改良型滷代醇環氧酶的製作方法

2023-08-12 20:45:21 2

專利名稱：：改良型滷代醇環氧酶的製作方法
技術領域：
：本發明涉及改良型囟代醇環氧酶及其製造方法等。
背景技術：
：卣代醇環氧酶也被稱作卣代醇氫卣裂合酶、卣代醇脫卣酶(HalohydrinDehalogenase)或者卣代醇脫囟酶(HaloalcoholDehalogenase),其是具有將1,3-二卣代-2-丙醇轉化成表閨代醇的活性和催化其逆反應的活性的酶(ECnumber:4.5丄-)。已知卣代醇環氧酶根據胺基酸序列的同源性等，大致被分為3組(組A、組B、組C)(非專利文獻1:J.Bacteriology,183(17),5058隱5066,2001)。作為分類於組A的滷代醇環氧酶，可以舉出來自^^奉狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074株的HheA(非專利文獻2:Biosci.Biotechnol.Biochem.，58(8)，1451-1457,1994)、來自節桿菌屬(Arthrobactersp.)AD2林的HheAAD2(非專利文獻1)、來自節桿菌屬(Arthrobactersp.)PY1抹的Deh-PY1(非專利文獻3:J.Health.Sci.,50(6)，605-612，2004)等。作為分類於組B的卣代醇環氧酶，可以舉出來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074株的HheB(非專利文獻2)、來自分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)GP1林的HheBGP1(非專利文獻1)、來自節桿菌erithii(Arthrobactererithii)H10a抹的DehA(非專利文獻4:Enz.Microbiol.Technol.,22,568-574，1998)等。作為分類於組C的囟代醇環氧酶，可以舉出來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)DH094抹的HheC(專利文獻1:特開平10-210981號公報)、來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC(非專利文獻)、來自才艮癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的HalB(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=protein&val=4960076#feature4960076)(非專利文獻5:Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom)等。作為各種醫藥品和生理活性物質的合成原料，表卣代醇是有用的物質。已知的是，例如，由(R)-表卣代醇的開環氰化所得到的(R)-(-)-4-滷代-3-羥基丁腈作為L-肉鹼的合成原料是有用的(專利文獻2:日本特開昭57-165352號公報)。對於至少一部分卣代醇環氧酶來說，除了具有上述將l，3-二卣代-2-丙醇轉換為表離代醇的活性和催化其逆反應的活性以外，還了解到可催化如下反應，即，在氰化物的存在下使表卣代醇開環氰化來生成4-卣代-3-羥基丁腈，作為利用該反應的例子，已知有由1,3-二卣代-2-丙醇製造光學活性4-卣代-3-羥基丁腈的方法(專利文獻3:日本特開平3-053889號公報，專利文獻4:日本特開2001-25397號公報)以及由表滷代醇製造4-滷代-3-羥基丁基的方法(專利文獻5:日本特開平3-053890號公報)。可是，從自然界中分離的微生物的每個菌體的面代醇環氧酶活性，從工業利用的角度來說，未必足夠高。為了解決這個技術問題，有人嘗試利用基因重組技術來提高每個轉化體的卣代醇環氧酶活性。有文獻例示出如下例子，例如，利用通過導入克隆有基因的各種表達質粒所得到的各種轉化體，可以有效地製造光學活性4-卣代-3-羥基丁腈，所述基因為編碼來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074林的卣代醇環氧酶HheB的基因(專利文獻6:日本特開平4-278089號公報，專利文獻7:日本特開平5-317066號公報以及專利文獻8:日本特開2007-049932號公報)。就這些轉化體而言，通過使菌體內保有多拷貝的卣代醇環氧酶基因，成功地大幅度提高每個轉化體的卣代醇環氧酶活性。另一方面，由於近年的基因工程學技術的進步，使得有意識地製作變異體成為可能，所述變異體通過使酶蛋白質的1個以上的構成胺基酸缺失、或添加、插入1個以上的構成胺基酸或者用其他胺基酸取代1個以上的構成胺基酸來獲得。已知這些變異體根據該變異的種類，與未導入變異的酶相比，其活性、穩定性、有機溶劑耐性、耐熱性、耐酸性、耐鹼性、底物特異性等性能得到提高。這些性能的提高，通過每單元活性的酶催化劑製造成本降低、酶催化劑的穩定化、反應工序的簡化、反應收率的提高等，有時為利用酶反應的工業生產帶來生產成本的大幅降低。因而，就多種酶而言，進行著提高各種性能的有用的改良酶的研製。就囟代醇環氧酶而言，也有人報導了使一個以上的構成胺基酸缺失，或添加、插入一個以上的構成胺基酸或者用其他胺基酸取代一個以上的構成胺基酸的變異體。例如，專利文獻9(國際公開第2005/017141號小冊子)6記載了來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1株的HheC的369種變異體以及來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的1種變異體。另夕卜，專利文獻10(美國專利申請公開第2005/0272064號說明書)記載了來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的570種變異體以及來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB的1種變異體。此外，專利文獻11(美國專利申請公開第2006/0099700號說明書)記載了來自放射形土;襄桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的1422種變異體以及來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB的1種變異體。對於這些變異體之中的幾種變異體而言，顯示出由乙基(R)-4-氯-3-羥基丁酸酯轉換為乙基(S)-4-氰基-3-羥基丁酸酯的轉換反應的活性得以提高。另夕卜，非專利文獻6(J.Bacteriol.,183(17),5058-5066,2001)記載了來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的變異體Serl32Ala、Serl32Cys、Tyrl45Phe、Argl49Lys、Argl49Glu以及Argl49Gln。非專利文獻7(Enz.Microbiol.Technol.,30，251-258，2002)記載了來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1林的HheC的變異體C30A、C153S、C229A以及C153S/C229A,顯示出變異體C30A以及C153S的穩定性相比於野生型卣代醇環氧酶得到了提高。非專利文獻8(EMBOJ.，22(19),4933-4944，2003)記載了來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的變異體Asp80Asn以及Asp80Ala。非專利文獻9(Biochemistry,42(47),14057-14065,2003)記載了來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1株的HheC的變異體W139F、W192F、W238F以及W249F。非專利文獻10(Biochemistry,44(17)，6609-6618，2005)記載了來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的變異體N176A、N176D以及Y187F。這些都與來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的面代醇環氧酶HheC的變異體相關。專利文獻1:日本特開平10-210981號公報專利文獻2:日本特開昭57-165352號公l艮專利文獻3:日本特開平3-053889號公報專利文獻4:日本特開2001-25397號公報專利文獻5:日本特開平3-0538卯號公報專利文獻6:日本特開平4-278089號公報專利文獻7:日本特開平5-317066號公報專利文獻8:日本特開2007-049932號公報專利文獻9:國際公開第2005/017141號小冊子專利文獻10:美國專利申請公開第2005/0272064號說明書專利文獻11:美國專利申請公開第2006/0099700號說明書非專利文獻l:J.Bacteriol.，183(17)，5058-5066，2001非專利文獻2:Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8),1451-1457,1994非專利文獻3:J.Health.Sci.，50(6),605-612，2004非專利文獻4:Enz.Microbiol.Technol.,22,568-574,1998非專利文獻5:Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom非專利文獻6:J.Bacteriol.,183(17)，5058-5066，2001非專利文獻7:Enz.Microbiol.Technol.30，251-258,2002非專利文獻8:EMBOJ.，22(19),4933-4944，2003非專利文獻9:Biochemistry,42(47),14057-14065,2003非專利文獻10:Biochemistry,44(17),6609-6618,2005
發明內容發明要解決的課題工業利用面代醇環氧酶的情況下，被期望作為酶催化劑的更加高度化。例如，如上所述通過使轉化體內的卣代醇環氧酶基因的高拷貝化，可以將每個轉化體的卣代醇環氧酶活性提高到某個程度，但從經濟性和實用性的角度考慮，期望活性進一步地提高。因而，期待著能帶來每個轉化體的卣代醇環氧酶活性提高的滷代醇環氧酶。另外，為了製造具有光學活性的4-滷代-3-羥基丁腈的情況下，通過已知的滷代醇環氧酶所製造的4-滷代-3-羥基丁腈的光學純度未必足夠高。因而，期待著提高了立體選擇性的滷代醇環氧酶，其可生成光學純度更高的4-卣代-3-羥基丁腈。另外，以1,3-二滷代-2-丙醇為起始原料，利用閨代醇環氧酶製造4-囟代-3-羥基丁腈的情況下，會產生因生成物(氯化物離子以及4-卣代-3-羥基丁腈)的阻礙而導致的反應速度的降低。因而，期待著難以受到生成物阻礙的囟代醇環氧酶。另外，為.了廉價地製造4-卣代-3-羥基丁腈，通常，優選增高反應體系內的底物和/或生成物(4-卣代-3-羥基丁腈)濃度來提高每個裝置的生產率，但是，由已知的卣代醇環氧酶所得到的生成物積累濃度未必足夠高。因而，期待著可以積累高濃度的生成物的卣代醇環氧酶。因此，本發明的目的在於提供一種可以解決這些技術問題的卣代醇環氧酶及其製造方法，並提供使用該酶的表面代醇或者4-卣代-3-羥基丁腈的製造方法。解決問題的手段本發明人等為了解決上述技術問題進行了深入的研究。結果發現，就野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列，尤其是分類於組B的野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列而言，通過將特定的胺基酸殘基取代成其他胺基酸，可以製作出每個轉化體的卣代醇環氧酶活性、立體選"^性、生成物阻礙耐性、生成物積累能力等屬性得到提高的改良型滷代醇環氧酶，從而完成本發明。即，本發明如下。(1)一種改良型囟代醇環氧酶，其特徵在於，其包含對野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列導入從以下的(A)(D)中選擇的任一個或多個胺基酸變異而得到的胺基酸序列，其中，所述野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列包含以下的氨基I踏列I:S-al-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-(x9畫al0-all-al2隱Y-al3-al4-A-R畫a15(序歹'J號74)(S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基,R表示精氨酸殘基，alal5分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基)以及以下的氨基晚亭列II:L-卩16-R-L-卩17-卩18-卩19畫卩20國E-卩21(序列號75)(L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示穀氨酸殘基，卩16-(321分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基)，(A)比起始胺基酸殘基(通常為甲硫氨酸殘基)離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(B)a14殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(C)a15殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；9(D)(321殘基被:取代成其他胺基酸的胺基酸變異。(2)—種改良型卣代醇環氧酶，其特徵在於，其包含對野生型閨代醇環氧酶的胺基酸序列導入從以下的(E)(H)中選擇的任一個或多個胺基酸變異的胺基酸序列，其中，所述野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列包含以下的氨基^列I:S-al-a2-a3-a4-a5-ct6-a7-a8-a9-alO-all畫al2-Y-al3陽al4-A-R畫a15(序歹11號74)(S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，alal5分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基)以及以下的胺基酸序列II:L-f316-R-L-卩17-(318-卩19-卩20-E-(321(序列號75)(L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示穀氨酸殘基，卩16-p21分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基)，(E)比起始胺基酸殘基(通常為曱硫氨酸殘基)離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基被取代成賴氨酸或天冬醯胺的胺基酸變異；(F)a14殘基被取代成丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的胺基酸變異；(G)a15殘基被取代成丙氨酸、絲氨酸或色氨酸的胺基酸變異；(H)(321殘基被取代成穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或曱硫氨酸的胺基酸變異。就上述(1)和(2)所記載的改良型卣代醇環氧酶而言，作為野生型滷代醇環氧酶，可以舉出例如分類於組B的酶。就上述(1)和(2)所記載的改良型卣代醇環氧酶而言，作為野生型滷代醇環氧酶，可以舉出例如來自棒狀桿菌(Corynebacterium)屬細菌或分枝桿菌(Mycobacterium)屬細菌的酶等。就上述(1)和(2)所記載的改良型卣代醇環氧酶而言，作為野生型滷代醇環氧酶的胺基酸序列，可以舉出例如序列號1或序列號2所示的胺基酸序列等。作為上述(1)和(2)所記載的改良型滷代醇環氧酶，可以舉出例如包含對野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列導入從以下的(i)~(iii)中選擇的任一個或多個胺基酸變異而得到的氨基S交序列的酶等。(i)從除了比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基、a14殘基、a15殘基以及p21殘基以外的胺基酸殘基中選擇的1個或數個胺基酸殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(ii)從除了比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基、胺基酸序列I所含的胺基酸殘基以及胺基酸序列II所含的胺基酸殘基以外的胺基酸殘基中選擇的1個或數個胺基酸殘基發生缺失的胺基酸變異；(iii)在比起始胺基酸殘基離C末端側近兩個以上殘基的胺基酸殘基構成的區域中的由胺基酸序列I和胺基酸序列II構成的區域以外的區域中，插入1個或數個任意胺基酸殘基的胺基酸變異。(3)編碼上述(1)或(2)所記載的改良型卣代醇環氧酶的基因。(4)含有上述(3)所記載的基因的重組載體。(5)將上述(4)所記載的重組載體導入宿主而得到的轉化體或轉導體。(6)培養上述(5)所記載的轉化體或轉導體所得到的培養物。(7)從上述(6)所記載的培養物中提取的改良型卣代醇環氧酶。(8)—種改良型卣代醇環氧酶的製造方法，其特徵在於，培養上述(5)所記載的轉化體或轉導體，從得到的培養物中提取改良型滷代醇環氧酶。(9)一種表囟代醇的製造方法，其特徵在於，通過使上述(1)、(2)或(7)所記載的改良型卣代醇環氧酶和/或上述(6)所記載的培養物與1,3-二卣代-2-丙醇接觸，來生成表面代醇。(10)—種4-卣代-3-羥基丁腈的製造方法，其特徵在於，通過使上述(l)、(2)或(7)所記載的改良型卣代醇環氧酶和/或上述(6)所記載的培養物在氰化物的存在下，與1,3-二滷代-2-丙醇或表滷代醇接觸，來生成4-滷代-3-羥基丁腈。發明的效果根據本發明，可以得到每個轉化體的卣代醇環氧酶活性、立體選擇性、生成物阻礙耐性、生成物積累能力等提高了的改良型滷代醇環氧酶，同時，可以利用這些酶來高效地製造表卣代醇或4-滷代-3-羥基丁腈。圖1是表示將來自表達野生型滷代醇環氧酶的轉化體(JM109/pST111、iiJM109/pSTK001和JM109/pSTT001)以及表達改良型囟代醇環氧酶的轉化體(JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT002以及JM109/pSTT003)的粗酶液用SDS-PSGE進行分析的結果的圖。具體實施例方式下面，對本發明的實施方式進行說明，但本實施方式是用於說明本發明的例示，並不是要將本發明僅限於該實施方式。只要本發明不脫離其要點，就可以以各種方式來實施。本說明書包含作為主張本申請優先權的基礎的日本特願2007-057854號說明書的全部內容。另外，本說明書中引用的全部的刊物，例如現有技術文獻和公開公報、特許公報及其他專利文獻，作為參考被納入本說明書中。(I)卣代醇環氧酶活性在本發明中，所說的"卣代醇環氧酶活性"是指將1，3-二離代-2-丙醇轉化為表卣代醇的活性和催化其逆反應的活性。1,3-二卣代-2-丙醇是用下述通式(1)表示的化合物。formulaseeoriginaldocumentpage12(式中，X，和X2分別獨立地表示相同或不同的卣原子。)作為卣原子，優選為氟、氯、溴、碘，特別優選為氯、溴。具體來講，可以舉出1，3-二氟-2-丙醇、1,3-二氯-2-丙醇(以下，有時稱為"DCP，，)、1,3-二溴-2-丙醇、1，3-二碘-2-丙醇等，優選為1，3-二氯-2-丙醇、1，3-二溴-2-丙醇。表卣代醇是用下述通式(2)表示的化合物。formulaseeoriginaldocumentpage12(式中，x表示滷原子)作為卣原子，優選為氟、氯、溴、碘，特別優選為氯、溴。具體來講，可以舉出表氟代醇、表氯代醇(以下，有時稱為"EHC")、表溴代醇、表碘代醇等，特別優選為表氯代醇、表溴代醇。在本發明中，"滷代醇環氧酶活性"通過對每小時由1,3-二滷代-2-丙醇生成表卣代醇的生成量或氯化物離子生成量進行測定來求得。表卣代醇生成量可以通過例如液相色譜或氣相色譜等進行定量。另外，氯化物離子生成量可以通過例如連續地或間斷地添加鹼溶液使得伴隨著該氯化物離子的生成而降低的pH值保持在一定的值，由每小時所需要的鹼量來方便地求出。有時將通過該方法算出的卣代醇環氧酶活性特別地稱作"脫氯活性"。另外，也可以製作針對於改良型卣代醇環氧酶的抗體，通過免疫印跡或ELISA法等免疫學方法來算出。另外，假定囟代醇環氧酶活性與轉化體內的表達量成正比的情況下，通過與囟代醇環氧酶活性已知的樣品相比較，利用SDS-PAGE等分析手段也可以間接求得。只要是本領域技術人員使用公知的方法就可以進行SDS-PAGE。對於至少一部分卣代醇環氧酶來說，除了上述的"卣代醇環氧酶活性，，以外，還具有催化如下反應的活性，即，在氰化物的存在下，將表卣代醇開環氰化來生成4-卣代-3-羥基丁腈的反應。作為此時的氰化物，可以舉出氰化氫、氰化鉀(以下，有時稱作"KCN")、氰化鈉、氰酸或者丙酮氰醇等在添加於反應液中時生成氰離子(CN-)或氰化氬的化合物或其溶液等。另外，4-囟代-3-羥基丁腈是用下述通式(3)表示的化合物。(式中，x表示滷原子)作為卣原子，優選為氟、氯、溴、碘，特別優選為氯、溴。具體來講，可以舉出4-氟-3-羥基丁腈、4-氯-3-羥基丁腈(以下，有時稱作"CHBN")、4-溴-3-羥基丁腈、4-碘-3-羥基丁腈等，優選為4-氯-3-羥基丁腈、4-溴-3-羥基丁腈。(II)卣代醇環氧酶(II-l)野生型囟代醇環氧酶本發明的改良型囟代醇環氧酶是通過在野生型卣代醇環氧酶(特別優選分類於組B的酶)中導入變異(胺基酸變異)來改良而得到的酶，其來源並無特別限制。這裡，所說的"野生型卣代醇環氧酶"是指可以從自然界的生物分離的囟代醇環氧酶，就構成該酶的胺基酸序列而言，不存在有意或無意的胺基酸缺失或由其他胺基酸所導致的取代或者插入，意味著保持有來自天然的屬性的卣^C醇環氧酶。此外，本發明中使用的野生型卣代醇環氧酶具有包含以下的胺基酸序列I(19胺基酸殘基)以及以下的胺基酸序列II(IO胺基酸殘基)的胺基酸序列，所述胺基酸序列I(19胺基酸殘基)S-al畫a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-al0-all-al2-Y-al3-(xl4-A-R-a15(序列號74)(S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，alal5分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基)，所述胺基酸序列II(10胺基酸殘基)L-卩16-R畫L-卩17-pi8-(319-p20-E匿卩21(序列號75)(L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示穀氨醯胺殘基，|316-(321分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基)。野生型卣代醇環氧酶是否是具有包含胺基酸序列I以及胺基酸序列II的胺基酸序列的酶，只要在公共的序列資料庫，例如由美國生物工程學信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供6勺GenBank悽史4居庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中，檢索作為卣代醇環氧酶註冊的酶，調查該酶的胺基酸序列中是否含有上述胺基酸序列I和胺基酸II即可。根據需要，可以使用基因信息解析用軟體進行。另外，如果在公知文獻中有對於野生型卣代醇環氧酶胺基酸序列的記載，也可以以其為參考。例如，通過以在J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001中記載的各種野生型囟代醇環氧酶胺基酸序列的比對信息為參考，可知是否含有胺基酸序列I和胺基酸序列II以及包含於整個胺基酸序列中的哪個位置上。胺基酸序列I中的絲氨酸殘基、酪氨酸殘基、精氨酸殘基和丙氨酸殘基，以及胺基酸序列II中的亮氨酸殘基、精氨酸殘基和穀氨酸殘基，在已知的各種野生型滷代醇環氧酶的胺基酸序列中被高度地保存。已知野生型卣代醇環氧酶根據胺基酸序列的同源性等，被大致分成3個組14(組A，組B,組C)(J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001)。其中，作為本發明中使用的野生型卣代醇環氧酶，特別優選屬於組B的酶。作為分類於組A的囟代醇環氧酶，可以舉出來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074才朱的HheA(Biosci.Biotechnol.Biochem.，58(8)，1451-1457,1994)、來自節桿菌屬(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAA^(J.Bacteriology,183(17)，5058-5066,2001)以及來自節桿菌屬(Arthrobactersp.)PYl抹的Deh-PYl(J.Health.Sci.，50(6)，605-612，2004)等。作為分類於組B的卣代醇環氧酶，可以舉出來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074才朱^JHheB(Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8)，1451，1994)、來自分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)GP1抹的HheBGP1(J.Bacteriology,183(17),5058-5066，2001)、來自節桿菌erithii(Arthrobactererithii)HI0a抹的DehA(Enz.Microbiol.Technol.，22，568-574,1998)等。作為分類於組C的卣代醇環氧酶，可以舉出來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)DH094抹的HheC(日本特開平10-210981號公報)、來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)ADl才朱的HheC(J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001)、來自根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的HalB(Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom)等。這些囟代醇環氧酶之中，對於胺基酸序列已知的酶，在美國生物工程學信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供的GenBank悽史才居庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中,通過以下的AccessionNo.來註冊。"AccessionNo.BAA14361":來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheA的氨基斷列"AccessionNo.AAK92100":來自節桿菌屬(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAAD2的氛基,列"AccessionNo.BAA14362，，來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的氨基i餅列"AccessionNo.AAK73175，，來自分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)GP1"AccessionNo.AAK92099":來自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1林的HheC的胺基酸序列"AccessionNo.AAD34609":來自才艮癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ha舊的胺基酸序列對於在本發明中主要例示的來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的卣代醇環氧酶HheB而言，有人報導了如下內容，由於其基因(HheB)有2個起始密碼子，因而存在2種卣代醇環氧酶，這兩種酶的區別僅在於N末端附近的8個胺基酸殘基的有無(Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8),1451-1457,1994)。在本發明中，將兩者(上述2種囟代醇環氧酶)區別稱呼時，將包含由最初的起始密碼子翻譯出來的胺基酸序列(序列號1)的HheB稱作"HheB(lst)"，將包含由第2個起始密碼子翻譯出來的胺基酸序列(序列號2)稱作"HheB(2nd)"，這些都是野生型卣代醇環氧酶。這裡，就包含用序列號1表示的胺基酸序列的HheB(1st)而言，胺基酸序列I相當於包含第126號第144號的胺基酸殘基的序列，胺基酸序列II相當於包含第198號第207號的胺基酸殘基的序列。同樣地，就包含用序列號2表示的胺基酸序列的HheB(2nd)而言，胺基酸序列I相當於包含第118號~第136號的胺基酸殘基的序列，胺基酸序列II相當於包含第l卯號第199號的胺基酸殘基的序列。另外，HheB(2nd)的胺基酸序列因受前述的兩個起始密碼子的影響，是包含缺失HheB(Ist)的胺基酸序列中的N末端附近的8個胺基酸殘基(具體來講，用序列號1表示的胺基酸序列中的第1號~第8號的胺基酸殘基)的狀態的胺基酸序列。在本說明書中，主要以來自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074林的野生型卣代醇環氧酶HheB為例進行說明，但如前所述，並不限定卣代醇環氧酶的由來，即使是HheB以外的卣代醇環氧酶，只要是具有包含前述胺基酸序列i和胺基酸序列n的胺基酸序列的酶，也可以應用同樣的說明。另外，通過對本發明所示的變異的位置或變異的胺基酸種類或者鹼基序列進行操作，也可以得到任一種改良型卣代醇環氧酶。在本發明中，說到"高同源性"時，是指例如60%以上的同源性，優選為75%以上的同源性，特別優選為90%以上的同源性。(II-2)改良型卣代醇環氧酶本發明中的"改良型卣代醇環氧酶"是包含如下的胺基酸序列的酶，所述胺基酸序列是主要利用基因重組技術，對野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列導入至少一個胺基酸取代變異而得到的胺基酸序列，是每個轉化體的卣代醇環氧酶活性、立體選棒性、生成物阻礙耐性、生成物積累能力等得到提高的囟代醇環氧酶。本發明中的改良型卣代醇環氧酶包括每個轉化體的卣代醇環氧酶活性比野生型囟代醇環氧酶高的酶。作為這裡所說的每個轉化體的卣代醇環氧酶活性的提高的本質的原因，可以A^因於胺基酸取代變異的任何原因，可以舉出例如每個酶蛋白質的比活性自身的提高、活性型構象形成能力的提高、轉化體內的表達量增加、轉化體內的酶的穩定性提高、對底物耐性的提高、生成物阻礙感受性的降低等。所說的"每個轉化體的卣代醇環氧酶活性"是指"每單位重量轉化體乾燥菌體的卣代醇環氧酶活性"，也稱"菌體比活性"(本說明書中，有時將乾燥菌體稱作"DC")。另外，所說的"每個可溶性蛋白質的卣代醇環氧酶活性"是指"每單位重量可溶性蛋白質的卣代醇環氧酶活性"，也稱作"蛋白質比活性"。此外，在本發明中，可以由一定量的轉化體方便地得到一定量的可溶性蛋白質，"每個轉化體的卣代醇環氧酶活性"("菌體比活性")與"每個可溶性蛋白質的卣代醇環氧酶活性"("蛋白質比活性")成正比。即，如果"每個可溶性蛋白質的囟代醇環氧酶活性，，("蛋白質比活性")高(如果低)，則"每個轉化體的卣代醇環氧酶活性"("菌體比活性")高(低)。另外，在本發明中，所說的"液活性"是指每單位溶液量的卣代醇環氧酶活性。作為該溶液，可以舉出含有能從培養生產卣代醇環氧酶的轉化體而得到的"培養物"所得到的物質的溶液。具體來講，可以舉出培養液、培養液上清液、細胞或菌體懸濁液、細胞或菌體破碎液、粗酶液以及它們的處理物等。通過將"液活性"除以其溶液的菌濃度或者可溶性蛋白質濃度，可以算出"每個轉化體的卣代醇環氧酶活性"("菌體比活性")或者"每個可溶性蛋白質的卣代醇環氧酶活性"("蛋白質比活性")。另外，本發明中所說的"活性回收率"是指以一定的操作前的活性17為100%,操作後回收的活性的相對比(％)。本發明的改良型卣代醇環氧酶中包含具有如下屬性的酶，即，從底物l，3-二卣代-2-丙醇或者表卣代醇生成表卣代醇或4-面代-3-羥基丁腈的情況的該生成物的光學純度比利用野生型卣代醇環氧酶從相同底物生成相同生成物的情況的該生成物的光學純度高。即，包含對作為底物的1，3-二卣代-2-丙醇和/或表由代醇的立體選擇性比野生型卣代醇環氧酶得到提高的酶。作為立體選擇性提高的本質的原因，可以是起因於胺基酸取代變異的任何原因。在本發明中，所說的"光學活性"是指含有的一種鏡像異構體多於另外的鏡像異構體的物質的狀態，或者僅由任一種鏡像異構體構成的物質的狀態。另外，所說的"光學純度"大致等同於"鏡像異構體過剩率(％ee)"，用下式定義。光學純度—鏡像異構體過剩率-100x([R]-[S])/([R]+[S])(%ee)這裡，[R]和[S]表示試樣中的鏡像異構體的各自濃度。另外，本發明中，所說的"立體選擇性"是指由底物生成生成物時，卣代醇環氧酶優先催化生成其中一種鏡像異構體的反應的性質。另外，本發明的改良型囟代醇環氧酶包括生成物阻礙性提高的酶，即，包含對反應阻礙的耐性比野生型卣代醇環氧酶得到提高的酶，所述反應阻礙是由來自1，3-二卣代-2-丙醇或者表卣代醇的生成物即氯化物離子或4-卣代-3-羥基丁腈所引起的。作為生成物阻礙耐性提高的本質的原因，可以是起因於胺基酸取代變異的任何原因。另外，本發明的改良型滷代醇環氧酶包括生成物積累能力得到提高的酶，即，包含具有如下屬性的酶，在由底物1,3-二卣代-2-丙醇或表卣代醇生成表滷代醇或4-卣代-3-羥基丁腈的情況下，可以使生成物高濃度生成並積累的屬性。作為生成物積累能力提高的本質的原因，可以是起因於胺基酸取代變異的任何原因。就本發明的"改良型面代醇環氧酶"而言，具體來講，包括這樣的胺基酸序列，即，對前述的包含氨基Sl/f列I和氨基S拼列II的野生型滷代醇環氧酶的胺基酸序列導入選自以下的(A)(D)的任一個或多個胺基酸變異而得到的氨基*列。(A)比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(B)a14殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(C)a15殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(D)|321殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異。.上述(A)中所說的"起始胺基酸殘基"是指與基因(DNA或mRNA)中翻譯起始密碼子編碼的野生型卣代醇環氧酶的胺基酸對應的胺基酸殘基，即，是指翻譯後的野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列中的N末端胺基酸殘基(通常為甲硫氨酸殘基)。上述(A)(D)的胺基酸變異，也可以通過將位於野生型卣代醇的胺基酸序列的最N末端側的起始胺基酸殘基(通常為曱硫氨酸殘基)定義為第1號時，是從該起始胺基酸殘基至C末端側的第幾號胺基酸殘基的胺基酸變異的方式來指明。例如，在野生型卣代醇環氧酶為包^^序列號1所示的胺基酸序列的來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(1st)的情況下，(A)中的"比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基"、(B)中的"al4殘基"、(C)中的"al5殘基"和(D)中的"(321殘基"分別相當於(A)第2號的胺基酸殘基(丙氨酸殘基)、(B)第141號的胺基酸殘基(蘇氨酸殘基)、(C)第144號的胺基酸殘基(苯丙氨酸殘基)以及(D)第207號的胺基酸殘基(天冬氨酸殘基)。另外，在野生型卣代醇環氧酶為包括序列號2所示的胺基酸序列的來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074株的HheB(2nd)的情況下，(A)中的"比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基"、(B)中的"al4殘基"、(C)中的"al5殘基"和(D)中的"卩21殘基"分別相當於(A)第2號的胺基酸殘基(丙氨酸殘基)、(B)第133號的胺基酸殘基(蘇氨酸殘基)、(C)第136號的胺基酸殘基(苯丙氨酸殘基)以及(D)第199號的胺基酸殘基(天冬氨酸殘基)。但是，HheB(2nd)如前所述，不過是包含缺失了HheB(1st)的氨基S吏序列中的N末端附近的8個胺基酸殘基的胺基酸序列的蛋白質，HheB(1st)和HheB(2nd)這兩個胺基酸序列中的各胺基酸殘基的絕對的作用實質上是相同的。作為本發明的"改良型滷代醇環氧酶"的優選的方式，可以舉出例如包含導入了選自以下的(E)(H)的任一個或多個胺基酸變異而得到的胺基酸序列的酶。(E)比起始胺基酸殘基(通常為曱硫氨酸殘基)離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基被取代成作為其他胺基酸的賴氨酸或天冬醯胺的胺基酸變異；(F)胺基酸序列I中的a14殘基被取代成作為其他胺基酸的丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的胺基酸變異；(G)胺基酸序列I中的a15殘基被取代成作為其他胺基酸的丙氨酸、絲氨酸或色氨酸的胺基酸變異；(H)氨基S交序列II中的(321殘基被取代成作為其他胺基酸的穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或曱硫氨酸的胺基酸變異。這裡，上述(E)(H)的胺基酸變異是對前述的(A)(D)的胺基酸酸"的具體例子的變異)。因此，與前述的(A)~(D)的情況相同，上述(E)中的"比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基"、(F)中的"al4殘基"、(G)中的"al5殘基，，和(H)中的"(321殘基"，也可以分別通過將位於野生型滷代醇環氧酶的胺基酸序列的最N末端側的起始胺基酸殘基(通常為甲硫氨酸殘基)定義為第1號時，是從該起始胺基酸殘基至C末端側的第幾號胺基酸殘基的胺基酸變異的方式來指明。即，例如在野生型滷代醇環氧酶為包含序列號1所示的胺基酸序列的來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(Ist)的情況下，上述(E)~(H)的胺基酸變異的方式可以如下指明。(E)第2號的胺基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代成賴氨酸或天冬醯胺的胺基酸變異；(F)第141號的胺基酸殘基(蘇氨酸殘基)被取代成丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的胺基酸變異；(G)第144號的胺基酸殘基(苯丙氨酸殘基)被取代成丙氨酸、絲氨酸或色氨酸的胺基酸變異；(H)第207號的胺基酸殘基(天冬氨酸殘基)被取代成穀氨醯胺、穀氨20酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或甲硫氨酸的胺基酸變異。另夕卜，在野生型囟代醇環氧酶為包括序列號2所示的胺基酸序列的來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB(2nd)的情況下，上述(E)~(H)的胺基酸變異的方式可以如下來指明。(E)第2號的胺基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代成賴氨酸或天冬醯胺的胺基酸變異；(F)第133號的胺基酸殘基(蘇氨酸殘基)被:取代成丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的胺基酸變異；(G)第136號的胺基酸殘基(苯丙氨酸殘基)被取代成丙氨酸或絲氨酸的胺基酸變異；(H)第199號的胺基酸殘基(天冬氨酸殘基)被取代成穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或酪氨酸的胺基酸變異。作為本發明的"改良型滷代醇環氧酶"的更具體和優選的方式，在野生型面代醇環氧酶為具有序列號1所示的胺基酸序列的來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1(H4林的HheB(Ist)的情況下，可以舉出具有序列號315和7679所示的胺基酸序列的改良型卣代醇環氧酶。另外，在野生型面代醇環氧酶為包括序列號2所示的胺基酸序列的來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(2nd)的情況下，可以舉出具有序列號1628和8083所示的胺基酸序列的改良型卣代醇環氧酶。以下，將序列號315和7679所示的胺基酸序列中的胺基酸變異(胺基酸取代)的方式示於表A中，將序列號16-28和8083所示的氨基S交序列中的胺基酸變異(胺基酸取代)的方式示於表B中。這裡，表A中的"Ala2"、"Thrl41"、"Phel44"和"Asp207"的標記表示序列號1的胺基酸序列中的作為胺基酸取代的對象的胺基酸殘基的位置和種類(3個字母標記)，例如，"Thrl41"意味著第141號的蘇氨酸殘基。另外，這些"Ala2"等下欄中的標記表示序列號3~15和76~79的各胺基酸序列的胺基酸取代後的胺基酸殘基，例如，如果是序列號3的胺基酸序列，則由於在"Ala2"的下欄標記"Lys"，因此意味著是第2號的丙氨酸殘基被取代成賴氨酸殘基的胺基酸序列。這裡，標記"-"意味著沒有胺基酸取代。此外，將編碼胺基酸取代後的各胺基酸序列的鹼基序列(後述)的序列號一併標記於表的最右欄。以上的表A中的標記的說明同樣也適用於表B中。tableseeoriginaldocumentpage22[表B]tableseeoriginaldocumentpage23本發明的改良型囟代醇環氧酶只要是包含具有一個以上選自上述(A)(D),優選為(E)(H)的胺基酸變異的胺基酸序列的酶即可。因而，本發明的改良型卣代醇環氧酶中也包括具有如下胺基酸序列的酶，所述胺基酸序列將多個上述(A)(H)的特徵(即，(A)~(H)的胺基酸變異)以組合的方式來具有。另外，本發明中的改良型卣代醇環氧酶的範圍中也包含如下的改良型滷代醇環氧酶，該酶在維持著上述(A)~(H)的胺基酸變異的方式的同時，進一步包括對作為改良型卣代醇環氧酶基礎的野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列導入選自以下(i)~(iii)的任一個或多個胺基酸變異而得到的胺基酸序列。(i)從除了比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基、胺基酸序列I中的a14殘基、胺基酸序列中的a15殘基以及胺基酸序列中的卩21殘基以外的胺基酸殘基中選擇的1個或數個胺基酸殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(ii)從除了比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基、胺基酸序列I所含的胺基酸殘基以及胺基酸序列II所含的胺基酸殘基以外的胺基酸殘基中選擇的1個或數個胺基酸殘基發生缺失的胺基酸變異；(iii)在比起始胺基酸殘基離C末端側近兩個以上殘基的胺基酸殘基構成的區域中的由胺基酸序列I和胺基酸序列II構成的區域以外的區域中，插入l個或數個任意胺基酸殘基的胺基酸變異。就上述(i)~(iii)的方式而言，所說的"1個或多個"是指例如1個~10左右，優選1個5個。在本發明中，有時用3個字母或1個字母標記來表示胺基酸的種類。此外，有時在數字之前或之後配以3個字母或1個字母來標記，此時，表示胺基酸殘基的位置和取代前後的胺基酸的種類。即，只要沒有特別說明，數字表示，如上所述，將利用翻譯起始密碼子編碼的胺基酸殘基(通常，為曱硫氨酸)定義為第1號的情況下是第幾號的胺基酸殘基。另夕卜，數字之前表示的3個字母或1個字母表示胺基酸取代前的胺基酸的3個字母或1個字母標記，數字之後表示的3個或1個字母表示發生胺基酸取代情況下的取代後的胺基酸的3個或1個字母標記。例如，第207號的天冬氨酸殘基有時標記成"Asp207"或"D207"，第207號的天冬氨酸殘基被取代成組氨酸的情況下，有時標記成"Asp207His"或"D207H"。(III)卣代醇環氧酶基因(in-i)野生型卣代醇環氧酶基因對於野生型卣代醇環氧酶之中已知其基因序列(鹼基序列)的酶而言，在通過美國生物工程學信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)4是供^fGenBank悽史才居庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中，通過以下的AccessionNo.進行註冊。24"AccessionNo.D90349":編碼來自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheA的基因的鹼基序列；"AccessionNo.AF397297，，編碼來自節桿菌屬(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAAD2的基因的鹼基序列；"AccessionNo.D90350":編碼來自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的基因的鹼基序列；"AccessionNo.AY044094":編碼來自分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)GP1林的他eB(jp,的基因的石威基序列；"AccessionNo.AF397296，，編碼來自放射形土i襄斥幹菌(Agrobacteriummdiobacter)AD1株的HheC的基因的鹼基序列；"AccessionNo.AF149769":編碼來自根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ha舊的基因的鹼基序列；在本發明中，將這些稱作"野生型面代醇環氧酶基因"。這裡，該"野生型卣代醇環氧酶基因"中的"野生型"這個詞是與"囟代醇環氧酶"有關的詞，意味著卣代醇環氧酶的胺基酸序列是"野生型"。構成本發明的"野生型滷代醇環氧酶基因"的鹼基序列只要是編碼能在轉化體宿主中利用的密碼子的序列即可，未必限於來源生物基因組DNA上所編碼的野生型卣代醇基因的鹼基序列。將編碼(II-l)野生型卣代醇環氧酶中描述的HheB(1st)的野生型囟代醇環氧酶基因稱作HheB(1st),將編碼HheB(2nd)的基因稱作HheB(2nd)。HheB(1st)的鹼基序列由序列號29表示，HheB(2nd)的鹼基序列由序列號30表示。作為取得已知石鹹基序列的野生型卣代醇環氧酶基因的方法，可以舉出如下方法，即，由來源生物製備基因組DNA,以已知的野生型卣代醇環氧酶基因序列信息為基礎來設計引物，使用該引物用PCR法將編碼滷代醇環氧酶的基因進行擴增。作為來源生物，可以舉出例如N-1074抹，該抹以保藏號"FERMBP-2643",在昭和63年11月10日保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1-1-1中央第6(以下，在本說明書中相同))。另夕卜，也可以以公知的基因序列信息為基礎，利用組合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)等，化學合成野生型卣代醇環氧酶基因的全長。例如，將野生型卣代醇環氧酶基因分割成幾個區域(例如，50個鹼基左右)，設計併合成多個在兩端具有與相鄰的區域重疊鹼基(例如，20個鹼基左右)的寡核苷酸。可以通過用PCR法使該寡核苷酸互相退火，來擴增野生型卣代醇環氧酶基因。另外，根據需要，也可以變更野生型卣代醇環氧酶基因的密碼子。作為變更密碼子的手段，可以使用例如MolecularCloning,ALabroatoryManual2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1987-1997)等記載的利用部位特異變異誘導法或部位特異突變誘導法的變異導入用試劑盒(例如，QuickChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(stratagene公司製造)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(invitrogen公司製造)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等寶生物公司製造)等來進行。此外，如上所述，進行組合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)時，也可以通過^f吏用變更密碼子的引物來變更密碼子。(III-2)改良型卣代醇環氧酶基因所說的本發明的改良型卣代醇環氧酶基因是指編碼(II-2)中所述的改良型離代醇環氧酶酶蛋白的基因。所說的本發明的改良型卣代醇環氧酶基因是編碼具有如下氨基^列的改良型囟代醇環氧酶的基因，所述氨基S臾序列例如是對包含序列號1或序列號2所示的胺基酸序列的野生型滷代醇環氧酶導入選自所述(II-2)的(A)~(D)的任一個或多個胺基酸變異而得到的序列，更優選為編碼具有導入選自所述(II-2)的(E)~(H)的任一個或多個胺基酸變異而得到的氨基S^f列的改良型卣代醇環氧酶的基因。構成野生型卣代醇環氧酶基因和上述胺基酸變異導入後的胺基酸殘基的鹼基序列，只要是編碼可在轉化體宿主中利用的密碼子的鹼基序列即可，未必限於來源生物基因組DNA上所編碼的野生型卣代醇環氧酶基因的鹼基序列。對前述(II-l)的野生型卣代醇環氧酶中敘述的HheB(1st)進行編碼的野生型面代醇環氧酶基因即HheB(lst)、以及編碼HheB(2nd)的野生型卣代醇環氧酶基因即HheB(2nd),也都可以用作野生型卣代醇環氧酶基因，該野生型卣代醇環氧酶作為用於得到改良型囟代醇環氧酶基因的基礎。作為本發明中的"改良型滷代醇環氧酶基因"26的更具體也是優選的方式，在野生型卣代醇環氧酶為具有序列號1所示的胺基酸序列的來自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB(1st)的情況下，可以舉出具有序列號31~43以及8487所示的鹼基序列的改良型卣代醇環氧酶基因。另外，在野生型囟代醇環氧酶為具有序列號2所示的胺基酸序列的來自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(2nd)的情況下，可以舉出具有序列號44~56以及88~91所示的鹼基序列的改良型卣代醇環氧酶基因。本發明的改良型面代醇環氧酶基因只要是編碼導入有1個以上選自前述的(II-2)的(A)~(H)的胺基酸變異的改良型卣代醇環氧酶的胺基酸序列的基因即可，因而，也包括編碼將多個前述(II-2)的(A)(H)的特徵(即(A)(H)的胺基酸變異)以組合方式來具有的改良型卣代醇環氧酶的胺基酸序列的基因。另夕卜，本發明中的改良型卣代醇環氧酶基因的範圍中也包含編碼如下的改良型卣代醇環氧酶的胺基酸序列的基因，該酶在維持著前述(II-2)的(A)(H)的胺基酸取代的方式的同時，進一步在作為改良型滷代醇環氧酶基礎的野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列導入選自前述(II-2)的(i)~(iii)的任一個胺基酸變異。進而，作為本發明的改良型卣代醇環氧酶基因，也包括具有與編碼改良型卣代醇環氧酶的胺基酸序列的鹼基序列互補的鹼基序列的DNA，所述改良型滷代醇環氧酶導入有選自前述(II-2)的(A)~(H)的任一個或多個胺基酸變異；在嚴格條件下雜交的DNA。這樣的DNA可通過如下方法獲得，例如，以包含對導入有選自上述(A)(H)的任一個或多個胺基酸變異的氨基S吏序列進行編碼的鹼基序列的改良型卣代醇環氧酶基因DNA或其互補序列或者它們的片段作為探針，通過菌落雜交、噬斑雜交、DNA印記法等公知的雜交法來獲得cDNA文庫以及基因組文庫。文庫可以利用由^^知的方法製作的文庫，也可以利用市售的cDNA文庫以及基因組文庫。所說的"嚴格的條件"是指雜交後的洗滌時的條件，即，鹽濃度為3002000mM、溫度為4075。C的條件，優選為鹽濃度600900mM、溫度為65。C的條件。可以舉出例如2xSSC且50。C等的條件。如果是本領域技術人員，除了這樣的緩衝液的鹽濃度、溫度等條件以外，還可以加入其他的探針濃度、探針的長度、反應時間等諸條件，來設定出用於得到具有與編碼改良型卣代醇環氧酶的胺基酸序列相互補的鹼基序列的DNA和在嚴格條件下雜交的DNA的條件，所述改良型囟代醇環氧酶導入有選自前述(II-2)的(A)~(H)的任一個或多個胺基酸變異。對於雜交法的詳細步驟，可以參照MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))等。作為雜交的DNA，可以舉出包含以下鹼基序列的DNA或者其部分片段，所述鹼基序列相對於編碼導入有選自前述(n-2)的(A)(H)的任一個或多個胺基酸變異而得到的氨基S吏序列的鹼基序列至少具有40%以上、優選60%、更優選90%以上的同源性。在本發明中，製備改良型卣代醇環氧酶基因的方法可以是導入變異的已知的任一種方法，通常，可以用公知的方法來進行。例如，可以舉出以野生型卣代醇環氧酶基因為基礎，利用市售的試劑盒來產生部位特異性取代的方法，或者選擇性地開裂基因DNA,接著除去或添加所選擇的寡聚核苦酸並進行連接的方法等。這些部位特異變異誘導法記載於"MolecularCloning,ALabroatoiyManual2nded.，，(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))、"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(JohnWiley&Sons(1987-1997))、Kunkel,Proc.Natl.Sci.USA,82:488-492(1985)、KramerandFritzMethod.Enzymol.，154:350-367(1987)、Kunkel，Method.Enzymol.,85:2763-2766(1988)等。近年，可以使用利用了基於Kunkel法或Gappedduplex的部位特異的突變誘導法的變異導入用試劑盒來進行，所述試劑盒例如有QuickChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(stratagene公司製造)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(invitrogen公司製造)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等寶生物株式會社製造)等。另夕卜，作為目的的變異導入位置存在於對象基因序列中容易消化、連接的限制性內切酶部位的附近的情況下，通過使用導入了目的變異的引物(合成寡聚DNA)進行PCR，可以容易地得到導入了目的變異的基因DNA片段。此外，也可以用組合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)進行延伸來得到合成基因。另外，通過使其與羥胺、亞硝酸等作為變異源的藥劑進行接觸、作用的方法、利用紫外線照射誘導變異的方法、使用PCR(聚合酶鏈式反應)隨機導入變異的方法等隨機變異導入法，也可以由野生型卣代醇環氧酶基因得到改良型卣代醇環氧酶基因。(IV)重組載體、轉化體(IV-1)重組載體為了使通過上述方法得到的本發明的改良型囟代醇環氧酶基因在宿主中表達，可以在基因的上遊插入轉錄啟動子，在下遊插入終止子，從而構建表達盒，將該盒插入表達載體。或者，在該改良型卣代醇環氧酶基因的表達載體中已經存在轉錄啟動子和終止子的情況下，可以不構建表達盒，只要利用載體中的啟動子和終止子在其間插入該變異基因即可。為了在載體中插入該改良型卣代醇環氧酶基因，可以利用使用限制性內切酶的方法、使用拓樸異構酶的方法等。另外，如果在插入時有必要的話，也可以添加適當的接頭。在本發明中，也可以在進行改良型卣代醇環氧酶基因的製備操作的同時，進行這樣的重組操作。即，可以使用具有取代成編碼其他胺基酸的鹼基序列的鹼基序列的引物，以克隆有野生型閨代醇環氧酶基因的重組載體為模板，進行PCR，將得到的擴增產物組入載體中。啟動子的種類只要是能在宿主中適當地表達的啟動子就沒有特別限制，例如，作為可在大腸桿菌宿主中利用的啟動子，可以舉出色氨酸操縱子的trp啟動子、乳糖操縱子的lac啟動子、來自入噬菌體的PL啟動子以及PR啟動子等，也可以利用被改變、設計成tac啟動子、trc啟動子這樣的序列。作為可在枯草菌宿主中利用的啟動子，可以舉出葡糖酸合成酶啟動子(gnt)、鹼性蛋白酶啟動子(apr)、中性蛋白酶啟動子(npr)、a-澱粉酶(amy)等。作為可在紅球菌屬細菌宿主中利用的啟動子，可以舉出表達載體pSJ034中所含有的來自灰暗諾卡氏菌諾卡氏菌(Rhodococcuserythropolis)SK92-B1林的腈水解酶表達調節基因所涉及的啟動子。pSJ034是在紅球菌(Rhodococcus)屬細菌中表達腈水合酶的質粒，可以用日本特開平10-337185號公報所示的方法由pSJ023來製作。pSJ023作為轉化體ATCC12674/pSJ023(保藏號"FERMBP-6232")的形態，於平成9年3月4日保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)。29終止子未必是必要的，其種類並不特別限定，可以舉出例如p因子非依賴性終止子，例如有脂蛋白終止子、trp操縱子終止子、miB終止子等。另外，作為對於翻譯成胺基酸重要的》成基序列，已知有SD序列和Kozak序列等核糖體結合序列，可以將這些序列插入變異基因的上遊。將原核生物用作宿主時，可通過PCR法等添加SD序列，將真核細胞用作宿主時，可通過PCR法等添加Kozak序列。作為SD序列，可以舉出來自大腸桿菌或者來自枯草桿菌的序列等，但只要是在大腸桿菌或枯草桿菌等理想的宿主內起作用的序列即可，並無特別限制。例如，可以通過DNA合成來製作共有序列並進行利用，所述共有序列是與16S核糖體RNA的3，末端區域相互補的序列為4個鹼基以上相連續的鹼基的序列。通常，載體中包含用於篩選作為目的的轉化體的因子(選擇標記)。作為選擇標記，可以舉出耐藥性基因或營養要求性互補基因、同化性賦予基因等，可以根據目的或宿主進行選擇。例如，作為在大腸桿菌中用作選擇標記的耐藥性基因，可以舉出抗氨爺西林基因、卡那黴素基因、二氫葉酸還原酶基因、抗新黴素基因等。本發明中使用的載體，只要是保持上述變異基因的載體即可，並無特別限制，可以使用適於各宿主的載體。作為載體，可以舉出例如質粒DNA、噬菌體DNA、逆轉座子DNA、人工染色體DNA等。例如，以大腸桿菌作為宿主的情況下，可以使用具有可在大腸桿菌內自我複製的區域的pTrc99A(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)、荷蘭；http:〃www.cbs.knaw.n1/)、pUC19(寶生物，日本)、pKK233-2(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)、荷蘭；http:〃www.cbs.knaw.n1/)、pET-12(Novagen公司，德國)、pET-26b(Novagen公司，德國)等。另外，也可以根據需要，使用改變了這些載體的物質。另外，也可以使用表達效率高的表達載體，例如具有trc啟動子、lac操縱子的表達載體pTrc99A或者pKK233-2等。含有上述改良型囟代醇環氧酶基因的重組載體，被包含在本發明的範圍內。作為含有改良型卣代醇環氧酶基因的重組載體的具體例子，可以舉出例如本發明中例示的pSTK002、pSTK003、pSTT002、pSTT003、pSTT002-T133A、pSTT002-T136C、pSTT002-T133S、pSTT002-F136A、pSTT002-F136S、pSTT002-F136W、pSTT002-D199Q、pSTT002-D199E、pSTT002-D199H、pSTT002-D199S、pSTT002-D199T、pSTT002-D199Y、pSTT002-D199L、pSTT002-D199M、pSTT002-D199I等。(IV-1)轉化體通過將本發明的重組載體對宿主進行形質轉換或形質導入，製作轉化體或轉導體(以下，將它們統稱為"轉化體")。該轉化體也被包含於本發明的範圍內。在本發明中使用的宿主，只要在導入上述重組載體後，能夠表達目的改良型滷代醇環氧酶，就沒有特別限制。作為宿主，可以舉出例如大腸桿菌、枯草桿菌、紅球菌屬細菌等細菌、酵母(Pichia,Saccharomyces)、麴黴菌(Aspergillus)、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等。以細菌作為宿主的情況下，在本發明中，可以優選使用大腸桿菌、紅球菌屬細菌作為宿主。作為大腸桿菌，可以舉出例如大腸桿菌K12林和B林、或者來自它們的野生林的派生林即JM109株、XL1-Blue株、C600林等。特別是，將上述乳糖操縱子的lac啟動子及其派生啟動子用作表達啟動子的情況下，如果使用具有lacI阻遏物基因的宿主，則表達就是誘導型(用IPTG等誘導)，如果使用沒有lacl阻遏物基因的宿主，則表達就是構成型，因此，可以利用適應需要的宿主。這些菌林可以從美國標準菌種收藏所(ATCC)等容易地獲得。作為枯草桿菌，可以舉出例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等。作為紅球菌(Rhodococcus)屬細菌，可以舉出例如紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)ATCC999抹、ATCC12674抹、ATCC17895株、ATCC15998抹、ATCC33275抹、ATCC184、ATCC4001林、ATCC4273株、ATCC4276抹、ATCC9356林、ATCC12483抹、ATCC14341抹、ATCC14347株、ATCC14350抹、ATCC15905抹、ATCC15998抹、ATCC17041林、ATCC19149株、ATCC19150林、ATCC21243林、ATCC29670株、ATCC29672抹、ATCC29675抹、ATCC33258抹、ATCC13808抹、ATCC17043抹、ATCC1卯67林、ATCC21999抹、ATCC21291抹、ATCC21785株、ATCC21924抹、IF014894林、IF03338林、NCIMB11215抹、NCIMB11216抹、JCM3202株、紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)Jl林(保藏號"FERMBP-1478")、球狀紅球菌(Rhodococcusgloberulus)IF014531抹、藤黃紅球菌(Rhodococcusluteus)JCM6162抹、JCM6164株、灰暗諾卡氏菌諾卡氏菌(Rhodococcuserythropolis)IF012538抹、IFO12320抹、馬紅球菌(Rhodococcus叫ui)IFO3730抹、JCM1313抹。優選的舉出紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)Jl林(保藏號"FERMBP-1478")。上述ATCC株可以從美國標準菌種收藏所獲得，IFO林可以從獨立行政法人製品評價技術基礎機構生物科技本部生物遺傳資源部門(NBRC)獲得，JCM抹可以從獨立行政法人理化學研究所生物資源中心微生物材料開發室獲得，FERM抹可以從獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心獲得。作為向細菌導入重組載體的方法，只要是向細菌中導入DNA的方法就沒有特別限制。可以舉出例如使用4丐離子的方法、電穿孔法等。以酵母作為宿主的情況下，可以-使用例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂歹直酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)等。作為向酵母導入重組載體的方法，只要是向酵母中導入DNA的方法就沒有特別限制，可以舉出例如電穿孔法、原生質球法、醋酸鋰法等。以動物細胞為宿主的情況下，可以使用猴細胞COS-7、Vero、CHO細胞、小鼠細胞、大鼠GH3、人FL細胞等。作為向動物細胞中導入重組載體的方法，可以舉出例如電穿孔法、磷酸鈞法、脂質轉染法等。以昆蟲細胞為宿主的情況下，可以使用Sf9細胞、Sf21細胞等。作為向昆蟲細胞中導入重組載體的方法，可以使用例如磷酸鈣法、脂質轉染法、電穿孔法等。以植物細胞為宿主的情況下，可以舉出菸草BY-2細胞等，但並不限於這些。作為向植物細胞中導入重組載體的方法，可以使用例如土壤桿菌法、基因槍法、PEG法、電穿孔法等。上述通過含有改良型卣代醇環氧酶基因的重組載體所得到的轉化體被包含於本發明的範圍內。作為通過含有改良型滷代醇環氧酶基因的重組載體所得到的轉化體的具體例子，可以舉出例如本發明中所例示的JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-T133S、JM109/pSTT002-F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002畫D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199Y、JM109/pSTT002曙D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199I等。(V.)改良型卣代醇環氧酶的製造方法在本發明中，改良型卣代醇環氧酶可以是培養上述轉化體得到的培養物自身或者從培養物中提取來製造。在本發明中，所說的"培養物，，是指包括培養液、培養液上清液、細胞或菌體、細胞或菌體懸濁液、細胞或菌體破碎液、粗酶液及它們的處理物等通過培養生產改良型離代醇環氧酶的轉化體所得到的物質以及源於它們的物質中的任一種。培養本發明的轉化體而得到的培養物也包括在本發明的範圍內。培養本發明的轉化體的方法，可以按照宿主的培養中所使用的通常的方法來進行。目的改良型卣代醇環氧酶在上述培養物中的任一種中被積累。本發明的培養轉化體的培養基，只要是含有宿主能夠同化的碳源、氮源、無機鹽類等，可有效地培養轉化體的培養基即可，可以使用天然培養基、合成培養基中的任一種。作為碳源，可以舉出葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、澱粉等碳水化合物、醋酸、丙酸等有機酸、乙醇、丙醇等醇類。作為氮源，可以舉出氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無機酸或有機酸的銨鹽或其他的含氮化合物。另外，可以使用蛋白腖、酵母粉、肉膏、玉米漿、各種胺基酸等。作為無機物，可以舉出亞磷酸鉀、磷酸鉀、磷酸錳、硫酸錳、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、碳酸鈣等。另外，根據需要，為了防止培養中產生發泡，也可以添加消泡劑。另外，根據需要，也可以適當地添加維他命。培養中，根據需要，可以向培養基中添加氨節西林或四環素等抗生素。培養過程中，為了防止載體和目的基因的脫落，可以以施加選擇壓的狀態來培養。即，在選擇標記為耐藥性基因的情況下，可以向培養基中添加與^目應的藥劑，在選擇標記為營養要求性互補基因的情況下，可以從培養基中除去與之相應的營養因子。另外，在選擇標記為同化性賦予基因的情況下，可以根據需要添加與^目應的同化因子作為唯一的因子。例如，在培養用含有耐氨苄基因的載體進行形質轉換的大腸桿菌的情況下，在培養中，可以根據需要向培養基中添加氨節西林。化體的情況下，可以根據需要在培養基中添加誘導劑。例如，培養用具有可由異丙基-P-D-硫代半乳糖香(IPTG)來誘導的啟動子的表達載體進行形質轉換的轉化體時，可以在培養基中添加IPTG等。另外，培養用具有可由吲哚乙酸(IAA)來誘導的trp啟動子的表達載體進行形質轉換的轉化體時，可以在培養基中添加IAA等。轉化體的培養條件，只要是不妨礙目的改良型卣代醇環氧酶的生產率和宿主的繁育的條件即可，並無特別限制，通常，培養溫度為10。C45。C，優選為10°C~40°C,更優選為15°C~40°C,進一步優選為20°C~37°C，根據需要，可以在培養過程中變更溫度。培養溫度為5~120小時，優選為5~100小時，進一步優選為10~100小時，更優選為15~80小時左右。使用無機或有機酸、鹼溶液等來進行pH的調節，如果是大腸桿菌則通常調節為6~9。作為培養方法，可以舉出固體培養、靜置培養、振蕩培養、通氣攪拌培養等。特別是培養大腸桿菌轉化體的情況下，優選通過振蕩培養或通氣攪拌培養(發酵罐)在好氧的條件下進行培養，此時，也可以用通常的固體培養法進行培養，但如果可能的話，優選採用液體培養法進行培養。作為培養所用的培養基，優選使用如下培養基，其是在例如酵母粉、胰蛋白腖、多聚蛋白腖、玉米漿、大豆或小麥麩的浸出液等1種以上氮源中添加氯化鈉、亞磷酸鉀、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鐵、硫酸鐵或硫酸錳等無機鹽類的l種以上，進一步根據需要適當地添加糖質原料、維他命等而得到的培養基。培養基的初始pH值最好調節至7~9。另外，培養在5。C40。C進行5100小時，優選在10°C~37。C進行5100小時。優選通過通氣攪拌深部培養、振蕩培養、靜置培養、流加培養等來實施。尤其是，以工業規模來生產改良型卣代醇環氧酶的情況下，可以利用通氣攪拌培養。此外，作為通氣攪拌培養的操作方式並無限制，可以選用分糸匕培養(batchculture)、半分糸匕培養(fed-batchculture,semi-batchculture)以及連續培養(continuousculture)中的任一種方式來進行。尤其是，在想通過高濃度培養來提高每個裝置、每小時、每筆費用或每次操作的生產率的情況下，可以進行半分批式培養。在半分批式培養中使用的流加(fed)培養基成分，可以使用與初批(batch)培養基成分的組成相同的培養基，也可以變更組成，但優選培養基成分的濃度高於初批培養基的濃度。流加培養基的體積並無特別限制，通常，可以添加初始培養基的1/2以下的體積。作為添加流加培養基的方法(feedingmode),可以舉出例如定流流加法(constant)、指悽t流力口法(exponential)、階IS:增力口流力口法(stepwiseincrease)、比增歹直速度4空制;克力口法(specificgrowth-ratecontrol)、pH,爭il力口';去(pH陽stat)、DO,爭力充力口'法(DO-stat)、葡萄糖濃度控制流加法(glucoseconcentrationcontrol)、醋酸濃度監觀'K危力口法(acetateconcentrationmonitoring)、才莫浙月3申經電i各;克力口法(fuzzyneuralnetwork)等(TrendsinBiotechnology(1996),14，98-105)，但只要能得到所希望的卣代醇環氧酶活性即可，並無特別限制。實施半分批式培養時的培養結束時期，沒有必要限定於流化培養基的投入結束後，可以根據需要繼續培養，在每個轉化體的卣代醇環氧酶活性達到最高點時結束培養。作為對以動物細胞為宿主所得到的轉化體進行培養的培養基，可以舉出通常使用的RPMI1640培養基、DMEM培養基或者在這些培養基中添加有小牛血清等的培養基等。通常在存在5。/。C02的條件下，在37。C培養1~30天。在培養過程中，可以根據需要，在培養基中添加卡那黴素和盤尼西林等抗生素。在轉化(轉導)體為植物細胞或植物組織的情況下，可通過使用通常的植物培養用培養基，例如MS基本培養基、LS基本培養基等來進行培養。培養方法可以釆用通常的固體培養法、液體培養法中的任一種。在轉化體為植物細胞或植物組織的情況下，可通過使用通常的植物培養用培養基，例如MS基本培養基、LS基本培養基等來進行培養。培養方法可以採用通常的固體培養法、液體培養法中的任一種。在上述培養條件下培養時，可以使本發明的改良型卣代醇環氧酶積累於上述培養物中，即，積累於培養液、培養液上清液、細胞、菌體或者細胞或者菌體的破碎物的至少一種。培養後，在改良型卣代醇環氧酶生產於菌體內或者細胞內的情況下，可以直接將菌體或者細胞用作物質生產的催化劑，或者，也可以通過破碎菌體或者細胞，來提取目的改良型卣代醇環氧酶。任何一種情況，如果有必要的話，可以通過離心分離或者膜過濾等固液分離操作來進行培養基的除去和洗滌。離心分離只要能夠提供使菌體或者細胞沉降的離心力即可，並無特別限制，可以利用圓筒形和分離^1型等。作為離心力，可以以例如500G20000G左右進行。另外，可用於本工序的膜過濾，只要是能夠實現作為目的的固液分離即可，可以是微濾(MF)膜、超濾'(UF)膜中的任一種，通常，優選使用微濾(MF)膜。就微濾而言，例如，如果基於流動方向，可以分類成死端或4晉流(切向流)方式，如果基於壓力的施加方式，可以分類成重力式、加壓式、真空式、離心力式等，如果基於操作方式，可以分類成分批式和連續式等，但只要能夠進行固液分離操作即可，可以利用其中的任一種。作為MF膜的材質，可以大致分為高分子膜、陶瓷膜、金屬膜以及它們的複合型，只要不使改良型滷代醇環氧酶活性和固液分離操作時的該活性回收率降低，就沒有特別限制，但特別優選高分子膜，例如聚碸、聚醚碸、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚烯烴、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯腈、混合纖維素酯、銅氨法再生纖維素酯、聚醯亞胺、尼龍、特氟龍(註冊商標)等。作為膜的孔徑，只要能夠捕捉菌體或細胞，實現濃縮操作即可，通常可以使用0.10.5pm左右的膜。由上述離心分離和膜過濾所進行的固液分離操作時，可以添加水或者根據需要添加緩沖液、等滲液進行稀釋洗滌。就使用的緩沖液而言，只要是不使改良型卣代醇環氧酶活性和固液分離操作時的該活性回收率降低的緩衝液即可，並無特別限制，例如，鹽濃度最好是5-500mM,優選為5~150mM左右，pH最好是59左右。作為緩衝液成分，可以舉出例如三羥曱基氨基曱烷(Tris)磷酸鈉鹽或鉀鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等。具體來講，可以舉出例如20mMTris-硫酸緩衝液(pH8)、20mM磷酸鈉緩沖液(pH7)等。另外，作為等滲液，可以舉出例如0.7~0.9%氯化鈉溶液等。此外，如果有能夠穩定改良型滷代醇環氧酶的物質等，則可以添加它們。進行上述的培養基除去和洗滌後，可以將菌體或細胞再度懸浮於水或者根據需要懸浮於緩衝液、等滲液中，可以製備菌體或細胞懸浮液。菌體或細胞懸濁液也可以直接用作物質生產中的催化劑，也可根據需要在進行處理後使用。作為處理方法，例如，在由上述培養得到的培養物中加入表面活性劑，使得終濃度達到0.01%~10%,最好在滷代醇環氧酶不失活的溫度下進行攪拌。表面活性劑的終濃度優選為0.05%~1%,特別優選為0.1%0.5°/。。處理溫度優選為0。C40。C,特別優選為4。C20。C。處理時間只要在可確認菌體處理的效果的時間內即可，優選為15分鐘24小時，特別優選為30分鐘2小時。作為表面活性，可以使用陰離子表面活性劑、陽離子表面活性或非離子表面活性劑。作為陰離子表面活性劑，可以使用十二烷基硫酸鈉等。作為陽離子表面活性劑，可以使用千索氯銨等。作為非離子表面活性劑，可以使用曲通X100等。用表面活性劑進行處理的菌，可以用緩衝液洗滌來使用，也可以不洗滌而直接使用。另外，也可以不進行上述培養基的除去和洗滌操作，而直接進行菌體或細胞的表面活性劑等的處理。另外，菌體或細胞也可以固定化來使用。具體來講，可以舉出例如將培養後的細胞或菌體用丙烯醯胺等凝膠包含而得到的物質、負載於氧化鋁、氧化矽、沸石、硅藻土等無機載體而得到的物質等。另一方面，通過破碎菌體或細胞，也可以提取目的改良型卣代醇環氧酶。作為菌體或細胞的破碎方法，可以舉出超聲波處理、由弗氏壓碎器或勻漿器所進行的高壓處理、由珠磨機所進行的磨碎處理、由衝擊波破碎裝置所進行的衝撞處理、使用溶菌酶、纖維素酶、果膠酶等的酶處理、凍結溶解處理、低滲液處理、由噬菌體所進行的溶菌誘導處理等，可以單獨使用任一種方法或者根據需要組合利用。以工業的規模進行菌體或細胞的破碎的情況下，考慮到操作性、回收率、成本等，優選主要利用高壓處理或磨碎處理、衝突處理，也可以根據情況在物理破碎操作中組合酶處理等。就各破碎處理方法而言，只要是由菌體或細胞得到的改良型面代醇環氧酶回收率足夠高的方法，則操作條件就沒有特別限制。所說的足夠高的改良型滷代醇環氧酶回收率，例如優選為85%以上，更優選為90%以上，進一步優選為95%，最優選為99%以上。利用珠磨機進行磨碎處理的情況下，就使用的微珠而言，可以通過例如將密度2.56.0g/cm3、尺寸0.11.0mm的微珠通常填充8085。/o左右，進行破碎，作為運轉方式，也可以採用分批式、連續式中的任一種。菌體或細胞濃度也沒有特別限制，例如，如果是細菌的話，最好是6~12%左右，如果是酵母的話，最好是14~18%左右。進行高壓處理的情況下，就處理壓力而言，只要來自菌體或細胞的改良型卣代醇環氧酶回收率足夠高即可，並無特別限制，例如，可以在40150MPa左右的壓力下進行破碎。菌體或細胞濃度也沒有特別限制，例如，可以是20%以下左右。也可以根據需要，通過將裝置串聯地配置，或者使用多級結構的裝置，進行多級處理，提高破碎和操作效率。通常，由於每lOMPa的處理壓力會產生2~3。C的溫度上升，因此優選根據需要進行冷卻處理。衝撞處理情況下，例如，可以預先利用噴霧急速凍結處理(凍結速度例如每分鐘數千攝氏度)等將被破碎菌體或細胞漿液製成凍結微粒(例如，50fim以下)，通過高速(例如約300m/s)的輸送氣體使其衝撞於衝撞板，從而破碎菌體或細胞。上述菌體或細胞破^5f處理的結果為，在因細胞內的核酸流出而使得處理液的粘度上升，操作困難的情況下，或者對於後續的殘渣分離工序下的活性回收率提高有效果的情況下，可以根據需要通過核酸除去或核酸分解，期待處理液的粘度降低或殘渣分離工序下的活性回收率的提高。作為除去或分解細胞破碎液中的核酸的方法，只要是不使改良型囟代醇環氧酶活性或該活性回收率降低，並且能夠除去或分解核酸的方法即可，可以是任一種方法，可舉出如生物化學實驗講座5巻200~201頁中所記載的方法通過在細胞破碎液中添加魚精蛋白硫酸或者鏈黴素來沉澱核酸的方法；用核酸分解酶來分解核酸的方法；使用葡聚糖-聚乙二醇進行液液分離的方法等。另外，有時進一步追加物理破碎處理也是有效的。這些方法中，尤其是想既避免繁雜的工序又迅速分解核酸的情況下，也可以釆用用核酸分解酶來分解核酸的方法。就用於核酸分解酶處理的核酸分解酶而言，只要是至少作用於脫氧核糖核酸(DNA),具有核酸分解反應催化能力，降低DNA聚合度的酶即可，可以是任何酶，也可以利用本來就存在於該轉化體細胞內的核酸分解酶，但也可以另外添加外因性的核酸分解酶。作為另外添加的核酸分解酶，可以舉出來自牛脾臟的DNaseI(和光純藥，曰本)、來自豬脾臟的DNaseII(和光純藥，日本)、來自粘質沙雷菌(Serratiamarcescens)的核酸分解酶Benzonase(註冊商標)核酸酶(Nuclease)(寶生物，曰本)、來自金黃葡萄球菌的核酸酶(NucleasefromStaphylococcusaureus)(和光純藥，日本)等。添加的酶量，因酶的種類和單位數(U)的定義而不同，如果是本領域技術人員則可以適當地設定。根據需要，可以在該酶溶液中添加核酸分解酶所要求的鎂等輔助因子。處理溫度根據使用的核酸分解酶而不同，但只要是來自常溫生物種類的核酸分解酶，則通常設定於2040。C的溫度即可。在需要從得到的破碎液中除去菌體或細胞破碎殘渣的情況下，可以通過例如離心分離或過濾(死端方式或4晉流方式)等來除去。離心分離操作可以如前所述地進行。在菌體或細胞破碎殘渣孩i小，且難以容易地沉降的情況下，可以根據需要使用凝集劑來提高殘渣沉澱效率。就有機高分子凝集劑而言，如果基於離子性，則可以舉出陽離子系凝集劑、陰離子系凝集劑、兩性系凝集劑、非離子系凝集劑，如果基於成分，則可以舉出丙烯酸系、聚乙烯亞胺、縮合系聚陽離子(聚胺)、二甲基二烯丙基氯化銨、殼聚糖等，就本發明中使用的凝集劑而言，只要是不使改良型閨代醇環氧酶活性或該活性回收率降低，並且能夠提高殘渣分離效率的凝集劑，就可以是任一種凝集劑。作為構成丙烯酸系凝集劑成分的丙烯酸系水溶性單體，可以舉出例如丙烯醯胺、丙烯酸鈉、丙烯醯胺2-曱基-丙烷磺酸鈉、二甲基氨乙基-曱基丙烯酸酯、甲基丙烯醯氧基乙基-三曱基氯化銨、曱基丙烯醯氧基乙基-節基二曱基-氯化銨、二甲基氨乙基-丙烯酸酯、丙烯醯氧基乙基-三曱基氯化銨、二曱基氨基丙基-丙烯醯胺、丙烯醯胺丙基-三曱基氯化銨、聚氯脒等，可以舉出這些單體的均聚物、由多種組合所形成的共聚物或者高分子改性物作為丙烯酸系凝集劑。作為極具代表性的陽離子系高分子凝集劑，可以舉出聚氨基烷基曱基丙烯酸酯類、聚氨基烷基曱基丙烯酸酯和丙烯醯胺的共聚物類、聚丙烯醯胺的曼尼希改性物類、聚二曱基二烯丙基銨鹽類、聚乙烯基咪唑啉類、聚丙烯醯胺類、胺系縮聚物類等，多數商品已經在市場上銷售。作為其主要商品，可以舉出例如Sanpoly-K-601,K-602(主成分聚胺，三共化成)、KuriflockLC-599(主成分聚胺和聚醯胺，慄田工業)、HymolockM-166，M-566,M-966,(主成分丙烯醯胺改性物，協立有機工業)、Uniflocker-UF-301,UF-304，UF-305，(主成分聚丙烯醯胺，尤尼吉可)、UF-330,UF-340，(主成分氨基曱基丙烯酸酯，尤尼吉可)、UF-505(主成分二氰胺(dicyanoamine),尤尼吉可)、RyuflocC-110(主成分聚胺，大日本油墨化學)、PuriflocC-31(主成分聚胺，陶氏化學)。另夕卜，也可以舉出Dia-Nitrix公司(曰本)製造的K-400系列、KM-200系列、KM-1200系列、KAM-200系列、KD-200系列、KP-000系列、KP-100系列、KP-200系列、KP-300系列、KP-500系列、KP-1200系列、KA-000系列、KA-200系列、KA-300系列、KA-400系列、KA-600系列、KA-700系列、KA-800系列等。這些凝集劑可以單獨使用或者將2種以上並用來使用。就本發明中使用的凝集劑而言，只要是不使改良型滷代醇環氧酶活性或該活性回收率降低，並且可提高殘渣分離效率提高的凝集劑，就可以是上述任一種凝集劑，具體來講,可以舉出例如Dia-Nitrix公司(日本)製造的K-403B、K-408、K-415等。作為凝集劑的添加量，才艮據凝集劑的種類、菌體或石皮^淬液的液狀而有所不同，例如，破碎後的微生物乾燥重量％濃度的1/200-1/5的濃度，優選為1/100~1/10濃度。作為添加方法，例如將凝集劑預先溶解於水中後，添加於菌體或細胞破碎液，靜置或攪拌至少5分鐘24小時即可，優逸靜置或攪拌30分鐘10小時左右。作為此時的溫度，優選例如為0。C60。C,特別優選為0。C50。C,進一步優選為0。C40。C。另外，在需要調節pH的情況下，也可以適當地添加成無機鹽終濃度為5~200mM,進行緩衝液化，根據需要，還可以添加使改良型卣代醇環氧酶穩定的物質。利用過濾進行殘渣分離時，如果能實現目的的殘渣分離，就可以使用微濾(MF)膜、超濾(UF)膜中的任一種膜，通常，優選使用微濾(MF)膜。微濾膜如前所述，只要是能夠進行殘渣分離操作的膜，就可以利用任一種膜。作為膜的孔徑，只要是可捕捉菌體或細胞殘渣，並且在濾液側回收改良型卣代醇環氧酶活性的孔徑即可，例如，可以使用0.1-0.5iim左右的膜。此外，如果使用過濾助劑、根據需要的凝集劑的話，也可以使用孔徑0，5pm以上的膜或者濾紙。作為過濾助劑，可以舉出硅藻土、纖維素粉末、活性炭等。凝集劑如上所述。除去殘渣之後所得到的上清液，是細胞提取液可溶性級分，可以作為含有改良型卣代醇環氧酶的粗酶溶液。然後，根據需要，通過使用在蛋白質的分離純化中使用的通常的生物化學方法，可以從所述培養物中分離純化滷代醇環氧酶，其中所述生物化學方法包括例如硫酸銨沉澱、各種色譜(例如凝膠過濾色i普(例如Sephadex色譜柱)、離子交換色譜(例如DEAE-Toyopearl)、親和色譜、疏水色鐠(例如butylToyopearl)、陰離子色譜(例如MonoQ色譜柱)等)、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳等，這些方法可以單獨使用或者適當地組合使用。在本發明的轉化體是基因重組體，並且，擔心由於轉化體在製造工序中向環境中洩露、混入製品中或者使用後的處理等而可能引起二次微生物汙染的情況下，可以根據需要進行滅活處理。作為滅活方法，只要是不使改良型滷代醇環氧酶活性或該活性回收率降低，並且可滅活轉化體的方法，就可以是任何方法，例如可以單獨或者組合利用熱處理、菌體破碎處理、藥劑處理等方法。例如，通過在菌體破碎處理之前或之後進行藥劑處理，可以進行滅活。作為所使用的藥劑，根據轉化體的宿主種類而異，可以舉出例如千索氯銨、氯化十六烷吡啶、甲基硬脂醯氯、十六烷基三甲基氯化銨等陽離子表面活性劑、鹽酸烷基二氨基乙基甘氨酸等兩性離子表面活性劑等。另外，也可以舉出乙醇等醇類、2-巰基乙醇等硫醇類、乙二胺等胺類、半胱氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸等胺基酸類等。就藥劑的濃度而言，只要是不降低改良型滷代醇環氧酶活性或該活性回收率，並且可以滅活的濃度即可，例如，優選為微生物乾燥重量％濃度的1/1001/2的濃度，更優選為1/101/5濃度左右。處理溫度為050。C,優選為04(TC。另夕卜，pH為5~9左右，優選為68左右。另一方面，在改良型卣代醇環氧酶生產於菌體外或細胞外的情況下，直接使用培養液，或者通過上述的離心分離或過濾等來除去菌體或細胞。然後，根據需要，通過利用硫酸銨沉澱進行萃取等，來從所述培養物中提取改良型滷代醇環氧酶，進一步根據需要，將透析、各種色譜(凝膠過濾、離子交換色譜、親和色i普等)單獨或適當組合來使用，從而也可以進行純化。在轉化體為植物細胞或植物組織的情況下，通過使用纖維二糖酶、果膠酶等酶的細胞溶解處理、超聲波破碎處理、磨碎處理等來破壞細胞。然後，如果需要的話，通過使用在蛋白質的分離純化中使用的通常的生物化學方法，可以從所述培養物中分離純化卣代醇環氧酶，其中所述生物化學方法包括例如^5克酸銨沉澱、各種色譜(例如凝膠過濾色譜(例如Sephadex色譜柱)、離子交換色i普(例如DEAE-Toyopearl)、親和色"i普、疏水色i普(例如butylToyopearl)、陰離子色譜(例如MonoQ色譜柱)等)、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳等，這些方法可以單獨使用或者適當地組合使用。分離的卣代醇環氧酶與上述細胞或菌體同樣地，可以保持於適當的載體上，作為固定化酶來使用。按以上方法得到的培養物和改良型卣代醇環氧酶，被包含於本發明的範圍內。得到的培養物和改良型卣代醇環氧酶的生產收率，可以通過測定(I)記載的卣代醇環氧酶活性，算出每個培養裝置、—每個培養液、每單位菌體(轉化體)溼重量或乾燥重量、每單位酶液中蛋白質重量等的活性來求出。另夕卜，在本發明中，也可以從上述改良型滷代醇環氧酶基因或含有改良型卣代醇基因的重組載體中提取改良型鹵代醇環氧酶。即，在本發明中，可以完全不使用生細胞而採用無細胞蛋白質合成體系，來產生改良型卣代醇環氧酶。所說的無細胞蛋白質合成體系，是使用細胞提取液在試管等人工容器內合成蛋白質的體系。在本發明中使用的無細胞蛋白質合成體系中，也包含以DNA為模板來合成RNA的無細胞轉錄體系。此時，與上述宿主對應的生物相當於下述的細胞提取液的來源生物。這裡，上述細胞提取液可以使用來自真核細胞或來自原核細胞的提取液，例如可以使用小麥胚芽、大腸桿菌等的提取液。這些細胞提取液可以是濃縮的也可以是未濃縮的。細胞提取液可以通過例如超濾、透析、聚乙二醇(PEG)沉澱等來得到。此外，在本發明中，無細胞蛋白質合成也可以使用市售的試劑盒來進行。作為這樣的試劑盒，可以舉出例如試劑盒PROTEIOS(東洋紡)、TNTTMSystem(promega)、合成裝置的PG-MateTM(東洋紡)、RTS(roche-diagnostics)等。如上述那樣通過無細胞蛋白質合成而得到的改良型卣代醇環氧酶，可以如前所述選擇適當的色譜來進行純化。(VI)表囟代醇和4-卣代-3-羥基丁腈的製造方法如上述方法製造的改良型面代醇環氧酶可以作為酶催化劑來用於物質生產。即，可以供於以下的(VI-1)(VI-3)所示的反應。(VI-1)1，3-二卣代-2-丙醇向表卣代醇的轉換本轉換反應可以通過使1,3-二卣代-2-丙醇與上述的改良型滷代醇環氧酶和/或由上述培養所得到的培養物相接觸來進行。作為底物的1,3-二卣代-2-丙醇是用前述通式(1)表示的化合物。作為滷原子，優選為氟、氯、溴、碘，特別優選為氯、溴。具體來講，可以舉出1,3-二氟-2-丙醇、1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇、1,3-二碘-2-丙醇等，優選為1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇。轉換反應液中的底物濃度優選為0.01-15(W/V)%。從酶穩定性的觀點出發，底物濃度在該範圍內時是理想的，特別優選為0.0110%。底物可以一次性添加於反應液中或者分次添加。從積累性的觀點出發，優選通過分次添加而使底物濃度恆定。作為反應液的溶劑，優選酶活性的最適值pH4~10的附近的水或緩衝液。作為緩衝液，優選例如由磷酸、硼酸、檸檬酸、戊二酸、蘋果酸、丙二酸、鄰苯二曱酸、琥珀酸或醋酸等的鹽等構成的緩沖液、Tris緩衝液或者good緩沖液等。反應溫度優選為5~50°C,反應pH值優選為4~10的範圍。反應溫度更優選為10~40°C。反應pH更優選為pH6~9。反應時間才艮據底物等的濃度、菌體濃度或者其他的反應條件等進行適當地選擇，優選設定成在1-120小時內結束的條件。另外，在本反應中，通過乂人反應體系內除去伴隨著反應的進行所生成的氯離子，可以進一步提高光學濃度。優選通過添加硝酸銀等來除去該氯離子。在反應液中生成、積累的表卣代醇可以釆用公知的方法來提取和純化。例如，用醋酸乙酯等溶劑進行萃取，在減壓下除去溶劑，從而可以得到表面代醇的漿液。另外，可以通過在減壓下蒸餾這些漿液來進一步純化。(VI-2)1，3-二卣代-2-丙醇向4-卣代-3-羥基丁腈的轉換本轉換反應可以通過使1,3-二囟代-2-丙醇與上述改良型卣代醇環氧酶和/或由上述的培養所得到的培養物接觸來進行。作為底物的1,3-二卣代-2-丙醇是用前述通式(1)表示的化合物，優選為1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇。另外，作為氰化物，可以使用氰化氫、氰化鉀、氰化鈉、氰酸或丙酮氰醇等在添加於反應液中時生成氰離子(CN-)或氰化氫的化合物或其溶液。反應液中的底物濃度從酶穩定性的觀點出發，優選為0.01~15(W/V)%,特別優選為0.0110%。另夕卜，氰化物的使用量從酶穩定性的觀點出發，優選為底物的1~3倍量(摩爾)。反應條件可以與上述(VI-1)相同。反應液中生成、積累的4-卣代-3-羥基丁腈可以使用公知的方法來提取和純化。例如，可以通過使用離心分離等方法從反應液除去菌體後，用醋酸乙酯等溶劑進行萃取，減壓下除去溶劑，可以得到4-滷代-3-羥基丁腈的漿液。另外，也可通過減壓下蒸餾這些漿液來進一步純化。(VI-3)表卣代醇向4-卣代-3-羥基丁腈的轉換本轉換反應通過使表面代醇與上述改良型卣代醇環氧酶和/或由上述培養所得到的培養物相接觸來進行。作為底物的表囟代醇是用前述通式(2)表示的化合物。作為囟原子，優選為氟、氯、溴、碘，特別優選為氯、溴。具體來講，可以舉出表氟代醇、表氯代醇、表溴代醇、表硪代醇等，特別優選為表氯代醇、表溴代醇。另外，氰化物可以使用氰化氬、氰化鉀、氰化鈉、氰酸或丙酮氰醇等添加於反應也中時生成氰離子(CN-)或者氰化氬的化合物或其溶液。反應條件、提取和純化方法可以與上述(VI-2)相同。以下，利用實施例來對本發明進行更具體地說明。但是，本發明並不因這些實施例而受到任何限制。實施例1比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基被取代成其他胺基酸的改良型卣代醇環氧酶的獲得及其評價(1)表達改良型囟代醇環氧酶的轉化體的製作(表達載體pKK233-2)按以下所述製作出表達改良型卣代醇環氧酶的表達質粒(表達載體pKK233-2)以及含有該表達質粒的表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體，所述改良型卣代醇環氧酶是，來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的野生型卣代醇環氧酶即HheB(2nd)中，由翻譯起始密碼子編碼的胺基酸殘基的下遊的1個胺基酸殘基(第2個胺基酸殘基)分別被取代成賴氨酸和天冬醯胺的酶。首先，通過PCR擴增卣代醇環氧酶基因HheB(2nd)。PCR反應液的組成(總量50ial)如下表所示，製備出3個系列(3個系列的不同在於正義引物各不相同)。44tableseeoriginaldocumentpage45用作引物的寡聚核苷酸的序列如下所示。DH-08:GGCCATGGCTAACGGAAGACTGGCAGGC(序列號57:由28個核苷酸構成，該序列中具有限制性內切酶Ncol識別部位(CCATGG)和滷代醇環氧酶基因HheB(2nd)的翻譯起始密碼子以後的序列，與第2個胺基酸對應的密碼子是GCT編碼丙氨酸)由33個核苷酸構成，該序列中具有限制性內切酶BspHI識別部位(TCATGA)和卣代醇環氧酶基因HheB(2nd)的翻譯起始密碼子以後的序列，與第2個胺基酸對應的密碼子是AAA編碼賴氨酸)由33個核苷酸構成，該序列中具有限制性內切酶BspHI識別部位(TCATGA)和卣代醇環氧酶基因HheB(2nd)的翻譯起始密碼子以後的序列，與第2個胺基酸對應的密碼子是AAC編碼天冬醯胺)DH畫07:CGCCTGCAGGCTACAACGACGACGAGCGCCTG(序列號60:由32個核苷酸構成，該序列中具有限制性內切酶Sse8387I兼PstI識別部位(CCTGCAGG)以及卣代醇環氧酶.基因HheB(2nd)終止密碼子下遊區域)另外，用作模板的pSTlll記載於日本特公平5-317066公報，由含有pSTlll的重組載體所得到的大腸桿菌轉化體JM109/pST111以保藏號"FERMBP-10922",在平成3年3月1日保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心。tableseeoriginaldocumentpage46利用GFXPCRDNAbandGelBand純化試劑盒(GE保健生物科學)分別對進行了熱處理的3個系列的PCR反應液進行純化，然後，對系列1的PCR擴增產物用限制性內切酶NcoI和PstI進行雙酶切消化，對系列2和系列3的PCR擴增產物用限制性內切酶BspHI和PstI進行雙酶切消化。用瓊脂糖凝膠電泳分離各消化產物後，用QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN)對含有卣代醇環氧酶基因全長的帶(約0.8kb)進行純化。另一方面，將作為pKK233-2(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS),荷蘭；http://www.cbs.knaw.nl/)的衍生物的，可通過WO2006/41226號小冊子記載的方法來製備的表達載體pKK233-2(+Sse)用限制性內切酶NcoI和PstI消化後，通過苯酚萃取、氯仿萃取、乙醇沉澱(MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))來純化。將其與含有上述囟代醇環氧酶基因全長的3種PCR擴增產物分別混合後，向該混合液添加溶液I(SolutionI)(DNALigation試劑盒ver.2(寶生物)，製作出連接混合物。通過將該混合物在16。C孵育12小時，從而使PCR擴增產物和表達載體pKK233-2(+Sse)結合。將200jil預先製備好的大腸桿菌JM109林感受態細胞(將大腸桿菌JM109抹接種於lml的LB培養基(1%蛋白腖，0.5%酵母粉，0.5%NaCl)中，在37°C好氧預培養5小時，然後將預培養液0.4ml加入SOB培養基40ml(2%蛋白腖，0.5%酵母粉，10mMNaCl，2.5mMKCl，lmMMgS04，lmMMgCl2)，在18°C培養20小時，將得到的培養物通過離心分離(3700xg，10分鐘，4。C)進行集菌後，加入13ml冷TF溶液(20mMPIPES-KOH(pH6.0),200mMKC1,10mMCaCl2，40mMMnCl2)，在0。C放置10分鐘，再次離心分離(3700xg,10分鐘，4°C)來除去上清液，將得到的大腸桿菌菌體懸浮於冷TF溶液3.2ml,加入0.22ml的二曱基亞碸，在0。C放置10分鐘，然後，使用液氮來保存於-80°C),加入IOjxI的上述連接產物中，在0。C放置30分鐘。接著，對該感受態細胞在42。C給予30秒鐘的熱激處理，在0。C冷卻2小時。然後，添加lml的SOC培養基(20mM葡萄糖，2%蛋白腖，0,5%酵母粉，lOmMNaCl,2.5mMKC1,lmMMgS04，lmMMgCl2),在37。C振蕩培養1小時。將培養後的培養液以各自200|il的量，塗布於LBAmp瓊脂培養基(氨千100mg/L,含有1.5%瓊脂的LB培養基)，在37。C培養1夜。將在瓊脂培養基上生長的多個轉化體菌落，用1.5ml的LBAmp培養基(含有100mg/L氨苄的LB培養基)在37。C培養1夜。將得到的培養液分別集菌後，採用FlexiPrep(GE保健生物科學)回收重組質粒。使用毛細管DNA測序儀CEQ2000(貝克曼庫爾特)，按照附加的操作手冊，對被克隆於3種質粒中的PCR擴增產物的鹼基序列進行解析，確認在PCR反應中沒有產生錯誤變異。將克隆有來自系列1的PCR擴增產物的DNA片段的質粒命名為pSTKOOl，將克隆有來自系列2的PCR擴增產物的DNA片段的質粒命名為pSTK002，將克隆有來自系列3的PCR擴增產物的DNA片段的質粒命名為pSTK003，另夕卜，將含有這些質粒的大腸桿菌JM109抹轉化體分別命名為JM109/pSTK001、JM109/pSTK002和JM109/pSTK003。下述各質粒的特徵如下。pSTK001:對第2胺基酸殘基為丙氨酸殘基的野生型卣代醇環氧酶HheB(2nd)進行編碼的野生型閨代醇環氧酶基因被克隆於表達載體pKK233-2上；pSTK002:對第2胺基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代為賴氨酸的改良型卣代醇環氧酶HheB(2nd)進行編碼的改良型卣代醇環氧酶基因被克隆於表達載體pKK233-2上；pSTK003:對第2胺基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代為天冬醯胺的改良型卣代醇環氧酶HheB(2nd)進行編碼的改良型卣代醇環氧酶基因被克隆於表達載體pKK233-2上。(2)表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體的製作(表達載體pTrc99A)製作出表達改良型卣代醇環氧酶的表達質粒(表達載體pTrc99A)以及含有該表達質粒的表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體，所述改良型卣代醇環氧酶是，在來自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的野生型卣代醇環氧酶即HheB(2nd)中，比起始胺基酸殘基離C末端側近1個殘基(第2個胺基酸殘基)分別被取代成賴氨酸和天冬醯胺的酶。就製作而言，使用pTrc99A來代替在實施例1(1)中使用的表達載體pkk233-2，其他與實施例1(1)同樣地進行。將克隆有來自系列1的PCR擴增物的DNA片段的質粒命名為pSTTOOl,將克隆有來自系列2的PCR擴增物的DNA片段的質粒命名為pSTT002,將克隆有來自系列3的PCR擴增物的DNA片^:的質粒命名為pSTT003,另外，將含有這些質粒的大腸桿菌JM109抹轉化體分別命名為JM109/pSTT001、JM109/pSTT002和JM109/pSTT003。上述各質粒的特徵如下。pSTT001:對第2個胺基酸殘基為丙氨酸殘基的野生型卣代醇環氧酶HheB(2nd)進行編碼的野生型滷代醇環氧酶基因被克隆在表達載體pTrc99A上。pSTT002:對第2個氨基S爽殘基(丙氨酸殘基)被取代成賴氨酸的改良型滷代醇環氧酶HheB(2nd)進行編碼的改良型卣代醇環氧酶基因被克隆在表達載體pTrc99A上。pSTT003:對第2個胺基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代成天冬醯胺的改良型滷代醇環氧酶HheB(2nd)進行編碼的改良型卣代醇環氧酶基因被克隆在表達載體pTrc99A上。(3)表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體的評價對於在實施例1(1)和(2)中製作的6株轉化體(JM109/pSTK001、JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT001、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003)和日本特公平5-317066號公l艮記載的JM109/pST111共計7抹，按如下方式進行IPTG(異丙基-l-硫代-D-p-D-半乳糖苷)的評價。在各沃色曼氏試驗管中分注lml的LBAmp培養基，在各試驗管中分別接種二次評價選拔林6株以及JM109/pST111的菌落。在37。C、210rpm的條件下，培養約8培養基(500ml容積的三角燒瓶中的100ml)，在37。C、210rpm的條件下，培養24小時。通過離心分離(3700xg,IO分鐘，4°C)從得到的培養液中回收各菌體，用20mMTris-硫酸緩衝液(pH8.0)進行洗滌後，懸浮於相同緩衝液中使得菌濃度為12.5gDC/L。使用超聲波破碎機VP-15S(taitec，日本)，在輸出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的條件下，對得到的lml的菌體懸濁液進行冰浴，同時進行3分鐘破碎。將破碎的菌體懸濁液供於離心分離(23000xg,5分鐘，4°C)，採用上清液作為粗酶液。用20mMTris-硫酸緩衝液(pH8.0)對得到的粗酶液進行稀釋，使得各破碎前的(在菌體懸法液時刻的)菌體濃度達到6.25gDC/L。將稀釋了的來自各轉化體的粗酶液與等量的聚丙烯醯胺凝膠電泳用樣品緩衝液(0.1MTris-HCl(pH6.8)，4%w/vSDS，12。/。v/v卩巰基乙醇，20。/。v/v甘油，微量溴酚藍)進行混合，煮沸5分鐘來進行變性處理。製作出10%聚丙烯醯胺凝膠，每1道供應5|il的變性處理完的樣品，進行電泳分析(圖1)。作為30kDa強的帶分別觀察到卣代醇環氧酶(圖1中的箭頭)。與來自表達野生型滷代醇環氧酶HheB(l"的JM109/pST111的粗酶液比較，確認出來自表達相同野生型面代醇環氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK001的粗酶液和來自JM109/pSTT001的粗酶液的表達量增加(認49為這是因為表達載體的不同所引起的)。另一方面，與來自JM109/pSTK001的粗酶液和來自JM109/pSTT001的粗酶液相比較，來自表達第2個胺基酸殘基被取代成天冬醯胺的改良型卣代醇環氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK003的粗酶液和來自JM109/pSTT003的粗酶液的表達量分別進一步增加，另外，來自表達第2個胺基酸殘基被取代成賴氨酸的改良型卣代醇環氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK002的粗酶液和來自JM109/pSTT002的粗酶液的表達量分別進一步大幅增加。接著，使用上述粗酶液，通過以下方法測定卣代醇環氧酶活性(脫氯活性)。製備100ml的活性測定用反應液(50mMDCP,50mMTris-硫酸(pH8)),將溫度調節為20°C。向該反應液中添加稀釋好的來自各轉化體的粗酶液，開始反應。使用pH自動控制器，用0.01當量的氫氧化鈉水溶液，來調節伴隨著因卣代醇環氧酶活性所導致的氯化物離子的游離的pH的降低，使得pH保持在8。在10分鐘的反應期間內，由為了將pH保持在8而投入的0.01當量的氬氧化鈉水溶液的量，來算出氯化物離子生成量，算出卣代醇環氧酶活性(脫氯活性)(U)。1U的定義為相當於在上述條件下每分鐘由DCP脫離l)imol氯化物離子的酶量，通過用在活性測定中使用的各粗酶液的活性和該活性除以在活性測定中使用的各粗酶液的液量，來算出各粗酶溶液的液活性。此外，假設通過上述超聲波處理使得菌體被完全破碎，通過用該液活性除以破碎前的(菌體懸濁液時刻的)菌濃度，算出菌體比活性。將對於各轉化體的菌體比活性的結果示於表1中。與表達野生型滷代醇環氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK001和JM109/pSTT001相比較，表達第2個胺基酸殘基被取代成天冬醯胺的改良型滷代醇環氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK003和JM109/pSTT003的各自的菌體比活性提高至大約12倍和大約5倍，此外，表達第2個胺基酸殘基被取代成賴氨酸的改良型滷代醇環氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK002和JM109/pSTT002的各自的菌體比活性提高至大約25倍和大約17倍。即，就比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基(用序列號2表示的胺基酸序列的第2個胺基酸殘基)被取代成其他胺基酸的表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體而言，每個轉化體的卣代醇環氧酶活性比野生型卣代醇環氧酶高。[表l]tableseeoriginaldocumentpage51*JM109/pSTK002和JM109/pSTK003以JM109/pSTK001的菌體比活性為1來分別算出相對值，JM109/pSTT002和JM109/pSTT003以JM109/pSTT001的菌體比活性為1來分別算出相對值。實施例2由隨機變異所得到的改良型卣代醇環氧酶的篩選(1)面代醇環氧酶變異體文庫的製作為了獲得更有用的改良型卣代醇環氧酶，製作通過錯配誘導PCR導入了隨機變異的卣代醇環氧酶基因變異體文庫，進行來自該文庫的改良型卣代醇環氧酶及其基因的篩選。將在實施例1(2)製作的pSTT002用作模板，如下所示，進行由錯誤誘導PCR所得到卣代醇環氧酶基因變異體文庫的製作。製備lOO^il的以下表的組成的PCR反應液。tableseeoriginaldocumentpage51用作引物的Trc-03的序列如下所示。Trc-03:GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC(序列號61:由25個核苷酸構成，與pTrc99A的多克隆位點的下遊區域對應)將製備好的lOO(il的PCR反應液以每管lOpl分注於10個PCR反應用管中，然後，分別將其供於以下的熱循環中。[表d]tableseeoriginaldocumentpage52將進行了熱循環處理的IO管PCR反應液混合，與實施例1(2)同樣地，進行PCR反應液的純化和限制性內切酶消化(由NcoI和PstI進行雙酶切消化)以及來自凝膠的純化、表達載體pTrc99A的限制性內切酶消化(由Nco1和PstI進行雙酶切消化)以及純化、連接反應以及形質轉換。將培養皿上生長的菌落製成卣代醇環氧酶基因變異體文庫。(2)改良型卣代醇環氧酶的篩選(一次評價)使用在實施例2(1)中製作的卣代醇環氧酶基因變異體文庫，按如下方式進行改良型卣代醇環氧酶的篩選(一次評價)。將含有終濃度為lmM的IPTG的LBAmp培養基分注於96孔板(深孔)，每個孔分注500|il,在各孔中接種卣代醇環氧酶基因變異體文庫的菌落。對96孔中的12個孔，接種用作評價對照的JM109/pSTT002菌落。在37。C、800rpm的條件下，培養大約16小時，然後，將得到的培養液中的20|il分注於蓋板式96孔板中。使用離心分離機(佐久間製作所50A-IVD)以及轉子(佐久間製作所HM-2HLS),將蓋板式96孔板供於離心分離(3000rpm,5分鐘，4°C)。除去培養液上清液後，將評價用反應液1(400mMDCP,800mM(R)-CHBN,0.025%溴曱酚紫(BCP),50mMTris-硫酸(pH8))40|il添加於各孔中。懸浮後，在室溫下靜置，隨時間的變化來觀察反應液所呈的顏色變化(伴隨著由卣代醇環氧酶活性所導致的氯化物離子的生成，pH值降低，由此，BCP的顏色從紫色變化為黃色)，選出比作為對照的JM109/pSTT002顯著更早發現變色的抹。對大約20000林的菌落進行該一次評價，選出77抹。(3)改良型卣代醇環氧酶的篩選(二次評價)對於實施2(2)中選出的一次評價選拔抹77才朱，按如下方式進行二次評價。對於一次評價選拔林77抹，與實施例2(2)同樣地，進行利用96孔板(深孔)的培養後，將得到的各培養液樣品((20^1，15(^1,lO)il，5fi1)x2)分注於蓋板式96孔板中。使用離心分離機(佐久間製作所50A-IVD)以及轉子(佐久間製作所HM-2HLS)，將蓋板式96孔板供於離心分離(3000rpm,5分鐘，4°C)。除去培養液上清液後，對於各培養液沉澱(菌體)，即實施例2(2)記載的評價用反應液1和評價用反應液2(400mMDCP，0.025%溴曱酚紫(BCP),50mMTris-硫酸(pH8))40|il添加於各孔中。懸浮後，在室溫下靜置，隨時間的變化來觀察反應液所呈的顏色變化，選擇在添加有評價用反應液1的體系中比作為對照的JM109/pSTT002顯著更早地發現變色的林，以及針對於各林的添加有評價用反應液1體系中的呈色速度和添加有評價用反應液2體系中的呈色速度之差少的林。對於一次評價選拔林77抹進行該二次評價，選出20株。(4)二次評價選拔林的卣代醇環氧酶基因變異的確認對於在實施例2(3)中選出的二次評價選拔林20林，解析各抹所具有的卣代醇環氧酶基因的變異。使用FlexiPrep(GE保健生物科學)從實施例2(3)中得到的各抹培養液回收質粒，使用毛細管DNA測序儀CEQ2000(貝克曼庫爾特)，按照附加的操作手冊，解析各質粒中的卣代醇環氧酶基因的鹼基序列。將其結果示於表2中。tableseeoriginaldocumentpage54(*)任一抹的卣代醇環氧酶都是第2個胺基酸殘基被取代成賴氨酸。另外，胺基酸變異的位置表示Hheb(2nd)(序列號2)中的位置。確認出在進行解析的20抹之中，12抹(#1007,#1009,#1014,#1019，#1023，#1024,#1034,#1037，#1038,#1066,#1068,#1072)表達了具有氨基S吏取代變異F136S的滷代醇環氧酶，2抹(#1002,#1005)表達了具有氨基S吏取代變異T133A的鹵代醇環氧酶，2抹(#1020,#1055)表達了具有胺基酸取代變異V75A的卣代醇環氧酶，1抹(#1018)表達了具有胺基酸取代變異D199H的卣代醇環氧酶，1林(#1029)表達了具有胺基酸取代變異V25I的卣代醇環氧酶，1抹(#1057)表達了具有胺基酸取代變異H57R和87F的卣代醇環氧酶。各轉化體、它們所表達的囟代醇環氧酶以及編碼其的卣代醇環氧酶基因如表2所示命名。(5)改良型卣代醇環氧酶的篩選(三次評價)對於在實施例2(3)中選拔的，在實施例2(4)中確認出其卣代醇環氧酶基因變異的6株(JM109/pSTT002-V25I,JM109/pSTT002-H57R+Y87F，JM109/pSTT002-V75A，JM109/pSTT002隱T133A，JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H)和作為對照的JM109/pSTT002共計7林，按如下方式進行三次評價。在各沃色曼氏試驗管中分注lml的LBAmp培養基，在各試驗管中分別接種二次評價選拔林6林以及JM109/pSTT002的菌落。在37°C、210rpm的條件下，培養約8小時後，將得到的各培養液lOOfil接種於含有終濃度為lmM的IPTG的LBAmp培養基(500ml容積的三角燒瓶中的100ml),在37。C、210rpm的條件下，培養16小時。通過離心分離(3700xg，IO分鐘，4'C)從得到的各培養液100ml中回收各菌體，用20mMTris-硫酸緩衝液(pH8.0)進行洗滌後，懸浮於相同緩衝液中使得菌濃度為12.5gDC/L。使用得到的菌體懸濁液，通過使用在實施例1(3)記載的方法中反應液的DCP濃度為400mM的反應液的方法，以及使用在實施例1(3)記載的方法中反應液的DCP濃度為400mM並且添加(R)-CHBN至終濃度800mM的反應液的方法，分別測定在不存在(R)-CHBN的條件下和存在(R)-CHBN的條件下的卣代醇環氧酶活性(脫氯活性)。將1U定義為相當於在上述個條件下每分鐘由DCP脫離l)imol氯化物離子的酶量，通過用活性測定中使用的各菌體懸浮液的活性，除以該活性測定中所使用的各菌體懸浮液的液量，來算出各菌體懸浮液的液活性。進一步，通過用該液活性除以菌濃度，算出各林的菌體比活性。將其結果示於表3中。[表3]tableseeoriginaldocumentpage56對於JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-V75A、JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H,確認出不存在(R)-CHBN下的菌體比活性高於JM109/pSTT002的菌體比活性。另外，對於JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H，確認出存在(R)-CHBN下的菌體比活性高於JM109/pSTT002的菌體比活性。即，確認出這些轉化體所表達的卣代醇環氧酶是在不存在(R)-CHBN下或存在(R)-CHBN下的帶來每個轉化體的卣代醇環氧酶活性提高的改良型卣代醇環氧酶。實施例3由部位特異性的隨機變異所得到的改良型卣代醇環氧酶的篩選(1)部位特異性的隨機變異體文庫的製作在實施例2(5)中檢測出的改良型卣代醇環氧酶之中，作為為每個轉化體帶來卣代醇環氧酶活性提高效果的胺基酸變異位點，發現了卣代醇環氧酶Hheb(2nd)(序列號2)的第133號的蘇氨酸殘基(T133)、第136號的苯丙氨酸殘基(F136)以及第199號的天冬氨酸殘基(D199)。使這些位點的胺基酸隨機變異，嘗試獲得更有效的改良型卣代醇環氧酶。作為使T133、F136和D199變異成20個必需胺基酸的隨機引物，製作出以下的引物。MDH-14:CGCTGGCCTACAGCNNNGCGCGTTTCGCT(序列號62:由29個核苷酸構成，對卣代醇環氧酶HheB(Ist)(序列號1)的第141號的胺基酸或者HheB(2nd)的第133號(序列號2)的胺基酸進行編v嗎的密碼子為隨機鹼基(NNN;N是腺噤呤、胸腺嘧咬、鳥噤呤或胞嘧咬中的任一種)的正義引物)MDH畫15:AGCGAAACGCGCNNNGCTGTAGGCCAGCG(序列號63:由29個核苷酸構成，具有MDH-14的互補序列的反義引物)MDH-16:CAGCACGGCGCGTNNNGCTCAGCGCGGGT(序列號64:由29個核苷酸構成，對卣代醇環氧酶HheB(Ist')(序列號1)的第144號的胺基酸或者HheB(2nd)(序列號2)的第136號的胺基酸進行編碼的密碼子為隨機鹼基(NNN;N是腺噤呤、胸腺嘧啶、鳥。票呤或胞嘧啶中的任一種)的正義引物)MDH-17:ACCCGCGCTGAGCNNNACGCGCCGTGCTG(序列號65:由29個核苷酸構成，具有MDH-16的互補序列的反義引物)MDH-18:CGACTGCCCGAGAGNNNGCGCTGCTCGCG(序列號66:由29個胺基酸構成，對卣代醇環氧酶HheB(Ist)(序列號1)的第207號的胺基酸或者HheB(2nd)(序列號2)的第199號的胺基酸進行編碼的密碼子為隨機鹼基(NNN;N是腺噪呤、胸腺嘧啶、鳥噤呤或胞嘧啶中的任一種)的正義引物)MDH畫19:CGCGAGCAGCGCNNNCTCTCGGGCAGTCG(序列號67:由29個核苷酸構成，具有MDH-18的互補序列的反義引物)使用上述引物和模板pSTT002，通過QuickChageSite-DirectedMutagenesis試劑盒(STRATAGENE公司)進行部位特異性的變異導入。反應液組成(總量50^1)如下表所述(系列1以獲得T133隨機變異體為目的，系列2以獲得F136隨機變異體為目的，系列3以獲得D199隨機變異體為目的)。[表e]tableseeoriginaldocumentpage58各系列中使用的引物的組合如下所示。系列1:正義引物MDH-14，反義引物MDH-15系列2:正義引物MDH-16,反義引物MDH-17系列3:正義引物MDH-17,反義引物MDH-18對於上述組成的各反應液，進行下表的熱循環。[表qtableseeoriginaldocumentpage58按照附加的操作手冊，在進行了熱循環處理的各反應液中添加的DpnI,在37。C孵育1小時。使用DpnI處理液，與實施例2(1)同樣地進行形質轉換。將出現在培養i上的菌落製成卣代醇環氧酶基因部位特異的(T133，F136,D199)變異體文庫。(2)來自部位特異的隨機變異體的改良型卣代醇環氧酶的篩選由在實施例3(1)中製作的卣代醇環氧酶基因部位特異的(T133,F136,D199)變異體文庫，進行更有用的改良型卣代醇環氧酶的篩選。將含有終濃度為lmM的IPTG的LBAmp培養基分注於96孔板(深孔)，每個孔分注500fil，對於實施例3(1)製作的卣代醇環氧酶基因部位特異的(T133,F136,D199)變異體文庫的各系列，將200個菌落接種於各孔中。與作為評價的對照所使用的JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-D199H以及JM109/pSTT002—並進行接種。在37°C、800rpm的條件下培養約16小時，然後，將得到的培養液中的20pl分注於蓋板式96孔板中。使用離心分離機(佐久間製作所50A-IVD)以及轉子(佐久間製作所HM-2HLS),將蓋板式96孔板供於離心分離(3000rpm,5分鐘，4°C)。除去培養液上清液後，將實施例2(2)記載的評價用反應液1和評價用反應液3(200mM(S)-CHBN,0.025%溴曱酚紫(BCP)，50mMTris-硫酸(pH8))40pl添加於各孔中。懸浮後，在室溫下靜置，隨時間的變化來觀察反應液所呈的顏色變化，選出在添加有評價用反應液1的體系中比作為對照的JM109/pSTT002顯著更早發現變色的株、在添加有評價用反應液3的體系中比作為對照的JM109/pSTT002顯著更早發現變色的株以及各抹的評價用反應液1添加系中的呈色速度和評價用反應液3添加系中的呈色速度的比例與作為對照的JM109/pSTT002的該比例不同的林。對各系列200菌落進行該評價，從系列1'(T133隨機變異體文庫)選出7林，從系列2(F136隨機變異體文庫)選出7株，從系列3(D199隨機變異體文庫)選出194^。(3)部位特異的隨機變異文庫選拔林的卣代醇環氧酶基因變異確認對於來自在實施例3(2)中選拔的系列1(T133隨機變異體文庫)的7抹、來自系列2(F136隨機變異體文庫)的7抹、來自系列3(D199隨機變異體文庫)的19林共計33林，對各林所具有的面代醇環氧酶基因的變異進行59解析。使用FlexiPrep(GE保健生物科學)從在實施例3(2)中得到的各林培養液回收質粒，使用毛細管DNA測序儀CEQ2000(貝克曼庫爾特)，按照附加的操作手冊，對各質粒中的卣代醇環氧酶基因的鹼基序列進行解析。將其結果示於表4中。[表4]系列轉化體胺基酸取代變異(*1)密碼子變異轉化體命名(*2)1T133-l,T133-2,T133-3，T133-4,T133-7T133CACG-TGT扁09/pSTT002-T133CT133畫5T133AACG-GCT~~—----—T133-6T133SACG-TCTJM109/pSTT002-T133S2F136-l，F136-6F136STTC-AGTF136曙3，F136-4，F136國5TTC畫TCAF136-2F136ATTC-GCGJM109/pSTT002-T133AF136-7F136WTTC-GCGJM109/pSTT002-T133W3D199-1，D199曙2，D199-3,D199-4,D199-5D199HGAC-CACD199-7,D199-8，D199-12D199EGAC畫GAGJM109/pSTT002畫D199ED199-11GAC-GAAD199-9D199QGAC-CAA.ivno(〕ps'n'02-卜)199(、)D199-6,D199-10D199YGAC-TATJM109/pSTT002-D199YD199-9-5D199RGAC-CGC腿09/pSTT002-D199RD199-6-2D199TGAC-ACTJM109/pSTT002-D199TD199-4-3GAC-ACCD199-6-4D199SGAC-TCCJM109/pSTT002-D199SD199-13D199LGAC-CTGJM109/pSTT002-D199LD199-14D199MGAC-ATGJM109/pSTT002-D199MD199-15D199IGAC-ATCJM109/pSTT002-D199I*1任一抹的卣代醇環氧酶都是第2號胺基酸殘基都被置換成賴氨酸。另外，表示胺基酸殘基的位置的數字是表示HheB(2nd)(序列號2)的氨基^列中的胺基酸殘基的位置的數字。*2作為胺基酸取代變異體，對於已經在實施例2或者本表中取得的變異體，不重新命名。60考慮到作為胺基酸取代變異的方式與已經取得的酶的重複，將進行了解析的33株所表達的卣代醇環氧酶以及對其進行編碼的卣代醇環氧酶基因如表2所示命名。實施例4由改良型卣代醇環氧酶所進行的(R)-CHBN合成反應(1)改良型卣代醇環氧酶粗酶液的製備為了調查通過在實施例2和實施例3中獲得的改良型卣代醇環氧酶所合成的(R)-CHBN的光學純度，首先，由表達各改良型卣代醇環氧酶的轉化體來製備粗酶液。對於表達改良型卣代醇環氧酶的15林的轉化體抹(JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T136C、JM109/pSTT002畫T133S、JM109/pSTT002國F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199I、JM109/pSTT002-D199Y)以及作為對照的JM109/pSTT002的合計16林，按如下方式進行三次評價。在各沃色曼氏試驗管中分注lml的LBAmp培養基，在各試驗管中分別接種二次評價選拔林15抹以及JM109/pST002的菌落。在37。C、210rpm的條件下，培養約8小時後，將得到的各培養液100^1接種於含有終濃度為lmM的IPTG的LBAmp培養基(500ml容積的三角燒瓶中的100ml)，在37。C、210rpm的條件下，培養16小時。通過離心分離(3700xg,IO分鐘，4。C)從得到的各培養液100ml中回收各菌體，用20mMTris-硫酸緩衝液(pH8.0)進行洗滌後，懸浮於相同緩衝液中使得菌濃度為12.5gDC/L。使用超聲波破碎機VP-15S(taitec，日本)，在輸出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的條件下，對得到的3ml的菌體懸濁液進行冰浴，同時進行10分鐘破碎。將破碎的菌體懸濁液供於離心分離(23000xg，5分鐘，4°C),提取上清液作為粗酶液。對於得到的各粗酶液，通過使用在實施例1(3)記載的方法中反應液的DCP濃度為400mM的反應液的方法，分別測定滷代醇環氧酶活性(脫氯活性)。將1U定義為相當於在上述個條件下每分鐘由DCP脫離ljLimol氯化物離子的酶量，通過用活性測定中使用的各菌體懸浮液的活性，除以該活性測61定中所使用的各菌體懸浮液的液量，來算出各菌體懸浮液的液活性。(2)分析方法在後述的通過改良型滷代醇環氧酶合成(R)-CHBN的合成反應中實施的反應液中的DCP、ECH以及CHBN濃度分析以及生成CHBN的光學純度分析4姿如下方式進4亍。反應液中的DCP、ECH以及CHBN濃度分析通過逆相HPLC來進行。逆相HPLC分析條件示於下表中。[表g]tableseeoriginaldocumentpage62將反應終止液1OOpl利用上表記載的流動相400(il稀釋混合之後，按照上表記載的分析條件進行分析。預先使用濃度已知的DCP、ECH以及CHBN溶液製作標準曲線，使用該標準曲線來求得反應液中的DCP、ECH以及CHBN濃度。生成CHBN的光學純度分析，在將CHBN酯化後，通過正相HPLC進行。將正相HPLC分析條件示於下表。[表h]tableseeoriginaldocumentpage63加入與約400|il的反應終止液等量的二異丙基醚(以下，有時稱作IPE)來進行萃取。取出IPE層，加入少量的無水硫酸鈉進行攪拌。取出100plIPE,添加10pl的(R)-a-曱氧基-a-(三氟曱基)苯基乙醯氯(以下，有時稱作(R)-MTPA)以及40ili1的吡啶。在室溫下反應一夜，然後，添加IPE,製成約400^1。加入400^1的1當量的鹽酸，進行2次萃取，然後，向提耳又的IPE層中加入400|Lil的飽和碳酸氫鈉水溶液，進行2次萃取。向提取的IPE層中加入少量的無水硫酸鈉進行攪拌，然後，通過吸氣器使IPE層揮發。通過上表記載的流動相使殘存物懸浮後，利用上述記載的分析條件進行分析。由(R)-CHBN-(R)-MTPA酯和(S)-CHBN-(S)-MTPA酯的區域面積比算出各濃度，以本說明書中說明的要領(前述)算出CHBN的光學純度。(3)通過改良型卣代醇環氧酶進行(R)-CHBN的合成使用在實施例4(1)中製備的來自各改良型囟代醇環氧酶表達轉化體的粗酶液，在氰化鉀的存在下，進行由DCP合成CHBN的反應。反應液基本組成^(口下表戶斤示,反應才示度(reactionscale)是2ml。tableseeoriginaldocumentpage63反應在2(TC進行3小時。反應結束後，通過實施例4(2)記載的分析條件，對反應液中的DCP、ECH以及CHBN濃度和CHBN的光學純度進行分析。tableseeoriginaldocumentpage64在使用來自表達野生型面代醇環氧酶的轉化體林JM109/pSTT002的粗酶液的反應中，CHBN只積累77mM，與此相對，在使用來自表達改良型滷代醇環氧酶的各轉化體4朱的粗酶液的反應中，積累了87149mM的CHBN。因而，顯示出這些改良型卣代醇環氧酶能夠比野生型囟代醇環氧酶積累高濃度的生成物。另外，使用來自表達野生型卣代醇環氧酶的轉化體株JM109/pSTT002的粗酶液來合成的(R)-(:1忖的光學純度是91.6°/化6,與此相對，使用來自表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體才朱(JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199I以及JM109/pSTT002-D199Y)的粗酶液來合成的(R)-CHBN的光學純度是93.l%ee~97.8%ee,確認出通過這些改良型卣代醇環氧酶合成的(R)-CHBN與通過野生型囟代醇環氧酶合成的(R)-CHBN相比，光學純度高。因而，認為這些改良型滷代醇環氧酶對於DCP和/或中間體ECH的立體選擇性提高。實施例5氯化物離子存在下的改良型卣代醇環氧酶活性的確認氯化物離子是通過囟代醇環氧酶由1,3-二卣代-2-丙醇和氰化物來合成4-卣代-3-羥基丁腈時的生成物，可以阻礙利用囟代醇環氧酶所進行的該合成反應。對在高濃度氯化物離子存在下的野生型卣代醇環氧酶和改良型商代醇環氧酶的卣代醇環氧酶活性進行調查、比較。使用實施例4中製備的來自表達野生型面代醇環氧酶的轉化體4朱JM109/pSTT002的粗酶液和來自表達改良型滷代醇環氧酶的轉化體林JM109/pSTT002-D199H的粗酶液，通過使用在實施例1(3)記載的方法中反應液的DCP濃度為400mM的反應液的方法，以及使用在實施例1(3)記載的方法中反應液的DCP濃度為400mM並且添加氯化鈉至終濃度100mM或200mM的反應液的方法，測定在不存在氯化鈉的條件下(OmM)以及存在氯化鈉的條件下(100mM和200mM)的卣代醇環氧酶活性(脫氯活性)，以來自各轉化體的粗酶液在不存在氯化鈉的條件下(OmM)的該活性為100%，算出相對活性值。將其結果示於表6中。來自粗酶液的轉化體反應液中的氯化鈉濃度[mM]0100200JM109/pSTT002-D199H100%91%78%JM109/pSTT002100%44%德65來自表達野生型囟代醇環氧酶的轉化體林JM109/pSTT002的粗酶液的卣代醇環氧酶活性，在存在1OOmM和200mM的氯化物離子的條件下，分別降低至44%和40%,與此相對，來自表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體抹JM109/pSTT002-D199H的粗酶液的卣代醇環氧酶活性，在存在100mM和200mM的氯化物離子的條件下，分別顯示出91%和78%的殘存活性。因而，確認出該改良型卣代醇環氧酶與野生型卣代醇環氧酶相比，相對於氯化物離子所引起的反應阻礙的耐性得到提高。實施例6表達改良型由代醇環氧酶的轉化體(紅球菌屬細菌宿主)的製作及其評價(1)表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體(紅球菌屬細菌宿主)的製作製作表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體(紅球菌屬細菌宿主)，對該轉化體進行評價。首先，以日本特開2007-49932號記載的表達質粒pJHB057為模板，製作出分別導入有如下變異的改良型卣代醇環氧酶表達質粒，所述變異為卣代醇環氧酶HheB(Ist)(序列號1)的第141號的蘇氨酸殘基變為丙氨酸的取代變異(T141A)，第144號的苯丙氨酸殘基變為絲氨酸的取代變異(F144S)以及第207號的天冬氨酸殘基變為組氨酸的取代變異(D207H)。作為在變異導入中所使用的引物，製作以下引物。MDH-05:CGCTGGCCTACAGCGCGGCGCGTTTCGCT(序列號68:由29個核苷酸構成，對卣代醇環氧酶HheB(Ist)的第141號的胺基酸進行編碼的密碼子為GCG(編碼丙氨酸)的正義引物)MDH-06:AGCGAAACGCGCCGCGCTGTAGGCCAGCG(序列號69:由29個核苦酸構成，具有MDH-05的互補序列的反義引物)MDH-07:CAGCACGGCGCGTTCCGCTCAGCGCGGGT(序列號70:由29個核苷酸構成，對滷代醇環氧酶HheB(Ist)的第144號的胺基酸進行編碼的密碼子為TCC(編碼絲氨酸)的正義引物)MDH-08:ACCCGCGCTGAGCGGAACGCGCCGTGCTG(序歹寸號71:由29個核苷酸構成，具有MDH-07的互補序列的反義引物)MDH-09:CGACTGCCCGAGAGCACGCGCTGCTCGCG(序列號72:由29個核苷酸構成，對滷代醇環氧酶他eB(Ist)的第207號的胺基酸進行編碼的密碼子為CAC(編碼組氨酸)的正義引物)MDH-10:CGCGAGCAGCGCGTGCTCTCGGGCAGTCG(序列號73:由29個核香酸構成，具有MDH-09的互補序列的反義引物)4吏用上述引物和衝莫才反pJHB057，通過QuickChangeSite-DirectedMutagenesis試劑盒(STRATAGEN公司)進行部位特異的變異導入。反應液組成(總量50^1)如下表所示(系列1以獲得T141A變異體為目的，系列2以獲得F144S變異體為目的，系列3以獲得D207H變異體為目的)。tableseeoriginaldocumentpage67各系列中使用的引物的組合如下所示。系列1:正義引物MDH-05,反義引物MDH-06系列2:正義引物MDH-07,反義？1物MDH-08系列3:正義引物MDH-09,反義引物MDH-IO對於上述組成的各反應液，進行下表的熱循環。tableseeoriginaldocumentpage68Jl/pJHB057畫D207H。(2)表達改良型卣代醇環氧酶的轉化體(紅球菌屬細菌宿主)的評價在實施例6中得到的3種轉化體(Jl/pJHB057-T141A、Jl/pJHB057-F144S以及Jl/pJHB057-D207H)的評價按照如下方式進行。將該3抹轉化體以及作為對照的Jl/pJHB057的共計4抹，分別接種於100ml的GGPK培養基(1.5%葡萄糖，1%穀氨酸鈉，0.1%酵母粉，0.05%K2HPO4,0.05%KH2P04,0.05%MgS(V7H2O,卡那黴素50[ig/ml,pH7.2),在30。C振蕩培養72小時。通過離心分離(3700xg,IO分鐘，4°C)從得到的各培養液100ml中回收各菌體，用20mMTris-硫酸緩衝液(pH8.0)進行洗滌後，懸浮於相同緩衝液中使得菌濃度為12.5gDC/L。使用超聲波破碎機VP-15S(taitec,日本)，在輸出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的條件下，對得到的3ml的菌體懸濁液進行冰浴，同時進行10分鐘破碎。將破碎的菌體懸濁液供於離心分離(23000xg,5分鐘，4°C),提取上清液作為粗酶液。對於得到的各粗酶液，通過使用在實施例1(3)記載的方法中反應液的DCP濃度為400mM的反應液的方法，分別測定卣代醇環氧酶活性(脫氯活性)。將1U定義為相當於在上述個條件下每分鐘由DCP脫離l|imol氯化物離子的酶量，通過用活性測定中使用的各菌體懸浮液的活性，除以該活性測定中所使用的各菌體懸浮液的液量，來算出各菌體懸浮液的液活性。進一步，通過用該液活性除以蛋白質濃度，來算出各株的每單位蛋白質的比活性。蛋白質濃度使用Bio-Rad蛋白質分析儀(Bio-Rad)來測定。將其結果示於表7中。tableseeoriginaldocumentpage69分別導入有如下變異的改良型卣代醇環氧酶，是即使在以紅球菌屬細菌為宿主的情況下，也能為每個轉化體帶來卣代醇環氧酶活性提高的改良型卣代醇環氧酶，所述變異為HheB(Ist)(序列號1)的第141號的蘇氨酸殘基變為丙氨酸的取代變異(T141A),第144號的苯丙氨酸殘基變為絲氨酸的取代變異(F144S)以及第207號的天冬氨酸殘基變為組氨酸的取代變異(D207H)。序列表自由文字序列號328:變異肽序列號3156:變異DNA序列號5161:合成DNA序列號62:合成DNA序列號62:n表示a、c、g或t(存在位置1517)序列號63:合成DNA序列號63:n表示a、c、g或t(存在位置13~15)序列號64:合成DNA序列號64:n表示a、c、g或t(存在位置14-16)序列號65:合成DNA序列號65:n表示a、c、g或t(存在位置1416)序列號66:合成DNA序列號66:n表示a、c、g或t(存在位置15~17)序列號67:合成DNA序列號67:n表示a、c、g或t(存在位置13~15)序列號6873:合成DNA序列號74:Xaa表示任意的胺基酸殘基(存在位置213、15、16、19)序列號75:Xaa表示任意的胺基酸殘基(存在位置2、58、10)序列號7683:變異肽序列號8491:變異DNA權利要求1.一種改良型滷代醇環氧酶，其特徵在於，其包含對野生型滷代醇環氧酶的胺基酸序列導入從以下的(A)～(D)中選擇的任一個或多個胺基酸變異而得到的胺基酸序列，所述野生型滷代醇環氧酶的胺基酸序列包含以下的胺基酸序列IS-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15(序列號74)，其中，S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，α1～α15分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基，以及以下的胺基酸序列IIL-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21(序列號75)，其中，L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示穀氨酸殘基，β16-β21分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基，(A)比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(B)α14殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(C)α15殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(D)β21殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異。2.—種改良型卣代醇環氧酶，其特徵在於，其包含對野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列導入從以下的(E)(H)中選擇的任一個或多個胺基酸變異而得到的胺基酸序列，所述野生型卣代醇環氧酶的氨基S吏序列包含以下的胺基酸序列I:S-al陽a2-a3-a4-a5畫a6-a7-a8-a9畫al0-all-al2陽Y-al3-al4-A-R-a15(序歹'J號74),其中，S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，alal5分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基，以及以下的胺基酸序列II:L-卩16-R-L-卩17-卩18-卩19-卩20-E-卩21(序列號75),其中，L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示穀氨酸殘基，pi6-(321分別獨立地表示相同或不同的任意胺基酸殘基，(E)比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基被取代成賴氨酸或天冬醯胺的胺基酸變異；(F)al4殘基被取代成丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的胺基酸變異；(G)al5殘基被取代成丙氨酸、絲氨酸或色氨酸的胺基酸變異；(H)(321殘基被取代成穀氨醯胺、穀氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或曱硫氨酸的胺基酸變異。3.根據權利要求1或2所記載的改良型囟代醇環氧酶，其中，所述野生型卣代醇環氧酶是分類於組B的酶。4.根據權利要求1~3的任一項所記載的改良型卣代醇環氧酶，其中，所述野生型卣代醇環氧酶是來自棒狀桿菌(Corynebacterium)屬細菌或分枝桿菌(Mycobacterium)屬糹田菌的酶。5.才艮據權利要求1~3的任一項所記載的改良型卣代醇環氧酶，其中，所述野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列是序列號1或序列號2所示的胺基酸序列。6.根據權利要求1~5的任一項所記載的改良型離代醇環氧酶，其包含對所述野生型卣代醇環氧酶的胺基酸序列導入從以下的(i)(iii)中選擇的任一個或多個胺基酸變異而得到的胺基酸序列，其中，(i)從除了比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基、a14殘基、a15殘基以及P21殘基以外的胺基酸殘基中選擇的1個或數個胺基酸殘基被取代成其他胺基酸的胺基酸變異；(ii)從除了比起始胺基酸殘基離C末端側近一個殘基的胺基酸殘基、胺基酸序列I所含的胺基酸殘基以及胺基酸序列II所含的胺基酸殘基以外的胺基酸殘基中選擇的1個或數個胺基酸殘基發生缺失的胺基酸變異；(iii)在比起始胺基酸殘基離C末端側近兩個以上殘基的胺基酸殘基構成的區域中的由胺基酸序列I和胺基酸序列II構成的區域以外的區域中，插入l個或數個任意胺基酸殘基的胺基酸變異。7.編碼權利要求16的任一項所記載的改良型卣代醇環氧酶的基因。8.含有權利要求7所記載的基因的重組載體。9.將權利要求8所記載的重組載體導入宿主而得到的轉化體或轉導體。10.培養權利要求9所記載的轉化體或轉導體而得到的培養物。11.從權利要求IO所記載的培養物中提取的改良型囟代醇環氧酶。12.—種改良型卣代醇環氧酶的製造方法，其特徵在於，培養權利要求9所記載的轉化體或轉導體，從得到的培養物中提取改良型卣代醇環氧酶。13.—種表卣代醇的製造方法，其特徵在於，通過使權利要求1~6和11的任一項所記載的改良型囟代醇環氧酶和/或^L利要求10所記載的培養物與1，3-二卣代-2-丙醇接觸，來生成表卣代醇。14.一種4-面代-3-羥基丁腈的製造方法，其特徵在於，在氰化物的存在下，使權利要求1~6和11的任一項所記載的改良型滷代醇環氧酶和/或權利要求10所記載的培養物與1，3-二卣代-2-丙醇或表卣代醇接觸，從而生成4-卣代-3-羥基丁腈。全文摘要本發明提供一種工業上有用的改良型滷代醇環氧酶、其製造方法以及使用該酶製造表滷代醇或4-滷代-3-羥基丁腈的製造方法。本發明的改良型滷代醇環氧酶是包含對野生型滷代醇環氧酶的胺基酸序列導入特定的胺基酸取代變異而得到的胺基酸序列的酶，其中，所述野生型滷代醇環氧酶的胺基酸序列包括規定的胺基酸序列I和胺基酸序列II。文檔編號C12N15/60GK101636497SQ20088000699公開日2010年1月27日申請日期2008年3月7日優先權日2007年3月7日發明者佐藤榮治,湯不二夫,瀧川優彌,渡邊文昭,秋山卓理申請人:三菱麗陽株式會社