，如圖所示，從而將波束152聚焦在反射層142上或者薄半反射層143上。
E.模擬-數字處理無論是從反射光碟的返回波束154獲得的還是從透射光碟的透射波束獲得的，關於生物測試樣品的信息都被導向到處理器166(見圖10A)用於信號處理。該處理包括將由底部探測器157(反射光碟)或頂部探測器158(透射光碟)探測的模擬信號轉換為離散的數字形式。
圖17是與圖10B所示裝置相關的信息檢索處理的概要流程圖。在步驟270中，如果實施例是透射光生物盤，那麼通過探測器158探測攜帶關於生物樣品信息的透射波束。如果實施例是反射光生物盤，那麼在步驟272中通過探測器157探測反射波束154。在任何一個實例中，在步驟274將信息發送到模擬-數字轉換。在步驟276中，結果數字數據是陣列。
圖18顯示了通過處理器166執行的模擬-數字轉換。該轉換包括以固定的時間間隔212取樣模擬信號210，和將信號的相應瞬時模擬振幅214編碼成為離散的二進位整數216。取樣在某一開始時間218開始，並在某一結束時間220停止。與任何模擬-數字轉換處理相關的兩個通用值是取樣頻率和比特深度(bit depth)。取樣頻率，也稱作取樣速度，是每單位時間所取的樣品數目。較高的取樣頻率在連續樣品之間產生較小的時間間隔212，這導致數位訊號222與原始模擬信號210相比具有更高的保真度。比特深度是每個指向(point to)編碼模擬信號210的採樣振幅214的樣品中使用的比特數目。比特深度越大，二進位整數與原始模擬振幅214的近似度越好。在本發明的一個實施例中，取樣速度是8MHz，每個樣品的比特深度是12比特，其允許的整數樣品範圍是0-4,095(0至2n-1，其中n是比特深度)。
在其它實施例中，比特深度和取樣頻率的組合能夠被自定義(customized)以適應特殊的精度需要。通過非限制性的實施例，可以期望提高實施例中的取樣頻率，該實施例包括用於計數通常比細胞小的珠子的方法。在模擬-數字轉換期間，沿雷射路徑的每個連續樣品點224都連續存儲在光碟上或存儲器內成為一維陣列226。每個連續軌道提供一個獨立的一維陣列。所有的一維陣列都組合在一起形成二維陣列228(如圖21B所示)，其類似於普通圖象表示。
這裡提供數據收集實例以進一步示出在從光生物盤收集數據時涉及的細節。圖19顯示了本發明的光生物盤110的透視圖。圖19包括被指定顯示相對於光生物盤軌道232定位的被捕獲白細胞230的部分的放大詳細透視圖。如圖所示，入射波束152與白細胞230的相互作用產生了含有信號的波束，其或者處於反射光碟返回波束154的形式，或者處於透射光碟透射波束156的形式，這些光碟由底部探測器157或頂部探測器158加以探測。
圖20A、20B和圖21A-21D示出了細胞如何被捕獲進入數字數據。在其它化驗中，目標的調查特徵不是細胞，而是珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。圖20A是相對於光生物盤110的軌道232定位的白細胞230的圖示。細胞230定位在類似於圖19所示光碟的光碟上。圖20B是根據本發明源自於圖20A中的白細胞230的信號軌跡系列。圖20B描繪了標誌有A、B、C和D的相應軌跡。然後模擬信號軌跡(信號)210被導向到處理器166用於轉換成相應的數位訊號222(如圖21A-21D所示)。圖20B進一步顯示出，對白細胞230的掃描產生了能夠被探測和處理的入射波束的擾動(perturbation)231。
圖21是示出圖21A、21B、21C和21D之間布置關係的圖示，這些圖組合在一起示出了來自圖20B的四個軌道A、B、C和D如何轉換為單一的二維數字數據陣列228。
現在特別參考圖21A，其顯示了來自圖20A所示光生物盤軌道A和B的取樣模擬信號210。然後處理器166將模擬信號210的相應瞬時模擬振幅214編碼成離散的二進位整數216(見圖12)。數據點的結果系列是類似於取樣模擬信號210的數位訊號222。
現在轉移到圖21B，來自軌道A和B(圖21A)的數位訊號存儲為獨立的一維存儲陣列226。每個連續軌道都提供相應的一維存儲陣列，其在與先前的一維陣列組合時產生數字數據的二維陣列228。然後數字數據存儲在存儲器中或光碟上作為樣品點224(圖18)的二維陣列228，該樣品點表示樣品區域中特殊點處的返回波束154或透射波束156的相對密度。然後二維陣列以原文件(raw file)或圖象文件240的形式存儲在存儲器中或光碟上。然後從存儲器242檢索存儲在文件240中的數據，並用作輸入到分析器168(圖10A)的數據輸出244。
圖21C顯示了來自圖20A所示光生物盤軌道C和D的取樣模擬信號210。然後處理器166將模擬信號210的相應瞬時模擬振幅214編碼成離散的二進位整數216(圖18)。數據點的結果系列是與取樣模擬信號210類似的數位訊號222。
現在參考圖21D，來自軌道C和D(圖21C)的數位訊號222存儲為獨立的一維存儲陣列226。每個連續軌道提供一個相應的一維陣列，其在與先前的一維陣列組合時產生與圖象類似的二維陣列228(圖21B)。如上，數字數據而後存儲在存儲器內或光碟上作為樣品點224(圖18)的二維陣列228，樣片點表示樣品區域特殊點處返回波束154或透射波束156(圖19)的相對強度。而後二維陣列以原文件、數據文件或圖象文件240的形式存儲在存儲器內或光碟上。然後從存儲器240檢索存儲在文件240內的數據，並用作向分析器168(圖10A)的數據輸出。
從光生物盤捕獲數據並將該數據轉換成二維整數陣列的附加方法和算法具有廣泛的應用性，並且在如下專利申請中公開，即美國臨時專利申請序列No.60/291,233，題目為「用於在光生物盤組件中提供分析結果像素的可變取樣控制及相關裝置」(Variable SamplingControl for Rendering Pixelation of Analysis Results in OpticalBio-Disc Assembly and Apparatus Relating Thereto)，其於2001年5月16日提出申請，並在這裡引用作為參考。
本發明的另一個實施例將調查數據存儲在存檔內。該存檔提供能夠對調查數據加以分類的空間。隨後，能夠分析各組數據指導不同人類群體的健康趨勢研究。例如，調查數據能夠聯繫患者的信息產生能夠通過患者的屬性(attributes)加以分類的調查數據目錄。諸如年齡、性別、種族和血型的信息例如能夠用於分類調查數據。該存檔能夠利用可搜索的相關資料庫。一旦建立這樣的存檔，就能夠對特定分類的調查數據進行分析。例如，人口健康趨勢研究可以通過檢索調查數據並分析這些調查數據加以執行，調查數據由特定城市的患者捐贈。該優勢在於研究的執行不需要人群本身到場。一段時間之後，能夠建立歷史存檔，並能夠對一段時期的特殊人口進行研究以及能夠分析一段時間的趨勢。
II.數據分析下述部分涉及本發明的數據分析方案。這裡特別地結合圖22-71D並一般地參考先前的圖1-21進行討論。
A.數據收集和處理在一個實施例中，對來自光生物盤的調查數據加以分析用於細胞計數，其中調查數據以數字數據的形式存儲。在另一個實施例中，使用其它形式的調查數據進行分析。在其它化驗中，調查數據能夠含有用於計數珠子(bead)(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記的信息。本發明的一個實施例將該調查數據實時發送到數據分析器。在另一個實施例中，存儲調查數據並在後來加以檢索進行分析。在兩個實施例中，本發明的計算和處理算法存儲在分析器168(圖10A)內，並應用於輸入調查數據244以產生有用的輸出結果262(圖22)，該結果可以顯示在顯示器114(圖10A)上。作為非限制性實例，下文說明了用於處於數字數據陣列形式的調查數據的分析方法。考慮到本發明，本領域技術人員可以意識到，除了數字數據陣列格式以外，本發明的方法能夠用於各種形式的調查數據。
現在繼續到圖22，其顯示的流程圖提供了根據本發明的處理方法和計算算法進行數據分析的步驟的一般概覽。本處理方法的第一步包括收到輸入調查數據244。如上所述，數據分析以二維整數陣列開始，其範圍為0-4,095。下一步246是選擇用於計數的光碟估計矩形。一旦限定該矩形，目標便成為得出矩形內所含全部白細胞的實際數量。這一區域稱作「調查數據區域」。步驟246的實現取決於光碟的構型。兩種可能的光碟構型包括具有窗口的光碟和沒有窗口的光碟。
作為非限制性的實例，在本發明使用的具有窗口，例如圖2和4所示靶或捕獲區140，的光碟實施例中，軟體識別窗口並切割其一部分用於分析和計數。在一個優選實施例中，如圖2所示出的，每個窗口(或捕獲區)都具有矩形的形狀，該矩形為1×2mm並在其每端(end)上具有半圓形部分。在該實施例中，軟體在各自窗口內切割1×2mm的標準尺寸估計矩形。在該實施例的方案中，閱讀器可以獲取數個連續的樣品值，以比較數個不同窗口內的細胞數目。
在本發明使用的無窗口透射光碟的實施例中，如圖4所示，步驟246以一種或兩種方式執行。標準矩形位置的選擇或者通過相對於具有固定坐標的點定位其中心或者通過發現校準點執行，校準點優選地是具有特殊特性的暗染色點。在採用校準點的實例中，具有期望對比度的染料相對於兩個細胞群沉積在光碟的特殊位置處。然後光碟閱讀器被引導跳躍到其中一個細胞群的中心，而後標準尺寸(1×2mm)估計矩形居中在所選擇群上。在其它化驗中，細胞可以替換為珠子(bead)(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。
除了提供兩種類型的光碟之外，步驟246還允許用戶進行選擇。用戶可以通過直接用滑鼠選擇或者其它方法直接交互地指定期望的用於細胞計數的樣品區域形狀，例如矩形區域。在軟體的這一實施例中，涉及使用滑鼠在顯示於監視器114(圖1)上的調查數據圖示的期望部分上點擊並拖動一個形狀。不管估計區域的選擇方法，在下一步驟248對各個矩形區域進行估計用以計數。
圖22的第三步是步驟248，其致力於背景照明均勻化。該處理通過一硬體構型修正可能的背景均勻性波動。背景照明均勻化補償每個樣品點的強度水平，從而使整個背景或者非細胞的調查數據的一部分接近一個具有任意背景值V背景(Vbackground)的平面。儘管V背景可以通過許多方式決定，例如採用整個標準矩形樣品區的平均值，但在本實施例中V背景被設定為2,000。所選矩形樣品區每個點P處的值V用數值(V背景+(P附近區域的V平均值))代替。如果需要，結果V可以縮小以適合數值實際可能的範圍，其在本發明優選實施例中為0-4,095。相鄰矩形的尺寸選擇得比細胞的尺寸充分地大，比標準矩形的尺寸充分地小。在其它化驗中，為珠子(bead)(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記選擇相鄰矩形。
圖22中流程圖的下一步是標準化步驟250。在執行標準化步驟250中，對標準矩形樣品區域內的數據進行線性轉換，從而使平均值為2,000，標準偏差為600。如果需要，縮小該數值以適應0-4,095的範圍。這一步驟250以及背景照明均勻化步驟248，使軟體對硬體修改和調諧較不敏感。作為非限制性實例，探測電路例如頂部探測器158(圖13)內的信號增益可以改變而不會顯著影響結果細胞計數。
如圖22所示，接下去執行過濾步驟252。對於標準矩形內的每個點P，計算P附近區域內點的數目，該區域的尺寸小於步驟248所示的尺寸，數值與V背景顯著不同。被計算的點的數目應當接近調查數據中細胞的尺寸。在其它化驗中，被計算點的數目應當接近於目標物，目標物包括珠子(bead)(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。如果所發現區別點的數目足夠大，P處的數值保持不變；否則將其指定為V背景。執行該過濾操作是為了除去噪音，並且在最佳情況下，只有細胞保留在調查數據中，而背景均一地等於V背景。
可以執行致力於除去壞成分的可選擇步驟254，如圖22所示。缺陷例如劃痕、氣泡、灰塵以及其它類似的不規則，可以經過過濾步驟252。這些缺陷可以通過直接或間接地影響調查數據直方圖中的整體分布導致細胞計數誤差。該步驟利用如下事實，即這些缺陷的尺寸顯著大於細胞的尺寸，並通過適當的算法除去它們。在其它化驗中，其可以實際地應用到其它調查特徵中，例如珠子(bead)(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。在確定除去缺陷有多好時要考慮它們的尺寸。在可選擇步驟254之後，優選地重複步驟248、250和252。
如圖22所示，下一處理步驟是步驟256，其致力於通過明亮中心計數細胞。計數步驟256包括數個分步驟。它們是(1)利用卷積使細胞中心更加可見，(2)標記這些中心，和(3)對細胞進行真實計數。在一些硬體構型中，一些細胞可以顯示出沒有明亮中心。在這些例子中，只有黑暗邊緣可見，從而下述的兩個可選擇步驟258和260是有用的。
步驟258致力於從圖象中除去所發現的細胞。在步驟258中，圍繞每個已發現細胞的圓形區域填充數值2,000(背景預設值)從而使同時具有明亮中心和黑暗邊緣的細胞不會被發現兩次。步驟260致力於通過識別黑暗邊緣計數額外的細胞。步驟258之後對調查數據進行兩種轉換。目的在於使黑暗邊緣更加明顯從而能夠計數在步驟256中未通過明亮中心方法計數的細胞。在另一個實施例中，通過黑暗邊緣計數細胞的方法能夠代替通過明亮中心計數細胞的方法。
在計數步驟256之後，或者在選擇地採用計數步驟260之後，圖2所示的最後一個步驟是結果輸出步驟262。在標準矩形中發現的細胞數目顯示在圖1所示的監視器114上。所識別的每個細胞在所顯示的得自光生物盤的調查數據上用十字標記。
下面聯繫詳細概述分步驟的框圖給出圖22所示每一步驟的詳細說明。
步驟1數據輸入步驟244檢索存儲在二維陣列內的範圍為0-4,095的數據。黑色部分填充數值常數0，而光線探測的面積範圍為1-4,095。在結果數據估計中，忽略0。
步驟2a在具有窗口的光碟中選擇估計矩形圖23顯示了選擇估計矩形的詳細處理過程(圖22的步驟246)。在步驟300，確定選擇的類型。第一選擇302包括從光生物盤選擇估計矩形，該光生物盤具有物理嵌入的窗口，例如圖2和4所示的靶或捕獲區140。圖24顯示了具有窗口326和328的光碟的調查數據實例的圖示，其通過根據本發明實施例的軟體加以顯示。
根據一個實施例的步驟304的詳細處理如圖25所示。在步驟330，圖25，調查數據陣列以如下方式壓縮，即只考慮每個第n行和每個第n列。然後在步驟332，以逐行的方式掃描經過壓縮的調查數據以確定二值化步驟中使用的閾值。圖26提供了用於示出的示例。在示例行342中，每個細胞代表調查數據上的一個點，且每個細胞內的數值表示該點處探測到的光線強度。掃描通過為調查數據陣列的每一行選擇所有可能的段(segment)長度L開始。從而，圖26為來自調查數據陣列的該示例行顯示了所有可能的段長度L。實際陣列將具有許多這樣的示例行。L被選擇為略小於光碟上窗口的寬度。然後，使用所考慮段內的所有整數值為每個段計算平均值。因為段沿著行「滑動」，所以該處理稱作發現「滑動平均值」。一旦發現了所有行段長度L的平均值，便確定了平均值的最小值和最大值。閾值T計算為(最小(平均值)+最大(平均值))/2。該處理減少了搜索窗口以發現覆蓋窗口區域的段的任務量。因為窗口區域比非窗口區域亮，所以這些段的平均值高於閾值T，並且在後面的步驟能夠更容易地識別。
一個實施例加速了段L平均值的計算，如下。在計算段中所有數值的總和a(n)時，其中n從K+1到K+L(K+1是段的開始點)，a(K+L)加到總和a(n)上並從總和a(n)減去a(K)。對K的所有數值重複該步。這使得算法不必在從行中移下一個單元時將段所有數值的總和再重新全加一遍。對每一行重複該發現閾值的整個處理直到以這種方法掃描完所有行為止。
返回圖25，在步驟334中執行二值化。在該步中，數值超過閾值T的點顯示為黑色，而其餘的則顯示為白色。所以現在調查數據能夠象是黑色和白色的圖象一樣加以處理。隨後的二值化，在步驟336對調查數據進行規則化。規則化包括兩個部分侵蝕(erosion)和擴展(expansion)。侵蝕的執行如下。對於圖象P，構建相應的圖象P』。如果(1)P中相應點X為白色，或者(2)X的任何相鄰點為白色，則P』中的點X』顯示為白色。如果每個條件都未滿足，則X』顯示為黑色。P』是侵蝕的結果圖象。以相反的方式執行擴展。對於圖象R，構建相應的圖象R』。如果(1)R中相應點X為黑色，或者(2)Y的任何相鄰點為黑色，則P』中的點Y』顯示為黑色。如果每個條件都未滿足，則Y』顯示為白色。R』是侵蝕的結果圖象。多個侵蝕和擴展的組合使得二值化圖象更加規則(單一黑色和單一白色消失)。
在執行規則化之後，結果調查數據傳遞到步驟338用於提取關聯成分。在該步驟中，對調查數據加以掃描，從而定義關聯成分。對於調查數據中任何給定的黑色點對，如果兩個點被它們之間一連串的黑點連接，則該對定義為處於同一成分。這一步驟的主要目的在於將調查數據分解成用白色空間分隔的關聯黑色成分的集合。
圖27顯示了提取關聯成分的分步。第一步驟350包括分配初始成分數字。以如下方式掃描調查數據，即給被掃描的第一黑色點分配「0」，下一個分配「1」，如此繼續。所有白色點分配「-1」。在步驟352，設定初始掃描方向。有四個方向(1)「++」表示從上到下，從左到右，(2)「+-」表示從上到下，從右到左，(3)「-+」表示從下到上，從左到右，(4)「--)表示從下到上，從右到左。
初始掃描方向設定為「++」，意味著從上到下，從左到右。在步驟354，對調查數據的掃描如下。具有如下黑色相鄰點P』的每個黑色點P獲得P』的分配數字，該黑色相鄰點P』的分配數字(在步驟350中分配)小於P的分配數字。例如，如果P的數字為7，其相鄰點P』的分配數字為6，則P的新數字為6。
接著改變確定步驟356。算法檢查，看是否調查數據點中的任何黑色點都通過步驟354分配了新的數字。如果是，則在步驟358中改變掃描方向。方向的改變遵循如下法則(1)如果當前方向為「++」，則新方向為「+-」。
(2)如果當前方向為「+-」，則新方向為「-+」。
(3)如果當前方向為「-+」，則新方向為「--」。
(4)如果當前方向為「--」，則新方向為「++」。
在步驟354中再次以新方向開始掃描。該循環持續到掃描完成而在成分數目中檢測不到任何改變時為止。根據成分數目變化改變掃描方向減小了處理所需的掃描經過次數。
步驟356之後，關聯成分內的所有點都應當具有相同的數字。在步驟360，對成分中的點重新編號。這一步驟是需要的，因為一些數字可能已經消失了。例如，如果初始調查數據中有20個黑色點，那麼每個點都會獲得0-19的數字。如果掃描之後，發現有5個成分，則20個初始數字中有5個會消失。在5個數字為例如1，4，9，16和18的成分中將留下黑色的點。重新編號步驟將這5個成分中的點重新編號為0-4。大體上，調查數據中N個成分的編號(enumeration)從0到N-1。這便完成了關聯成分提取的處理。
返回圖25，在提取關聯成分之後(步驟338)進行發現落入窗口內的成分的步驟(步驟340)。選擇滿足特定邏輯限制的最大的黑色成分。邏輯限制包括能夠位於光碟上的窗口的數目以及窗口之間的近似距離。這便完成了發現窗口的處理，其將整個矩形選擇處理(圖23中)帶到下一在窗口內切割標準矩形的步驟(步驟306)。
為了發現標準矩形，其具有(1)最大的總和照明(summaryillumination)和(2)位於相應於窗口的成分的一個點處的中心，包括該成分的區域的掃描如下。首先，算法沿著水平方向掃描並計算滑動平均值，如圖26所示。然後算法沿著垂直方向掃描並計算滑動平均值。這包括產生如下段，其垂直地穿過調查數據陣列中的多個行。段的長度近似於窗口的高度。水平滑動平均值與垂直滑動平均值的最大平均值的交點顯示為估計矩形的中心。該點具有最大值，因為它是窗口中最亮的點。將該點選擇作為估計矩形的中心。一旦定義了該中心，在步驟312中，通過從中心點進行測量產生1×2mm(標準尺寸)的估計矩形。圖28顯示了在根據本發明實施例的軟體顯示上發現窗口之後，切割估計矩形的結果。
其它發現中心點的技術包括使用邊緣跟蹤(edge tracing)發現窗口，發現窗口的中心(使用點值)，和通過檢查代表調查數據的圖象人工選擇點。
步驟2b在無窗口的光碟內選擇估計矩形選擇估計矩形的第二個選擇是圖23中的步驟308，為無窗口的光生物盤選擇。一個實施例使用光碟上的暗點定位估計矩形的期望位置。算法開始於步驟310，圖23，發現用作用於標定光碟上樣品不同區域的標記的暗點。暗點能夠以如下的方式發現，該方式與結合圖26討論的在發現窗口中使用的滑動平均值相同。因為現在靶標是非常小的暗點(而不是窗口)，所以發現暗點中使用的段要短得多。它們的長度接近於暗點的尺寸。然而，發現滑動平均值的操作原理相同。具有最低滑動平均值的段鑑別為暗點。
圖29示出了暗點366的實例。在步驟312，圖23，一旦發現了暗點，算法移離暗點以產生估計矩形。切割標準尺寸的估計矩形，其中該矩形具有定位在通過從所發現的暗點移離預先確定距離而發現的點處。圖30顯示了在從所發現的暗點366移離預先確定距離後切割的估計矩形368的實例。虛橢圓368、370和372鑑別了其它的細胞區域。在本發明的優選實施例中，估計矩形的位置信息能夠嵌入在光碟上。代替發現暗點，系統能夠從光碟閱讀位置信息以定位用於放置估計矩形的區域。
步驟2c選擇估計矩形，包括用戶選擇的選項選擇估計矩形中的第三個且是最後一個選項涉及用戶通過軟體用戶界面的輸入，如圖23的步驟316所示。在屏幕上，將根據調查數據生成的光生物盤的圖象顯示給用戶，用戶通過在圖象上定義(defining)矩形選擇估計矩形。在步驟316，確認用戶所選的矩形是否大於標準尺寸。如果否，則意味著用戶的矩形小於標準尺寸(步驟318，圖23)。在這種情況下，在步驟322使用用戶所選擇的矩形進行計數。如果用戶的矩形大於標準尺寸(步驟320，圖23)，在步驟324中切出標準尺寸估計矩形。
步驟3背景照明均勻化圖31給出了圖22中步驟248的更詳細說明。選擇出估計矩形之後，在以估計矩形為邊界的區域內(稱作「調查數據區域」)執行背景照明均勻化。這一步驟的主要目的是消除背景噪音，從而使背景更加均勻。為了實現它，在電執行(electrical implementation)中，背景照明均勻化使用軟體算法模擬增益控制(gain control)的效果。
在圖31的步驟380，選擇相鄰矩形(標準矩形內)的標準尺寸。注意相鄰矩形不要與估計矩形混淆。相鄰矩形設定在單一估計點的周圍。其尺寸選擇成比細胞足夠地大，但受背景照明不均勻的影響足夠地小。在其它化驗中，能夠替代細胞的調查特徵是珠子(bead)(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。從而，根據所進行化驗的類型選擇相鄰矩形的尺寸。相鄰矩形的尺寸為給定點P確定了在P附近有多少點被估計用於背景照明均勻化的處理。
在步驟382和384中分別進行垂直掃描和水平掃描以計算調查數據中每個點的K均值。
K以如下方式導出。首先，執行垂直掃描。在一個實施例中，首先計算調查數據區域中所有點的垂直平均值。點(x，y)的垂直平均值Kvert是(x，y-dy)-(x，y+dy)的範圍中所有點的平均值。實際上，所有點列均沿著垂直方向加以掃描。dy項是相鄰矩形的半高，該相鄰矩形的尺寸在步驟380中確定。這裡應用圖26所描述的滑動平均值計算技術，除了現在的處理是沿著垂直方向進行之外。
一旦發現所有點的Kvert，便如下地執行水平掃描。對於點(x，y)，該點的最終平均值通過獲取(x-dx，y)-(x+dx，y)範圍內所有點的Kvert給出。實際上，所有行均沿著水平方向加以掃描。dx項是相鄰矩形的半寬，該相鄰矩形的尺寸在步驟380中確定。總體結果是，對於特定點P，將P的相鄰矩形內與P在同一行的所有預先計算的Kvert值加以平均以獲得P的最終平均值。預先計算Kvert值減少了計算時間。計算時間不是與調查數據區域的尺寸乘以相鄰矩形的尺寸成比例，而是計算時間僅與調查數據區域成比例。
繼續參考圖31，在步驟386，通過將每個點P的值V再分配給Vbackgroud+(V-Kneighbor)，其中Kneighbor是以P的相鄰矩形為邊界的所有點的平均值。在一個實施例中，背景值Vbackgroud設定為整個調查數據區的平均值。在另一個實施例中，Vbackgroud設定為2,000。如果P的新值大於4,000，則使用4,000。如果它小於1，則使用1。先前為0的P值替換為2,000。該步之後，調查數據任何大區域內的平均值大約為2,000。換言之，整個背景接近一個具有任意背景值Vbackground的平面。圖32顯示了如背景照明均勻化之前軟體所顯示的調查數據，而圖33顯示了如背景照明均勻化之後軟體所顯示的調查數據。已成像的調查數據572，其是以圖象格式提供的調查數據，表示了調查目標的數據。在圖32和圖33中，已成像的調查數據572標記或相應於被捕獲的細胞。不使用滑動平均值，另一個實施例在背景照明均勻化步驟中使用傅立葉變換(FT)。在執行傅立葉變換時，調查數據首先轉化為頻域。然後，除去頻域內的一部分頻譜。這除去了一部分由光生物盤以及電路中的電噪音和其它不規則產生的背景噪音。在一個實施例中，除去了波長非常短或非常長的頻譜(頻率除以波長為1)。這些被除去波長的閾值經驗地加以確定。最後，執行逆變換從而將數據還原成空間域。
步驟4標準化圖34詳細示出了圖2的步驟250中所包含的步驟。如本文上面所概述的，需要進行標準化使標準偏差為600左右的數值，而調查數據的平均值為2,000左右的數值。標準化還使軟體對硬體修改和調諧較不敏感。例如，探測電路，例如圖10A的頂部探測器158，中的信號增益可以改變而不會顯著影響結果細胞計數。
為了實現它，在一個實施例中，處理在步驟390開始，為來自上一步驟(背景照明均勻化)的結果調查數據計算平均值A和標準偏差S。忽略數值為0的點。在步驟392，圖34，如下地對調查數據中的每一個點執行標準化。在一個實施例中，對於每個點P，P的值v替代為2,000+(v-A)*600/(S)。成分(v-A)使每個點集中，同時成分(600/S)調節振幅。結果與背景值2,000相加。數值600能夠被調整以便獲得期望的振幅範圍。圖36的數值曲線400顯示了標準化之後曲線的一個實例。注意，數值曲線在2,000附近波動，波動振幅保持在600左右。
一旦P值被標準化，便如下地執行截取(步驟394)1)如果P的新值超過4,000，則數值截取為4,000；2)如果P的新值小於1，則數值截取為1。
在一個實施例中，軟體的繪圖用戶界面顯示調查數據中所有點的直方圖，從而使用戶看到標準化過程。圖35顯示了在逐步標準化期間軟體所顯示的示例調查數據的一部分。已成像調查數據572表示調查目標的數據。在圖35中，已成像調查數據572表示或相應於被捕獲細胞。輸入框(input box)要求標準化的範圍。如圖所示，使用的數值為0-4,000。應當意識到，能夠根據期望地使用任何範圍的數值。
圖36顯示了標準化步驟之後的軟體顯示。頂部窗口396顯示了一部分示例調查數據的近視圖(close-up view)。已成像調查數據572表示被捕獲細胞。底部曲線400顯示了窗口396中水平虛線398所經過的點的相應數值。底部曲線400顯示出，調查數據的背景區域被標準化(也就是具有小噪音的穩定值)，其中含有細胞的區域在曲線上具有明顯的「尖峰」。例如，在底部曲線400中，尖峰信號402相應於特定位置處的特定示例細胞404。尖峰信號402與背景噪音406顯著不同。這簡化了細胞識別的處理。
步驟5過濾圖37詳細示出了圖22的步驟250中所包含的步驟。在圖37的步驟410中，選擇相鄰矩形的尺寸。這些相鄰矩形與背景照明均勻化步驟(圖22的步驟248)中所使用的在概念上相似。然而，這一步驟中使用的相鄰矩形大約為細胞的尺寸，且小於在背景照明均勻化中使用的相鄰矩形。在步驟412，對調查數據中的每個點P，計算數值「足夠區分」於Vbackground的P的附近點的數目。在一個實施例中，Vbackground的數值設定為2,000。通過閾值數目確定多大的差異(所調查點與Vbackground之間)構成「足夠區分」。在一個實施例中，閾值數目通過檢查調查數據的信號模式指出(note)背景數值與細胞(或者樣品中目標的其它物質)的數值之間的差異加以確定。在其它化驗中，調查特徵除細胞之外，還能夠是珠子(bead)(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。在其它實施例中，閾值數目通過校準機制產生，該校準機制基於可變條件確定背景噪音和背景值。這些條件包括光生物盤的反射率，光生物盤驅動內光生物盤的不平衡，光生物盤的顫動(rattle)、震動(vibration)或不穩定，電噪音，光生物盤的金屬化，所涉及樣品的類型(白細胞或其它)，和任何其它需要通過校準調節加以補償或修正的條件。
在步驟414，檢測「足夠區分」點的數目，看是否該數目大於預先確定的過濾標準。如果是，則P值保持與步驟416一樣。否則變為步驟418的Vbackground(或2,000)。這一步驟的期望效果是除去噪音，從而只有細胞保留在調查數據中並且背景均勻地等於Vbackground。圖38顯示了過濾步驟之後軟體所顯示的示例調查數據。已成像調查數據572標記或表示被捕獲的細胞。注意，背景與調查數據中的細胞具有良好的對比度。圖39提供了圖39調查數據一部分的近視圖。已成像調查數據572標記並相應於被捕獲細胞。如圖39的底部曲線420所示，現在背景具有平線值(flat line value)，且含有細胞的區域被尖峰422良好地限定。對比度的改良有助於下一步驟的細胞計數。
步驟5a除去不合需要的成分圖40詳細顯示了圖22的步驟254所涉及的步驟。這是一個設定為消除不合需要的成分，例如可能干擾細胞計數的空氣泡、灰塵和裂縫，的可選擇步驟。這裡使用的處理與結合圖25說明的發現窗口中使用的處理相似。在步驟428，圖40，選擇閾值T。在一個實施例中，T設定為在背景照明均勻化步驟中發現的Vbackground。然後在步驟430，執行二值化。類似於在窗口發現(圖25的步驟334)中使用的二值化步驟，在步驟430中，數值超過閾值T的點顯示黑色，而其餘的顯示白色。從而現在，調查數據能夠認為是黑與白的圖象，並能夠用1比特表示。在步驟432，以和圖25的步驟336中相同的方法對調查數據進行規則化。
在執行規則化之後，結果調查數據傳遞到步驟434用於提取關聯成分。在這一步驟中，掃描調查數據從而定義關聯成分。對於任何給定的一對調查數據中的黑點，如果兩個點能夠用它們之間一連串的黑點連接，則該對定義為相同的成分。本步驟的主要目的是將調查數據分解成用白色空間分隔的關聯黑色成分的集合。這裡採用的關聯成分提取處理可以與圖27中詳細顯示的處理相同。
本去除處理的下一步是步驟436，其致力於除去不規則尺寸的成分。用戶選擇的尺寸閾值應用於所有的關聯成分。如果成分小於或大於尺寸閾值，則從調查數據中除去整個成分。該方法是有效的，因為不規則成分(例如氣泡，裂縫)的尺寸通常比典型的細胞尺寸大得多。同樣，用戶能夠根據計數細胞的類型選擇閾值。在一個實施例中，通過用具有恆定值2,000(背景值)的成分替代所有的點實現。優選地，在實現圖40的所有步驟時，調查數據應當返回步驟248-步驟252(圖22)進行重新處理。
圖41顯示了除去裂縫之前調查數據的實例。已成像調查數據572相應於被捕獲細胞。如圖所示，裂縫574遍布該區域。圖42顯示了除去裂縫後圖41的相同調查數據。只保留標記被捕獲細胞的已成像調查數據572。
步驟6通過明亮中心計數細胞現在參考圖43，其詳細顯示了圖22的步驟256中所涉及的步驟。在步驟440，圖43，對調查數據進行卷積。在卷積期間，形成代表卷積圖象的輔助陣列。卷積圖象的每個點P是調查數據在P的圓形鄰域中過濾後積分(integration)的結果。如本領域技術人員將意識到的，圖象處理中使用的通用卷積方法包括兩個函數。兩個函數f和gR2-＞R的卷積是函數F(x,y)=fog(x,y)=R2f(x+u),y+v)g(u,v)dudv.]]>更精確地，在本發明的一個實施例中，被積分的函數f是函數f(x，y)＝h(x，y)-2,000 如果h(x，y)＞2,000 或＝0 如果h(x，y)＜＝2,000其中h(x，y)是描述先前步驟中x，y點的數值的函數。一旦確定了f(x，y)，便用圓形鄰域(neighborhood)指示函數g進行卷積，其中g(u，v)＝1如果u2+v2≤r2， 或者＝0其它其中r是細胞預期的半徑。卷積積分是F(x,y)=(u-x)2+(v-y)2r2f(x+u,y+v)dudv.]]>用所有格點(u，v)內f的總和值代替積分，格點處於如下限定的圓形鄰域內(u-x)2+(v-y)2＜r2。
卷積之後，對步驟442，圖43，中的卷積圖象進行局部最大值的尋找。卷積步驟使調查數據中的明亮中心突出作為局部最大值，從而更容易識別。因為使用整數值，所以捨入(rounding)能夠產生多餘的局部最大值。為了修正它，在步驟444中除去位於同樣緊鄰的鄰域內的冗餘局部最大值。然後在步驟446中，所有保留的局部最大值顯示為細胞中心。在其它化驗中，細胞能夠替換為珠子(基於珠子的化驗)、凝集物質、沉澱(酶反應)，或其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。局部最大值用於發現這些目標或者這些化驗中靶定的調查特徵的中心。在本發明其它實施例中，計數方法考慮細胞凝集的效果。彼此接近的最大值不會被自動地忽略。在一個實施例中，局部峰在一個附近的下陷(nearby dip)之後被斷言為細胞中心。參數能夠加以調節，從而如果凝集細胞顯示在調查數據上，限定局部冗餘最大值的距離閾值能夠被調節得更小。類似地，能夠為正在計數的細胞類型調節距離閾值。例如，因為紅細胞具有更一致的尺寸，所以假定的細胞尺寸能夠用作距離閾值。
在另一個實施例中，能夠對細胞的分布進行統計分析。從而每個區域上細胞的平均數目能夠用於估計位於由於可見性低或者細胞凝集使它們不能計數的區域中的細胞數目。在其它化驗中，細胞能夠替換為珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。另一個實施例允許用戶以更高的解析度重新採樣調查數據區域以執行更加完全而精確的計數。
圖44顯示了充滿用明亮中心法計數的細胞的示例調查數據。已成像調查數據572標記被捕獲細胞。在明亮中心法中執行的步驟有助於突出細胞，從而它們相對於背景的黑暗對比顯得明亮。如軟體所示，它們被單個地標記和計數。圖45顯示了圖44所示一部分調查數據的近視圖和數值跡線曲線。已成像調查數據572相應於被捕獲細胞。
步驟7和8細胞標記和通過黑暗邊緣附加計數細胞步驟7和8，圖22，是能夠執行用於提高細胞計數精度的可選擇步驟。在圖2中，它們參考步驟258和260。在硬體構型可能會剩下沒有明亮中心的細胞的情況下，這兩個可選擇步驟可以用於修正細胞的欠計數。在其它化驗中，本方法不是應用於細胞，而是能夠應用於珠子(基於珠子的化驗)、凝集物、沉澱(酶反應)或者其它尺寸能夠通過本發明光學系統的入射波束檢測到的生物指示標記。選擇地，可以使用這兩個步驟代替通過識別明亮中心計數細胞。
如果一些細胞已經通過識別明亮中心法加以計數了，那麼執行步驟7標記這些已計數細胞並將它們從調查數據中除去。然後通過識別具有黑暗邊緣的細胞進行計數。圖46A詳細示出了圖22的步驟260(主要步驟8)(principal step 8)中所包含的步驟。在步驟450，對調查數據進行反轉(inversion)。每個點P的數值v替換為2,000-v。如果結果數值為負，則用0代替。以等式形式表達反轉，我們進行如下假定h(x，y)為以前的調查數據，我們引入f(x，y)使f(x，y)＝2,000-h(x，y)如果h(x，y)＜2,000＝0 其它這保證在我們執行卷積時，具有低數據值的黑暗邊緣具有較高的值。在步驟452，執行使用移動環(shifted ring)的卷積。本領域技術人員會意識到，在圖象處理中使用的通用卷積方法包括兩個函數。兩個函數，f和g:R2-＞R，的卷積是函數F(x,y)=fog(x,y)=R2(x+u,y+v)g(u,v)dudv]]>以等式形式表達卷積有F(x,y)=g(u,v)f(x+u,y+v)dudv]]>用圓形鄰域指示函數(circular neighborhood indicator function)g執行卷積，其中g(u，v)＝1如果u2+v2≤r2或＝0其它其中r是細胞的預期半徑。在本實施例中，g是具有內徑r1和外徑r2的環的指示函數，其中r1和r2限定細胞預期半徑r的界限。這產生F(x,y)=r12(u-x)2+(v-y)2r22f(x+u,y+v)dudv]]>用環內所有格點(u，v)的總和值f代替積分。進行四次卷積，我們得到四個函數f1(x，y)＝f(x+hx，y)；f2(x，y)＝f(x-hx，y)；f3(x，y)＝f(x，y+hy)；和f4(x，y)＝f(x，y-hy)，其中hx和hy是沿x和y方向的特定移動。它們等於細胞估計尺寸的一半。四個函數意味著用內徑為r1，外徑為r2的環的指示函數進行四次卷積。數值r1和r2分別限定細胞預期半徑r的最小值和最大值。用沿左、右、上和下方向移動距離r的環進行四次卷積。圖46B顯示了這樣的一個示例。首先產生環458，限定細胞黑暗邊緣的邊界。四次移動的卷積產生四個環。在步驟454，圖46A，總和四次移動的結果。再次返回圖46B，我們看到總和的環在點457產生局部最大值。然後斷言點457為這一細胞的局部最大值並加以計數。注意，圖46B是應用到細胞的一個示例。在卷積環不限定細胞黑暗邊緣邊界的位置，不存在最大值。這樣，卷積步驟通過突出細胞的黑暗邊緣發現潛在的細胞。在步驟456，圖46A，在卷積計數局部最大值之後，計數步驟檢查所有(go through)調查數據。
圖47顯示了調查數據的圖象，在調查數據中通過該方法發現(計數)的細胞用十字標記。已成像調查數據572相應於被捕獲的細胞。十字580標記已計數細胞。
選擇地，能夠根據如下等式形式執行卷積步驟F(x，y)＝f1(x，y)+f2(x，y)+f3(x，y)+f4(x，y)，如果f1、f2、f3或f4中至少有三個(或者選擇地，兩個)大於0，和F(x，y)＝0 其它。
注意，如果函數中有兩個或三個大於0，則該卷積無移動環地加以執行。卷積步驟的另一個選擇是使用眾所周知的光滑函數來卷積函數f。在另外一個能夠用於本卷積步驟和在識別明亮中心中使用的卷積步驟的選擇中，採用不同的指示函數g。在其一個特殊實施例中，g能夠是高斯形式g(u,v)=e-(u2a2+v2b2)]]>或者其它用於執行卷積的合適函數，其中執行卷積的目的在於突出細胞的特徵。
步驟9數據輸出在步驟9，數據輸出到合適的顯示裝置上。軟體的一個實施例具有用戶界面，以便為由估計矩形限定邊界的調查數據區域顯示細胞計數的結果。另一個實施例顯示了調查數據區域的圖象，該區域的每個細胞用十字標記，如圖47所示。
B.紅細胞實例本領域技術人員會意識到，數據分析的各種步驟和方法能夠以不同的方式組合用於分析各種類型的調查數據。圖48提供了一個流程圖，其示出了計數調查數據中紅細胞的實例。在步驟460，選擇閾值並進行二值化，其中數值超過閾值的點顯示為黑色，其餘的顯示白色。二值化步驟將高數值的點與低數值的點分離開，高數值的點通常表示細胞，而低數值的點通常表示背景或背景噪音。
圖49顯示了執行步驟460之前調查數據的圖示。已成像調查數據572相應於被捕獲細胞。圖50顯示了二值化結果(步驟460)。二值化成像數據576標記或指示調查目標的數據。在這一例子中，二值化成像數據576指示細胞。非細胞標記二值化成像數據578指出了不代表細胞的數據。
然後在步驟462，圖48，執行構成規則化的兩個部分，侵蝕和擴展，以填充細胞邊界的缺失部分。此處的目的是獲得清晰劃分出單個細胞的細胞邊界。圖51顯示了侵蝕和擴展(步驟462)的結果。二值化成像數據576標記調查目標的數據。在這個實例中，二值化成像數據576標記細胞。非細胞標記的二值化成像數據578指出了不代表細胞的數據。
在圖48的步驟464中，為每個細胞提取一個像素寬的細胞邊界。圖52顯示了提取一個像素寬度邊界(步驟464，圖48)的結果。二值化成像數據576標記調查目標的數據。在這一實例中，二值化成像數據576標記細胞。非細胞標記的二值化成像數據578指出了不代表細胞的數據。在提取一個像素寬度的邊界時，選擇出所有同時具有黑色和白色鄰域的黑色點使其保持黑色。相鄰點不同時具有這兩種顏色的黑色點被轉變為白色。這產生了粗邊界，其位於數個像素寬度的位置內。然後應用細化處理(thinning process)消除邊界內多餘的點，直到僅剩下一個像素顯示調查數據中的輪廓。細化處理通過從邊界上除去冗餘的黑色點開始，直到只有一個像素寬度的線標記每個黑色區域的邊界為止。如圖52所示，在圖51中存在的非細胞標記的二值化成像圖象578現在不存在了。
細化處理首先以粗邊界開始。粗邊界包括所有同時具有位於細胞內部和外部的相鄰點的像素。在粗邊界提取之後，數據包括三類(1)細胞內的像素，(2)標記細胞邊界的像素，和(3)細胞外的像素。
這三類根據三個條件相關。
(A)所有三類都相連，(B)(1)通過(2)與(3)不相連，和最後(C)(2)中的每個點都具有位於(1)或(2)內的相鄰點，但不同時具有位於(1)和(2)內的相鄰點。
然後細化處理逐個檢查(2)內的像素。如果(2)內的像素P具有(1)或(3)內的相鄰點，那麼進行檢查，看重新塗色P(例如由黑色變為白色)使之從(2)變到(1)或(3)是否仍保持(preserve)條件(A)、(B)和(C)。如果是，則進行重新塗色。執行該塗色直到為每個細胞獲得一個像素寬的邊界。
在提取一個像素寬的邊界之後，被一個像素寬度的邊界限定的區域用黑色點填充(步驟466，圖48)。圖53顯示了步驟466的結果。二值化成像數據576標記細胞。非細胞標記的二值化成像數據578指出不代表細胞的數據，例如圖51所示。使用這一系列黑色和白色點作為標記，填充原始數據點以代替黑色點。從而，細胞區域被隔離並且現在容易加以分析。
圖54顯示了填充原始數據點的結果。已成像調查數據572標記被捕獲細胞。該方法的優點在於能夠精確地提取細胞。該提取使用戶能夠測量細胞的直徑，檢查細胞內的其它特徵，如被染色細胞核的形態。關於這類應用進一步的細節在共同轉讓(commonly assigned)美國專利申請序列No.10/xxx，xxx中有所討論，其題目為「基於使用光生物盤系統鑑定和量化白細胞類型的細胞核形態學」，(NuclearMorphology Based Identification and Quantification of White BloodCell Types Using Optical Bio-Disc Systems)，於2002年9月6日提出申請，在這裡引用作為參考。
除了檢查已成像細胞以外，用戶能夠通過採用本發明的用戶特徵(user feature)標記和計數細胞。圖55是圖49-54的調查數據原始圖示的近視圖，該調查數據具有用十字標記以顯示它們已被計數的紅細胞。已成像調查數據572相應於被捕獲細胞。十字580標記已計數的細胞。
C.可選擇算法本發明包括大量用於處理在細胞計數操作期間可能出現的特殊情況的可選擇算法。
圖56A-64顯示了本發明的實施例，其處理計數沒有明顯的明亮中心或黑暗邊緣的細胞的情況。該方法稱作「絕對值計數」，主要處理細胞看上去沒有明顯的明亮中心或黑暗邊緣的情況。明亮中心法依賴於隔離調查數據的高數值區域(亮點)以計數細胞。黑暗邊緣法依賴於隔離調查數據的低數值區域(暗點)以計數細胞。相反，該絕對值計數法隔離如下區域，該區域可以不具有由先前的一種或兩種方法可探測的明顯的高或低的數值，但是仍然含有能夠區分於背景噪音的數值模式。
圖56A是在它們根據絕對值計數法用十字標記之前，分散細胞的圖示屏幕拍攝(pictorial screen shot)。已成像調查數據572代表被捕獲細胞。圖56B是描述絕對值計數所含步驟的流程圖。在步驟480，對調查數據進行標準化和過濾。圖57是最初在圖56A中顯示的分散細胞在標準化和過濾步驟(步驟480，圖56B)之後的圖示屏幕拍攝。已成像調查數572相應於被捕獲細胞。標準化和過濾處理與本文上面所說明的處理相同。
在標準化和過濾之後，下一步驟包括背景去除和二值化(步驟482，圖56B)。圖58是最初在圖56A中顯示的分散細胞在背景去除和二值化步驟(步驟482，圖56B)之後的圖示屏幕拍攝。在該實例中，二值化成像數據576表示細胞。非細胞標記二值化成像圖象578指出不代表細胞的數據。除去背景以隔離細胞定位的位置。然後對調查數據進行二值化從而在調查數據中產生黑色和白色的點。二值化處理的進行如下。首先檢查每個點的數值。當點值與背景值之差大於預先確定的閾值時，點顯示為黑色。否則點顯示為白色。在一個實施例中，選擇閾值使與背景值差異小的點(背景或背景噪音)成為白色，而與背景值差異大的點(細胞的黑暗或明亮區域)成為黑色。在其它實施例中，閾值通過校準機制產生，該校準機制根據可變條件確定背景噪音和背景值。這些條件包括光生物盤的反射率，光生物盤驅動內光生物盤的不平衡，光生物盤的顫動(rattle)、震動(vibration)或不穩定，電噪音，光生物盤的金屬化，所涉及樣品的類型(白細胞或其它)，和任何其它需要補償或修正的條件類型。
規則化(步驟484，圖56B)是處理的下一步。圖59是最初在圖56A中顯示的分散細胞在規則化步驟(步驟482，圖56B)之後的圖示屏幕拍攝。二值化成像數據576標記調查目標的數據。在該實例中，二值化成像數據576表示細胞。非細胞標記二值化成像圖象578指出不代表細胞的數據。規則化包括侵蝕和擴展。侵蝕的執行如下。對於圖象P，構建相應的圖象P』。如果(1)P中相應的點X為白色，或者(2)X的任何鄰域為白色，則P』中的點X』顯示為白色。如果哪個條件都不滿足，則X』顯示為黑色。P』是侵蝕的結果圖象。擴展操作是相反的形式。對於圖象R，構建相應的圖象R』。如果(1)R中相應的點Y為黑色，或者(2)Y的任何鄰域為黑色，則R』中的點Y』顯示為黑色。如果哪個條件都不滿足，則Y』顯示為白色。R』是擴展的結果圖象。多個侵蝕和擴展的組合使得二值化圖象更加規則(單一黑色和單一白色點消失)。
下一步驟是提取一個像素寬度的邊界。該提取步驟參考圖56B的步驟486。圖60是一些最初在圖56A中顯示的分散細胞在應用一個像素寬度邊界提取的步驟486之後的圖示屏幕拍攝。二值化成像數據576標記調查目標的數據。在該實例中，二值化成像數據576相應於細胞。非細胞標記二值化成像圖象578指出不代表細胞的數據。在提取一個寬度的邊界中，選擇所有同時具有黑色和白色鄰域的黑色點保持其黑色。相鄰點不同時具有兩種顏色的黑色點轉換為白色。這產生了粗邊界，其位於數個像素寬度的位置內。然後應用細化處理(thinningprocess)消除邊界內冗餘的點，直到僅剩下一個像素顯示調查數據中的輪廓。細化處理通過從邊界上除去冗餘的黑色點開始，直到只有一個像素寬度的線標記每個黑色區域的邊界為止。
細化處理首先以粗邊界開始。粗邊界包括所有同時具有位於細胞內部和外部的相鄰點的像素。在粗邊界提取之後，數據包括三類(1)細胞內的像素，(2)標記細胞邊界的像素，和(3)細胞外的像素。
這三類根據三個條件相關。
(A)所有三類都相連，(B)(1)通過(2)與(3)不相連，和最後(C)(2)中的每個點都具有位於(1)或(2)內的相鄰點，但不同時具有位於(1)和(2)內的相鄰點。
然後細化處理逐個檢查(2)內的像素。如果(2)內的像素P具有(1)或(3)內的相鄰點，那麼進行檢查，看從(2)到(1)或(3)的重新塗色P(例如由黑色變為白色)是否仍保留(preserve)條件(A)、(B)和(C)。如果是，則進行重新塗色。執行該塗色直到為每個細胞獲得一個像素寬的邊界。
在提取一個像素寬的邊界之後，被一個像素寬度的邊界限定的區域用黑色點填充(步驟488，圖56B)。圖61是一些最初在圖56A中顯示的分散細胞在執行根據本發明的填充成分步驟488之後的圖示屏幕拍攝。二值化成像數據576標記調查目標的數據。在該實例中，二值化成像數據576標記細胞。非細胞標記的二值化成像數據578指出不代表細胞的數據。使用這一系列黑色和白色點作為標記，填充原始數據點以代替黑色點(步驟490，圖56B)。從而，細胞區域被隔離並且能夠加以計數。在一個實施例中，卷積應用於調查數據中被隔離的區域，並標記局部最大值以鑑定細胞。如先前所顯示的實施例，能夠應用具有圓形鄰域的卷積。因為在卷積中使用的圓形鄰域的尺寸大約為細胞的尺寸，所以局部最大值能夠確定為細胞中心。圖62是最初在圖56A中顯示的分散細胞在調查數據填充步驟之後的圖示屏幕拍攝。成像調查數據572標記被捕獲細胞。最後，圖63顯示了根據圖56B的步驟492加以計數並用十字標記的細胞。成像調查數據572相應於被捕獲細胞。十字580標記已計數的細胞。然而，圖63隻顯示了凝集的細胞，圖64顯示了應用於稀疏群集(packed)樣品的絕對值計數法，該樣品具有單個的細胞和多個凝集細胞區域。類似地，成像調查數據572相應於被捕獲細胞，且十字580標記已計數細胞。
本發明的另一個實施例改良了標記用於細胞計數的估計矩形的屏上顯示。在細胞計數期間，有時需要向用戶顯示估計矩形的圖象。除了提供樣品的可視表示以外，高品質的圖象能夠幫助用戶確定應當使用什麼方法計數和分析細胞。例如，清晰的圖象可以提醒用戶存在許多沒有明亮中心的細胞。這樣，用戶可以選擇也通過黑暗邊緣方法計數細胞。本實施例通過快速傅立葉變換法改良了圖象的品質。如本公開所給出領域的技術人員會意識到的，快速傅立葉變換(FFT)是傅立葉變換(FT)的變型。傅立葉變換的任何變型都能夠在這裡應用。傅立葉變換在較早前結合背景照明均勻化時有所討論。圖65提供了示出本發明該實施例的流程圖。在步驟520，對調查數據執行快速傅立葉變換。調查數據轉換為頻域。然後在步驟522，除去頻域內的一部分頻譜。最後，在步驟524，執行逆變換。圖66顯示了快速傅立葉變換之前的示例調查數據。已成像調查數據572表示被捕獲細胞。圖67顯示了快速傅立葉變換之後的同一調查數據。已成像調查數據572表示被捕獲細胞，且十字580標記已計數細胞。從而改良了屏上顯示。
本發明的另一個實施例處理窗口區域的屏上顯示。在具有窗口的光碟上進行細胞計數期間，有時需要向用戶顯示窗口區域。有時窗口區域的圖象是歪斜的(skewed)，如圖68所示。為了適當地顯示窗口區域，需要修正歪斜。修正方法的第一步發現歪斜的方向。該發現歪斜的步驟利用如下事實，即窗口是黑暗背景中的明亮區域——這方便地顯示為白色。為了澄清這些項目，窗口是在其頂部和底部具有半圓形接觸的矩形，且該矩形的寬度在下文稱作窗口寬度。歪斜發現步驟進行如下。首先，數字地差分圖象每條線的點。這意味著，對於每個點(x，y)，從(x，y)到(x+dx，y)間隔內的平均值中減去(x-dx，y)到(x，y)間隔內所有點的平均值。這裡dx是選擇用於消除噪音的特殊間隔長度。
對於與窗口一致的圖象的線，該減法的結果在窗口的左邊界採用最大值，在右邊界採用最小值。這是因為明亮窗口內的平均值大大高於黑暗背景的平均值。在位於窗口外的圖象的線中，這最大值和最小值可以發生在別的任意位置，因為平均值來自於可能具有一些噪音的黑暗背景。利用這一性質，在下一步驟中，為每條線計算最大值和最小值之間的距離D。接著，該處理選擇具有選擇作為標準窗口寬度的D值的線。之後，在這些被選線中標記最大值點。最後，直線擬合通過這些最大值點。該直線的方向是歪斜的方向。圖69顯示了具有已發現方向線的結果。最後，使用該方向線作為導向並且據此除去所有相應點以修正歪斜。圖象適當地加以對準並顯示給用戶，如圖70所示。
本發明的一個實施例包括用於從調查數據中除去氣泡痕跡的方法。有時空氣泡可以截留在光碟上的溝道內。該空氣泡可能通過樣品，並且在其通過捕獲區時除去一些沿著其路徑的細胞。該細胞去除可能導致細胞分布的不均勻。因為報告的最終結果為每平方毫米區域(mm2)的細胞數目，所以不規則細胞必須加以修正。修正的執行如下。圖71A顯示了處理的流程圖。在步驟540，如前地執行細胞計數。然後在步驟542分析細胞的分布。在步驟544忽略細胞局部濃度太小的區域，因為這些區域內的細胞可能已經被氣泡擦除。
在一個實施例中，正在計數的整個區域劃分成盒形的格子。圖71B顯示了這種實例。已成像調查數據572標記被捕獲細胞(用圓表示)。氣泡痕跡548通過由方形550、552、554和556限定邊界的區域。忽略由這些方形限定邊界的區域。一旦忽略這些區域，在圖71A的步驟546中重新計算細胞計數。圖71C和71D顯示了氣泡痕跡的實例。圖71C顯示了通過樣品的氣泡痕跡(包括痕跡548和558)，如5X顯微鏡下所見。圖71D顯示了另一個實例，其中示出了40X顯微鏡下通過樣品的氣泡痕跡548。
III.白細胞計數方法圖72提供了如何利用本發明的方法執行用於快速確定CD4+和CD8+T-淋巴細胞種群絕對數值的類均勻固相細胞捕獲化驗(generichomogeneous solid phase cell capture assay)。該檢測在整合於光生物盤上的小流動溝道內執行，確定7-15μl從全血中分離的單核細胞(MNC)中被捕獲區內特異抗體捕獲的CD4+、CD8+CD2+、CD3+、CD19+和CD45+細胞的數目。該檢測根據在光碟的局部位置上進行特定細胞捕獲的原理。在光碟上通過基於單克隆或多克隆特殊血細胞表面抗原的抗體局部應用捕獲化學劑產生多個特殊的細胞捕獲區。在充滿25-100μl具有MNC血液(10,000-30,000細胞/μl)的室時，表達CD4、CD8、CD2、CD3、CD19和CD45抗原的細胞被捕獲在光碟的捕獲區內。同時在捕獲區內限定陰性和陽性控制區域(negative andpositive control areas)。
在圖72的步驟1中，血液(4-8ml)和抗凝血劑如EDTA、ACD或肝素直接收集到4或8ml的Becton Dickinson CPT VacutainerTM中。在本發明另一實施例的等價步驟中，3ml含有抗凝血劑的血液覆蓋含有分離梯度(separation gradient)176如Histopaque 1077的管172。在任何情況下，血液樣品174優選地用在2小時以內的收集中。血液樣品所覆蓋的含有分離梯度176的管172在具有水平馬達的生物危害物質離心機(biohazard centrifuge)中在1,500-1,800RCF(2,800rpm)下離心。離心之後，除去血漿層178(步驟2)，在單核細胞(MNC)部分180上方留下大約2mm的血漿。收集並用磷酸鹽緩衝液(PBS)衝洗MNC層180。細胞在室溫下以300RCF(1200rpm)離心10分鐘成為小球(pelleted)，從而除去任何殘留的血小板。除去上清液，並通過輕輕敲打管使MNC小球180在PBS中重新懸浮。根據光生物盤110流動溝道130的高度，將最終的小球180(步驟3)重新懸浮為10,000-30,000細胞/μl的細胞數。
光生物盤110的流動溝道130充滿7μl的MNC懸液，且室的入口122和出口124(圖3和5)用密封標籤密封(步驟4)。光生物盤110在室溫下培育15分鐘，然後用光碟機動器112內的780nm雷射器掃描以成像捕獲區域(步驟5)。應當理解，如果使用透射光生物盤110，光碟機動器112選擇地包括頂部探測器158(圖10A)以成像捕獲區域。軟體優選地編碼在光碟上指導驅動自動地執行如下操作(a)離心光碟從而在一個或多個階段中旋出多餘的未鍵合細胞，(b)在顯示器114上成像特殊捕獲窗口，和(c)處理數據。數據處理包括，但不僅限於，計數每個捕獲區內特異捕獲的細胞並得出CD4+/CD8+的比率或任何其它可以相應編程的期望計數或定量。
如圖72進一步示出的，本發明致力於用光碟和光碟機動器執行聚類指示計數(cluster designation count)的方法。該方法包括如下步驟在含有分離梯度的第一管內提供血液樣品，在某時旋轉第一管且速度足以使血液樣品分離成層，重新懸浮含有T-細胞的MNC層形成MNC懸液，在包括至少一個含有至少一種捕獲劑的捕獲區的光碟表面提供MNC懸液樣品，將光碟裝載到光學閱讀器內，旋轉光碟，將電磁輻射的入射波束導向到捕獲區，探測在與光碟捕獲區相互作用之後形成的電磁輻射波束，將探測到的波束轉換為輸出信號，和分析輸出信號以提取有關捕獲區內捕獲的細胞數目的信息。在本發明的一個實施例中，光碟用反射層加以構建，從而反射被導向到捕獲區的並與細胞相互作用的光線。在本發明的另一個實施例中，構建光碟使得被導向到捕獲區的並與細胞相互租用的光線透過光碟。
在分析/處理步驟期間，軟體通讀每個捕獲區圖象並在其遇到細胞圖象時標記細胞圖象。例如，在估計CD4+和CD8+細胞之後，軟體計算CD4+/CD8+細胞的比率，並同時顯示CD4+、CD8+、CD3+和CD45+捕獲區內每毫升全血的細胞絕對數目和CD4+/CD8+的比率。整個處理從將光碟插入光碟機動器內到獲得數目和比率花費大約12分鐘。
在一個實施例中，光碟是前擺動系列FDL21:13707或FDL21:1270 CD-R光碟，其塗覆有300nm的金作為編碼信息層。在反射光碟上，通過眾所周知的平版印刷技術從反射層腐蝕掉尺寸為2×1mm的觀察窗口。在透射光碟的一些設計中，不腐蝕單獨的觀察窗口，且整個光碟都可以使用。附加層是Fraylock粘合劑DBL 201 Rev C3M94661。頂蓋是具有48個直徑為0.040英寸的樣品入口的乾淨光碟，樣品入口等距離地分布在26mm的半徑上。使用CD4+/CD8+計數軟體以4X速度和2.67MHz的取樣速度掃描並閱讀數據光碟。
IV.結論這樣，結合一個或多個特殊的實施例說明了用於成像實驗室樣品中的細胞和分析該圖象的方法和裝置。儘管參考某些優選實施例詳細地說明了本發明，但是應當意識到，本發明並不僅限於那些確定的實施例。而是，由於說明了用於實踐本發明的當前最佳模式的本公開，許多修改和變化將自身提供給本領域的技術人員而不背離本發明的範圍和精神。因此本發明的範圍由下文的權利要求指明而不是前述的說明。在權利要求等價物的意思和範圍內出現的所有改變、修改和變化均認為包含在其範圍之內。
權利要求
1.一種對細胞進行計數的方法，該方法包括如下步驟獲得含細胞樣品的調查數據；在所述調查數據中選擇估計矩形；在所述估計矩形內強化所述調查數據；和對所述估計矩形內的細胞進行計數。
2.權利要求1的方法，其中所述選擇步驟進一步包括對所述估計矩形選擇自定義尺寸的步驟。
3.權利要求1的方法，其中所述選擇步驟選擇多個估計矩形。
4.權利要求1的方法，其中所述強化所述調查數據區域的步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據執行背景照明均勻化；對所述調查數據執行標準化；和過濾所述調查數據。
5.權利要求4的方法，其中所述執行背景照明均勻化的步驟進一步包括如下步驟為相鄰矩形選擇尺寸；在所述調查數據中選取一個點；執行水平掃描從而為將中心定於所述點的所述相鄰矩形內的所有相鄰點計算第一滑動平均值；執行垂直掃描從而為將中心定於所述點的所述相鄰矩形內的所有相鄰點計算第二滑動平均值；組合所述第一滑動平均值與第二滑動平均值產生整體平均值；將所述點的原始值重新分配給一個結果值，該結果值通過獲得所述整體平均值與所述原始值之間的差值並將所述差值加到背景值而計算出來；和對所述調查數據中的所有點重複所述執行水平掃描、執行垂直掃描、組合兩個所述平均值和重新分配原始值的步驟。
6.權利要求4的方法，其中所述執行背景照明均勻化的步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據執行傅立葉變換以產生頻域函數；從所述頻域函數中除去低波長函數；從所述頻域函數中除去高波長函數；和對所述頻域函數執行逆變換以獲得所述調查數據的修改版本。
7.權利要求4的方法，其中所述執行標準化的步驟進一步包括如下步驟計算所述調查數據中所有點數值的平均值和標準偏差；使用所述平均值和標準偏差使所述調查數據中的所有點的數值標準化；和如果需要則截去一些點的所述數值。
8.權利要求4的方法，其中所述過濾步驟進一步包括如下步驟為相鄰矩形選擇一個尺寸；在所述調查數據中選取一個點；發現位於將中心定於所述點的所述相鄰矩形內的所有足夠區別的點；如果所述足夠區別的點的數目大於預先確定的過濾標準則重新分配所述點的數值；和重複所述發現所有足夠區別的點和為所述調查數據中的所有點重新分配數值的步驟。
9.權利要求4的方法，進一步包括步驟在所述過濾步驟之後從所述調查數據中除去不合需要的成分；和重複所述執行背景照明的步驟、所述執行標準化的步驟和所述過濾步驟。
10.權利要求9的方法，其中所述除去不合需要成分的步驟進一步包括如下步驟選擇閾值；使用該閾值對所述調查數據執行二值化；對所述調查數據執行規則化；提取關聯成分；選擇尺寸閾值；和除去不滿足所述尺寸閾值的成分。
11.權利要求10的方法，其中所述執行規則化的步驟進一步包括執行多個侵蝕和擴展的步驟。
12.權利要求10的方法，其中所述提取關聯成分的步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據上的所有黑色點分配初始成分數目；選取開始點；設定掃描方向；掃描所述調查數據的所有點以重新分配每個所述黑色點的成分數目從而與相鄰黑色點的成分數目相匹配；根據一組預先確定的規則改變所述掃描方向；和重複所述掃描和改變的步驟從而使關聯的黑色點的所述成分數目相同。
13.權利要求1的方法，其中對所述顯示於所述估計矩形內的細胞進行計數的步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據執行卷積；尋找所述調查數據的多個局部最大值；從所述多個局部最大值中除去冗餘的局部最大值；斷言剩餘的最大值為細胞的明亮中心；和通過識別所述細胞的明亮中心對細胞進行計數。
14.權利要求13的方法，其中所述執行卷積的步驟使用定義了一個圓形鄰域的指示函數，其中所述圓形鄰域限定了細胞預期尺寸的邊界。
15.權利要求13的方法，其中所述執行卷積的步驟使用高斯指示函數。
16.權利要求13的方法，其中所述除去冗餘局部最大值的步驟進一步包括如下步驟選擇距離閾值；和使用所述距離閾值以確定一個局部最大值是否是冗餘的。
17.權利要求13的方法，進一步包括執行統計分析的步驟，其包括如下步驟根據已計數細胞獲得細胞的分布；和估計細胞凝集或可見性低的區域內的細胞數量。
18.權利要求13的方法，進一步包括如下步驟以更高的解析度重新取樣所述調查數據；和重複所述執行卷積、尋找多個局部最大值、除去冗餘局部最大值、斷言剩餘的最大值為細胞的明亮中心和通過識別所述細胞的明亮中心對細胞進行計數的步驟。
19.權利要求13的方法，進一步包括如下步驟從所述調查數據中除去所述通過明亮中心計數的細胞；通過識別黑暗邊緣對細胞進行計數；和將從通過識別明亮中心對細胞進行計數的步驟獲得的總數和從通過識別黑暗邊緣而計數的步驟獲得的總數相加。
20.權利要求19的方法，其中所述通過識別黑暗邊緣對細胞進行計數的步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據執行反轉；執行多次使用移動環的卷積；總和來自所述多次卷積的結果；發現局部最大值；斷言最大值為細胞的中心；和對所述細胞的中心進行計數。
21.權利要求20的方法，其中所述執行多次卷積的步驟無移動環地執行卷積。
22.權利要求20的方法，其中所述執行卷積的步驟使用高斯指示函數。
23.權利要求20的方法，其中所述執行卷積的步驟使用光滑函數。
24.權利要求1的方法，其中所述對顯示於所述估計矩形內的細胞進行計數的步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據執行反轉；執行多次使用移動環的卷積；總和來自所述多次卷積的結果；發現局部最大值；斷言最大值為細胞的中心；和對所述細胞的中心進行計數。
25.權利要求24的方法，其中所述執行多次卷積的步驟無移動環地執行卷積。
26.權利要求1的方法，其中所述強化步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據執行標準化；對所述調查步驟執行過濾；選擇閾值數目；通過確定所述調查數據是否與一組背景值相差大於所述閾值數目的數值而對所述調查數據執行二值化；對所述調查數據執行規則化；在所述調查數據中提取一個像素寬度的邊界；用調查數據填充由所述一個像素寬度的邊界限定的區域；和在所述區域填充中應用卷積。
27.權利要求1的方法，進一步包括在計算機監視器上顯示表示所述調查數據的圖象的步驟。
28.權利要求27的方法，其中所述顯示步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據進行快速傅立葉變換以在頻域中產生調查數據；除去頻域內的一部分頻譜；和對頻域內的所述調查數據執行逆變換以強化用於顯示的所述調查數據。
29.權利要求1的方法，其中所述獲得含有細胞樣品的調查數據的步驟包括如下步驟在光碟表面上提供血液樣品，所述表面包括一個或多個具有一種或多種捕獲劑的捕獲區；將所述光碟裝載到光學閱讀器內；旋轉所述光碟；將電磁輻射的入射波束從光源導向到所述捕獲區的其中一個；用探測器探測電磁輻射的結果波束，該結果波束在所述入射波束與光碟在所述捕獲區相互作用之後形成；將探測到的波束轉換成模擬輸出信號；和將所述模擬輸出信號轉換成含有在所述捕獲區捕獲的細胞的數字數據。
30.權利要求29的方法，其中所述將所述模擬輸出轉換成所述數字數據的步驟進一步包括如下步驟以固定的間隔取樣所述模擬信號的幅度；將所述取樣振幅記錄在一維陣列內；使用所述取樣和記錄步驟產生多個一維陣列；和組合所述多個一維陣列產生含有所述樣品的數字數據的二維陣列。
31.根據權利要求29的方法，其中所述光碟用反射層構建，從而導向到所述捕獲區的光線被反射到所述探測器。
32.權利要求31的方法，其中所述探測器是底部探測器。
33.根據權利要求29的方法，其中光碟構建成使導向到所述捕獲區的光線透射通過所述光碟，所述光碟在所述光源與所述探測器之間。
34.權利要求33的方法，其中所述探測器是頂部探測器。
35.權利要求33的方法，其中所述探測器是分波探測器。
36.權利要求29的方法，其中所述一個或多個捕獲區定位在所述光碟內的一個或多個室內。
37.權利要求29的方法，其中所述光碟包括多個相應於所述捕獲區的窗口。
38.權利要求37的方法，其中所述選擇估計矩形的步驟進一步包括如下步驟在所述調查數據中發現所述多個窗口的其中一個；和在所述窗口內修剪標準尺寸的估計矩形。
39.權利要求37的方法，其中發現所述多個窗口的其中一個的步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據執行壓縮；對所述調查數據執行閾值估計；對所述調查數據執行二值化；對所述調查數據執行規則化；從所述調查數據中提取關聯成分；和從所述關聯成分中發現對應於一個窗口的成分。
40.權利要求39的方法，其中所述提取關聯成分的步驟進一步包括如下步驟為所述調查數據上的所有黑色點指定初始成分數目；選取開始點；設定掃描方向；掃描所述調查數據的所有點以重新分配每個所述黑色點的成分數目以便與相鄰黑色點的成分數目相匹配；根據一組預先確定的規則改變所述掃描方向；和重複所述掃描和改變的步驟從而使關聯的黑色點的所述成分數目相同。
41.權利要求29的方法，其中所述光碟的表面含有標記所述捕獲區位置的暗點。
42.權利要求41的方法，其中所述選擇估計矩形的步驟進一步包括在所述調查數據中發現所述暗點的其中一個；和產生標準尺寸的估計矩形，中心位於通過從所述暗點移動預先確定的距離發現的點處。
43.權利要求42的方法，其中所述發現所述暗點的其中一個的步驟進一步包括如下步驟對所述調查數據進行壓縮；對所述調查數據進行閾值估計；對所述調查數據進行二值化；對所述調查數據進行規則化；從所述調查數據提取關聯成分；和從所述關聯成分中發現相應於暗點的成分。
44.權利要求43的方法，其中所述提取關聯成分的步驟進一步包括如下步驟為所述調查數據上的所有黑色點指定初始成分數目；選取開始點；設定掃描方向；掃描所述調查數據的所有點以重新分配每個所述黑色點的成分數目以便與相鄰黑色點的成分數目相匹配；根據一組預先確定的規則改變所述掃描方向；和重複所述掃描和改變的步驟從而使關聯的黑色點的所述成分數目相同。
45.權利要求42的方法，其中所述發現所述暗點其中一個的步驟進一步包括讀取位置信息的步驟。
46.權利要求29的方法，其中所述光碟含有用於定位所述捕獲區的計算機可讀的位置信息。
47.權利要求37的方法，進一步包括在計算機監視器上顯示所述窗口的圖象的步驟。
48.權利要求47的方法，其中所述顯示所述窗口的所述圖象的步驟進一步包括確定所述圖象是否歪斜；發現歪斜的方向；和修正所述圖象的歪斜。
49.權利要求1的方法，其中所述獲得所述含有細胞樣品的調查數據的步驟包括從存檔中檢索先前存儲的樣品的調查數據。
50.權利要求49的方法，其中所述存檔根據患者的特徵對所述存儲的調查數據進行分類。
51.權利要求50的方法，其中所述檢索先前存儲的樣品調查數據的步驟進一步包括如下步驟選擇與多個從所述患者的特徵中選則出的標準相匹配的樣品從而進行人口健康趨勢分析。
52.權利要求1的方法，進一步包括輸出來自所述對細胞進行計數步驟的結果的步驟。
53.權利要求52的方法，其中所述細胞是白細胞。
54.權利要求53的方法，其中所述結果包括CD4+細胞和CD8+細胞的計數，和CD4+與CD8+細胞的比率。
55.權利要求54的方法，其中所述結果進一步包括CD3+細胞和CD45+細胞的計數。
56.權利要求1的方法，其中所述對細胞進行計數的步驟進一步包括如下步驟對氣泡痕跡分析細胞分布；忽略具有過小的局部細胞濃度的區域；和重新計算細胞的計數。
全文摘要
本發明提供了一種用於成像細胞特別是血細胞的光學方法、系統和軟體。在一個實施例中，含有血細胞的實驗室樣品沉積在光生物盤上，該光生物盤是專門製造的光碟，具有混合室，其含有特效抗原用於鎖定血細胞的各種組分。一旦放入光碟機動器，光碟便會旋轉，且樣品和抗原與其它溶液混合。然後將電磁波束導向到光生物盤上，在特殊捕獲區與樣品相互作用，並通過探測器收集結果波束。然後包含在波束內的信息發送給處理器，由處理器產生數字圖象。執行各種圖象處理的方法，例如二值化、背景均勻化、標準化和過濾，以強化調查數據中用於精確計數的細胞。設計其它的技術用於修正不規則，例如氣泡和模糊細胞。
文檔編號G01N33/50GK1575475SQ02820990
公開日2005年2月2日 申請日期2002年9月11日 優先權日2001年9月12日
發明者麥克海爾·馬特維夫, 安德魯·A·佩爾 申請人:長岡實業株式會社