Opg融合蛋白組合物和方法

2023-08-13 06:43:26

專利名稱：：Opg融合蛋白組合物和方法
技術領域：
：本發明涉及OPG融合蛋白組合物及其製備方法和應用。
背景技術：
：重組蛋白有效用於治療用途使得增強蛋白質修飾以增強或改善這種蛋白質作為藥物的特性。這樣的修飾可以通過還原或消除蛋白酶解達到增強蛋白質的保護並減少其降解。其它的優點還包括在某些情況下，增加所述治療蛋白的穩定性、循環時間和生物活性。描述蛋白質修飾的綜述文章有Francis，FocusonGrowthFactors34-10(1992年5月)(由Mediscript，London，UK出版)。一種這樣的修飾是應用免疫球蛋白分子的Fc區。抗體包含兩個功能獨立的部分，即稱為「Fab」的可變結構域和稱為「Fc」的恆定結構域，可變結構域結合抗原而恆定結構域連接效應子功能物例如補體或吞噬細胞。免疫球蛋白的Fc片段具有長的血漿半壽期，而Fab卻存在時間短。(Capon等，Nature337，525-531(1989))。採用Fc區已經製備出治療性蛋白製品，以使半壽期延長或摻入以下功能例如免疫球蛋白的Fc蛋白具有的Fc受體結合、A蛋白結合、補體結合和胎盤轉移功能。同上。例如，已經將IgG1抗體的Fc區融合到CD30配體(CD30-L)的N-末端，CD30配體是結合在以下細胞上表達的CD30受體的分子何杰金氏病腫瘤細胞、退行性發育淋巴瘤(anaplasticlymphoma)細胞、T細胞白血病細胞和其它惡性腫瘤細胞類型。參見，美國專利第5,480,981號。已經將IL-10(一種消炎藥和抗排斥劑)融合到鼠Fcγ2a中以增加循環半壽期短的細胞因子的半衰期。(Zheng等，TheJournalofImmunology，154，5590-5600(1995))。也已經評價了應用和人IgG1的Fc蛋白連接的腫瘤壞死因子受體治療敗血症性休克患者的研究。(Fisher等，N.Engl.J.Med.，3341697-1702(1996)；VanZee等，TheJournalofImmunology，156，2221-2230(1996))。也已經將Fc和CD4受體融合以生產治療性蛋白用於治療AIDS。參見，Capon等，Nature337，525-531(1989)。另外，也已經將白細胞介素-2(IL-2)的N末端融合到IgG1或IgG3的Fc片段以克服IL-2短的半壽期及其系統毒性。參見，Harvill等，Immunotechnology，1，95-105(1995)。PCT公開第WO97/23614號描述了osteoprotegerin(OPG)並發現它在體外和體內負調節破骨細胞的形成。在表達OPG多肽的轉基因小鼠中，OPG顯著地增加骨密度，而如果給予卵巢切除的大鼠則OPG減少骨丟失的程度。分析OPG在體外破骨細胞形成中的活性揭示，OPG阻斷來自單核細胞/巨噬細胞前體的破骨細胞的分化。看來OPG在調節破骨細胞形成的程度方面具有特異性。OPG是阻斷骨吸收的有效因子，可以用於預防和治療骨質量的丟失。用包含OPG和Fc結構域的融合蛋白也觀察到抑制破骨細胞形成和阻止骨丟失的體外和體內活性。以各種不同的方法可將OPG多肽與異源蛋白或肽諸如Fc結構域融合，以使產生的OPG融合蛋白可具有作為治療藥物的可變生物特性和潛在的可變功效。例如，可將Fc結構域與OPG多肽的氨基端或羧基端融合，可直接融合或通過連接分子融合，和/或根據其天然形式可修飾的Fc或OPG部分之一或二者。這些不同的OPG融合蛋白構成物可以在表達水平、易於分離和/或純化、生物活性等方面的各不相同。因此，需要研製OPG融合蛋白組合物作為有效治療藥物。這樣的組合物會表現出與生產、分離、純化、生物活性、穩定性和循環時間有關的有利特性。本發明提供這樣的組合物。發明概述本發明提供OPG融合蛋白組合物、這種組合物的製備方法及其應用。更具體地講，本發明涉及包含OPG蛋白、或其變體、片段或衍生物以及Fc蛋白、或其變體、片段或衍生物的OPG融合蛋白。意想不到的是，已經觀察到Fc區與截短的OPG多肽的融合證實在未融合截短的OPG多肽或全長OPG多肽中沒有觀察到的優勢。這種意外的優勢歸因於本發明多肽的較低劑量和/或較低頻率的給藥。因此，如以下更詳細的描述，本發明具有與通過Fc區與OPG蛋白(或其變體、片段或衍生物)融合後的多肽修飾，以及其特異性的修飾、製備和應用方法有關的許多方面。一方面，本發明提供具有選自R1-R2、R2-R1、R1-L-R2和R2-L-R1形式的蛋白，其中R1為Fc蛋白、或其變體或片段，R2為OPG蛋白、或其變體或片段，而L為接頭。本發明還提供本文所述的R1和R2部分的接頭。另一方面，本發明提供OPG融合蛋白，其中將Fc(或其變體、片段或衍生物)通過遺傳工程融合到OPG蛋白(或其變體、片段或衍生物)的羧基端。在本發明的另一方面，也可以將Fc部分通過本領域已知的肽接頭或化學接頭連接到OPG蛋白(或其變體、片段或衍生物)的羧基端。本發明的其它方面不僅包括OPG融合蛋白組合物，而且包括編碼這種蛋白的核酸序列、相關載體和含有這種載體的宿主細胞，兩者均可用於生產本發明的融合蛋白。另一方面，本發明提供製備OPG融合蛋白的方法。採用本領域技術人員可用的重組DNA方法。也提供用於合成和連接OPG融合多肽的化學方法。此外，這些方面包括蛋白生產以及純化的方法。另一方面，本發明提供用於治療骨病、特別是骨質量的丟失的方法。這樣的骨病包括骨質疏鬆症、腫瘤轉移引起的溶解性骨病(lyticbonediseases)、血鈣過多(hypercalcemia)、佩吉特病(Paget’sdesease)、類風溼性關節炎引起的骨丟失等。另一方面，本發明還提供用於以上療法的OPG融合蛋白、其變體、片段及衍生物的相關藥用組合物。附圖的描述圖1(SEQIDNO1)顯示人IgGγ1的鉸合區、CH2區和CH3區的胺基酸序列。圖2(SEQIDNO2)顯示人OPG[1-401]的胺基酸序列。圖3(SEQIDNO3)顯示OPG[22-194]-Fc的胺基酸序列。圖4(SEQIDNO4)顯示OPG[22-201]-Fc的胺基酸序列。圖5(SEQIDNO5)顯示OPG[22-194]-FcΔC的胺基酸序列。圖6(SEQIDNO6)顯示OPG[22-201]-FcΔC的胺基酸序列。圖7(SEQIDNO7)顯示OPG[22-194]-FcG10的胺基酸序列。圖8(SEQIDNO8)顯示[met]FcΔC-OPG[22-194]的胺基酸序列。發明詳述本發明涉及OPG融合蛋白組合物、這種組合物的製備方法及其應用。更具體地講，本發明涉及免疫球蛋白Fc區與OPG多肽的融合物。意想不到的是，已經觀察到Fc區與截短的OPG多肽的融合物具有用未融合截短的OPG多肽或用全長成熟OPG沒有觀察到的優勢。(其中全長成熟OPG具有380個胺基酸，例如圖2(SEQIDNO2)所示的包括殘基22-401)。還觀察到，與Fc區在OPG多肽的氨基端的融合相比，Fc區在OPG多肽的羧基端的融合具有意想不到的優勢。因此，以下更詳細地描述OPG融合蛋白、及其變體、片段和衍生物，以及相關應用和製備的方法。術語「OPG」或「OPG多肽」是指包含圖2(SEQIDNO2)所示胺基酸序列的多肽以及本文所述的相關多肽。相關多肽包括等位基因變體；剪接變體；片段；衍生物；取代型、缺失型和插入型變體；融合多肽；和非人類同系物。OPG多肽可以是本文定義的成熟多肽，以及根據製備方法可能具有或可能不具有氨基端甲硫氨酸殘基。術語「OPG融合蛋白」是指被連接到異源肽或多肽的OPG蛋白或OPG多肽。採用本領域已知的任何合適的方法，諸如經OPG與異源肽或多肽部分的基因融合或化學融合，可以製備本發明的OPG融合蛋白。在本發明的一個實施方案中，所述異源肽或多肽是免疫球蛋白的Fc區、最好是人免疫球蛋白的Fc區。可以將異源肽或蛋白或者連接到OPG多肽的氨基端或者連接到OPG多肽的羧基端。術語「成熟OPG多肽」或「成熟OPG融合多肽」是指缺乏前導序列的多肽或融合多肽，並還可以包括其它修飾諸如蛋白酶解加工的氨基端(具有或不具有前導序列)和/或羧基端、由較大前體剪接的較小多肽、N-聯糖基化和/或O-聯糖基化等。術語「Fc」是指包含抗體的非抗原結合部分的序列的分子或序列，或者為單體形式或者為多聚體形式。Fc的原始免疫球蛋白來源最好是人源的Fc，並可以是來自任何同種型例如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD。分離的Fc分子的一種製備方法包括用木瓜蛋白酶消化抗體以分離所述抗體的抗原和非抗原結合部分。分離的Fc分子的另一種製備方法是，重組DNA表達後，再經純化這樣表達的Fc分子來製備。全長Fc包含以下Ig重鏈區CH1、CH2和CH3，其中CH1區和CH2區通常由柔性鉸合區連接。在一個實施方案中，Fc具有IgG1的胺基酸序列，諸如圖1所示胺基酸序列。術語「Fc蛋白」、「Fc序列」、「Fc分子」、「Fc區」和「Fc部分」和「Fc」具有相同的含義。術語「片段」如果與Fc或OPG多肽或其融合多肽一起使用時，是指包含少於Fc或OPG多肽的全長胺基酸序列的肽或多肽。例如在所述胺基酸序列的氨基端截短、在羧基端截短和/或內部殘基缺失可產生這樣的片段。可變RNA剪接或體內蛋白酶活性也可產生OPG或Fc片段。術語「變體」如果與Fc或OPG多肽或與其融合多肽一起使用時，是指與天然Fc或OPG多肽胺基酸序列相比，包含具有一個或多個胺基酸序列取代、缺失和/或添加的胺基酸序列的多肽。變體可以是天然存在的變體或人工構建的變體。本發明的變體可以從編碼所述變體的相應核酸分子製備，所述核酸分子是具有不同於天然Fc或OPG多肽的相應DNA序列的DNA序列。術語「衍生物」如果與Fc或OPG多肽或與其融合多肽一起使用時，是指其化學修飾的Fc或OPG多肽變體或片段，例如所述修飾為共價連接一個或多個多聚體，包括但不限於水溶性聚合物、N-聯或O-聯碳水化合物、糖、磷酸鹽和/或其它這樣的分子。以所述分子與所述多肽連接的類型或者位置不同於天然Fc或OPG的方法修飾所述衍生物。衍生物還包括缺失天然連接Fc或OPG多肽的一個或多個化學基團。術語「融合」是指經基因或化學方法連接不同的肽或蛋白區段，其中所述肽或蛋白區段的連接末端可以是相互直接連接或可以是由接頭或間隔部分(諸如胺基酸殘基或其它連接基團)分隔開。多肽本發明提供OPG融合多肽及其組合物，更詳細地講，提供包含OPG和Fc部分的融合多肽。在OPG的氨基端可以製備Fc區與OPG多肽的融合物，也就是將Fc區的羧基端融合到OPG的氨基端。這些融合蛋白(和其編碼核酸)本文命名為FcOPG。此外，可能最好將OPG的羧基端融合到Fc區的氨基端。其融合蛋白(和編碼它們的核酸)本文命名為OPGFc。Fc、或其變體、片段或衍生物可以來自一種Ig類。在一個實施方案中，Fc來自IgG類，諸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一個實施方案中，Fc來自IgG1。Fc也可以包含通過所述Ig類中的任何兩個或多個的組合的胺基酸殘基，諸如IgG1和IgG2的殘基；或IgG1、IgG2和IgG3的殘基等。在一個實施方案中，OPG融合蛋白的Fc區具有包含人IgG1的鉸合部、CH2和CH3區的圖1(SEQIDNO1)所示序列。(參見Ellison等，NucleicAcidsRes.10，4071-4079(1982))。除了Fc區的天然變異外，Fc變體、片段和衍生物還可以含有通過以下方法構建的Fc非天然變異，例如在天然或天然存在的Fc中引入殘基或序列的取代、添加、插入或缺失，或通過化學修飾法修飾所述Fc部分等。一般而言，製備Fc變體、片段和衍生物以便主要使OPG的Fc融合物的循環半壽期增加。本發明還提供具有保守胺基酸取代的Fc變體。術語「保守胺基酸取代」是指用非天然殘基取代天然胺基酸殘基以便幾乎沒有或沒有影響該位置胺基酸殘基的極性或電荷。例如，由用任何其它非極性殘基取代多肽中的非極性殘基產生保守取代。用於保守胺基酸取代的通用規則見表I。表I保守胺基酸取代原始殘基典型取代優選取代AlaVal，Leu，IleValArgLys，Gln，AsnLysAsnGln，His，Lys，ArgGlnAspGluGluCysSerSerGlnAsnAsnGluAspAspGlyPro，AlaAlaHisAsn，Gln，Lys，ArgArgIleLeu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸LeuLeu正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，PheIleLysArg，Gln，AsnArgMetLeu，Phe，IleLeuPheLeu，Val，Ile，Ala，TyrLeuProAlaAlaSerThrThrThrSerSerTrpTyr，PheTyrTyrTrp，Phe，Thr，SerPheValIle，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸Leu保守胺基酸取代還包括非天然存在的胺基酸殘基，即通常通過化學肽合成而不是通過生物系統合成摻入。這些包括肽模擬物(Peptidomimetics)及其它相反或反向形式的胺基酸部分。預期對所述胺基酸序列的保守修飾(和對所述編碼核苷酸的相應修飾)產生具有功能和化學特徵類似於未修飾Fc和FcOPG蛋白的Fc分子(和FcOPG融合蛋白)。除了表I所述的取代之外，Fc區(或FcOPG融合蛋白)的任何天然殘基也可以用丙氨酸取代，與以前關於「丙氨酸掃描誘變」(Cunningham等，Science244，1081-1085(1989))的一樣。在方面相當大的修飾可以通過選擇明顯不同於其對保持以下特徵的作用顯著不同的取代來達到明顯改進Fc分子(和FcOPG融合蛋白)的功能和/或化學特徵(a)在所述取代區中的分子主鏈的結構，例如，像摺疊或螺旋構象；(b)在所述靶位點處分子的電荷或疏水性；或(c)大部分的側鏈。根據共同的側鏈特性可以對天然殘基進行分類1)疏水性胺基酸正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水性胺基酸Cys、Ser、Thr；3)酸性胺基酸Asp、Glu；4)鹼性胺基酸Asn、Gln、His、Lys、Arg；5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro；和6)芳族胺基酸Trp、Tyr、Phe。非保守取代基可以包括這些類之一的一個成員變換為另一類中的一個成員。可以將這樣的取代殘基引入與非人Fc或OPG同源的Fc或OPG分子的各區中或引入所述分子的非同源區中。可以缺失或用其它胺基酸取代Fc分子中的半胱氨酸殘基以防止形成二硫化交聯。特別是，可以用一種或多種胺基酸諸如丙氨酸或絲氨酸取代圖1(SEQ.ID.NO.1)的位置5上的半胱氨酸殘基。或者，可以缺失位置5上的半胱氨酸殘基。可以通過如圖1(SEQ.ID.NO.1)所示的位置1、2、3、4和5的任何位置上的一個或多個胺基酸的缺失來製備Fc片段。在一個實施方案中，缺失包括位置1-5上的胺基酸殘基。也可以進行這些位置上的取代，並且它們在本發明的範圍內。也可以製備Fc變體，所述Fc變體與Fc受體的結合性降低，而所述結合觸發效應子功能諸如依賴抗體的細胞毒性(ADCC)和補體活化。這樣的變體可以包括缺失或用穀氨醯胺殘基取代位置20的亮氨酸，缺失或用丙氨酸殘基取代位置103的穀氨酸，以及缺失或用丙氨酸殘基取代位置105和107的賴氨酸(按照圖1所示的編號)。設計一個或多個這樣的取代。在一個實施方案中，與天然Fc比較，Fc變體更強地結合FcRn受體(「補救受體」)和循環半壽期更長。這種變體的實例包括圖1(SEQ.ID.NO.1)所示殘基33、35-42、59、72、75、77、95-98、101、172-174、215和220-223的一個或多個中的胺基酸取代，其中所述取代使Fc變體更緊密結合到所述FcRn受體。其它Fc變體包括用例如苯丙氨酸殘基取代一個或多個酪氨酸殘基。另外，也設想其它變體的胺基酸插入、缺失和/或取代，並且它們在本發明的範圍內。實例包括公開於WO96/32478和WO97/34630(其通過引用結合到本文中)的Fc變體。此外，改變可以是改變胺基酸的形式，例如肽模擬物(peptidomimetics)或D-胺基酸。也可以通過或者化學或者改變長度的胺基酸的「接頭」部分，將Fc蛋白連接到OPG蛋白上。這樣的化學接頭是本領域眾所周知。胺基酸接頭序列可以包括但不限於(a)ala-ala-ala；(b)ala-ala-ala-ala；(c)ala-ala-ala-ala-ala；(d)gly-gly；(e)gly-gly-gly；(f)gly-gly-gly-gly-gly；(g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly-gly-pro-gly-gly；(j)val；(k)ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(l)gly-gly-ser-gly-ser-gly-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-ser-gly-gly；(m)化學部分；和(n)組成部分(subparts)(a)-(m)的任何組合本發明還提供OPG變體、片段和衍生物，一般與本文上面關於Fc分子的所述相同，不同的是修飾胺基酸殘基的具體部位。OPG變體、片段和衍生物描述於PCTWO97/23614，其通過引用結合到本文中。在一個優選實施方案中，OPG融合蛋白的OPG部分是羧基端截短形式的OPG。羧基端截短形式的OPG缺失圖2位置186-401中的一個或多個胺基酸。例如，OPG截短物包含所述胺基酸序列22-X，其中X為包括185-400的任何殘基。在另一個實施方案中，OPG截短物包含所述胺基酸序列22-X，其中X為包括185-278、或包括185-293、或者包括194-278、或包括194-293的任何殘基。包含本文所述的OPG截短的多肽的融合蛋白包括直接地或通過間隔或接頭分子連接所述OPG和異源肽或多肽部分，其中所述間隔物或接頭任選地包含一個或多個胺基酸殘基。本發明也包括本文所述的OPG截短形式的變體和衍生物。本發明優選的融合蛋白包括其中融合到Fc區的OPG部分包含所述胺基酸序列22-X的那些融合蛋白，其中採用圖2(SEQIDNO2)所示編號，X為包括位置194-201的任何殘基。這樣的融合蛋白實例包括下列多肽OPG[22-194]-Fc(圖3和SEQIDNO3)OPG[22-201]-Fc(圖4和SEQIDNO4)OPG[22-194]-FcΔC(圖5和SEQIDNO5)OPG[22-201]-FcΔC(圖6和SEQIDNO6)OPG[22-194]-FcG10(圖7和SEQIDNO7)metFcΔC-OPG[22-194](圖8和SEQIDNO8)關於以上列舉的優選多肽，術語「Fc」是指圖1(SEQIDNO1)所示的人IgG1序列，術語「FcΔC」是指圖1(SEQIDNO1)所示的缺乏包括胺基酸殘基1-5的序列，而術語「FcG10」是指缺乏包括胺基酸殘基1-9而具有一個ser-(gly)8接頭的Fc部分。核酸分子本發明提供編碼OPG融合蛋白、或其變體、片段或衍生物的核酸分子。採用定點誘變、PCR擴增或其它合適的方法，可以產生本發明的核酸分子，其中所述引物具有所需的突變。關於誘變技術的描述，參見Sambrook等(MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringsHarborLaboratoryPress，ColdSpringsHarbor，N.Y.(1989))和Ausubel等(CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyandSons，N.Y.(1994))。採用Engels等(Angew.Chem.Intl.Ed.28，716-734(1989))描述的方法的化學合成法也可以用來製備這樣的變體。也可以採用本領域技術人員已知的其它方法。在某些實施方案中，核酸變體含有用於在給定的宿主細胞中最適表達OPG融合多肽而改變的密碼子。具體的密碼子改變取決於OPG融合多肽和選定用於表達的宿主細胞。可以通過各種方法實現這種「密碼子最優化」，例如，通過選擇在給定的宿主細胞中高度表達基因的最佳密碼子。可使用結合用於最適高度表達細菌基因的密碼子的密碼子頻率表(例如「Ecohigh.Cod」)的計算機算法，該算法由Wisconsin大學PackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup，Madison，WI提供。其它有用的密碼子頻率表包括「Celegans_high.cod」、「Celegans_loW.cod」、「Drosophila_high.cod」、「Human_high.cod」、「Maize_high.cod」和「Yeast_high.cod」。在一個實施方案中，可以對所述融合多肽的OPG部分或者Fc部分進行密碼子優化。在另一個實施方案中，核酸分子編碼具有本文上述定義保守胺基酸取代的OPG融合蛋白變體。例如，在融合蛋白的OPG部分中和/或Fc部分中產生保守胺基酸取代。本發明也提供包含添加和/或缺失一個或多個N-聯或O-聯糖基化位點、或包含上述的Fc或OPG多肽片段的Fc或OPG變體。不用說，本發明的核酸分子可以編碼Fc和/或OPG變體、片段的任何組合和本文所述的融合多肽。載體和宿主細胞採用標準連接技術，將編碼OPG融合蛋白的核酸分子插入到合適表達載體中。通常所選的載體是在所用的特定宿主細胞中有功能的(即所述載體適合於所述宿主細胞器以便可擴增和/或表達所述基因的)。編碼Fc-OPG蛋白的核酸分子可以在原核、酵母、昆蟲(杆狀病毒系統)和/或真核宿主細胞中擴增/表達。宿主細胞的選擇將部分取決於OPG融合蛋白是否翻譯後修飾(例如糖基化和/或磷酸化)。如果這樣的話，優選酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。通常，在任何宿主細胞中所用的表達載體將含有用於質粒保持及克隆和表達外源核苷酸序列的序列。在某些實施方案中統稱為「側翼序列」的這種序列通常包括一個或多個以下核苷酸序列一個啟動子、一個或多個增強子序列、一個複製起點、一個轉錄終止序列、一個含有供體和受體剪接位點的完全內含子序列、一個用於分泌的前導序列、一個核糖體結合位點、一個聚腺苷酸化序列、一個用於插入編碼需要表達的多肽的核酸的多接頭區和一個選擇標記元件。側翼序列可以是同源的(即來自與所述宿主細胞相同的物種和/或菌株)、異源的(即來自物種不是所述宿主細胞的物種或菌株)、雜種(即一種以上來源的側翼序列的組合)、合成的或天然序列，所述側翼序列通常的作用是調節OPG和/或Fc蛋白的表達。因此，側翼序列的來源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎動物或無脊椎動物生物、或任何植物，前提是所述側翼序列在所述宿主細胞器中有功能並能被所述宿主細胞器活化。前導序列或信號序列可以用來控制OPG融合多肽泌出宿主細胞。該信號序列最常見直接位於OPG融合多肽編碼區的5』端。已經鑑定出許多信號序列，其中在選定宿主細胞中有功能的任一種可與編碼OPG融合蛋白的核酸序列一起使用。例如，信號序列可以是與OPG或Fc基因或cDNA同源(天然存在)或異源。另外，可以採用以上所述方法化學合成信號序列。在大多數情況下，所述宿主細胞通過存在的信號肽分泌OPG融合多肽、更具體為OPG和Fc部分的融合物將導致將所述信號肽多從所述融合多肽中去除。信號序列可以是載體的一個組分，或它可以是插入到所述載體中的編碼OPG融合多肽的核酸序列的一部分。例如，天然OPGDNA編碼所述蛋白氨基端的一個信號序列，所述信號序列在翻譯後加工所述分子期間被剪切形成成熟蛋白。本發明範圍包括具有天然信號序列的OPG核苷酸以及其中缺失或用異源信號序列取代所述天然信號序列的OPG核苷酸。選定的異源信號序列應是被所述宿主細胞識別和加工(即被號肽酶剪切)的序列。本發明部分提供為描述於WO97/23614的OPG信號序列的信號序列。關於不識別和加工天然OPG信號序列的原核宿主細胞，用選自例如鹼性磷酸酶、青黴素酶或熱穩定腸毒素II前導序列的原核信號序列取代所述信號序列。關於酵母分泌，可用酵母轉化酶、α-因子或酸性磷酸酶前導序列取代天然OPG信號序列。在哺乳動物細胞表達，儘管其它哺乳動物信號序列可能是適合的，但是所述天然信號序列是最好的。用於實施本發明的優選載體是適合於細菌、昆蟲和哺乳動物宿主細胞的那些載體。這樣的載體尤其包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(InvitrogenCompany，SanDiego，CA)、pBSII(StratageneCompany，LaJolla，CA)、pET15b(Novagen，Madison，WI)、pGEX(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，PaloAlto，CA)、pETL(BlueBacII；Invitrogen)、pDSRα2(PCT公開號WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco/BRL，GrandIslald，NY)。其它可能的載體包括但不限於粘粒、質粒或修飾的病毒，但是所述載體系統必須適合於所選定的宿主細胞。這樣的載體包括但不限於質粒諸如Bluescript質粒衍生物(基於ColEl的高拷貝數噬菌粒，StratageneCloningSystemsInc.，LaJollaCA)、設計用於克隆Taq擴增的PCR產物的PCR克隆質粒(例如，TOPOTMTA克隆試劑盒(CloningKit)，PCR2.1質粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)、以及哺乳動物、酵母或病毒載體諸如杆狀病毒表達系統(pBacPAK質粒衍生物，Clontech，PaloAlto，CA)。通過轉化、轉染、感染、電穿孔或其它已知技術，可以將重組分子引入宿主細胞。在構建所述載體並將編碼OPG多肽的核酸分子插入到所述載體合適的位點後，可以將所述完全載體插入到合適宿主細胞用於擴增和/或多肽表達。宿主細胞可以是原核宿主細胞(例如大腸桿菌)或真核宿主細胞(例如酵母細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞)。當在合適條件下培養時，所述宿主細胞合成OPG多肽，然後可從所述培養基中收集(如果所述宿主細胞將其分泌到培養基中時)或直接從產生它的宿主細胞中收集(如果不分泌時)所述OPG多肽。合適宿主細胞的選擇將取決於各種因素，例如所需的表達水平、活性需要或必需的多肽修飾諸如糖基化或磷酸化、以及易於摺疊成生物活性分子。合適的宿主細胞或細胞系可以是哺乳動物細胞例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)(ATCC#CCL61和Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77，4216-4220(1980))、人胚腎(HEK)293或293T細胞(ATCC#CRL1573)或3T3細胞(ATCC#CRL1658)。合適的哺乳動物宿主細胞的選擇及用於轉化、培養、擴增、篩選和產物生產及純化的方法是本領域已知的。其它合適的哺乳動物細胞系是猴COS-1和COS-7細胞系(ATCC#CRL1651)、和CV-1細胞系(ATCC#CCL70)。典型的哺乳動物宿主細胞還包括靈長類細胞系和嚙齒類動物細胞系，包括轉化的細胞系。正常二倍體細胞、得自原代組織體外培養的細胞株以及原代外植塊也適用。候選細胞可以是所述選擇基因遺傳缺陷型的或可以含有一個顯性作用選擇基因。其它合適的哺乳動物細胞系包括但不限於小鼠成神經細胞瘤N2A細胞、HeLa、小鼠L-929細胞、得自Swiss的3T3系、Balb-c或NIH小鼠、BHK或HaK倉鼠細胞系。這些細胞系中每一種都是本領域技術人員已知並可使用的。同樣適合本發明的有用宿主細胞是細菌細胞。例如，大腸桿菌的各種菌株(例如，HB101、DH5α、DH10和MC1061)是生物
技術領域：
熟知的宿主細胞。枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)、其它芽孢桿菌(Bacilluspp.)、鏈黴菌(Streptomycesspp.)等也可以用於本方法。本領域技術人員已知的酵母細胞的許多菌株也可用作表達本發明多肽的宿主細胞。優選的酵母細胞包括例如釀酒酵母(Saccharomycescerivisae)。此外，如果需要，昆蟲細胞系統可以用於本發明的方法中。這樣的系統例如描述於Kitts等(Biotechniques，14，810-817(1993))、Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.，4，564-572(1993))和Lucklow等(J.Virol.，67，4566-4579(1993))。優選的昆蟲細胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，CA)。根據眾所周知的方法，包括諸如氯化鈣、電穿孔、微注射、脂轉染或DEAE-葡聚糖方法的方法，可以實現將用於OPG融合多肽的表達載體轉化或轉染到選定的宿主細胞中。所選定的方法部分隨將使用的宿主細胞類型而變。這些方法和其它合適的方法是本領域技術人員熟知的，並陳述於例如Sambrook等，參見上文。多肽生產可以採用本領域技術人員熟知的標準培養基，培養包含經轉化或轉染OPG表達載體的宿主細胞。所述培養基通常含有所述細胞生長和存活的所有必需營養素。用於培養大腸桿菌的合適培養基是例如Luria液體培養基(LB)和/或Terrific液體培養基(TB)。用於培養真核細胞的合適培養基是RPMI1640、MEM、DMEM，根據培養的特定細胞系的需要，所有這些培養基都可補充血清和/或生長因子。用於昆蟲培養的合適培養基是補充必需yeastolate、乳白蛋白水解物和/或胎牛血清的Grace培養基(GibcoLifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。作為所述培養基的補充物，通常加入可用來選擇性轉染或轉化細胞生長的抗生素或其它化合物。所使用的化合物取決於存在於用其轉化宿主細胞的質粒中的選擇標記元件。例如，當選擇標記元件是卡那黴素抗性時，則加入到培養基中的化合物是卡那黴素；當選擇標記元件是氨苄青黴素抗性時，則加入到培養基中的化合物是氨苄青黴素。採用本領域已知的標準方法，可以評價宿主細胞所產生的OPG融合多肽的量。這樣的方法包括但不限於蛋白質印跡分析、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、非變性凝膠電泳、HPLC分離、免疫沉澱法和/或活性分析諸如DNA結合凝膠移位試驗。當製備OPG融合多肽而無連接標記(atagattached)及得不到抗體時，可以採用其它眾所周知的純化方法。這樣的方法包括但不限於離子交換層析、分子篩層析、HPLC、聯合凝膠洗脫的非變性凝膠電泳和製備型等電聚焦(「Isoprime」machine/technique，HoeferScientific)。在某些情況下，可以聯合這些技術中的二種或多種以達到提高純度。如果OPG融合多肽產生在細胞內，則可以採用本領域技術人員已知的任何標準技術，從所述宿主細胞提取所述細胞內物質(對於革蘭氏陰性細菌而言包括內含體)。例如，可以通過弗氏壓碎器(Frenchpress)、勻漿和/或超聲處理，然後通過離心，使所述宿主細胞裂解以釋放周質/胞質內容物。如果OPG融合多肽在所述細胞溶膠中形成內含體，則所述內含體通常可結合到內和/或外細胞膜，因此主要存在於離心後的沉澱物。然後將所述沉澱物於極端pH或用以下條件處理釋放、裂解和溶解所述內含體在還原劑諸如鹼性pH的二硫蘇糖醇或酸性pH的三羧乙基膦(triscarboxyethylphosphine)存在下的離液劑諸如洗滌劑、胍、胍衍生物、尿素或尿素衍生物。然後可以採用凝膠電泳或免疫沉澱法等，分析在其現在可溶形式OPG多肽。如果需要分離OPG融合多肽，則可以採用諸如下文所述和Marston等(Meth.Enz.，182，264-275(1990))所述的標準方法實施分離。在某些情況下，OPG融合多肽分離後沒有生物活性。用於「重摺疊」或使所述多肽形成其四級結構並產生二硫鍵的各種方法，可以用來恢復生物活性。這樣的方法包括將所述溶解的多肽暴露於pH通常7以上並在特定濃度的離液劑存在下。離液劑的選擇非常類似於內含體溶解所用的選擇方法，但通常使用較低濃度的離液劑，並且所用離液劑不一定與用來溶解的離液劑一樣。在大多數情況下，所述重摺疊/氧化溶液也含還原劑或還原劑加特定比率的其氧化形式，以產生特定氧化還原電位，使二硫化物改變(shufflind)形成所述蛋白的半胱氨酸橋。某些常用氧化還原偶包括半胱氨酸/胱胺、穀胱甘肽(GSH)/二硫代雙(dithiobis)GSH、氯化銅、二硫蘇糖醇(DTT)/二噻烷DTT和2-巰基乙醇(bME)/二硫代-b(ME)。在許多情況下，助溶劑可以用來或可能需要來增強重摺疊的效力，用於該目的的較常見試劑包括甘油、各種分子量的聚乙二醇、精氨酸等。衍生物通過連接一個或多個化學部分衍生本發明OPG融合蛋白及其變體和片段。例如，可用OPG部分或者Fc部分或者兩者製備OPG和Fc多肽的融合物。還可以將這些化學修飾的衍生物配製用於下文討論的動脈內、腹膜內、肌內、皮下、靜脈內、口、鼻、肺、局部或其它給藥途徑。已經發現生物活性蛋白的化學修飾在某些情況下還提供更多的優點，諸如增加所述治療蛋白的穩定性和循環時間以及減少免疫原性。參見，美國專利第4,179,337號。關於綜述，參見，Abuchowski等，載於EnzymesasDrugs。(J.S.Holcerberg和J.Roberts編著，第367-383頁，(1981))；Francis等，參見上文。適合於這種衍生化作用的化學部分可以選自各種水溶性聚合物。根據諸如所述聚合物/蛋白質綴合物是否作治療用途的這種考慮，如果是這樣的話，則考慮所需劑量、循環時間、對蛋白酶解的抗性及其它考慮，本領域技術人員能夠選擇所需聚合物。關於本發明蛋白，可通過以下方法確定所述衍生化作用的有效性以所需形式(即例如通過滲透泵或更優選通過注射或輸注或進一步配製用於例如口、肺或鼻傳遞)給予所述衍生物，觀察本文所述的生物效應。水溶性聚合物可以選自例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環、聚-1，3，6-三氧雜環己烷、乙烯/馬來酐共聚物、聚胺基酸(或者均聚物或者無規共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性，所以在製備方面可能有許多優點。此外，也可使用琥珀酸和苯乙烯。另外，聚胺基酸可以選自血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或其它聚胺基酸例如賴氨酸。聚合物可以是任何分子量的聚合物並可以是直鏈或支鏈聚合物。關於聚乙二醇，為了便於加工和生產，優選分子量為約2kDa-約100kDa(術語「約」是指在聚乙二醇製品中有些分子的分子量比所述分子量高，而有些則較小)。連接到OPG融合多肽的聚合物分子的數目可以變化，本領域技術人員能夠確定其對功能的影響。人們可用相同或不同化學部分(例如諸如不同分子量的聚乙二醇的聚合物)進行單衍化，或可以提供二、三、四衍化作用或某種組合。聚合物分子與蛋白(或肽)分子的比例隨其在反應混合物中的濃度而變化。一般而言，根據諸如所需衍化程度(一、二、三等)、所選定的聚合物的分子量、所述聚合物是直鏈還是支鏈以及反應條件等因素，確定最適比率(以沒有過量的未反應蛋白或聚合物的反應效率表示)。考慮到對所述蛋白的功能域或抗原結構域的影響，所述化學部分應連接到OPG融合蛋白。有許多本領域技術人員可用的連接方法。(EP0401384，其通過引用結合到本文中，(PEG偶聯到G-CSF)；Malik等，Exp.Hematol.20，1028-1035(1992)(報導採用tresylchloride使GM-CSFpegylation))。例如，通過具有游離氨基(例如賴氨酸、精氨酸或N端殘基)或游離羧基(例如穀氨酸、天冬氨酸或C端殘基)的胺基酸殘基，可以使聚乙二醇共價結合。也可以使用具有游離巰基的胺基酸殘基(例如半胱氨基)。用於治療目的優選連接為氨基連接例如在N端或賴氨基殘基連接。如果需要結合受體，則應避免在受體結合的重要殘基上的連接。人們可能特別需要N端化學修飾的OPG融合蛋白。採用聚乙二醇作為所述化學部分的實例，通過在游離氨基衍化所述多肽，從PEG化(pegylated)蛋白分子群體中分離N端PEG化物質，可以獲得基本上N端PEG化的OPG融合多肽製品。或者，通過利用可用於衍化特定蛋白不同類型伯氨基(賴氨酸與N端)的不同活性的還原性烷基化，可以實現選擇性N端化學修飾。在合適的反應條件下，實現以含羰基的聚合物基本上在N端選擇性衍化所述蛋白。可以使用含有單一活性醛的聚乙二醇丙醛。為了便於治療藥物的生產，優選N端單PEG化衍生物。N端PEG化確保製品均一，因為相對於二、三或其它多PEG化產物而言，所述製品的表徵鑑定簡單。為了便於工業生產，優選應用還原烷基化製備N端製品。所述多肽的用途本發明的融合多肽用於預防和/或治療骨量丟失(lossofbonemass)。包括以下的各種病症表現為骨丟失(boneloss)骨質疏鬆症，諸如原發性骨質疏鬆症、內分泌性骨質疏鬆症(甲狀腺功能亢進、甲狀旁腺功能亢進、庫欣症候群(Cushing’ssyndrome)和肢端肥大症)、遺傳和先天性骨質疏鬆症(成骨不全、高胱氨酸尿、門克士症候群(Menkes’syndrome)和賴利-戴症候群(Piley-Daysyndrome))和由於肢體固定引起的骨質疏鬆症；成年和青少年的佩吉特骨病(Paget’sdiseaseofbone)(變形性骨炎)；導致骨丟失的骨髓炎或感染性骨病變；由實體瘤(胸、肺和腎)和血癌(多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病)引起的血鈣過多、特發性血鈣過多和與甲狀腺功能亢進、甲狀旁腺功能亢進、肉樣瘤和腎功能障礙相關的血鈣過多；手術後、服用類固醇藥物引起的、與小腸和大腸疾病以及慢性肝臟疾病和慢性腎臟疾病相關的骨質減少；與外傷性損傷相關的骨壞死或骨細胞死亡或與戈謝病(Gaucher’sdisease)、鐮狀細胞性貧血、系統性紅斑狼瘡和其它疾病相關的非創傷性壞死；由於類風溼性關節炎引起的骨丟失；牙周骨丟失；溶骨性轉移；溶骨性關節炎和假肢鬆動。在本發明的一個實施方案中，由於活性和循環半壽期增加，OPG融合多肽有助於用來治療骨丟失，特別是由於惡性腫瘤或轉移瘤引起的骨的溶骨性破壞產生的骨丟失。本發明的OPG融合多肽可用來治療與乳腺、前列腺、甲狀腺、腎、肺、食管、直腸、膀胱、宮頸、卵巢和肝癌以及胃腸道癌相關的骨丟失。也包括與某些血液性腫瘤諸如多發性骨髓瘤和淋巴瘤諸如霍奇金病(Hodgkin’sDisease)相關的骨丟失。藥用組合物本發明也提供OPG融合蛋白及其變體、片段和衍生物的藥用組合物。這樣的藥用組合物可注射給予、或口、肺、鼻、經皮或其它形式的給藥。一般而言，本發明包括的藥用組合物包含有效量的本發明OPG融合蛋白以及藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔助劑和/或載體。OPG融合蛋白的有效量或治療有效量是根據以下所述的分析和方法的測定，足以減少骨丟失的量或速率的量。本發明的藥用組合物包括各種緩衝內含物(例如Tris-HCl、乙酸、磷酸)、pH和離子強度的稀釋劑；添加劑諸如洗滌劑和增溶劑(例如吐溫80、Polysorbate80)；抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如硫柳汞(Thimersol)、苄醇)和填充劑(例如乳糖、甘露糖醇)；將所述物質摻入到多聚化合物諸如聚乳酸、聚乙醇酸等的顆粒製劑中或摻入到脂質體中。也可以使用Hylauronicacid，它可能具有提高循環持續時間的作用。這樣的組合物可以影響本發明蛋白和衍生物的物理狀態、穩定性、體內釋放率和體內清除率。參見，例如，Remingtoh’sPharmaceuticalSciences，18thEd.，MackPublishingCo.，Easton，PA(1990)，第1435-1712頁，其通過引用結合到本文中。可以以液體形式製備或可以以乾粉形式例如凍幹形式製備所述組合物。也可以設想可植入的緩釋製劑，同樣可設計經皮製劑。設計用於本發明用途的口服固體劑型，Remington’sPharmaceuticalSciences，18thEd.，1990(MackPublishingCo.Easton，PA18042)，第89章(其通過引用結合到本文中)全面描述了固體劑型。固體劑型包括片劑、膠囊、丸劑、錠劑、扁囊劑或小丸劑。此外，脂質體或類蛋白質(proteinoid)包膠囊可以用來配製本發明組合物(例如，美國專利第4,925,673號報導的類蛋白質微球體)。可以使用脂質體包膠囊並可用各種聚合物衍生所述脂質體(例如，美國專利第5,013,556號)。Marshall，K.描述了可能的固體劑型，載於由G.S.Banker和C.T.Rhodes編著的ModernPharmaceutics中的第10章，1979，其通過引用結合到本文中。一般而言，所述製劑包含所述OPG融合蛋白、或其變體、片段或衍生物和用於保護以抗胃酸環境的而在腸中釋放所述生物活性物質的惰性成分。可以任選地化學修飾OPG融合蛋白以有效便口服傳遞所述衍生物。一般而言，所設計的化學修飾是連接至少一個部分到所述蛋白(或肽)分子本身，其中所述部分允許(a)抑制蛋白酶解；和(b)從胃和腸吸收進血流中。所需的也是增加所述蛋白的總體穩定性並增加機體內的循環時間。這種部分的實例包括聚乙二醇、乙二醇和丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，可溶性聚合物-酶加成化合物(SolublePolymer-EnzymeAdducts)。載於「EnzymesasDrugs」，Hocenberg和Roberts編著，Wiley-Interscience，NewYork，NY，(1981)，第367-383頁；Newmark等，J.Appl.Biochem.4185-189(1982)。可能應用的其它聚合物是聚-1，3-二氧戊環和聚-1，3，6-三氧雜環己烷。如上所述，藥物用途優選聚乙二醇部分。為了保證在口服給藥後不在胃中的被降解，至少pH5.0不透水性包衣是必需的。用作口服製劑的腸溶衣的更常用惰性成分的實例有乙酸苯三酸纖維素(CAT)、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚乙酸鄰苯二甲酸乙烯酯(PVAP)、EudragitL30D、Aquateric、乙酸鄰苯二甲酸纖維素(CAP)、EudragitL、EudragitS和Shellac。這些包衣可用作混合膜(mixedfilms)。在製劑中包含的OPG融合蛋白可以為粒子大小約1mm的顆粒或小丸的形式的精細多顆粒(finemultiparticulates)。膠囊給藥的所述物質的製劑也可以為粉、略微壓制的填料(lightlycompressedplugs)或甚至為片劑。本發明的藥用組合物包括稀釋劑諸如碳水化合物，特別是甘露醇、α-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、修飾的葡聚糖和澱粉。某些無機鹽也可以用作填充劑，包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。某些商業上可得到的稀釋劑有Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。在固體劑量製劑中可以包括崩解劑。用作崩解劑的物質包括但不限於澱粉，包括基於澱粉的市售崩解劑Explotab。羥基乙酸澱粉鈉、Amberlite、羧甲基纖維素鈉、超支鏈澱粉(ultramylopectin)、藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和皂土所有都可以用。另一種形式的崩解劑是不溶性陽離子交換樹脂。粉狀樹膠可以用作崩解劑和粘合劑，並且這些可以包括粉狀樹膠諸如瓊脂、梧桐膠或西黃蓍膠。藻酸及其鈉鹽也可用作崩解劑。粘合劑可以用於硬片劑(hardtablets)，包括天然產物物質諸如金合歡膠、西黃蓍膠、澱粉和明膠的。其它粘合劑包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)兩者都可以用於乙醇溶液中以使所述治療藥物成粒。可以加入到所述製劑的潤滑劑包括但不限於包括其鎂和鈣鹽的硬脂酸、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。也可使用可溶性潤滑劑諸如十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鎂、各種分子量的聚乙二醇、Carbowax4000和6000。可以加入增進藥物配製期間的流動特性並有助於壓片重排的助流劑。助流劑可以包括澱粉、滑石粉、熱解矽膠和水合鋁酸矽。為了有助於OPG融合蛋白組合物的溶解，可以加入作為潤溼劑的表面活性劑。表面活性劑可以包括陰離子洗滌劑諸如十二烷基硫酸鈉、琥珀酸二辛酯磺酸鈉和二辛基硫酸鈉。可使用陽離子洗滌劑，包括苯扎氯銨或苄索氯銨。潛在的可用作表面活性劑的非離子型洗滌劑包括lauromacrogol400、聚氧化乙烯40硬脂酸、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、甘油單硬脂酸酯、吐溫40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨或者作為不同比率的混合物存在於所述蛋白或衍生物的製劑中。潛在增強多肽吸收的添加劑例如為脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸。控釋製劑可能最好。可以將OPG融合蛋白摻入到通過擴散或者瀝濾機制釋放的惰性基質例如樹膠。也可以將緩慢變性基質摻入到所述製劑中，例如藻酸鹽、多糖。控釋該治療劑的另一種形式是採用基於Oros治療系統(AlzaCorp.)的方法，即將所述藥物封入一個半透膜中，所述半透膜由於滲透效應允許水通過單一小孔進入而使藥物滲出。某些腸溶衣也具有延遲釋放作用。所述製劑可以使用其它包衣。例如，膜包衣片劑可以包含兩種不同類型的材料。第一種類型包括非腸溶性材料諸如甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥基乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、providone和聚乙二醇。第二種類型包含通常為鄰苯二甲酸的酯的腸溶性材料。可以使用多種材料的混合物以提供最適膜包衣。可以在包衣鍋(pancoater)或在流化床中或通過壓片包衣進行膜包衣。本文還設計肺傳遞本發明蛋白(或其衍生物)。所述蛋白(或衍生物)吸入傳遞到哺乳動物的肺，並經過肺上皮內襯到血流中。(該方法的其它報導包括Adjei等，PharmaceuticalResearch7565-569(1990)；Adjei等，IntemationalJournalofPharmaceutics62，135-144(1990)(leuprolideacetate)；Braquet等，JournalofCardiovascularPharmacology13，(增刊5)第143-146頁(1989)(內皮縮血管肽-1)；Hubbard等，AnnalsofInternalMedicine3206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，J.Clin.Invest.841145-1146(1989)(α1-蛋白酶)；Oswein等，「AerosolizationofProteins」，ProceedingsofSymposiumonRespiratoryDrugDeliveryII，Keystone，Colorado，1990年3月(重組人生長激素)；Debs等，TheJournalofImmunology1403482-3488(1988)(幹擾素γ和腫瘤壞死因子α)和美國專利第5,284,656號(粒細胞集落刺激因子)。用於實施本發明為設計用於肺傳遞治療性製品的各式各樣的機械裝置，包括但不限於霧化器、計量劑量吸入器和粉末吸入器，所有這些都是本領域技術人員熟悉的。某些適合實施本發明的商業上可得到的裝置的具體實例為Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri製造的Ultravent霧化器；MarquestMedicalProducts，Englewood，Colorado製造的AcomII霧化器；GlaxoInc.，ResearchTrianglePark，NorthCarolina製造的沙丁胺醇計量劑量吸入器和FisonsCorp.，Bedford，Massachusetts製造的Spinhaler粉末吸入器。所有這些裝置需要應用適合於分散多肽或多肽製品的製劑。通常，每種製劑對所用的裝置類型是特異性的，而除了可用於治療的稀釋劑、輔助劑和/或載體以外，還可包括應用合適的拋射劑物質。最好製備平均粒子大小小於10μm、最優選0.5-5μm的顆粒形式的OPG融合蛋白(或衍生物)，，以最有效地傳遞到遠側肺。載體包括碳水化合物，諸如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用於製劑的其它成分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可以使用天然或合成的表面活性劑。可以使用聚乙二烯(除外其用於衍化OPG融合蛋白)。可以使用葡聚糖例如環狀葡聚糖。可以使用膽汁鹽和其它相關增強劑。可以使用纖維素和纖維素衍生物。可以使用胺基酸，例如用於緩衝製劑中。設計應用脂質體、微膠囊或微球體、包藏複合物或其它類型的載體。也設計了OPG融合蛋白的鼻傳遞。鼻傳遞使所述蛋白在將所述治療性製品給予到鼻後直接進入到血流中，而不需要所述製品沉積到肺中。用於鼻傳遞的製劑包括採用葡聚糖或環狀葡聚糖的那些製劑。也設計通過經其它黏膜轉運的傳遞。劑量以治療有效量給予本發明的OPG融合多肽，以預防和/或治療與轉移性骨病有關的骨丟失。OPG融合多肽的「治療有效量」是減少骨量丟失的速率和/或程度的量。通過各種已知的方法測量骨量，例如單光子吸收測定法(SPA)、雙光子吸收測定法(DPA)、雙能量X射線吸收測定法(DEXA)、定量計算機X射線斷層攝影術(QCT)和超聲波檢查法(參見Johnston等，載於PrimerontheMetabolicBoneDiseaseandDisordersofMineralMetabolism，第2版，M.J.Favus編著，RavenPress第137-146頁)。本領域技術人員可以應用這些方法以確定OPG融合多肽的治療有效量。也可以通過測量骨轉換的生化標記變化，確定治療有效量，例如血清骨鈣蛋白、血清鹼性磷酸酶、血清原膠原I伸展肽、尿或血清膠原蛋白的C端或N端端肽、尿鈣、羥脯氨酸和尿吡啶啉(pyrridnoline)和脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline)。人們一般認為，前述生化標記水平降低表明骨吸收減少而骨丟失也減少。或者，也可以通過測量骨機械強度變化、特別是骨扭轉強度增強，確定OPG融合多肽的治療有效量。一般而言，OPG融合多肽的治療有效量為約0.1mg/kg-約10mg/kg，最好是約1mg/kg-約10mg/kg。鑑於OPG融合多肽、特別是OPG與免疫球蛋白Fc區的融合物的半壽期增加，給藥的頻率將少於未修飾的OPG，諸如成熟全長OPG多肽。給予OPG融合多肽約每月1次，或者每兩個月1次，或者每三個月1次。應該指出的是，給藥的準確劑量和頻率將取決於幾個因素，包括製劑、給藥途徑、所治療的病症等等，並可以由技術人員容易地確定。採用所述OPG融合多肽的診斷測定，可以確定已經給予的融合蛋白量。這種診斷測定可以是抗體測定形式，諸如抗體夾層測定(antibodysandwichassay)，其中所述抗體特異性地結合到OPG融合蛋白而不結合到內源性、天然循環的OPG。以本領域技術人員已知的各種方法，可以進行測定OPG融合蛋白水平的基於抗體的測定。提供以下實施例以更全面地說明本發明，但不解釋用其限制本發明的範圍。實施例1OPG多肽和OPG融合多肽的構建和表達WO97/23614描述了編碼圖2(SEQIDNO2)所示OPG[1-401]的重組質粒的構建，其通過引用結合到本文中。將該質粒用於哺乳動物宿主細胞以產生具有如圖2(SEQIDNO2)中所示的包括胺基酸殘基22-401的成熟全長OPG多肽。基本上按照WO97/23614所述構建編碼OPG[1-201]和OPG[1-201]-Fc多肽的質粒。這些質粒用來產生OPG[22-201]和OPG[22-201]-Fc多肽。採用寡核苷酸1745-92和1789-04以及OPGcDNA作為模板，通過PCR構建OPG[1-194]。有義引物(1745-92)產生用於克隆的XbaI位點和起始密碼子ATG之前的共有Kozak序列。反義引物(1789-04)接入胺基酸殘基194之後的一個終止密碼子和用於克隆的SalI限制位點。將該PCR產物克隆到pDSRα19中，產生用於哺乳動物表達OPG[22-194]多肽的pDSRα19-人OPG[1-194]。經採用寡核苷酸1745-92和1745-94以及OPGcDNA作為模板的PCR，構建OPG[1-293]。有義引物(1745-92)產生用於克隆的XbaI位點和起始密碼子ATG之前的共有Kozak序列。反義引物(1745-94)接入胺基酸殘基293之後的一個終止密碼子和用於克隆的SalI限制位點。將該PCR產物克隆到pDSRα19中以產生pDSRα19人OPG[1-293]，用於哺乳動物表達OPG[22-293]。1745-92(SEQIDNO9)5』-AAGTCTAGACCACCATGAACAAGTTGCTGT-3』XbaIKozakOPG編碼1745-94(SEQIDNO10)5』-GCTAGTCGACTACTCGAAGGTGAGGTTAGCAT-3』SalI*OPG編碼1789-04(SEQIDNO11)5』-ATCTGTCGACTATTTTTGAGTTGATTCAC-3』SalI*OPG編碼0PG[1-194]-FcΔc的構建採用PCR方法從質粒pDSRα2OPG[1-201]-Fc中構建質粒pDSRα19OPG[1-194]-FcΔC，去除於OPG區段3』末端的不成對半胱氨酸以及Fc區段5』末端的不成對半胱氨酸，。然後將該克隆用作PCR的模板以獲得OPG結構域。5』OPG引物摻入用於克隆的XbaI位點(TCTAGA)和起始Met密碼子之前的一個「CCACC」Kozak序列。3』OPG引物摻入一個用於克隆Fc結構域的SalI位點(GTCGAC)。所述PCR產生編碼OPG蛋白的最初194個胺基酸殘基的OPG基因的592bp片段。所述PCR產物用XbaI和SalI切下，並克隆到pDSRα19中以產生稱為質粒p615的終構成物。有義OPG引物(1745-92)(SEQIDNO12)5』-AAGTCTAGACCACCATGAACAAGTTGCTGT-3』XbaI位點KozakOPG編碼反義OPG引物(1775-27)(SEQIDNO13)5』-CACGCGTCGACTTTTTGAGTTGATTCACTGTTTCC-3』SalI位點OPG編碼用克隆pDSRα2/OPG[1-201]-Fc作為模板以獲得Fc結構域。所述PCR產生包括鉸合、CH2和CH3結構域的Fc羧基端的227個胺基酸。5』Fc引物摻入一個SalI位點(編碼「VD」)，而3』Fc引物在Fc終止密碼子之後摻入一個XhoI位點(CTCGAG)。將所述FcPCR產物克隆到p615的SalI位點以產生pDSRα19OPG[1-194]-FcΔC，該質粒在哺乳動物細胞中表達產生OPG[22-194]-FcdC。該融合蛋白在Fc-OPG接點含有一個額外的纈氨酸。在所述連接反應中丟失XhoI位點。有義Fc引物(1476-25)(SEQIDNO14)5』-AATCTGTCGACAAAACTCACACATGC-3』SalI位點Fc編碼反義Fc引物(1504-63)(SEQIDNO15)5』-CCATGCTCGAGTTATCATTTACCCGGAGACAGG-3』XholI位點*Fc編碼OPG[1-194]-FcG10的構建經用引物1775-30和1504-63和OPG[1-201]-FccDNA作為模板的PCR，構建具有G10鉸合部(1個絲氨酸和8個甘氨酸殘基)的Fc區。將所述產物亞克隆到pCRscript(pCRscriptFcG10BspE)中並測序。經用引物1745-92和1790-72和OPG[1-201]-FccDNA作為模板的PCR獲得OPG[1-194]。將所述PCR產物亞克隆到pCRScript中並測序。然後將含有OPG[1-194]序列的Xba/BspEI片段和含有具有G10鉸合部的Fc的BspEI/XhoI片段亞克隆到pDSRα19中。該質粒在哺乳動物細胞中表達後產生OPG[22-194]-FcG10。所述胺基酸序列示於圖7中。G10-Fc5』引物(SEQIDNO16)BspEIGly接頭KpnIFc結構域→1775-305』-AATCCGGAGGAGGTGGTGGAGGTGGGGGTACCTGCCCACCGTGC-3』SGGGGGGGGTCPPCG10-Fc3』引物(SEQIDNO17)XhoI1504-635』-CCATGCTCGAGTTATCATTTACCCGGAGACAGG-3』**KGPSLOPG5』引物(SEQIDNO18)XbaIKozakopgCoding→1745-925』-AAGTCTAGACCACCATGAACAAGTTGCTGT-3』MNKLLOPG3』引物(SEQIDNO19)BspEI1790-725』-CCTCCGATTTTTGAGTTGATTCACTGTTTCCAGA-3』KQTSESNGSFcΔC-OPG[22-194]的構建採用pDSRα2OPG[1-201]-FcDNA作模板通過標準PCR技術，產生編碼FcΔC-OPG[22-194]的DNA分子。用寡核苷酸1757-22和1757-23產生所述Fc部分。1757-22引物具有一個符合讀框的EpoBssHII信號信號，以使Fc位於促紅細胞生成素信號序列(該信號序列描述於美國專利第4,703,008號)的下遊。1757-23引物將所述Fc結構域的最後一個胺基酸融合到人OPG的胺基酸殘基22。用寡核苷酸1757-24和1789-04產生OPG部分。1789-04引物植入在人OPG胺基酸194之後的一個終止密碼子和用於克隆的SalI位點。然後將這兩個純化的產物用作模板以產生含有引物1757-22和1789-04的Fc/OPG融合分子。將產生的PCR產物用BssHII和SalI消化、純化、然後克隆到BssHII/SalI消化的pDSRα19中。該質粒在哺乳動物宿主細胞中表達產生FcΔC-OPG[22-194]，如圖8(SEQIDNO8)所示，具有用胺基酸ala-pro取代氨基端的甲硫氨酸的修飾。有義Fc引物(1757-22)(SEQIDNO20)5』-TTGGCGCGCCCAAATCTTGTGACAAAACT-3』BssHII反義Fc/OPG引物(1757-23)(SEQIDNO21)5』-CTTTGGAGGAAACGTTTCTTTACCCGGAGACAGGGA-3』OPG→|←Fc有義Fc/OPG引物(1757-24)(SEQIDNO22)5』-TCCCTGTCTCCGGGTAAAGAAACGTTTCCTCCAAAG-3』Fc→|←OPG反義OPG引物(1789-04)(SEQIDNO23)5』-ATCTGTCGACTATTTTTGAGTTGATTCAC-3』SalI*OPG編碼以前已經描述了載體pDSRα2(參見WO90/14363和其中的圖12，其通過引用結合到本文中)。載體pDSRα19是功能相似、但含有pDSRα2的以下變化的修飾形式pDSRα21)從3』末端減少αFSHpolyA大約1400bp。它現在為885bp而在NdeI位點結束。2)二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子被從5』末端減少大約1kb，而現在僅含有209bp。3)缺失DHFRpolyA中的大約550bpBglII片段。WO97/23614全面描述了從條件培養基純化截短多肽和融合多肽的條件。metFcAc-OPG[22-194]的構建採用以下方法構建methuOPG[22-194]編碼序列。構建合成的寡核苷酸，它含有OPGDNA編碼序列的完整全上鏈和下鏈構成的重疊50-mer。將內部50-mer寡核苷酸磷酸化、退火然後連接過夜。將外部寡核苷酸(34-mers)用作聚合酶鏈式反應(PCR)的引物以擴增所述全長基因。採用TaqDNA聚合酶和以試劑盒形式(BoehringerMannheim)提供的其它反應組分，進行所述PCR反應。產生的584鹼基對PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳純化，然後採用QIAquick旋轉柱方法(spincolumnmethod)(Qiagen)，從所述凝膠提取出來。然後將所述凝膠純化的片段用限制酶XbaI和BamHI(BoehringerMannheim)消化。用上述片段和用相同限制酶消化的質粒載體pAMG21(ATCC保藏號98113)進行連接反應。經電穿孔將所述連接的DNA轉化到大腸桿菌株#393中。選擇卡那黴素抗生素抗性的克隆，分離質粒，並經DNA序列測定驗證所述編碼區的序列。DNA序列測定顯示最初選定的克隆(稱為質粒A)在所述基因中間存在明顯錯配鹼基。通過用限制酶SpeI和HpaI消化質粒A並用產生的產物作為所述載體片段，修復該基因序列。採用內部寡核苷酸1466-91和1467-03作為聚合酶鏈式反應的PCR引物，通過最初連接的寡核苷酸混合物的PCR，製備一條新的插入片段。將所述插入片段用SpeI和HpaI消化，然後連接到質粒A載體中以取代含有錯配鹼基的DNA片段。如上所述進行轉化、選擇和質粒分離。經DNA序列測定證實含有人OPG[22-194]的正確序列的克隆(質粒B)。上鏈寡核苷酸1466-90至1467-011466-90(SEQIDNO24)5』AACAAACTCTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGG-3』1466-91(SEQIDNO25)5』AGGAATAACATATGGAAACTTTTCCACCTAAATATCTTCATTATGATGAA-3』1466-92(SEQIDNO26)5』GAAACTAGTCACCAGCTGCTGTGCGACAAATGTCCTCCGGGTACCTACCT-3』1466-93(SEQIDNO27)5』GAAACAGCACTGCACCGCTAAATGGAAAACCGTTTGCGCTCCTTGTCCGG-3』1466-94(SEQIDNO28)5』ACCACTACTACACCGACTCCTGGCACACCTCCGACGAATGCCTGTACTGC-3』1466-95(SEQIDNO29)5』TCACCGGTTTGCAAGGAGCTGCAGTACGTTAAACAGGAATGCAACCGTAC-3』1466-96(SEQIDNO30)5』GCACAACCGTGTTTGCGAATGCAAAGAAGGTCGTTACCTGGAGATCGAAT-3』1466-97(SEQIDNO31)5』TCTGCCTGAAACACCGTTCCTGTCCGCCTGGTTTCGGTGTTGTACAGGCT-3』1466-98(SEQIDNO32)5』GGTACCCCGGAACGTAACACCGTTTGCAAACGTTGCCCGGACGGTTTCTT-3』1466-99(SEQIDNO33)5』CTCCAACGAAACCTCGAGCAAAGCTCCGTGCCGTAAACACACCAACTGCT-3』1467-00(SEQIDNO34)5』CCGTTTTCGGTCTCCTGTTAACCCAGAAAGGTAACGCTACCCACGACAAC-3』1467-01(SEQIDNO35)5』ATCTGCTCCGGTAACTCCGAGTCGACCCAGAAATAATGGATCCCAAACAA-3』下鏈寡核苷酸1476-02至1476-131467-02(SEQIDNO36)5』-TTGTTTGGGATCCATTATTTCTGGGTCGACTCGG-3』1467-03(SEQIDNO37)5』AGTTACCGGAGCAGATGTTGTCGTGGGTAGCGTTACCTTTCTGGGTTAAC-3』1467-04(SEQIDNO38)5』AGGAGACCGAAAACGGAGCAGTTGGTGTGTTTACGGCACGGAGCTTTGCT-3』1467-05(SEQIDNO39)5』CGAGGTTTCGTTGGAGAAGAAACCGTCCGGGCAACGTTTGCAAACGGTGT-3』1467-06(SEQIDNO40)5』TACGTTCCGGGGTACCAGCCTGTACAACACCGAAACCAGGCGGACAGGAA-3』1467-07(SEQIDNO41)5』CGGTGTTTCAGGCAGAATTCGATCTCCAGGTAACGACCTTCTTTGCATTC-3』1467-08(SEQIDNO42)5』GCAAACACGGTTGTGCGTACGGTTGCATTCCTGTTTAACGTACTGCAGCT-3』1467-09(SEQIDNO43)5』CCTTGCAAACCGGTGAGCAGTACAGGCATTCGTCGGAGGTGTGCCAGGAG-3』1467-10(SEQIDNO44)5』TCGGTGTAGTAGTGGTCCGGACAAGGAGCGCAAACGGTTTTCCATTTAGC-3』1467-11(SEQIDNO45)5』GGTGCAGTGCTGTTTCAGGTAGGTACCCGGAGGACATTTGTCGCACAGCA-3』1467-12(SEQIDNO46)5』GCTGGTGACTAGTTTCTTCATCATAATGAAGATATTTAGGTGGAAAAGTT-3』1467-13(SEQIDNO47)5』TCCATATGTTATTCCTCCTTTAATTAGTTAAAACAAATCTAGAGTTTGTT-3』如下進行上述人OPG[22-194]DNA序列與人IgG1FcΔC的融合。將包含在其氨基端與質粒pFc-A3的Fc區融合的上述OPGDNA編碼序列的插入片段的質粒DNA，用限制酶NdeI和SpeI消化。質粒pFc-A3已經描述於WO97/23614。產生的質粒載體片段含有除去所述基因的前14個密碼子(直到SpeI位點)的OPG編碼序列。該載體命名為載體C。採用WO98/28427陳述的SEQIDNO13和SEQIDNO14所示的DNA序列作為模板，經進行聚合酶鏈式反應，產生所述插入片段。將用於質粒pAMG21(ATCC保藏號98113)的通用5』引物(#1209-85)用來引發(prime)所述Fc序列(一個NdeI位點已經存在於所述Fc序列的起點)的5』端。設計兩條寡核苷酸引物引發Fc編碼序列的3』端，同時加入與osteoprotegerin基因的5』端相同的一個重疊區。設計第一引物(1595-18)去引發Fc編碼序列的3』端，並加入osteoprotegerin序列的5』端的第一密碼子。第二引物(1585-16)在上述引物的3』端引發並通過第14個密碼子的SpeI位點加入其它OPG編碼序列。採用具有WO98/28427的SEQIDNO13和SEQIDNO14序列的DNA分子作為模板，引物為1209-85和1595-18，以及採用上述Taq聚合酶進行第一輪PCR。將該反應的799個鹼基對PCR產物凝膠純化並用作第二輪PCR反應的模板，其引物為1209-85和1585-16。將第二輪PCR反應的825個鹼基對產物凝膠純化、用NdeI和SpeI消化，然後連接到上述載體C中。將連接反應混合物轉化到大腸桿菌中，然後分離克隆，並經DNA序列測定證實具有正確OPG編碼序列。產生的質粒編碼具有圖8(SEQIDNO8)中所示的胺基酸序列的[met]FcΔC-人OPG[22-194]。引物1209-85(SEQIDNO48)5』-CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG-3』引物1585-16(SEQIDNO49)5』ACAAACACTAGTTTCTTCATCATAATGAAGATATTTAGGTGGAAACGT3』引物1595-18(SEQIDNO50)5』GAAGATATTTAGGTGGAAACGTTTCTTTACCCGGAGACAGGGAG-3』基本上按照WO97/23614所述，進行在pAMG21中的編碼[met]FcdC-人OPG[22-194]的DNA序列的表達。通過常規方法純化所述融合多肽。實施例2OPG多肽的活性如下測定描述於實施例1中的選定OPG多肽和OPG融合多肽的體內活性。將OPG製劑持續4天皮下(SC)注射給予4-5周齡雄性BDF1小鼠，然後在第5天對所述小鼠進行放射照相。與媒介物處理的對照相比，陽性結果為脛骨幹骺近端的X射線密度增加。每組4隻動物，將每個脛骨與不同對照脛骨相比，得到編號1-8的結果。需要8個結果中至少5個為陽性結果，以得出產生了生物反應的結論。人們認為產生生物反應的最低劑量說明其體內效力。所有劑量以mg/kg/天表示。截短的OPG多肽和全長OPG多肽的日用量實驗示於表2中。OPG融合多肽的日用量實驗示於表3中。在大腸桿菌宿主細胞中表達具有N端甲硫氨酸殘基的OPG多肽和OPG融合多肽，而在CHO細胞中表達不具有N端甲硫氨酸的OPG多肽和OPG融合多肽。實施例22根據本發明製備如下液體硬表面清潔組合物*乙二胺二乙酸四鈉**二甘醇單己基醚表3第5天進行X射線照相的日用量實驗在單劑量實驗中，周齡3-4周的雄性BDF1小鼠在第0天(或第1天)用載體(PBS/0.1％BSA)經單次皮下注射，接受以下所示的不同劑量的OPG融合蛋白，然後將小鼠在第7天(或第5天)進行x射線照射。對於每次處理，一個組的所有小鼠和PBS/0.1％BSA對照組的所有小鼠都在一個膠片上(onasinglefilm)進行x射線照相。如上所述記錄陽性結果。劑量以mg/kg表示。所述結果示於表4中。表4在第5天進行X射線照相的單劑量實驗在第7天進行X射線照相的單劑量實驗顯而易見的是，融合到Fc區的OPG截短多肽顯示較低劑量的體內活性比未融合的OPG截短多肽或全長多肽高。此外，OPG[22-194]-FcΔC(在OPG[22-194]多肽的羧基端的Fc融合物)顯示其體內效力比FcΔC-OPG[22-194](在OPG[22-194]的氨基端的Fc融合物)高。***雖然通過優選實施方案描述了本發明，但不用說本領域技術人員會想到各種變化和修改。因此，所附權利要求書覆蓋所有這樣的屬於要求保護的本發明範圍的等同變化。序列表110AMGENINC.120OPG融合蛋白組合物和方法130A-60414014116050170PatentInVer.2.12101211232212PRT213人類4001GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAla151015ProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysPro202530LysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValVal354045ValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrVal505560AspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGln65707580TyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGln859095AspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAla100105110LeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnPro115120125ArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThr130135140LysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer145150155160AspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyr165170175LysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyr180185190SerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPhe195200205SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLys210215220SerLeuSerLeuSerProGlyLys2252302102211401212PRT213人類4002MetAsnLysTrpLeuCysCysAlaLeuLeuValLeuLeuAspIleIle151015GluTrpThrThrGlnGluThrLeuProProLysTyrLeuHisTyrAsp202530ProGluThrGlyHisGlnLeuLeuCysAspLysCysAlaProGlyThr354045TyrLeuLysGlnHisCysThrValArgArgLysThrLeuCysValPro505560CysProAspHisSerTyrThrAspSerTrpHisThrSerAspGluCys65707580ValTyrCysSerProValCysLysGluLeuGlnSerValLysGlnGlu859095CysAsnArgThrHisAsnArgValCysGluCysGluGluGlyArgTyr100105110LeuGluIleGluPheCysLeuLysHisArgSerCysProProGlySer115120125GlyValValGlnAlaGlyThrProGluArgAsnThrValCysLysLys130135140CysProAspGlyPhePheSerGlyGluThrSerSerLysAlaProCys145150155160IleLysHisThrAsnCysSerThrPheGlyLeuLeuLeuIleGlnLys165170175GlyAsnAlaThrHisAspAsnValCysSerGlyAsnArgGluAlaThr180185190GlnLysCysGlyIleAspValThrLeuCysGluGluAlaPhePheArg195200205PheAlaValProThrLysIleIleProAsnTrpLeuSerValLeuVal210215220AspSerLeuProGlyThrLysValAsnAlaGluSerValGluArgIle225230235240LysArgArgHisSerSerGlnGluGlnThrPheGlnLeuLeuLysLeu245250255TrpLysHisGlnAsnArgAspGlnGluMetValLysLysIleIleGln260265270AspIleAspLeuCysGluSerSerValGlnArgHisLeuGlyHisSer275280285AsnLeuThrThrGluGlnLeuLeuAlaLeuMetGluSerLeuProGly290295300LysLysIleSerProGluGluIleGluArgThrArgLysThrCysLys305310315320SerSerGluGlnLeuLeuLysLeuLeuSerLeuTrpArgIleLysAsn325330335GlyAspGlnAspThrLeuLysGlyLeuMetTyrAlaLeuLysHisLeu340345350LysThrSerHisPheProLysThrValThrHisSerLeuArgLysThr355360365MetArgPheLeuHisSerPheTh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ctccaaag362102321129212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40023atctgtcgactatttttgagttgattcac292102421134212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40024aacaaactctagatttgttttaactaattaaagg342102521150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40025aggaataacatatggaaacttttccacctaaatatcttcattatgatgaa502102621150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40026gaaactagtcaccagctgctgtgcgacaaatgtcctccgggtacctacct502102721150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40027gaaacagcactgcaccgctaaatggaaaaccgtttgcgctccttgtccgg502102821150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40028accactactacaccgactcctggcacacctccgacgaatgcctgtactgc502102922150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40029tcaccggtttgcaaggagctgcagtacgttaaacaggaatgcaaccgtac502103021150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40030gcacaaccgtgtttgcgaatgcaaagaaggtcgttacctggagatcgaat502103121150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40031tctgcctgaaacaccgttcctgtccgcctggtttcggtgttgtacaggct502103221150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40032ggtaccccggaacgtaacaccgtttgcaaacgttgcccggacggtttctt502103321150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40033ctccaacgaaacctcgagcaaagctccgtgccgtaaacacaccaactgct502103421150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40034ccgttttcggtctcctgttaacccagaaaggtaacgctacccacgacaac502103521150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40035atctgctccggtaactccgagtcgacccagaaataatggatcccaaacaa502103621134212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40036ttgtttgggatccattatttctgggtcgactcgg342103721150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40037agttaccggagcagatgttgtcgtgggtagcgttacctttctgggttaac502103821150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40038aggagaccgaaaacggagcagttggtgtgtttacggcacggagctttgct502103921150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40039cgaggtttcgttggagaagaaaccgtccgggcaacgtttgcaaacggtgt502104021150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40040tacgttccggggtaccagcctgtacaacaccgaaaccaggcggacaggaa502104121150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40041cggtgtttcaggcagaattcgatctccaggtaacgaccttctttgcattc502104221150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40042gcaaacacggttgtgcgtacggttgcattcctgtttaacgtactgcagct502104321150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40043ccttgcaaaccggtgagcagtacaggcattcgtcggaggtgtgccaggag502104421150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40044tcggtgtagtagtggtccggacaaggagcgcaaacggttttccatttagc502104521150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40045ggtgcagtgctgtttcaggtaggtacccggaggacatttgtcgcacagca502104621150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40046gctggtgactagtttcttcatcataatgaagatatttaggtggaaaagtt502104721150212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40047tccatatgttattcctcctttaattagttaaaacaaatctagagtttgtt502104821125212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40048cgtacaggtttacgcaagaaaatgg252104921148212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40049acaaacactagtttcttcatcataatgaagatatttaggtggaaacgt482105021144212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成寡核苷酸40050gaagatatttaggtggaaacgtttctttacccggagacagggag4權利要求1.具有選自以下組成形式的蛋白R1-R2、R2-R1、R1-L-R2和R2-L-R1，其中R1為Fc蛋白、或其變體或片段，R2為OPG蛋白、或其變體或片段，而L為接頭。2.權利要求1的所述蛋白，具有式R2-L-R1。3.按照權利要求1的所述蛋白，其中所述Fc蛋白選自以下(a)圖1所示的Fc胺基酸序列；(b)亞部分(a)的胺基酸序列，在以下一個或多個位置(採用按照圖1的編號)具有取代或缺失的不同胺基酸(i)一個或多個半胱氨酸殘基；(ii)一個或多個酪氨酸殘基；(iii)缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；(iv)缺失或用穀氨醯胺取代位置20的亮氨酸；(v)缺失或用丙氨酸取代位置103的穀氨酸；(vi)缺失或用丙氨酸取代位置105的賴氨酸；(vii)缺失或用丙氨酸取代位置107的賴氨酸；(viii)缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一個或多個胺基酸；(ix)取代或缺失一個或多個殘基以消除所述Fc受體結合位點；(x)取代或缺失一個或多個殘基以消除所述補體(Clq)結合位點的；和(xi)亞部分i-x的組合；(c)亞部分(a)或(b)的胺基酸序列，在N端具有一個甲硫氨醯殘基；(d)亞部分(a)至(c)中任何一種的Fc蛋白、或其變體、片段或衍生物，包含連接到所述蛋白部分的化學部分；(e)亞部分(d)的一種衍生物，其中所述化學部分為水溶性聚合物部分；(f)亞部分(e)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；和(g)亞部分(e)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分連接在所述蛋白部分的唯一N端。4.按照權利要求1的所述蛋白，其中所述OPG蛋白、或其變體、片段或衍生物選自以下(a)胺基酸序列22-X，其中X為圖2(SEQIDNO2)所示的包括位置185-401的任何殘基；(b)胺基酸序列22-X，其中X為圖2(SEQIDNO2)所示的包括位置185-293的任何殘基；(c)亞部分(a)和(b)的胺基酸序列，在N端具有一個甲硫氨醯殘基。(c)任何亞部分(a)、(b)和(c)的OPG蛋白、或其變體、片段或衍生物，包含連接到所述蛋白部分的化學部分；(d)亞部分(c)的一種衍生物，其中所述化學部分為水溶性聚合物部分；(e)亞部分(d)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；(f)亞部分(d)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚胺基酸部分；和(g)亞部分(d)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分連接在所述蛋白部分的唯一N端。5.權利要求1的所述蛋白，其中所述接頭是選自甘氨酸、天冬醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸的一個或多個胺基酸。6.權利要求1的所述蛋白，其中所述接頭選自以下(a)ala-ala-ala；(b)ala-ala-ala-ala；(c)ala-ala-ala-ala-ala；(d)gly-gly；(e)gly-gly-gly；(f)gly-gly-gly-gly-gly；(g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly-gly-pro-gly-gly；(j)val；(k)ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(l)gly-gly-ser-gly-ser-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-ser-gly-gly；(m)化學部分；和(n)亞部分(a)-(m)的任何組合。7.一種融合蛋白，它包含選自圖5、6、7或8(分別為SEQIDNO5、6、7、8)所示胺基酸序列的胺基酸序列。8.一種核酸序列，它編碼具有選自R1-R2、R2-R1、R1-L-R2和R2-L-R1的組成式的蛋白，其中R1為Fc蛋白、或其變體或片段，R2為OPG蛋白、或其變體或片段，而L為接頭。9.權利要求8的所述核酸序列，編碼包含選自以下的Fc蛋白、變體、片段或衍生物部分的蛋白(a)圖1(SEQIDNO1)所示的Fc胺基酸序列；(b)亞部分(a)的胺基酸序列，具有在以下一個或多個位置(用按照圖1的編號)中取代或缺失的不同胺基酸(i)一個或多個半胱氨酸殘基；(ii)一個或多個酪氨酸殘基；(iii)缺失或用丙氨酸取代位置5的半胱氨酸；(iv)缺失或用穀氨醯胺取代位置20的亮氨酸；(v)缺失或用丙氨酸取代位置103的穀氨酸；(vi)缺失或用丙氨酸取代位置105的賴氨酸；(vii)缺失或用丙氨酸取代位置107的賴氨酸；(viii)缺失或取代位置1、2、3、4和5中的一個或多個胺基酸；(ix)取代或缺失一個或多個殘基以消除所述Fc受體結合位點；(x)取代或缺失一個或多個殘基以消除所述補體(Clq)結合位點；和(xi)亞部分i-x的組合；(c)亞部分(a)或(b)的胺基酸序列，在N端具有一個甲硫氨醯殘基；(d)亞部分(a)至(c)中任何一種的Fc蛋白、或其變體、片段或衍生物，包含連接到所述蛋白部分的化學部分；(e)亞部分(d)的一種衍生物，其中所述化學部分為水溶性聚合物部分；(f)亞部分(e)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；和(g)亞部分(e)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分連接在所述蛋白部分的唯一N端。10.按照權利要求8的所述核酸序列，編碼包含選自以下的OPG蛋白、變體、片段或衍生物部分的蛋白(a)胺基酸序列22-X，其中X為圖2(SEQIDNO2)所示的包括位置185-401的任何殘基；(b)胺基酸序列22-X，其中X為圖2(SEQIDNO2)所示的包括位置185-293的任何殘基；(c)亞部分(a)和(b)的胺基酸序列，在N端具有一個甲硫氨醯殘基。(d)任何亞部分(a)、(b)和(c)的OPG蛋白、或其變體、片段或衍生物，包含連接到所述蛋白部分的化學部分；(e)亞部分(d)的一種衍生物，其中所述化學部分為水溶性聚合物部分；(f)亞部分(e)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚乙二醇；(g)亞部分(e)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分為聚胺基酸部分；和(h)亞部分(e)的一種衍生物，其中所述水溶性聚合物部分連接在所述蛋白部分的唯一N端。11.權利要求8的所述核酸序列，編碼包含接頭的蛋白，所述接頭是選自甘氨酸、天冬醯胺、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸的一個或多個胺基酸。12.權利要求8的所述核酸序列，編碼具有選自以下接頭的蛋白(a)ala-ala-ala；(b)ala-ala-ala-ala；(c)ala-ala-ala-ala-ala；(d)gly-gly；(e)gly-gly-gly；(f)gly-gly-gly-gly-gly；(g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly-gly-pro-gly-gly；(j)val；(k)ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(l)gly-gly-ser-gly-ser-gly-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-ser-gly-gly；(m)化學部分；和(n)亞部分(a)-(m)的任何組合。13.編碼融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含選自以下的胺基酸序列圖5、6、7或8(分別為SEQIDNO5、6、7、8)所示的胺基酸序列。14.一種載體，它包含按照權利要求8-13中的任一項的核酸序列。15原核或真核宿主細胞，含有權利要求14的所述載體。16.用於生產權利要求1或6的蛋白的方法，所述方法包括以下步驟在合適條件下培養權利要求15的宿主細胞和分離所產生的蛋白。17.權利要求16的方法，還包括純化所產生的蛋白的步驟。18.一種藥用組合物，它包含在藥學上可接受的稀釋劑、輔助劑或載體中的有效量權利要求1或6的蛋白。19.預防或治療哺乳動物骨丟失的方法，該方法包括給予有效量的權利要求1-6任一項的所述蛋白。20.權利要求19的方法，其中所述骨丟失選自骨質疏鬆症、佩吉特病、骨髓炎、血鈣過多、與手術或服用類固醇相關的骨質減少、骨壞死、由類風溼性關節炎引起的骨丟失、牙周骨丟失、溶骨性轉移和假肢鬆動(prostheticloosening)。全文摘要本發明涉及OPG融合蛋白組合物、這種組合物的製備方法及其應用。更具體地講,本發明涉及包含OPG多肽和免疫球蛋白Fc區的融合蛋白。文檔編號A61P7/00GK1335888SQ00802417公開日2002年2月13日申請日期2000年8月18日優先權日1999年9月3日發明者C·R·敦斯坦,S·K·伍登,M·B·曼申請人:安姆根有限公司