一種細菌發酵生產氫氣的方法

2023-08-04 10:36:06

專利名稱：一種細菌發酵生產氫氣的方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌發酵生產氫氣的方法。
背景技術：
生物質能一直是人類賴以生存的重要能源，它僅次於煤炭、石油和天然氣，居 於世界能源消費總量的第四位，在整個能源系統中佔有重要地位。在我國，生物質
能佔全部能源消耗總量的20%。但長期以來，生物質能在我國商業用能結構中的比 率極小，其主要是作為一次能源在農村利用，約佔農村總能耗的70%左右。以生物 質為原料的生物煉製作為一個相對比較年輕的研究領域，系統的研究和開發主要是 在歐洲進行的；而工業領域的發展則主要是在美國。美國生物質技術顧問委員會開 展了一個關於生物能量、生物燃料和生物產物的長期計劃和目標，基於生物質的運 輸燃料將從2001年佔美國燃料消耗的0. 5%增長到2030年的20%。從2006年1月1 日起，我國開始施行《中華人民共和國可再生能源法》，將大大促進可再生能源的 開發利用，增加能源供應，改善能源結構，保障能源安全，保護環境，實現經濟社 會的可持續發展。在生物煉製中，基於生物原料的燃料包括固體、液體和氣體三種 形式，生物柴油、乙醇、甲醇、甲垸和氫氣等，是目前世界上被廣泛關注的幾種能 源形式。
因為氫氣本身無毒，燃燒後僅生成水，所以被認為是理想的清潔能源。氫氣不 但是一種優質燃料，還是石油、化工、化肥和冶金工業的重要原料。所有氣體中， 氫氣最輕，導熱性最好；除核燃料外，氫的發熱值是所有化石燃料、化工燃料和生 物燃料中最高的；氫可以氣態、液態或固態的金屬氫化物出現，能適應忙運及各種 應用環境的不同要求。通過生命周期分析，在所有燃料中氫氣有最高的原料靈活性， 來源於可再生生產途徑的氫氣環境友好，不涉及溫室氣體排放，最終實現化石能源 到可再生能源的平穩轉換。
相對於日益完備的氫能利用的下遊體系，氫氣卻沒有在以可再生資源為原料的 生產方面實現突破。目前，氫氣還是主要來自化石燃料的重整轉化(佔氫氣來源的 96%)和電解水制氫(佔4%)，這顯然未能擺脫原有的化石能源體系。因此，如何可持 續地從自然界中獲取氫氣尤其受到人們的關注。生物制氫是解決這一問題的重要途20世紀70年代的能源危機，到90年代隨著對 溫室效應的進一步認識，生物制氫作為可持續發展的工業技術再次引起人們的重 視。生物制氫技術包括光碟機動過程和厭氧發酵兩種路線前者利用光合細菌直接將 太陽能轉化為氫氣，是一個非常理想的過程，但是由於光利用效率很低，光反應器 設計困難等因素，近期內很難推廣應用；而後者採用的是產氫菌厭氧發酵，它的優 點是產氫速度快，反應器設計簡單，且能夠利用可再生資源和廢棄有機物進行生產， 相對於前者更容易在短期內實現。
發酵法制氫的研究始於90年代中，但是由於研究小組不多，進展並不大。90年 代末到本世紀初，由於逐步意識到發酵制氫具有在近期內實現產業化的潛力，在暗 發酵制氫方面的科研投入也大大增加。大量的微生物都具有不同程度的產氫能力， 因此利用發酵產氫微生物，將葡萄糖等生物質轉化為氫氣在技術本身沒有問題，而 一直困擾其應用的是過程經濟性的問題，即如何降低發酵制氫的成本，使之可以和 化石能源催化重整制氫的經濟性相比擬，或者使之可以與其他生物能源(生物制甲 垸、燃料酒精、生物柴油)相競爭。當前的核心問題是如何提高氫氣的轉化得率以 降低生產成本。
目前，國內外的研究主要是基於菌種的篩選、馴化、育種以及各種發酵工藝參 數的優化，還無法達到實際應用的水平。但是近年來，隨著分子生物學、代謝工程、 系統生物學、微生物生態學以及與其交叉的物理、化學等學科技術的發展，使得人 們能夠深入了解細菌產氫的物質和能量代謝及調控機理，能夠更好的對複雜微生物 複合體系進行定性定量分析及調控，這些都是目前發酵制氫的前沿研究方向。 生物發酵制氫形成的本質是厭氧條件下電子流或能量的調節控制機制之一 (2e—+2H+—H2)。目前一般的提高氫氣生產能力的研究都是與產氫相關的代謝路徑 及酶的局部調控研究，而很少從產氫本質出發對整個代謝進行全局能量調控的研 究。

發明內容
本發明的目的是提供一種細菌發酵生產氫氣的方法。
本發明提供的生產氫氣的方法，是在如下(1)或(2)的條件下，在含有磷酸 根離子的基礎培養基中培養產氫微生物生產氫氣
(1) 完全厭氧培養；
(2) 先在氧氣體積百分比濃度為0. 1-7. 6%培養，然後在完全厭氧條件下培養。其中，所述磷酸根離子為焦磷酸鹽或正磷酸鹽中的H2P(V、 HP042—、 P0/—、焦磷 酸根或聚磷酸根離子。所述焦磷酸鹽或正磷酸鹽為焦磷酸鈉鹽或正磷酸鈉鹽。所述 基礎培養基中所述磷酸根離子的濃度為0. 01-0. 50 mol/L。
所述產氫微生物為能夠在代謝過程中產生分子氫的發酵細菌，包括兼性厭氧 菌和專性厭氧菌，主要有腸桿菌科(f/^ero力acten'aceae)、梭菌屬(C7oWn'力'〃/z )、 巨型球菌屬U/e^a邵力aers)、韋榮氏球菌屬(Kei77o"e7Zs)、互養球菌屬 (5y/2tro/7力ococcys)、線形醋菌屬(^ce"/iJa/z e/2t朋)、醋微球菌屬 C4cefo肌'cro&'y/ff)、醋弧菌屬C4ce"W力r7'o)、擬桿菌屬Cfe"ero^/es)、閃爍桿菌 屬(屍erwVo力a"eri〃歷)、瘤胃球菌屬(j u/zu./ ococcw5)、真桿菌屬(A〃Z a"e"'〃/z )、 糞球菌屬(6b/^o""ws)等。本發明中以為產氣腸桿菌為例。所述產氣腸桿菌可為 產氣腸桿菌IAM1183或過表達聚磷酸激酶的產氣腸桿菌。所述過表達聚磷酸激酶的 產氣腸桿菌是將聚磷酸激酶基因導入產氣桿菌中獲得的。所述聚磷酸激酶基因的核 苷酸序列為GenBank 946971自5，末端第1-2067位。
所述培養基為適合產氫微生物生長的多種培養基。以產氣腸桿菌為例，其每升 基礎培養基可由如下成分組成葡萄糖2.0-15.0g、胰蛋白腖1.0-10.0g、硫酸銨 0. 2-3. 0g、硫酸鎂0. 1-0. 4g;所述基礎培養基的pH可為5-7。
本發明提供的生產氫氣的方法，在完全厭氧條件下，通過添加焦磷酸鹽或正磷 酸鹽增強ATP的生成，以促使更多的能量流向氫氣生成路徑。加入0. 15 mol/L焦 磷酸鈉後，產氣腸桿菌利用1摩爾葡萄糖生產1.572±0.027摩爾氫氣；過表達聚 磷酸激酶的產氣腸桿菌利用1摩爾葡萄糖生產1. 863±0. 026摩爾氫氣。
在好氧條件下，1摩爾葡萄糖可以生成36或者38摩爾ATP理論值；而在厭氧 條件下1摩爾葡萄糖理論上只能產生2摩爾ATP。好氧條件下相比厭氧條件下利用 葡萄糖可以生成更多的ATP。在好氧條件下利用葡萄糖生成大量ATP，將ATP能量 通過聚磷酸激酶(Polyphosphate kinase, PPK)以聚磷形式儲存起來(ATP + polyP —ADP+ polyPn+1)，然後在厭氧條件下通過聚磷酸激酶的可逆反應將能量釋 放出來(ADP+ polyPn+1—ATP + polyPn)，以促使更多的能量流向氫氣生成路徑。
本發明提供的生產氫氣的方法，先在有氧條件下培養產氣腸桿菌，使其利用有 限氧氣將ATP能量以聚磷形式儲存起來，然後在氧氣耗盡後進行產氫代謝。在加入 0. 15mol/L正磷酸鹽後，在完全厭氧條件下，產氣桿菌利用1摩爾葡萄糖可以生產 1.416士0.039摩爾(平均值士標準差)氫氣，在先有氧再厭氧條件下，產氣桿菌利用1摩爾葡萄糖可以生產1.512士0.023摩爾(平均值士標準差)氫氣。在完全厭 氧條件下，過表達聚磷酸激酶的產氣腸桿菌利用1摩爾葡萄糖生產1. 463±0. 013 摩爾(平均值士標準差)氫氣，在先有氧再厭氧條件下，過表達聚磷酸激酶的產氣 腸桿菌利用1摩爾葡萄糖生產1.587士0.031摩爾(平均值士標準差)氫氣。本發 明的生產氫氣的方法可提高氫氣的轉化得率，降低生產成本。
具體實施例方式
以下實施例以產氣腸桿菌(^^ero力a"er aeroge/ es IAM1183)為例，以葡萄 糖作為碳源，進一步闡述本發明的生產氫氣的方法。
產氣腸桿菌(f/^eroZ^"er aarograes IAM1183)，購自日本東京大學應用微 生物研究所菌種庫。產氣腸桿菌為兼性厭氧菌。產氣腸桿菌培養溫度為37。C，基礎 培養基組分(每升)為葡萄糖10. 0g、胰蛋白腖5. 0g、硫酸銨2. 0g、硫酸鎂0. 2g。 產氣腸桿菌能利用葡糖酸鹽、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-甘露醇、 水楊苷、D-阿東醇、間-肌醇、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、棉籽糖、L-鼠李糖、麥芽 糖、D-木糖、海藻糖、纖維二醇、ct-甲基-D-葡萄糖苷、七葉靈、蜜二糖、D-阿拉 伯糖醇、粘質酸鹽、D-甘露糖和甘油，也能利用丙二酸鹽、檸檬酸鹽和醋酸鹽作為 唯一碳源，並能利用一定濃度甲酸。產氣腸桿菌可以在log P值為3. 2以上的溶劑 (異辛烷、庚烷、己烷、環己垸)中生存，還能在汞存在的條件下生存，表明其具 有處理富溶劑廢物的潛力。
實施例1、產氣腸桿菌以焦磷酸鈉為磷源生產氫氣
1) 向基礎培養基(葡萄糖15.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸 鎂0.2g/L)中加入焦磷酸鈉，使其終濃度為0. 01mol/L ， pH調至6. 0，以不加焦 磷酸鈉的培養基作為對照。在培養基中接入活化後的產氣腸桿菌IAM1183
(^ fara^3cferaeroge/2es)，使產氣腸桿菌IAM1183的初始含量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養15h。
2) 向基礎培養基(葡萄糖15.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸 鎂0.2g/L)中加入焦磷酸鈉，使其終濃度為0. 10mol/L， pH調至6. 0，以不加焦磷 酸鈉的培養基作為對照。在培養基中接入活化後的產氣腸桿菌IAM1183
(^^ero力3cz^raeroge/2es)，使產氣腸桿菌IAM1183的初始含量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養15h。
3) 向基礎培養基(葡萄糖15.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸
6鎂0.2g/L)中加入焦磷酸鈉，使其終濃度為0. 15 mol/L， pH調至6.0，以不加焦 磷酸鈉的培養基作為對照。在培養基中接入活化後的產氣腸桿菌IAM1183
(&terotecz^raeroge/2es)，使產氣腸桿菌IAM1183的初始含量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養15h。
以不加入焦磷酸鈉的基礎培養基培養產氣腸桿菌IAM1183作為對照。 培養過程中採用厭氧條件，通過氮氣吹掃的方式去除空氣中的氧氣。培養過程 中收集產生的氣體，培養結束後，計算生成的氫氣總量，同時檢測培養基中葡萄糖 的剩餘含量。
氫氣的測量採用氣相色譜的方法(上海精密科學儀器有限公司GC112A型號氣 相色譜；TCD檢測器；TDX-01不鏽鋼填充柱；進樣器、檢測器和柱箱溫度分別為120、 120和8(TC;氮氣作為載氣，流速為10ml/min。
葡萄糖的測定採用常規3，5-二硝基水楊酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31(3) :426-428.)。
試驗重複三次，結果為平均值土標準差的形式。
實驗結果表明，培養結束後，對照胞內ATP含量為10nmol/g細胞乾重，1升培 養物生產0. 462±0. 014升(平均值土標準差)(常溫常壓)氫氣；加入0. 01 mol/L 焦磷酸鈉後，胞內ATP含量為263nmol/g細胞乾重，1升培養物生產0. 608±0. 018 升(平均值士標準差)(常溫常壓)氫氣；加入O. 10mol/L焦磷酸鈉後，胞內ATP 含量為638nmol/g細胞乾重，1升培養物生產1. 656±0. 041升(平均值士標準差) (常溫常壓)氫氣；加入O. 15 mol/L焦磷酸鈉後，胞內ATP含量為855nmol/g細 胞乾重，1升培養物生產1.996士0.034升(平均值土標準差)(常溫常壓)氫氣。
焦磷酸鈉的添加作為能量供體，大大的提高了細胞的能量水平，單位體積產氫 能力是不加焦磷酸鈉體系的4. 3倍。
實施例2、重組產氣腸桿菌以焦磷酸鈉為磷源生產氫氣
以pMCL質粒作為產氣腸桿菌IAM1183 (^3terotecz^r aeroge/2es)表達載體， pMCL質粒構建過程如下
用P1F和P1R引物(表l)擴增pMAL-c2X (購買自NEB公司，編號為N8076) 上除去氨苄青黴素抗性"邁/ )的序列，然後用XhoI和KpnI酶切，得產物I;PCR擴增條件為:94。C， 5min; 30個循環，94°C, lmin; 60°C， 3min; 72。C， 1 min;最終72'C延伸5 min，最後4'C保存。
用引物P2F和P2R擴增pACYC184 (購買自NEB公司，編號為E4152S)上氯黴 素序列，然後克隆到pMD-18T載體上，獲得重組載體，KpnI和XhoI酶切重 組載體，得產物n;
PCR擴增條件為94°C， 5min; 30個循環，94°C， lmin; 58°C， 1. 5min; 72°C， 1 min;最終72'C延伸5 min，最後4'C保存。
酶切產物I和II連接，獲得重組質粒pMCL。
用PCR引物P3F和P3R克隆來自大腸桿菌K-12 (fsc力en'c/l^ co7i)(購買自 NEB公司，編號為E4104S)的聚磷酸激酶基因； /A，用BamHI和Pstl酶切後，插入 pMCL質粒對應的酶切位點，構成表達質粒pMCL-ppA。將表達質粒pMCL-ad々電導入 產氣腸桿菌IAM1183細胞，獲得重組產氣腸桿菌。將表達質粒pMCL電導入產氣腸 桿菌IAM1183細胞獲得對照菌。
表l.質粒構建需要引物
名稱 用途 引物序列(5' —3' ) , p
位點
P1F去除pMAL-c2X ^ p序列CATCCTCGAGACCMGTTTACTCATATAXhol
P1R去除pMAL-c2X ^t ; 序列TAGGTACCATGAGCGGATACATATTTKpnl
P2F複製pACYC184 C/z/序列CGGGGTACCAGGAGGGACAGCTGATAGAAAKpnl
P2R複製pACYC184 C/z 序列CCGCTCGAGGCTGCTGGCTACCCTGXhol
P3F複製￡K12 p/^r序列CGGGATCCATGGGTCAGGAAAAGCTATABamHI
P3R複製￡K12 p/ A序列AACTGCAGTTATTCAGGTTGTTCGAGTGAPstl
1)向基礎培養基(葡萄糖7.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸鎂 0.2g/L)中加入焦磷酸鈉，使其終濃度為0.01mol/L， pH調至6.0。在培養基中接 入活化後的重組產氣腸桿菌或對照菌，使重組產氣腸桿菌或對照菌的初始含量為5 X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養15h。
2)向基礎培養基(葡萄糖7.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸鎂 0. 2g/L)中加入焦磷酸鈉，使其終濃度為0. 1Omol/L， pH調至6. 0。在培養基中接 入活化後的重組產氣腸桿菌或對照菌，使重組產氣腸桿菌或對照菌的初始含量為5 X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養15h。3)向基礎培養基(葡萄糖7.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸鎂 0. 2g/L)中加入焦磷酸鈉，使其終濃度為0. 15mol/L， pH調至6. 0。在培養基中接 入活化後的重組產氣腸桿菌或對照菌，使重組產氣腸桿菌或對照菌的初始含量為5 X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養15h。
培養過程中採用厭氧條件，通過氮氣吹掃的方式去除空氣中的氧氣。培養過程 中收集產生的氣體，培養結束後，計算生成的氫氣總量，同時檢測培養基中葡萄糖 的剩餘含量。
氫氣的測量採用氣相色譜的方法(上海精密科學儀器有限公司GC112A型號氣 相色譜；TCD檢測器；TDX-01不鏽鋼填充柱；進樣器、檢測器和柱箱溫度分別為120、 120和80。C;氮氣作為載氣，流速為10ml/min)。
葡萄糖的測定採用常規3， 5-二硝基水楊酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31 (3) :426-428.)試驗重複三次，結果為平均值士標準差的形式。
實驗結果表明培養結束後，加入0.01mol/L焦磷酸鈉後，對照菌l摩爾葡萄 糖可以生產1.295士0.023摩爾(平均值士標準差)氫氣；重組產氣腸桿菌過量表 達後，細胞能量水平大大增強，細胞產氫速率提高了30.6%， l摩爾葡萄糖可以生 產1.718±0. 065摩爾(平均值士標準差)氫氣，提高了32. 7%;加入0. 10mol/L 焦磷酸鈉後，對照菌1摩爾葡萄糖可以生產1.462士0.051摩爾(平均值士標準差) 氫氣；重組產氣腸桿菌過量表達後，細胞能量水平大大增強，細胞產氫速率提高了 31.0%， 1摩爾葡萄糖可以生產1.815士0.038摩爾(平均值士標準差)氫氣，提高 了 24. 1%;加入0. 15mol/L焦磷酸鈉後，對照菌1摩爾葡萄糖可以生產1. 572±0. 027 摩爾(平均值士標準差)氫氣，重組產氣腸桿菌過量表達後，細胞能量水平大大增 強，細胞產氫速率提高了 33. 6%， 1摩爾葡萄糖可以生產1.863士0.026摩爾(平均 值土標準差)氫氣，提高了18.5%。
上述實驗說明，通過過量表達聚磷酸激酶，強化以焦磷酸鈉為磷源生成ATP的 過程，從而促進更多的能量流向氫氣生成，提高氫氣生產能力。
實施例3、產氣腸桿菌通過好氧厭氧轉換生產氫氣
1)向基礎培養基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸 鎂0.2g/L)中加入磷酸二氫鈉，使其終濃度為0. 01mol/L， pH調至6.0。在培養
9基中接入活化後的產氣腸桿菌IAM1183 (^ z^ro力acz^r 3ero《e/2es)，使產氣腸杆 菌IAM1183 (^2tero&a"eraero《e/7es)的初始含量為5X 108CFU/ml， 37°C、 170rpm i咅養15h。
2) 向基礎培養基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸 鎂0.2g/L)中加入磷酸二氫鈉，使其終濃度為0. 10mol/L， pH調至6.0。在培養基 中接入活化後的產氣腸桿菌IAM1183 (^^erote"er aero《e/2")，使產氣腸桿菌 IAM1183 (^)^ero力a"er aeroge/7es)的初始含量為5X 108CFU/ml， 37°C、 170rpm 培養15h。
3) 向基礎培養基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸 鎂0.2g/L)中加入磷酸二氫鈉，使其終濃度為0. 15mol/L ， pH調至6.0。在培養 基中接入活化後的產氣腸桿菌IAM1183 (^2fero力3"er aeroge/2es)，使產氣腸杆 菌IAM1183 (^2力aroZ^"ar3eroge/7es)的初始含量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm 培養15h。
以不加入磷酸二氫鈉的基礎培養基培養產氣腸桿菌IAM1183作為對照。
培養過程中對照採用厭氧條件，通過氮氣吹掃的方式去除空氣中的氧氣。其他 均在厭氧基礎上，用針筒打入一定量的氧氣，保證培養初期氧氣濃度0.8% (體積分 數)，培養至氧氣濃度為O，繼續培養15h。培養過程中收集產生的氣體，培養結 束後，計算生成的氫氣總量，同時檢測培養基中葡萄糖的剩餘含量。
氫氣的測量採用氣相色譜的方法(上海精密科學儀器有限公司GC112A型號氣 相色譜；TCD檢測器；TDX-01不鏽鋼填充柱；進樣器、檢測器和柱箱溫度分別為120、 120和80。C;氮氣作為載氣，流速為10ml/min)。
葡萄糖的測定採用常規3,5-二硝基水楊酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31(3):426-428.)試驗重複三次，結果為平均值土標準差的形式。
實驗結果表明，培養結束後，在完全厭氧條件下，對照l摩爾葡萄糖可以生產 0. 933±0. 026摩爾(平均值士標準差)氫氣；加入0. Olmol/L磷酸二氫鈉產氣腸杆 菌IAM1183 l摩爾葡萄糖可以生產l. 134士0.051摩爾(平均值士標準差)氫氣； 加入0. 10mol/L磷酸二氫鈉產氣腸桿菌IAM1183 1摩爾葡萄糖可以生產1. 356± 0. 003摩爾(平均值土標準差)氫氣；加入0. 15mol/L磷酸二氫鈉產氣腸桿菌IAM1183 1摩爾葡萄糖可以生產1.416士0.039摩爾(平均值士標準差)氫氣。當初始氧氣濃度為0. 8%(體積分數)，對照1摩爾葡萄糖可以生產0. 952±0. 031 摩爾(平均值士標準差)氫氣；加入0.01mol/L磷酸二氫鈉l摩爾葡萄糖可以生產 1. 187士0.013摩爾(平均值土標準差)氫氣，相比完全厭氧條件下提高了4.7%; 加入0. 1Omol/L磷酸二氫鈉1摩爾葡萄糖可以生產1. 411±0. 002摩爾(平均值士 標準差)氫氣，相比完全厭氧條件下提高了4. 1%;加入0. 15mol/L磷酸二氫鈉1 摩爾葡萄糖可以生產1.512土0.023摩爾(平均值土標準差)氫氣，相比完全厭氧 條件下提高了6. 8%。
實施例4、重組產氣腸桿菌通過好氧厭氧轉換生產氫氣
1) 向基礎培養基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸 鎂0. 2g/L)加入磷酸二氫鈉，使其終濃度為0. 01 mol/L， pH調至6. 0。在培養基 中接入活化後的實施例2中獲得的重組產氣桿菌和對照菌，重組產氣桿菌的初始含 量為5X108CFU/ml， 37。C、 170rpm培養15h。
2) 向基礎培養基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸 鎂0. 2g/L)加入磷酸二氫鈉，使其終濃度為0. 10 mol/L， pH調至6. 0。在培養基 中接入活化後的實施例2中獲得的重組產氣桿菌和對照菌，重組產氣桿菌的初始含 量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養15h。
3) 向基礎培養基(葡萄糖10.0g/L，胰蛋白腖5.0g/L，硫酸銨2.0g/L，硫酸 鎂0. 2g/L)加入磷酸二氫鈉，使其終濃度為0. 15mol/L， pH調至6. 0。在培養基 中接入活化後的實施例2中獲得的重組產氣桿菌和對照菌，重組產氣桿菌的初始含 量為5X108CFU/ml， 37°C、 170rpm培養15h。
培養過程中對照採用厭氧條件，通過氮氣吹掃的方式去除空氣中的氧氣。其他 均在厭氧基礎上，用針筒打入一定量的氧氣，保證培養初期氧氣濃度2.1% (體積分 數)，培養至氧氣濃度為0，繼續培養15h。培養過程中收集產生的氣體，培養結 束後，計算生成的氫氣總量，同時檢測培養基中葡萄糖的剩餘含量。
氫氣的測量採用氣相色譜的方法(上海精密科學儀器有限公司GC112A型號氣 相色譜；TCD檢測器；TDX-01不鏽鋼填充柱；進樣器、檢測器和柱箱溫度分別為120、 120和80。C;氮氣作為載氣，流速為10ml/min)。
葡萄糖的測定採用常規3， 5-二硝基水楊酸比色法(Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem31(3):426-428.)試驗重複三次，結果為平均值士標準差的形式。
實驗結果表明培養結束後，在完全厭氧條件下，加入0.01mol/L磷酸二氫鈉 後，對照菌l摩爾葡萄糖可以生產l. 134士0.051摩爾(平均值士標準差)氫氣， 重組產氣腸桿菌可以生產1.203土0.012摩爾(平均值士標準差)氫氣；加入 0. 10mol/L磷酸二氫鈉後，對照菌1摩爾葡萄糖可以生產1. 356±0. 003摩爾(平均 值士標準差)氫氣，重組產氣腸桿菌可以生產1.392士0.012摩爾(平均值士標準 差)氫氣；加入O. 15mol/L磷酸二氫鈉後，對照菌1摩爾葡萄糖可以生產1. 416± 0. 039摩爾(平均值士標準差)氫氣；重組產氣腸桿菌可以生產1. 463±0. 013摩爾 (平均值士標準差)氫氣。
當初始氧氣濃度為2. 1% (體積分數)，加入O.Ol mol/L磷酸二氫鈉後，對照 菌l摩爾葡萄糖可以生產l. 172士0.021摩爾(平均值士標準差)氫氣，重組產氣 腸桿菌可以生產1.264土0.013摩爾(平均值土標準差)氫氣，提高了7.8%;加入 0. 10mol/L磷酸二氫鈉後，對照菌1摩爾葡萄糖可以生產1. 397±0. 004摩爾(平均 值土標準差)氫氣，重組產氣腸桿菌可以生產1.504土0.037摩爾(平均值土標準 差)氫氣，提高了7.7%;加入O. 15mol/L磷酸二氫鈉後，對照菌1摩爾葡萄糖可以 生產1. 423±0. 018摩爾(平均值士標準差)氫氣；重組產氣腸桿菌可以生產1. 587 士0.031摩爾(平均值士標準差)氫氣，提高了11.5%。
權利要求
1、一種生產氫氣的方法，是在如下(1)或(2)的條件下，在含有磷酸根離子的基礎培養基中培養產氫微生物生產氫氣(1)完全厭氧培養；(2)先在氧氣體積百分比濃度為0.1-7.6％培養，然後在完全厭氧條件下培養。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述磷酸根離子為焦磷酸鹽或正 磷酸鹽中的H2P(V、 HP042—、 P0廣、焦磷酸根或聚磷酸根離子。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述焦磷酸鹽或正磷酸鹽為焦磷 酸鈉鹽或正磷酸鈉鹽。
4、 根據權利要求1至3中任一所述的方法，其特徵在於所述磷酸根離子在所 述基礎培養基中的終濃度為0. 01-0. 15 mol/L。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述產氫微生物為產氣腸桿菌。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述產氣腸桿菌為產氣腸桿菌 IAM1183或過表達聚磷酸激酶的產氣腸桿菌。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述過表達聚磷酸激酶的產氣腸 桿菌是將聚磷酸激酶基因導入產氣桿菌IAM1183中獲得的。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述聚磷酸激酶基因的核苷酸序 列為GenBank 946971自5'末端第1-2067位。
9、 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述基礎培養基的溶質由葡萄糖、 胰蛋白腖、硫酸銨和硫酸鎂組成，所述基礎培養基的溶劑為水；所述葡萄糖的終濃度 為2. 0-15. 0g/L，所述胰蛋白腖的終濃度為1.0-10.0 g/L，所述硫酸銨的終濃度為 0.2-3.0 g/L，所述硫酸鎂的終濃度為0. 1-0. 4 g/L;所述基礎培養基的pH為5-7。
10、 根據權利要求1至9中任一所述的方法，其特徵在於所述氧氣體積百分 比濃度為0. 8-2. 1%。
全文摘要
本發明公開了一種細菌發酵生產氫氣的方法。本發明的生產氫氣的方法是在如下(1)或(2)的條件下，在添加磷酸根離子的基礎培養基中培養產氫微生物生產氫氣(1)完全厭氧培養；(2)先在氧氣體積百分比濃度為0.1-7.6％培養，然後在完全厭氧條件下培養。所述磷酸根離子為H2PO4-、HPO42-、PO43-、焦磷酸根或聚磷酸根離子。所述磷酸根離子的濃度為0.01-0.15mol/L所述基礎培養基。所述產氫微生物為產氣腸桿菌。所述產氣腸桿菌為產氣腸桿菌或過表達聚磷酸激酶的產氣腸桿菌。本發明的生產氫氣的方法可提高氫氣的轉化得率，降低生產成本。
文檔編號C12R1/145GK101597624SQ20091008848
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月2日 優先權日2009年7月2日
發明者元 盧, 翀 張, 來奇恆, 邢新會 申請人:清華大學