核糖核酸內切酶組合物及其使用方法與流程

2023-08-02 01:38:36

核糖核酸內切酶組合物及其使用方法交叉引用該申請要求2010年5月10日提交的美國臨時專利申請號61/333,163；2010年7月19日提交的美國臨時專利申請號61/365,627；以及2010年11月12日提交的美國臨時專利申請號61/413,287的權益，這些申請各自以引用方式全部併入本文。關於政府贊助研究的聲明該發明是根據美國國立衛生研究院授予的撥款號T32GM07232和美國國家科學基金會授予的撥款號MCB-0950971的政府支持下進行的。政府具有本發明的某些權利。發明背景在二十世紀七十年代，DNA限制酶通過使隨意裂解特定DNA序列成為可能而改變了分子生物學。目前RNA分子的測序必需將RNA拷貝進DNA鏈，然後通過常規方法來對所述DNA鏈進行測序。該方法也稱為RNASeq，其有效並且可產生數百萬個序列讀數。然而，由於個別步驟的序列依賴性功效，產生cDNA的必要性導致固有偏好。文獻Carte等(2008)GenesDev.22：3489；美國專利公開號2010/0093026。發明概要本公開提供了變體Csy4核糖核酸內切酶、編碼變體Csy4核糖核酸內切酶的核酸以及經所述核酸遺傳修飾的宿主細胞。也提供了變體Csy4核糖核酸內切酶用於多種應用。本公開也提供了檢測靶多核糖核苷酸中特定序列的方法；以及調節真核細胞中靶RNA的生成的方法。附圖簡述圖1A-C示出Pal4Csy4對前體-crRNA(pre-crRNA)底物的特異性識別。示出的核苷酸序列是5′-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3′(SEQIDNO：1)。圖2A-C示出結合RNA底物的Csy4的晶體結構。圖3A和3B示出：Csy4的催化中心的詳細視圖(圖3A)；以及Csy4野生型(WT)和突變體的裂解活性(圖3B)。圖4示出12個Csy4序列中不變的胺基酸。Pa(SEQIDNO：8)；Yp(SEQIDNO：34)；Ec89(SEQIDNO：39)；Dn(SEQIDNO：79)；Ab(SEQIDNO：84)；MP1(SEQIDNO：2)；MP01(SEQIDNO：3)；SW(SEQIDNO：4)；Pm(SEQIDNO：85)；Pw(SEQIDNO：13)；和Dd(SEQIDNO：10)。圖5A-5BD展示各種Csy4多肽的胺基酸序列比對以及由各Csy4多肽識別的RNA序列的核苷酸序列。圖6示出無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶的胺基酸序列的例子。圖7示出檢測靶多核糖核苷酸中特定序列的方法的例子。圖8示出咪唑對各種無酶活性的Csy4變體的活化的作用。圖9示出分離靶RNA的示例性方法。示出Csy4靶莖-環(SEQIDNO：103)。圖10示出調節真核細胞中靶RNA的表達的示例性方法。示出Csy4RNA底物序列(SEQIDNO：103)。定義如本文所使用，「多核糖核苷酸」是指核苷酸的聚合形式，並且包括RNA、包含脫氧核苷酸的RNA以及包含核苷酸的DNA。在一些情況下，多核糖核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸(例如，脫氧肌苷、脫氧尿苷或羥甲基脫氧尿苷)。在一些情況下，多核糖核苷酸僅由核苷酸組成(即，不包括任何脫氧核苷酸)。在一些情況下，多核糖核苷酸包含核苷酸，以及一種或多種修飾的核苷酸，但不包括任何脫氧核苷酸。在其他情況下，多核糖核苷酸包含核苷酸，並且可包含一種或多種修飾的核苷酸，以及一種或多種脫氧核苷酸(包括修飾的脫氧核苷酸)。在一些情況下，其中多核糖核苷酸包含一種或多種脫氧核苷酸，脫氧核苷酸佔多核糖核苷酸中總核苷酸的約50％至約40％、約40％至約30％、約30％至約20％、約20％至約10％、約10％至約1％或者小於1％。術語「核酸」和「多核苷酸」可交換使用並且指任意長度的核苷酸(脫氧核苷酸或核苷酸或其類似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性例子包括線性和環狀核酸、信使RNA(mRNA)、cDNA、重組多核苷酸、載體、探針和引物。「生物樣本」涵蓋從細胞、細胞外物質、組織或多細胞生物體中獲得的多種樣本類型。定義涵蓋血液和生物來源的其他液體樣本、固體組織樣本，例如活檢標本或組織培養物或者由其衍生的細胞及其子代。定義也包括在採購後以任何方式進行操作的樣本，所述方式例如通過使用試劑處理、溶解或富集某些組分諸如多核苷酸。術語「生物樣本」涵蓋臨床樣本，並且也包括培養物中的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物流體(例如，腦脊液、支氣管肺泡灌洗液、尿液、血液、血液部分(例如，血漿、血清)、痰等)以及組織樣本。在一些情況下，生物樣本包括細胞。在其他情況下，生物樣本無細胞。術語「可操作連接」是指在分子之間功能性連接以提供期望的功能。在核酸的情況中，「可操作連接」是指核酸之間的功能性連接以提供期望的功能，諸如轉錄、翻譯等，例如，在核酸表達控制序列(例如啟動子、信號序列或轉錄因子結合位點的陣列)和第二多核苷酸之間的功能性連接，其中表達控制序列影響第二多核苷酸的轉錄和/或翻譯。在多肽的情況中，「可操作連接」是指在(例如，不同結構域的)胺基酸序列之間的功能性連接以提供多肽的所述活性。「分離的」是指(如果天然存在)在與其天然存在的環境不同的環境中的蛋白質或核酸。「分離的」意思為包括在樣本內的蛋白質或核酸，該樣本基本上富含目標蛋白質或核酸和/或其中目標蛋白質或核酸是部分或基本上純的。在其中蛋白質或核酸不是天然存在的情況中，「分離的」表示已經將蛋白質或核酸通過合成或重組方式從其製備的環境中分離。「基本上純的」表示實體(例如，多肽或核酸)構成組合物的總含量(例如，組合物的總蛋白)的大於約50％並且通常總蛋白含量的大於約60％。在一些實施方案中，「基本上純的」是指其中總組合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多為目標實體(例如總蛋白的95％)的組合物。在一些實施方案中，目標蛋白質或核酸將構成組合物中總蛋白質或核酸的大於約90％、大於約95％、大於約98％或大於約99％。在進一步描述本發明之前，應理解，本發明不受描述的具體實施方案限制，因為其當然可變化。也應理解，本文所使用的術語的目的僅僅是為了描述具體實施方案，而不是旨在限制，因為本發明的範圍僅受所附權利要求的限制。在其中提供大量數值的情況中，應理解，除非上下文中明確另有說明，該範圍和任何其他所述範圍的上下限之間的下限單位的十分之一的各居中值或者在所述範圍中居中值涵蓋在本發明內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括在較小範圍中，並且也涵蓋在本發明內，服從在所述範圍中任何具體排除限制。在其中所述範圍包括限值的一個或兩者的情況中，排除一個或兩個這些包括的限值的範圍也包括在本發明中。除非另有定義，本文所使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬
技術領域：
：普通技術人員通常所理解的相同的含義。儘管在本發明的實踐或測試中也可使用與本文所述類似或等同的任何方法和材料，但現描述優選的方法和材料。本文所提及的所有出版物以引用的方式併入本文以公開和描述關於其這些出版物被引用的方法和/或材料。必須注意的是，除非上下文中明確另有說明，如本文所使用以及在所附權利要求中，單數形式「一個」、「一種」、和「所述」包括複數參照對象。因此，例如，參照「位點特異性核糖核酸內切酶」包括多種此類位點特異性核糖核酸內切酶以及參照「靶多核糖核苷酸」包括參照一種或多種靶多核糖核苷酸及其本領域技術人員已知的等同形式等。還需注意，可撰寫權利要求以排除任何任選要素。就其本身而言，該陳述旨在用作使用與權利要求要素的敘述相關的此類排除性術語如「單獨地」、「僅」等或者使用「消極」限制的先行基礎。僅提供在本申請的提交日之前公開的本文所討論的出版物。不應當將本文中任何內容解釋為承認本發明不可憑藉之前的發明早於這些公開。而且，所提供的公開日可能與實際公開日不同，這可能需要獨立確定。發明詳述本公開提供了變體Csy4核糖核酸內切酶、編碼變體Csy4核糖核酸內切酶的核酸以及經核酸遺傳修飾的宿主細胞。也提供了變體Csy4核糖核酸內切酶用於多種應用。本公開也提了供檢測靶多核糖核苷酸中特定序列的方法；以及調節真核細胞中靶RNA的生成的方法。檢測在靶多核糖核苷酸中序列的方法本公開提供了檢測靶多核糖核苷酸中序列的方法。本方法用於檢測在多核糖核苷酸中特定序列的存在，並且因而可用於檢測包含特定序列的多核糖核苷酸。例如，本方法可用於檢測樣本中(例如，生物樣本中)病原體的多核糖核苷酸的存在。主題方法可檢測僅僅100拷貝、少至單一拷貝的靶多核糖核苷酸。因此，例如，主題方法可檢測在樣本中(例如，在單細胞中、在單胚胎或其他生物樣本中)1至約5、約5至約10、約10至約50、或約50至約100或大於100拷貝的靶多核糖核苷酸。因此，主題方法用於各種法醫、研究和診斷應用中。在一些實施方案中，檢測靶多核糖核苷酸中特定序列的主題方法包括：a)在有利於寡核苷酸探針和靶多核糖核苷酸之間形成雙鏈體的條件下使靶多核糖核苷酸與寡核苷酸探針接觸，所述寡核苷酸探針包含特定序列以及酶活性序列特異性Csy4核糖核酸內切酶，其中雙鏈體被Csy4核糖核酸內切酶裂解；以及b)檢測寡核苷酸探針和靶多核糖核苷酸之間的特異性結合，其中檢測到寡核苷酸探針和靶多核糖核苷酸之間雙鏈體的形成指示在靶多核糖核苷酸中特定序列的存在。在一些情況下，寡核苷酸探針連接肽，並且由Csy4核糖核酸內切酶裂解雙鏈體後，則釋放肽；在這些情況下，檢測步驟包括檢測釋放的肽。例如，通過結合對肽特異性的抗體來檢測所述釋放的肽，例如，其中抗體被固定。在一些實施方案中，靶多核糖核苷酸被固定在固體支撐物上。靶多核糖核苷酸包括多種多核苷酸的任何一種，例如，靶多核糖核苷酸可以是病原體的多核糖核苷酸。如上所示，在一些實施方案中，抗體或靶多核苷酸被固定在固體支撐物(不溶性支撐物)上。合適的不溶性支撐物包括但不限於瓊脂糖珠、磁珠、試驗條、多孔平皿等。不溶性支撐物可包括多種物質(玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈澱粉、天然和修飾的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁鐵)以及可以多種形式提供，包括例如，瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠態金屬粒子、玻璃和/或矽片以及表面、硝化纖維條帶、尼龍膜、薄片、反應盤的孔(例如，多孔板)、塑料管等。在一些實施方案中，本方法通常包括：：a)使靶多核糖核苷酸與序列特異性核糖核酸內切酶接觸；以及b)檢測通過靶多核糖核苷酸的位點特異性裂解產生的裂解片段，其中在多核糖核苷酸中特定序列處裂解後產生預期的裂解片段，則表明存在特定序列。在其他實施方案中，在檢測靶多核糖核苷酸中序列的主題方法包括：a)使靶多核糖核苷酸與以下物質接觸：i)序列特異性核糖核酸內切酶；以及ii)包含連接的檢測部分的寡核苷酸探針，其中寡核苷酸探針包含特異性、已知的核苷酸序列；其中基於在寡核苷酸探針中存在的已知核苷酸序列與靶多核糖核苷酸中互補序列的結合，寡核苷酸探針與靶多核糖核苷酸中的互補序列形成雙鏈體，以及其中序列特異性核糖核酸內切酶以序列特異性方式裂解雙鏈體，從而釋放來自寡核苷酸探針的檢測部分；以及b)檢測釋放的檢測部分，其中檢測部分的釋放指示特定序列的存在。在一些實施方案中，使用兩種或多種不同的寡核苷酸探針，各自包含不同的特異性、已知的核苷酸序列。在一些實施方案中，檢測部分是多肽。使用免疫測定(例如，酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)等)、使用對多肽檢測部分特異的抗體可檢測多肽。對多肽檢測部分特異的抗體可包含可檢測標記。可在試驗條(例如，在橫向流動測定中)或者諸如多孔板的其他合適的介質上進行免疫測定。在一些實施方案中，檢測部分是螢光蛋白，其中合適的螢光蛋白如本文所述。在其他實施方案中，檢測部分是螢光素或者螢光素酶的其他底物。合適的螢光素或其他螢光素酶底物包括例如螢光素(例如，螢火蟲螢光素)；胺基酸螢光素；腔腸素；如美國專利號7,537,912所描述的修飾的腔腸素；如美國專利公開號2009/0081129所描述的腔腸素類似物(例如，如在美國專利公開號2009/0081129中所描述的膜滲透腔腸素類似物；例如，美國專利公開號2009/0081129的結構II、III、IV、V和VI之一)；胺基酸螢光素；二氫螢光素；螢光素6′甲基醚；或者螢光素6′氯乙醚。例如，參見Branchini，B.R.等Anal.Biochem.2010，396，290-296；以及Mezzanotte，L.等Invivobioluminescenceimagingofmurinexenograftcancermodelswithared-shiftedthermostableluciferase.Mol.ImagingBiol.(2009年11月9日，在線；PubMedID：19937390)。主題檢測方法的非限制性例子示意性圖示在圖7中。在圖7示出的例子中，使結合靶多核苷酸(例如，病毒RNA)的離散區域的小寡核苷酸與靶多核苷酸接觸，其中寡核苷酸包含可檢測的部分(例如，配體、肽等)。將靶向寡核苷酸/病毒RNA雙鏈體的酶活性、序列特異性限制性核酸內切酶(RRE)加入。酶裂解寡核苷酸/病毒RNA雙鏈體；並且釋放配體用於檢測。酶進一步裂解雙鏈體，從而放大信號。使用橫向流動(例如，試驗條)或者基於免疫的測定(例如，ELISA)來測定釋放的配體。合適的序列特異性核糖核酸內切酶是酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶。適合在主題檢測方法中使用的核糖核酸內切酶包括以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸、包括酶活性多肽並且與圖4所示的胺基酸序列(Csy4胺基酸序列)具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％、或100％胺基酸序列同一性的核糖核酸內切酶。適合在主題檢測方法中使用的核糖核酸內切酶包括以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸、包括酶活性多肽並且與圖5所示的胺基酸序列(Csy4胺基酸序列)具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％胺基酸序列同一性的核糖核酸內切酶。圖5提供由各種核糖核酸內切酶特異性結合的序列。在一些情況下，合適的酶活性序列特異性Csy4核糖核酸內切酶可包含在圖5中示出的Csy4胺基酸序列的胺基酸序列。適合在主題檢測方法中使用的核糖核酸內切酶包括以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸、包括酶活性多肽並且通過1至20(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個胺基酸取代和/或插入和/或缺失而與圖4或5中任一圖中所示的胺基酸序列不同的核糖核酸內切酶。待檢測的靶多核糖核苷酸可存在於樣本中，例如生物樣本，例如血液、血液產品(例如，血漿)、尿、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液、唾液、組織、細胞等。可將靶多核糖核苷酸分離或純化。靶多核糖核苷酸可以為信使RNA(mRNA)、病毒RNA、細菌RNA、寄生蟲RNA或其他RNA種類。病毒RNA包括但不限於：黃病毒科(Flaviviridae)的任何成員，例如，C型肝炎病毒、登革病毒、黃熱病病毒、西尼羅河病毒等；逆轉錄病毒科(Retroviridae)的任何成員；免疫缺陷病毒(例如，人免疫缺陷病毒)等。待檢測的靶多核糖核苷酸可存在於多細胞生物體的細胞中(或者可從多細胞生物體的細胞中獲得)。待檢測的靶多核糖核苷酸可存在於六界中任何一種的細胞或生物體或從六界中任何一種的細胞或生物體中獲得，例如，細菌界(例如，真細菌界)；原始細菌界；原生生物界；真菌界；植物界；和動物界。靶多核糖核苷酸的合適的來源包括原生生物界的類似植物的成員，包括但不限於藻類(例如，綠藻、紅藻、灰胞藻、藍細菌)；原生生物界類似真菌的成員，例如，粘菌、水黴等；原生生物界的類似動物的成員，例如，鞭毛類(例如，眼蟲屬)、變形蟲(例如，阿米巴)、孢子蟲(例如，頂復亞門、粘原蟲門、微孢子目)和纖毛蟲(例如，草履蟲)。靶多核糖核苷酸的合適的來源包括真菌界的成員，包括但不限於以下任意門的任何成員：擔子菌亞門(珊瑚菌(clubfungi)；例如，蘑菇屬(Agaricus)、鵝膏屬(Amanita)、牛肝菌屬(Boletus)、雞油菌屬(Cantherellus)等的成員)；子囊菌亞門(Ascomycota)(子囊菌，包括例如酵母菌屬(Saccharomyces))；菌藻門(Mycophycophyta)(地衣)；接合菌門(Zygomycota)(接合菌)；以及不完全菌門(Deuteromycota)。靶多核糖核苷酸的合適的來源包括植物界的成員，包括但不限於以下任意分類的成員：苔蘚植物門(Bryophyta)(例如，蘚類)；角苔門(Anthocerotophyta)(例如，角蘚)；苔類(Hepaticophyta)(例如，地錢)；石松植物門(Lycophyta)(例如，石松類)；楔葉植物門(Sphenophyta)(例如，木賊)；裸蕨類(Psilophyta)(例如，松葉蕨)；瓶爾小草門(Ophioglossophyta)；蕨類門(Pterophyta)(例如，厥類植物)；蘇鐵門(Cycadophyta)；銀杏門(Gingkophyta)；松柏門(Pinophyta)；買麻藤門(Gnetophyta)；以及木蘭門(Magnoliophyta)(例如，顯花植物)。靶多核糖核苷酸的合適的來源包括動物界的成員，包括但不限於以下任意門的成員：多孔動物門(Porifera)(海綿動物)；扁盤動物門(Placozoa)；直泳蟲門(Orthonectida)(海洋無脊椎動物的寄生蟲)；菱形蟲門(Rhombozoa)；刺胞動物門(Cnidaria)(珊瑚、海葵、水母、海筆、海腎、海黃蜂)；櫛水母類(Ctenophora)(櫛水母)；扁形動物門(Platyhelminthes)(扁形蟲)；紐形動物門(Nemertina)(紐形動物類)；顎胃動物門(Ngathostomulida)(顎胃動物)；腹毛綱(Gastrotricha)；輪蟲綱(Rotifera)；三部蟲門(Priapulida)；動吻綱(Kinorhyncha)；鎧甲動物門(Loricifera)；棘頭動物門(Acanthocephala)；內肛動物門(Entoprocta)；線蟲門(Nemotoda)；線形蟲動物門(Nematomorpha)；環口動物門(Cycliophora)；軟體動物門(Mollusca)(軟體動物)；星蟲動物門(Sipuncula)(花生蠕蟲)；環節動物門(Annelida)(分節蠕蟲)；緩步動物門(Tardigrada)(北極熊)；有爪動物門(Onychophora)(天鵝絨蟲)；節肢動物門(Arthropoda)(包括以下亞門：有螯肢亞門(Chelicerata)、多足綱(Myriapoda)、六足綱(Hexapoda)和甲殼綱(Crustacea)，其中有螯肢亞門包括：例如，蛛形綱(arachnids)、肢口綱(Merostomata)和海蜘蛛亞門(Pycnogonida)，其中多足綱包括：例如，唇足綱(Chilopoda)(唇足類)、倍足綱(Diplopoda)(千足蟲)、少足綱(Paropoda)和綜合綱(Symphyla)，其中六足綱包括昆蟲，以及其中甲殼綱包括蝦、磷蝦、貝屬動物等)；帚蟲動物門(Phoronida)；外肛動物門(Ectoprocta)(苔蘚蟲)；腕足動物門(Brachiopoda)；棘皮動物門(Echinodermata)(例如海星、海菊花、毛頭星、海膽、海參、海蛇尾、brittlebaskets等)；毛顎動物門(Chaetognatha)(矢蟲)；半索動物門(Hemichordata)(囊舌蟲)；以及脊索動物門(Chordata)。脊索動物門的合適的成員包括以下亞門的任何成員：尾索動物(Urochordata)(海鞘；包括海鞘綱(Ascidiacea)、海樽綱(Thaliacea)和幼形綱(Larvacea))；頭索亞門(Cephalochordata)(文昌魚)；盲鰻綱(Myxini)(粘盲鰻)；以及脊椎動物門(Vertebrata)，其中脊椎動物門的成員包括：例如，七鰓鰻綱(Petromyzontida)(七鰓鰻)、軟骨魚綱(Chondrichthyces)(軟骨魚)、輻鰭亞綱(Actinopterygii)(輻鰭魚)、Actinista(空棘魚亞目)、肺魚綱(Dipnoi)(肺魚)、爬行綱(Reptilia)(爬行類，例如蛇、短吻鱷、鱷魚、蜥蜴等)、鳥綱(Aves)(鳥)和哺乳綱(哺乳動物)的成員。合適的植物包括任何單子葉植物和任何雙子葉植物。因此，例如，靶多核糖核苷酸可存在於來自生物體的細胞或從來自生物體的細胞獲得，該生物體包括但不限於：原生動物、植物、真菌、藻類細胞、酵母、爬行動物、兩棲動物、哺乳動物、海洋微生物、海洋無脊椎動物、節肢動物、等足類動物、昆蟲、蛛形綱動物、古生細菌以及真細菌。靶多核糖核苷酸可以存在於非人胚胎中或由非人胚胎獲得，例如果蠅(Drosophila)胚胎、斑馬魚胚胎、小鼠胚胎等。靶多核糖核苷酸可以存在於幹細胞中或由幹細胞獲得，例如，體外幹細胞、非人幹細胞等。合適的幹細胞包括胚胎幹細胞、成體幹細胞和誘發多能性幹(iPS)細胞。在一些實施方案中，將靶多核糖核苷酸從生物體中取得的組織、從生物體中分離的特定細胞或細胞組等中分離。例如，在生物體是植物的情況下，在一些實施方案中，靶多核糖核苷酸將從木質部、韌皮部、形成層、葉、根等中分離。在生物體是動物的情況下，在一些實施方案中，靶多核糖核苷酸將從特定組織(例如，肺、肝臟、心臟、腎臟、腦、脾臟、皮膚、胎兒組織等)或特定細胞類型(例如，神經細胞、上皮細胞、內皮細胞、星形細胞、巨噬細胞、膠質細胞、胰島細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等)中分離。調節靶RNA生成的方法本公開提供調節細胞中靶RNA生成的方法。本方法通常包括使遺傳修飾的宿主細胞與活化誘導型啟動子的試劑接觸，其中遺傳修飾的宿主細胞被重組表達載體遺傳修飾，該重組表達載體包含編碼酶的核苷酸序列，該酶催化底物多核糖核苷酸中序列特異性裂解位點處的裂解，其中編碼酶的核苷酸序列可操作連接至誘導型啟動子，並且其中活化誘導型啟動子後，酶在細胞中生成並且從前體RNA中裂解所述靶RNA。圖10提供調節靶RNA生成的示例性方法的示意性說明。在圖10中，內源性靶RNA被修飾以在3′非翻譯區(3′UTR)中包括Csy4RNA底物(例如，GUUCACUGCCGUAUAGGCAG(SEQIDNO：103)；或者SEQIDNO：1)。在宿主細胞中Cys4表達導致RNA底物的結合和裂解。裂解的RNA現缺乏其polyA尾且將被降解。例如，在一些實施方案中，本公開提供調節真核細胞中靶RNA的生成的方法，其中該方法包括使遺傳修飾的宿主細胞與活化誘導型啟動子的試劑接觸，其中遺傳修飾的宿主細胞被重組表達載體遺傳修飾，該重組表達載體包含編碼酶活性序列特異性Csy4核糖核酸內切酶的核苷酸序列，該酶活性序列特異性Csy4核糖核酸內切酶催化在底物多核糖核苷酸中序列特異性裂解位點處的裂解，其中編碼酶的核苷酸序列可操作連接至誘導型啟動子，並且其中活化所述誘導型啟動子後，酶在所述細胞中生成並且從前體RNA中裂解所述靶RNA。在一些情況下，靶RNA種類是調控RNA。在一些情況下，從前體RNA中裂解靶RNA使前體RNA失活。合適的序列特異性核糖核酸內切酶是酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶。適合在調節靶RNA生成的主題方法中使用的核糖核酸內切酶包括以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸、包括酶活性多肽並且與圖4中所示的胺基酸序列(Csy4胺基酸序列)具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％胺基酸序列同一性的核糖核酸內切酶。適合在調節靶RNA生成的主題方法中使用的核糖核酸內切酶包括以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸、包括酶活性多肽並且與圖5所示的胺基酸序列(Csy4胺基酸序列)具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％胺基酸序列同一性的核糖核酸內切酶。圖5提供由各種核糖核酸內切酶特異性結合的序列。適合在調節靶RNA生成的主題方法中使用的核糖核酸內切酶包括以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸、包括酶活性多肽並且通過1至20(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20)個胺基酸取代和/或插入和/或缺失而與圖4或5中任一圖中所示的胺基酸序列不同的核糖核酸內切酶。合適的誘導型啟動子可包括在真核細胞中發揮功能的啟動子。合適的誘導型啟動子是本領域已知的。例如，合適的誘導型啟動子包括但不限於：GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHO5啟動子、CUP1啟動子、GAL7啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子和AOX1。合適的誘導型啟動子包括四環素-誘導型啟動子；金屬硫蛋白啟動子；四環素-誘導型啟動子；甲硫氨酸-誘導型啟動子；以及半乳糖-誘導型啟動子，這些啟動子是本領域熟知的。其他合適的啟動子包括ADH2乙醇脫氫酶啟動子(在葡萄糖中被抑制；當葡萄糖耗盡並且產生乙醇時被誘導)以及CUP1金屬硫蛋白啟動子(在Cu2+、Zn2+的存在下誘導)。誘導任何給定誘導型啟動子的試劑是本領域已知的。例如，通過四環素或強力黴素可調節四環素-可調控的啟動子；糖類可用於誘導糖類-誘導型啟動子(例如，用於半乳糖-誘導型啟動子的半乳糖)；甲硫氨酸可用於誘導甲硫氨酸-誘導型啟動子；金屬可用於誘導金屬硫蛋白啟動子。靶RNA可以為調控RNA。調節RNA是本領域熟知的並且包括例如微-RNA、短髮夾RNA(shRNAs)等。在一些實施方案中，來自前體RNA的靶RNA的裂解使前體RNA失活。遺傳修飾的宿主細胞可以為體外細胞，例如，原核細胞或真核細胞(例如，哺乳動物細胞，包括原生細胞、轉化細胞系等)。遺傳修飾的宿主細胞可以為體內細胞。在一些實施方案中，體內細胞是非人細胞。遺傳修飾的宿主細胞可以為多細胞生物體的細胞(或可由多細胞生物體的細胞獲得)。遺傳修飾的宿主細胞可以是由六界中任一種的生物體中獲得或者存在於六界中任一的生物體中的細胞，例如，細菌界(例如，真細菌界)；原始細菌；原生生物界；真菌界；植物界；和動物界。合適的生物體包括原生生物界的類似植物的成員，包括但不限於藻類(例如，綠藻、紅藻、灰胞藻、藍細菌)；原生生物界的類似真菌的成員，例如，粘菌、水黴等；原生生物界的類似動物的成員，例如，鞭毛類(例如，眼蟲屬)、變形蟲(例如，阿米巴)、孢子蟲(例如，頂復亞門、粘原蟲門、微孢子目)和纖毛蟲(例如，草履蟲)。合適的生物體包括真菌界的成員，包括但不限於以下任意門的成員：擔子菌亞門(珊瑚菌；例如，蘑菇屬、鵝膏屬、牛肝菌屬、雞油菌屬等的成員)；子囊菌亞門(子囊菌，包括例如，酵母菌屬)；菌藻門(地衣)；接合菌門(接合菌)；以及不完全菌門。合適的生物體包括植物界的成員，包括但不限於以下任意分類的成員：苔蘚植物門(例如，蘚類)；角苔門(例如，角蘚)；苔類(Hepaticophyta)(例如，地錢)；石松植物門(例如，石松類)；楔葉植物門(例如，木賊)；裸蕨類(例如，松葉蕨)；瓶爾小草門；蕨類門(例如，厥類植物)；蘇鐵門；銀杏門(Gingkophyta)；松柏門；買麻藤門；和木蘭門(例如，顯花植物)。合適的生物體包括動物界的成員，包括但不限於以下任意門的成員：多孔動物門(海綿動物)；扁盤動物門；直泳蟲門(海洋無脊椎動物的寄生蟲)；菱形蟲門；刺胞動物門(珊瑚、海葵、水母、海筆、海腎、海黃蜂)；櫛水母類(櫛水母)；扁形動物門(扁形蟲)；紐形動物門(紐蟲)；顎胃動物門(顎胃動物)；腹毛綱；輪蟲綱；三部蟲門；動吻綱；鎧甲動物門；棘頭動物門；內肛動物門；線蟲門；線形蟲動物門；環口動物門；軟體動物門(軟體動物)；星蟲動物門(花生蠕蟲)；環節動物門(分節蠕蟲)；緩步動物門(北極熊)；有爪動物門(天鵝絨蟲)；節肢動物門(包括以下亞門：有螯肢亞門、多足綱、六足綱和甲殼綱，其中有螯肢亞門包括：例如，蛛形綱、肢口綱和海蜘蛛亞門；其中多足綱包括：例如，唇足綱(唇足類)、倍足綱(千足蟲)、少足綱和綜合綱；其中六足綱包括昆蟲，以及其中甲殼綱包括蝦、磷蝦、貝屬動物等)；帚蟲動物門；外肛動物門(苔蘚蟲)；腕足動物門；棘皮動物門(例如海星、海菊花、毛頭星、海膽、海參、海蛇尾、brittlebaskets等)；毛顎動物門(矢蟲)；半索動物門(囊舌蟲)；以及脊索動物門。脊索動物門的合適的成員包括以下亞門的任何成員：尾索動物(海鞘；包括海鞘綱、海樽綱和幼形綱)；頭索亞門(文昌魚)；盲鰻綱(粘盲鰻)；以及脊椎動物門，其中脊椎動物門的成員包括：例如，七鰓鰻綱(七鰓鰻)、軟骨魚綱(軟骨魚)、輻鰭亞綱(輻鰭魚)、Actinista(空棘魚亞目)、肺魚綱(肺魚)、爬行綱(爬行類，例如蛇、短吻鱷、鱷魚、蜥蜴等)、鳥綱(鳥)和哺乳綱(哺乳動物)的成員。合適的植物包括任何單子葉植物和任何雙子葉植物。因此，例如，遺傳修飾的宿主細胞可以是由以下獲得或存在於以下中的細胞：原生動物、植物、真菌、藻類細胞、酵母、爬行動物、兩棲動物、哺乳動物、海洋微生物、海洋無脊椎動物、節肢動物、等足類動物、昆蟲、蛛形綱動物、古生細菌以及真細菌。合適的哺乳動物細胞包括原生細胞和無限增殖化細胞系。合適的哺乳動物細胞系包括人細胞系、非人靈長類細胞系、嚙齒類(例如，小鼠、大鼠)細胞系等。合適的哺乳動物細胞系包括但不限於：海拉細胞(例如，美國模式培養物保藏所(ATCC)編號CCL-2)、CHO細胞(例如，ATCC編號CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例如，ATCC編號CRL-1573)、Vero細胞、NIH3T3細胞(例如，ATCC編號CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如，ATCC編號CCL10)、PC12細胞(ATCC編號CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC編號CRL1651)、RATI細胞、小鼠L細胞(ATCC編號CCLI.3)、人胚胎腎(HEK)細胞(ATCC編號CRL1573)、HLHepG2細胞等。遺傳修飾的宿主細胞可以是由非人胚胎獲得或存在於非人胚胎中的細胞，例如，果蠅胚胎；斑馬魚胚胎；小鼠胚胎等。遺傳修飾的宿主細胞可以為幹細胞，例如，體外幹細胞；非人幹細胞等。合適的幹細胞包括胚胎幹細胞、成體幹細胞和誘發多能性幹(iPS)細胞。分離靶核酸的方法本公開提供從核酸的混合群中分離靶核酸的方法。本方法通常包括：a)使核酸的混合群與固定的序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶接觸，其中核酸的混合群包括靶核酸，該靶核酸包含由固定的序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶特異性結合的「標記」(或「識別」)核苷酸序列，使得包含標記核苷酸序列(「標記的靶核酸」)的靶核酸結合固定的序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶，形成標記的靶核酸/固定的序列特異性、酶活性核糖核酸內切酶複合物，其中接觸步驟發生在液體溶液(「結合溶液」)中；以及b)將咪唑加入液體溶液至約100mM至約500mM的最終濃度(例如，約100mM至約150mM、約150mM至約200mM、約200mM至約250mM、約250mM至約300mM、約300mM至約350mM、約350mM至約400mM、約400mM至約450mM或約450mM至約500mM)，從而形成酶再活化無酶活性核糖核酸內切酶的再活化溶液，使得核糖核酸內切酶變得具有酶活性並且從「標記」核苷酸序列中裂解靶核酸，從而釋放靶核酸。圖9是用於分離靶RNA的主題方法的示例性實施方案示意圖。本方法可進一步包括一個或多個洗滌步驟。例如，在步驟(a)之後以及在步驟(b)之前，可使用結合溶液將包含結合的靶核酸的固定的序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶洗滌一次或多次，該結合的靶核酸包含「標記」核苷酸序列，使得靶核酸保持與序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶結合，並且將任何未結合的核酸洗滌掉。核酸的混合群可包括RNA和DNA。靶核酸是包含由序列特異性核糖核酸內切酶來特異性結合的「標記」」或「識別」核苷酸序列的RNA。在其無酶活性狀態(「未誘導的」狀態)下，核糖核酸內切酶可結合、但不可裂解標記的靶RNA。在其酶活性狀態(「誘導的」狀態)下(例如，在約100mM至約500mM的濃度的咪唑存在下)，核糖核酸內切酶可結合和裂解標記的靶核酸中的識別核苷酸序列，從而從標記中釋放靶核酸。結合溶液可包括緩衝劑和鹽；但沒有咪唑。再活化溶液可包括最終濃度為約100mM至約500mM(例如，約100mM至約150mM、約150mM至約200mM、約250mM至約350mM、約350mM至約400mM或約400mM至約500mM)的咪唑。咪唑的存在再活化序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶，使得核糖核酸內切酶變得具有酶活性，例如，核糖核酸內切酶表現出至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％或大於95％的野生型序列特異性核糖核酸內切酶(例如，如圖5中所示的胺基酸序列(例如，SEQIDNO：6、8、或9))。如一個非限制性例子中，序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶是Csy4的H29A突變體(如下所描述；以及如在圖6中所示)；如上所述，使Csy4(H29A)突變體與咪唑接觸；再活化核糖核酸內切酶，使得它能夠以序列特異性方式裂解靶核糖核酸中的識別序列。也適合使用的是Csy4的H29A、S50C雙重突變體(如下所描述)。在一些實施方案中，「標記」或識別序列包含核苷酸序列5′-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3′(SEQIDNO：1)。使用標準重組方法可將「標記」或「識別」核苷酸序列引入核酸。因此，標記的靶核酸將包括酶裂解的標記，從而釋放靶核酸。在一些實施方案中，標記的靶核酸(RNA)將具有結合至其的一個或多個多肽。具有結合至其的一個或多個多肽的標記的靶RNA在本文中稱為RNA蛋白複合物。因此，在一些實施方案中，使用主題方法分離的靶RNA是RNA蛋白複合物。在一些實施方案中，主題方法可進一步包括分析結合至分離的靶RNA的多肽。主題方法提供分離靶RNA(或RNA蛋白複合物)。在一些實施方案中，主題方法提供純化靶RNA(或RNA蛋白複合物)，使得靶RNA(或RNA蛋白複合物)至少約50％純、至少約60％純、至少約70％純、至少約80％純、至少約90％純、至少約95％純、至少約98％純或大於98％純。在一些實施方案中，在靶RNA/蛋白複合物中結合靶RNA的蛋白質可從RNA/蛋白複合物中洗脫。通過例如測序、酶消化、功能測定等可進一步對洗脫的蛋白質進行表徵。核酸的混合群可存在於細胞裂解物中。例如，將包含編碼標記的靶RNA的核苷酸序列的表達載體引入細胞(例如，體外或體內)，使得細胞合成標記的靶RNA。從細胞中產生裂解物，並且將裂解物(任選地經過一個或多個步驟以使富集核酸)施加至固定的序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶。可將序列特異性、無酶活性的核糖核酸內切酶固定在多種不溶性支撐物的任何一種上。合適的不溶性支撐物包括但不限於瓊脂糖珠、磁珠、試驗條、多孔平皿等。不溶性支撐物可包括各種物質(玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈澱粉、天然和修飾的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁鐵)以及可以各種形式來提供，包括例如，瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠態金屬粒子、玻璃和/或矽片以及表面、硝化纖維條帶、尼龍膜、薄片、反應盤的孔(例如，多孔板)、塑料管等。本公開也提供分離結合靶RNA的多肽的方法，其中該方法包括：a)使固定的複合物與液體溶液接觸，該液體溶液包含結合靶RNA的多肽，其中固定的複合物包含變體Csy4核糖核酸內切酶和標記的靶RNA，該標記的靶RNA包含由變體Csy4核糖核酸內切酶特異性結合的識別核苷酸序列，其中所述接觸導致多肽與靶RNA結合，其中所述接觸在沒有咪唑的結合溶液中進行；以及b)洗脫結合的多肽。核糖核酸內切酶本公開提供序列特異性核糖核酸內切酶。在一些實施方案中，本公開提供結合靶多核糖核苷酸中的識別序列，但不裂解靶多核糖核苷酸的序列特異性核糖核酸內切酶，即，序列特異性核糖核酸內切酶無水解靶多核糖核苷酸的酶活性。在一些實施方案中，本公開提供結合靶多核糖核苷酸中的識別序列，並且裂解在識別序列內或靠近識別序列的靶多核糖核苷酸的序列特異性核糖核酸內切酶，即，序列特異性核糖核酸內切酶具有水解靶多核糖核苷酸的酶活性。在一些實施方案中，將主題序列特異性核糖核酸內切酶固定在不溶性底物上。合適的不溶性底物包括但不限於瓊脂糖珠、磁珠、試驗條、多孔平皿等。不溶性底物可包括多種物質(玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈澱粉、天然和修飾的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁鐵)並且可以各種形式來提供，包括例如，瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠態金屬粒子、玻璃和/或矽片以及表面、硝化纖維條帶、尼龍膜、薄片、反應盤的孔(例如，多孔板)、塑料管等。無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶本公開提供無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶，其中無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶以序列特異性方式結合多核糖核苷酸中的靶序列。主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶以序列特異性方式結合靶多核糖核苷酸，但不裂解靶多核糖核苷酸。如上所述，主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶用於從核酸的混合群中分離靶RNA。在一些實施方案中，與天然存在的酶活性Csy4、CasE或Cas6多肽相比，主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶包含一個或多個胺基酸取代。在一些實施方案中，主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶包含在Csy4多肽的His-29處或在CasE或者Cas6多肽的等同位置處的胺基酸取代。在一些實施方案中，主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶包含在Csy4多肽的Ser-148處或者在CasE或者Cas6多肽的等同位置處的胺基酸取代。圖6示出合適的無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶胺基酸序列的非限制性例子。在一些實施方案中，主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶包含與圖6示出的胺基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％胺基酸序列同一性的胺基酸序列，其中胺基酸序列包括在His-29、Ser-50或者His-29和Ser-50處的取代。例如，變體Csy4核糖核酸內切酶可包括H29A(His-29至Ala-29)取代、S50C(Ser-50至Cys-50)取代或者H29A和S50C取代。在一些實施方案中，主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶是變體Csy4核糖核酸內切酶。在一些情況下，主題變體Csy4核糖核酸內切酶包含與圖6所示的胺基酸序列具有至少約95％胺基酸序列同一性的胺基酸序列，其中核糖核酸內切酶包含在His-29處的胺基酸取代，其中在缺乏咪唑時，變體Csy4核糖核酸內切酶無酶活性，並且其中在咪唑存在下，變體Csy4核糖核酸內切酶可活化。在一些例子中，胺基酸取代是His29至Ala29取代。在一些情況下，變體Csy4核糖核酸內切酶也包括Ser-50取代。在一些例子中，主題變體Csy4核糖核酸內切酶結合包含核苷酸序列5′-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3′(SEQIDNO：1)的RNA底物。主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶是「有條件地」無酶活性，例如，在沒有咪唑下，主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題變體Csy4核糖核酸內切酶)無酶活性；以及通過咪唑可活化無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題變體Csy4核糖核酸內切酶)。例如，通過使核糖核酸內切酶與濃度為約100mM至約500mM的咪唑接觸可酶促活化無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題變體Csy4核糖核酸內切酶)。咪唑(例如，濃度範圍為約100mM至約500mM)的存在再活化序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶，使得核糖核酸內切酶變得具有酶活性，例如，核糖核酸內切酶表現出至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％或大於95％的野生型序列特異性核糖核酸內切酶(例如，如圖5所示的胺基酸序列(例如，SEQIDNO：6、8、或9))。在一些實施方案中，主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題變體Csy4核糖核酸內切酶)包含可檢測標記，該可檢測標記包括提供可檢測信號的部分。合適的可檢測標記和/或提供可檢測信號的部分包括但不限於：酶、放射性同位素、FRET對的成員、特異性結合對的成員、螢光團、螢光蛋白、量子點等。適合使用的FRET對(供體/受體)包括但不限於：EDANS/螢光素、IAEDANS/螢光素、螢光素/四甲基若丹明、螢光素/Cy5、IEDANS/DABCYL、螢光素/QSY-7、螢光素/LCRed640、螢光素/Cy5.5和螢光素/LCRed705。此外，可使用螢光團/量子點供體/受體對。合適的螢光團(「螢光標記」)包括通過它的固有螢光性能可被檢測的任何分子，其包括激發後即可檢測的螢光。合適的螢光標記包括但不限於：螢光素、若丹明、四甲基若丹明、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠、芪、螢光黃、CascadeBlueTM、TexasRed、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LCRed640、Cy5、Cy5.5、LCRed705和OregonGreen。合適的光學染料描述在2002年MolecularProbesHandbook，第9版，RichardP.Haugland中，其以引用方式明確併入。合適的酶包括但不限於辣根過氧化物酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶等。合適的螢光蛋白包括但不限於綠色螢光蛋白(GFP)，例如，如美國專利號6,066,476；6,020,192；5,985,577；5,976,796；5,968,750；5,968,738；5,958,713；5,919,445；5,874,304中所描述的來自維多利亞多管發光水母(Aequoriavictoria)或者其突變體或衍生物的GFP；紅色螢光蛋白；黃色螢光蛋白；如Matz等(1999)NatureBiotechnol.17：969-973描述的來自珊瑚蟲種類的多種螢光和有色蛋白的任一種等。合適的納米粒子包括例如量子點(QD)、螢光或冷光納米粒子和磁納米粒子。可檢測納米粒子的任意光學或磁性能或特徵。QD和它們的合成方法是本領域熟知的(參見，例如，美國專利號6,322,901；6,576,291；和6,815,064)。通過施加包含多種不同材料的塗層可使QD為水溶性的(參見，例如，美國專利號6,423,551；6,251,303；6,319,426；6,426,513；6,444,143；和6,649,138)。例如，使用兩性聚合物來溶解QD。已經使用的示例性聚合物包括經辛胺修飾的低分子量聚丙烯酸、由聚乙二醇(PEG)衍生的磷脂、聚酐、嵌段共聚物等。通過大量不同官能團或連接劑中的任何一種可使QD與多肽綴合，所述官能團或連接劑可直接或間接連接塗層(參見，例如，美國專利號5,990,479；6,207,392；6,251,303；6,306,610；6,325,144；和6,423,551)。具有多種吸收和發射光譜的QD可從例如QuantumDotCorp.(HaywardCalif.；現屬於Invitrogen)或者從EvidentTechnologies(Troy，N.Y.)商購。例如，可獲得峰值發射波長為約525、535、545、565、585、605、655、705和800nm的QD。因此，QD可具有穿過光譜的可見部分並且在一些情況下甚至超過的一系列不同顏色。合適的放射性同位素包括但不限於14C、3H、32P、33P、35S、1251和131I。用作標記的放射性同位素的使用是本領域熟知的。在一些實施方案中，將主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題變體Csy4核糖核酸內切酶)固定在不溶性底物上。合適的不溶性底物包括但不限於瓊脂糖珠、磁珠、試驗條、多孔平皿等。不溶性底物可包括多種物質(玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈澱粉、天然和修飾的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁鐵)並且可以各種形式來提供，包括例如，瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠態金屬粒子、玻璃和/或矽片以及表面、硝化纖維條帶、尼龍膜、薄片、反應盤的孔(例如，多孔板)、塑料管等。在一些實施方案中，將主題無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題變體Csy4核糖核酸內切酶)純化至例如，至少80％純、至少85％純、至少90％純、至少95％純、至少98％純、至少99％純或大於99％純。組合物本公開提供包含主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶的組合物。除主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶之外，主題組合物可包含以下一種或多種：鹽，例如NaCl、MgCl、KCl、MgSO4等；緩衝劑，例如，Tris緩衝劑、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶劑；去汙劑，例如非離子去汙劑，例如Tween-20等；蛋白酶抑制劑等。酶活性序列特異性核糖核酸內切酶在一些實施方案中，主題酶活性序列特異性核糖核酸內切酶包含提供檢測的部分。例如，主題酶活性序列特異性核糖核酸內切酶可包含提供檢測的共價或非共價連接的部分。合適的可檢測標記包括通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法可檢測的任何組合物。提供檢測的部分包括但不限於：螢光分子；量子點；酶(不是核糖核酸內切酶)，其中酶催化底物轉化至可檢測的產物，其中產物可直接檢測；納米粒子等。可連接至主題酶活性序列特異性核糖核酸內切酶的合適的螢光蛋白包括但不限於：綠色螢光蛋白(GFP)，例如美國專利號6,066,476；6,020,192；5,985,577；5,976,796；5,968,750；5,968,738；5,958,713；5,919,445；5,874,304中所描述的來自維多利亞多管發光水母或者其突變體或衍生物的GFP；紅色螢光蛋白；黃色螢光蛋白；如Matz等(1999)NatureBiotechnol.17：969-973描述的來自珊瑚蟲種類的多種螢光和有色蛋白的任一種等。合適的納米粒子包括例如量子點(QD)；螢光或冷光納米粒子；和磁納米粒子。可檢測納米粒子的任何光學或磁性能或特徵。QD和它們合成的方法是本領域熟知的(參見，例如，美國專利號6,322,901；6,576,291；和6,815,064)。通過施加包含多在不同材料的塗層可使QD溶於水中(參見，例如，美國專利號6,423,551；6,251,303；6,319,426；6,426,513；6,444,143；和6,649,138)。例如，使用兩性聚合物來溶解QD。已經使用的示例性聚合物包括經辛胺修飾的低分子量聚丙烯酸、由聚乙二醇(PEG)衍生的磷脂、聚酐、嵌段共聚物等。通過大量不同官能團或連接劑中的任何一種可使QD與多肽綴合，該官能團或連接劑可直接或間接連接塗層(參見，例如，美國專利號5,990,479；6,207,392；6,251,303；6,306,610；6,325,144；和6,423,551)。具有多種吸收和發射光譜的QD可從例如QuantumDotCorp.(HaywardCalif.；現屬於Invitrogen)或者從EvidentTechnologies(Troy，N.Y.)商購。例如，可獲得峰值發射波長為約525、535、545、565、585、605、655、705和800nm的QD。因此，QD可具有穿過光譜的可見部分以及在一些情況下甚至超過的一系列不同顏色。在一些實施方案中，將主題酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶純化至例如，至少80％純、至少85％純、至少90％純、至少95％純、至少98％純、至少99％純或大於99％純。組合物本公開提供包含主題序列特異性、酶活性核糖核酸內切酶的組合物。除主題序列特異性、酶活性核糖核酸內切酶之外，主題組合物可包含以下一種或多種：鹽，例如NaCl、MgCl、KCl、MgSO4等；緩衝劑，例如，Tris緩衝劑、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶劑；去汙劑，例如非離子去汙劑，例如Tween-20等；蛋白酶抑制劑等。本公開提供包含主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶(例如，主題變體Csy4核糖核酸內切酶)的組合物。除主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶(例如，主題變體Csy4核糖核酸內切酶)之外，主題組合物可包含以下一種或多種：鹽，例如NaCl、MgCl、KCl、MgSO4等；緩衝劑，例如，Tris緩衝劑、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶劑；去汙劑，例如非離子去汙劑，例如Tween-20等；蛋白酶抑制劑等。在一些實施方案中，組合物沒有咪唑。在一些實施方案中，組合物包含濃度為約100mM至約500mM的咪唑。製備主題序列特異性核糖核酸內切酶的方法通過任何已知方法，例如，用於蛋白質合成的常規合成方法；重組DNA方法等可製備主題序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題序列特異性酶活性、核糖核酸內切酶；主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶)。在化學合成主題序列特異性核糖核酸內切酶的情況下，可通過液相或固相來進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中序列的C-末端胺基酸附接不溶性支撐物，隨後連續加入序列中的其餘胺基酸)是化學合成主題序列特異性核糖核酸內切酶的合適的方法的例子。可使用用於合成主題序列特異性核糖核酸內切酶的SPPS的各種形式，諸如Fmoc和Boc。用於固相合成的技術描述在Barany和Merrifield，Solid-PhasePeptideSynthesis；第3-284頁，在Peptides：Analysis，Synthesis，Biology.第2卷：SpecialMethodsinPeptideSynthesis，PartA.；Merrifield，等J.Am.Chem.Soc，85：2149-2156(1963)；Stewart等，SolidPhasePeptideSynthesis，第2版，PierceChem.Co.，Rockford，111.(1984)；以及GanesanA.2006MiniRev.MedChem.6：3-10和CamareroJA等2005ProteinPeptLett.12：723-8中。標準重組方法可用於製備主題序列特異性核糖核酸內切酶。例如，將編碼主題序列特異性核糖核酸內切酶的核酸插入表達載體內。編碼主題序列特異性核糖核酸內切酶的DNA片段可操作連接至確保編碼的多肽的表達的表達載體中的控制序列。表達控制序列包括但不限於：啟動子(例如，天然相關的或異源性啟動子)、信號序列、增強子元件以及轉錄終止序列。表達控制序列可以是能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如，COS或CHO細胞)的載體中的真核啟動子體系。一旦載體已經合併至恰當的宿主內，則將宿主保持在適合核苷酸序列的高水平表達的條件下，並且收集和純化核糖核酸內切酶。核酸和宿主細胞本公開提供包含編碼主題序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題序列特異性、酶活性核糖核酸內切酶；主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶)的核苷酸序列的核酸。在一些實施方案中，核酸是表達載體，其中表達載體可提供例如在細胞中產生序列特異性核糖核酸內切酶。編碼主題序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題序列特異性、酶活性核糖核酸內切酶；主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶)的核苷酸序列可操作連接至一個或多個調控元件，例如啟動子和增強子，該一個或多個調節元件使核苷酸序列在預期靶細胞(例如，經遺傳修飾以合成編碼的核糖核酸內切酶的細胞)中表達。在一些實施方案中，主題核酸包含編碼具有與圖4或圖5所示的胺基酸序列至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％的多肽的核苷酸序列。在一些實施方案中，如上所述，主題核酸包含編碼變體Csy4多肽的核苷酸序列。編碼主題序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題序列特異性、酶活性核糖核酸內切酶；主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶)的核苷酸序列可操作連接至轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子等)。合適的啟動子和增強子元件是本領域已知的。對於在細菌細胞中表達，合適的啟動子包括但不限於：lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。對於在真核細胞中表達，合適的啟動子包括但不限於：巨細胞病毒早期瞬時啟動子(cytomegalovirusimmediateearlypromoter)；單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；早期和晚期SV40啟動子；逆轉錄病毒的長末端重複序列中存在的啟動子；小鼠金屬硫蛋白-I啟動子；以及各種本領域已知組織特異性啟動子。在一些實施方案中，例如，對於在酵母細胞中表達，合適的啟動子是組成型啟動子，例如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子等；或者調控型啟動子，例如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHO5啟動子、CUP1啟動子、GAL7啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子以及AOX1(例如，畢赤酵母屬(Pichia)中使用)。恰當的載體和啟動子的選擇正好在本領域普通技術的水平範圍內。在原核宿主細胞中使用的適合的啟動子包括但不限於：噬菌體T7RNA聚合酶啟動子；trp啟動子；lac操縱子啟動子；雜合啟動子，例如，lac/tac雜合啟動子、tac/trc雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子；trc啟動子；tac啟動子等；araBAD啟動子；體內調控啟動子，例如ssaG啟動子或相關的啟動子(參見，例如，美國專利公開號20040131637)；pagC啟動子(Pulkkinen和Miller，J.Bacteriol，1991：173(1)：86-93；Alpuche-Aranda等，PNAS，1992；89(21)：10079-83)；nirB啟動子(Harborne等(1992)Mol.Micro.6：2805-2813)等(參見，例如，Dunstan等(1999)Infect.Immun.67：5133-5141；McKelvie等(2004)Vaccine22：3243-3255；以及Chatfield等(1992)Biotechnol.10：888-892)；sigma70啟動子，例如，共有sigma70啟動子(參見，例如，GenBank登記號AX798980、AX798961和AX798183)；固定相啟動子，例如，dps啟動、spv啟動子等；由致病島SPI-2衍生的啟動子(參見，例如，W096/17951)；actA啟動子(參見，例如，Shetron-Rama等(2002)Infect.Immun.70：1087-1096)；rpsM啟動子(參見，例如，Valdivia和Falkow(1996).Mol.Microbiol.22：367)；tet啟動子(參見，例如，Hillen，W.和Wissmann，A.(1989)，由Saenger，W.和Heinemann，U.(編著)，TopicsinMolecularandStructuralBiology，Protein-NucleicacidInteraction.Macmillan，London，UK，第10卷，第143-162頁)；SP6啟動子(參見，例如，Melton等(1984)Nucl.AcidsRes.12：7035)等。在諸如大腸桿菌的原核細胞生物中使用的合適的強啟動子包括但不限於：Trc、Tac、T5、T7和Pλ。在細菌宿主細胞中使用的操縱基因的非限制性例子包括乳糖啟動子操縱基因(當與乳糖接觸時，LacI阻遏蛋白改變構象，從而防止LacI阻遏蛋白結合操縱基因)、色氨酸啟動子操縱基因(當與色氨酸複合時，TrpR阻遏蛋白具有結合操縱基因的構象；沒有色氨酸時，TrpR阻遏蛋白具有未結合操縱基因的構象)以及tac啟動子操縱基因(參見，例如，deBoer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。編碼主題序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題序列特異性、酶活性核糖核酸內切酶；主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶)的核苷酸序列可存在於表達載體和/或克隆載體中。表達載體可包括可選擇標誌、複製起點以及提供複製和/或維持載體的其他特徵。大量合適的載體和啟動子是本領域技術人員已知的；許多可商購用於產生主題重組構建體。以例子方式提供以下載體。細菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescriptSK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，LaJolla，Calif.，USA)、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。表達載體通常具有位於靠近啟動子序列的便利限制位點以提供插入編碼異源性蛋白質的核酸序列。可存在在表達宿主中可操作的可選擇標誌。合適的表達載體包括但不限於：病毒載體(例如基於以下的病毒載體：牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；腺病毒(參見，例如，Li等，InvestOpthalmolVisSci35：25432549，1994；Borras等，GeneTher6：515524，1999；Li和Davidson，PNAS92：77007704，1995；Sakamoto等，HGeneTher5：10881097，1999；WO94/12649；WO93/03769；WO93/1919l；WO94/28938；WO95/11984和WO95/00655)；腺伴隨病毒(參見，例如，Ali等，HumGeneTher9：8186，1998，Flannery等，PNAS94：69166921，1997；Bennett等，InvestOpthalmolVisSci38：28572863，1997；Jomary等，GeneTher4：683690，1997；Rolling等，HumGeneTher10：641648，1999；Ali等，HumMolGenet5：591594，1996；Srivastava的WO93/09239；Samulski等，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等，Virol.(1988)166：154-165；以及Flotte等，PNAS(1993)90：10613-10617)；SV40；單純皰疹病毒；人免疫缺陷病毒(參見，例如，Miyoshi等，PNAS94：1031923，1997；Takahashi等，JVirol73：78127816，1999))；逆轉錄病毒載體(例如，鼠白血病病毒；脾壞死病毒；以及由諸如勞氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus)、哈維肉瘤病毒(HarveySarcomaVirus)、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒的逆轉錄病毒衍生的載體)等。本公開提供分離的遺傳修飾的宿主細胞(例如，體外細胞)，該宿主細胞經主題核酸遺傳修飾。在一些實施方案中，主題分離的遺傳修飾的宿主細胞可產生主題序列特異性核糖核酸內切酶(例如，主題序列特異性、酶活性核糖核酸內切酶；主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶)。合適的宿主細胞包括真核宿主細胞，諸如哺乳動物細胞、昆蟲宿主細胞、酵母細胞；和原核細胞，諸如細菌細胞。例如通過磷酸鈣沉澱、DEAE葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染、電穿孔或其他已知方法可將主題核酸引入宿主細胞。合適的哺乳動物細胞包括原生細胞和無限增殖化細胞系。合適的哺乳動物細胞系包括人細胞系、非人靈長類細胞系、嚙齒類(例如，小鼠、大鼠)細胞系等。合適的哺乳動物細胞系包括但不限於：HeLa細胞(例如，美國模式培養物保藏所(ATCC)編號CCL-2)、CHO細胞(例如，ATCC編號CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例如，ATCC編號CRL-1573)、Vero細胞、NIH3T3細胞(例如，ATCC編號CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如，ATCC編號CCL10)、PC12細胞(ATCC編號CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC編號CRL1651)、RATI細胞、小鼠L細胞(ATCC編號CCLI.3)、人胚胎腎(HEK)細胞(ATCC編號CRL1573)、HLHepG2細胞等。合適的酵母細胞包括但不限於：巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichiafinlandica)、喜海藻糖畢赤氏酵母(Pichiatrehalophila)、Pichiakoclamae、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichiaopuntiae、耐熱畢赤酵母(Pichiathermotolerans)、柳畢赤酵母(Pichiasalictaria)、Pichiaguercuum、皮傑普畢赤酵母(Pichiapijperi)、樹幹畢赤酵母(Pichiastiptis)、嗜甲畢赤酵母(Pichiamethanolica)、畢赤酵母(Pichiasp.)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酵母菌(Saccharomycessp.)、多形漢遜酵母屬(Hansenulapolymorpha)、克魯維酵母(Kluyveromycessp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、構巢麴黴(Aspergillusnidulans)、黑麴黴(Aspergillusniger)；米麴黴(Aspergillusoryzae)、裡氏木黴(Trichodermareesei)、Chrysosporiumlucknowense、鐮刀菌(Fusariumsp.)、禾穀鐮孢(Fusariumgramineum)、嗜熱真菌木聚糖酶(Fusariumvenenatum)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、萊因衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)等。合適的原核細胞包括但不限於大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳酸桿菌(Lactobacillussp.)、沙門氏菌(Salmonellasp.)、志賀菌(Shigellasp.)等的多種實驗室菌株中的任何一種。參見，例如，Carrier等(1992)J.Immunol.148：1176-1181；美國專利號6,447,784；和Sizemore等(1995)Science270：299-302。在本發明中可採用的沙門氏菌菌株的例子包括但不限於：傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)和鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)。合適的志賀氏菌菌株包括但不限於：弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、宋內志賀菌(Shigellasonnei)和痢疾志賀菌(Shigelladisenteriae)。通常，實驗室菌株是非病原性菌株。其他合適的細菌的非限制性例子包括但不限於：枯草桿菌(Bacillussubtilis)、惡臭假單胞菌(Pseudomonaspudita)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、Pseudomonasmevalonii、類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)、莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus)、深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)等。在一些實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌。試劑盒本公開也提供了用於測定靶多核糖核苷酸的核苷酸序列的試劑盒。本公開提供了進行底物多核糖核苷酸的序列特異性裂解的試劑盒。本公開提供了進行檢測靶多核糖核苷酸中RNA序列的試劑盒。本公開提供了進行分離靶RNA的試劑盒。本公開提供了進行分離結合靶RNA的多肽的試劑盒。進行多核糖核苷酸直接測序的試劑盒進行多核糖核苷酸的直接測序的主題試劑盒至少包括主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶，其中序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶被純化。在一些實施方案中，無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶連接至受體分子或供體分子，用於FRET檢測。進行多核糖核苷酸的直接測序的主題試劑盒至少包括主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶；並且可包括一種或多種另外的組分，其中一種或多種另外的組分可以為：1)緩衝劑；2)包含確定序列的探針寡核苷酸；3)包含確定序列的探針寡核苷酸，其中探針寡核苷酸連接至受體分子或供體分子，用於FRET檢測；4)用於連接至靶多核糖核苷酸的不溶性支撐物；5)陽性對照多核糖核苷酸，其中陽性對照多核糖核苷酸包含已知核苷酸序列；6)與陽性對照多核糖核苷酸的已知序列結合和形成雙鏈體的陽性對照探針寡核苷酸。除了上述組分外，主題試劑盒可進一步包括使用試劑盒的組分以實施主題方法的說明書。實施主題方法的說明書通常記錄在合適的記錄介質上。例如，說明書可印刷在諸如紙張或塑料等的基材上。同樣地，說明書可作為包裝說明書存在於試劑盒、試劑盒或其組件(即，與包裝或分包裝相關)等的容器的標記中。在其他實施方案中，說明書可作為存在於諸如CD-ROM、軟磁碟等的合適的計算機可讀存儲介質上的電子儲存數據文件而存在。在又一其他實施方案中，實際的說明書未存在於試劑盒中，但提供獲取來自遠端來源的說明書的方法，例如通過網際網路。該實施方案的例子是包括網址的試劑盒，其中可由此查看說明書和/或由此下載說明書。與說明書一樣，獲取說明書的該方式記錄在合適的基材上。進行底物多核糖核苷酸的序列特異性裂解的試劑盒進行底物多核糖核苷酸的序列特異性裂解的主題試劑盒至少包括純化的序列特異性核糖核酸內切酶和/或核酸，該核酸包含編碼序列特異性核糖核酸內切酶的核苷酸序列。除純化的序列特異性核糖核酸內切酶(和/或包含編碼序列特異性核糖核酸內切酶的核苷酸序列的核酸)外，進行底物多核糖核苷酸的序列特異性裂解的主題試劑盒可包括一種或多種另外的組分。合適的另外的組分包括：例如，緩衝劑；用作陽性對照的多核糖核苷酸底物；多核糖核苷酸尺寸標準品；陰性對照底物等。組分可各自在單獨的容器中。試劑盒可進一步包括一種或多種陽性和陰性對照。除了上述組分外，主題試劑盒可進一步包括使用試劑盒的組分以實施主題方法的說明書。實施主題方法的說明書通常記錄在合適的記錄介質上。例如，說明書可印刷在諸如紙張或塑料等的基材上。同樣地，說明書可作為包裝說明書存在於試劑盒、試劑盒或其組件(即，與包裝或分包裝相關)等的容器的標記中。在其他實施方案中，說明書可作為存在於諸如CD-ROM、軟磁碟等的合適的計算機可讀存儲介質上的電子儲存數據文件而存在。在又一其他實施方案中，實際的說明書未存在於試劑盒中，但提供獲取來自遠端來源的說明書的方法，例如通過網際網路。該實施方案的例子是包括網址的試劑盒，其中可由此查看說明書和/或由此下載說明書。與說明書一樣，獲取說明書的該方式記錄在合適的基材上。進行靶多核糖核苷酸中序列的檢測的試劑盒進行靶多核糖核苷酸中序列的檢測(例如，進行多核糖核苷酸的檢測)的主題試劑盒可包括包含已知序列的寡核苷酸探針。在一些實施方案中，試劑盒將包括包含已知序列並包含可檢測部分的寡核苷酸探針，所述可檢測部分例如使用免疫測定可檢測的多肽；螢光蛋白；螢光素等。試劑盒可進一步包括陽性對照多核糖核苷酸，該陽性對照多核糖核苷酸包含能夠與寡核苷酸探針形成雙鏈體的核苷酸序列。試劑盒可進一步包括酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶，該酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶特異性檢測和裂解由寡核苷酸探針和靶多核糖核苷酸所形成的雙鏈體。試劑盒可進一步包括一種或多種緩衝劑；用於檢測可檢測部分的組分；試驗條等。試劑盒可進一步包括一種或多種陽性和陰性對照。除了上述組分外，主題試劑盒可進一步包括使用試劑盒的組分以實施主題方法的說明書。實施主題方法的說明書通常記錄在合適的記錄介質上。例如，說明書可印刷在諸如紙張或塑料等的基材上。同樣地，說明書可作為包裝說明書存在於試劑盒、試劑盒或其組件(即，與包裝或分包裝相關)等的容器的標記中。在其他實施方案中，說明書可作為存在於諸如CD-ROM、軟磁碟等的合適的計算機可讀存儲介質上的電子儲存數據文件而存在。在又一其他實施方案中，實際的說明書未存在於試劑盒中，但提供獲取來自遠端來源的說明書的方法，例如通過網際網路。該實施方案的例子是包括網址的試劑盒，其中可由此查看說明書和/或由此下載說明書。與說明書一樣，獲取說明書的該方式記錄在合適的基材上。進行靶RNA的分離的試劑盒進行靶RNA的分離(例如，純化)的主題試劑盒可包括以下的一種或多種：1)主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶；2)包含「標記」核苷酸序列的表達構建體，即，由序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶特異性結合的核苷酸序列，其中可將編碼選擇靶RNA的核苷酸序列插入「標記」核苷酸序列的3′；以及3)咪唑。可將序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶固定在不溶性支撐物上。試劑盒可進一步包括用於使核酸的混合群與固定的序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶接觸的液體組合物。試劑盒可進一步包括洗滌緩衝劑。試劑盒可進一步包括一種或多種陽性和陰性對照。陽性對照可包括表達載體，該表達載體包含編碼標記的靶RNA的核苷酸序列，其中標記由序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶特異性結合。組分可各自在單獨的容器中。例如，主題試劑盒可包括主題序列特異性、無酶活性核糖核酸內切酶。主題試劑盒可進一步包括重組表達載體，該重組表達載體以5′至3′的順序以及可操作連接包含：a)編碼由主題變體Csy4核糖核酸內切酶特異性結合的RNA底物的核苷酸序列；以及b)適合插入編碼靶RNA的核酸的多克隆位點。編碼RNA底物的核苷酸序列可操作連接至啟動子。在一些例子中，啟動子是誘導型啟動子。RNA底物可包含核苷酸序列5′-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3′(SEQIDNO：1)。在一些情況下，重組表達載體包含編碼靶RNA的核苷酸序列，該核苷酸序列插入多克隆位點內。試劑盒可進一步包括沒有咪唑的緩衝劑。試劑盒可進一步包括咪唑或咪唑溶液。試劑盒可進一步包括一種或多種洗滌緩衝劑。在一些情況下，試劑盒將包括陽性對照表達載體。可將變體Csy4核糖核酸內切酶固定在不溶性支撐物上，其中合適的不溶性支撐物包括但不限於瓊脂糖珠、磁珠、試驗條、多孔平皿等。不溶性支撐物可包括多種物質(玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈澱粉、天然和修飾的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁鐵)以及可以多種形式來提供，包括例如，瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠態金屬粒子、玻璃和/或矽片以及表面、硝化纖維條帶、尼龍膜、薄片、反應盤的孔(例如，多孔板)、塑料管等。除了上述組分外，主題試劑盒可進一步包括使用試劑盒的組分以實施主題方法的說明書。實施主題方法的說明書通常記錄在合適的記錄介質上。例如，說明書可印刷在諸如紙張或塑料等的基材上。同樣地，說明書可作為包裝說明書存在於試劑盒、試劑盒或其組件(即，與包裝或分包裝相關)等的容器的標記中。在其他實施方案中，說明書可作為存在於諸如CD-ROM、軟磁碟等的合適的計算機可讀存儲介質上的電子儲存數據文件而存在。在又一其他實施方案中，實際的說明書未存在於試劑盒中，但提供獲取來自遠端來源的說明書的方法，例如通過網際網路。該實施方案的例子是包括網址的試劑盒，其中可由此查看說明書和/或由此下載說明書。與說明書一樣，獲取說明書的該方式記錄在合適的基材上。直接對靶多核糖核苷酸進行測序的方法本公開提供直接測定靶多核糖核苷酸的核苷酸序列的方法。因此，例如，本方法無需合成靶多核糖核苷酸的聚脫氧核苷酸對應物以測定靶多核糖核苷酸的核苷酸序列。病毒診斷、個體化用藥、單細胞轉錄物分析以及翻譯圖譜均是直接RNA檢測和測序應用的領域。主題多核糖核苷酸測序方法以及檢測多核糖核苷酸中的特定序列的主題方法應用於這些各種領域中。主題多核糖核苷酸測序方法通常包括：a)在有利於在寡核苷酸探針和靶多核糖核苷酸之間形成雙鏈體的條件下使靶多核糖核苷酸與寡核苷酸探針接觸，寡核苷酸探針包含特定已知序列和無酶活性序列特異性Csy4核糖核酸內切酶，其中無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶結合雙鏈體中的特定序列；以及b)檢測寡核苷酸探針和靶多核糖核苷酸之間的特異性結合，其中無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶與雙鏈體的特異性結合指示靶多核糖核苷酸中特定序列的存在。在一些情況下，無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶連接(共價或非共價)至發射性標記。所謂「發射性標記」是指通過其固有發射性能可檢測的任何分子，其包括激發後可檢測的發射。合適的發射性標記包括但不限於：螢光素、若丹明、四甲基若丹明、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠、芪、螢光黃、CascadeBlueTM、TexasRed、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LCRed640、Cy5、Cy5.5、LCRed705和OregonGreen。合適的光學染料描述在2002MolecularProbesHandbook，第9版，RichardP.Haugland。在一些例子中，在主題多核糖核苷酸測序方法中使用的寡核苷酸探針連接至供體分子；無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶連接至受體分子，並且通過螢光共振能量轉移(也稱為「福斯特共振能量轉移(resonanceenergytransfer)」或者″FRET″)來檢測雙鏈體形成。福斯特共振能量轉移(FRET)是本領域已知的現象，其中在沒有發射光子下，一種發射性染料的激發轉移至另一染料中。FRET對由供體發色團和受體發色團(其中受體發色團可以為猝滅劑分子)組成。供體的發射光譜和受體的吸收光譜必須重疊，並且兩種分子必須緊密靠近。通過福斯特半徑(radius)來定義50％的供體失活(轉移能量至受體)的供體和受體之間的距離，其通常為10-100埃。可檢測包含FRET對的發射光譜的改變，其表明緊密靠近(即，彼此在100埃內)的數目變化。這將通常由兩種分子的結合或締合所致，其中之一為用FRET供體標記，並且另一用FRET受體標記，其中這種結合使得FRET對緊密靠近。這些分子的結合將導致增加受體發射和/或供體螢光發射的猝滅。適合使用的FRET對(供體/受體)包括但不限於：EDANS/螢光素、IAEDANS/螢光素、螢光素/四甲基若丹明、螢光素/Cy5、IEDANS/DABCYL、螢光素/QSY-7、螢光素/LCRed640、螢光素/Cy5.5以及螢光素/LCRed705。此外，可使用螢光團/量子點供體/受體對。EDANS是(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)；IAEDANS是5-({2-[(碘乙醯基)氨基]乙基}氨基)萘-1-磺酸)；DABCYL是4-(4-二甲基氨基苯基)二氮烯基苯甲酸。Cy3、Cy5、Cy5.5等是花青。例如，Cy3和Cy5是花青染料家族中反應性、水溶性螢光染料。Cy3染料是紅色(-550nm激發、-570nm發射，並且因而呈現綠色)，而Cy5在紅色區域(-650/670nm)具有螢光，但在橙色區域(-649nm)吸收。也可使用AlexaFluor染料、Dylight、IRIS染料、Seta染料、SeTau染料、SRfluor染料和Square染料。在FRET的另一方面中，可採用發射性供體分子和非發射性受體分子(「猝滅劑」)。在該申請中，當將猝滅劑放置緊密靠近供體時，供體發射將增加，並且當將猝滅劑帶到緊密靠近供體時，發射將減少。有用的猝滅劑包括但不限於：DABCYL、QSY7和QSY33。有用的螢光供體/猝滅劑對包括但不限於：EDANS/DABCYL、TexasRed/DABCYL、BODIPY/DABCYL、螢光黃/DABCYL、香豆素/DABCYL和螢光素/QSY7染料。在一些情況下，無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶連接(共價或非共價)至標記酶。所謂「標記酶」是指在標記酶底物的存在下可反應、產生可檢測的產物的酶。合適的標記酶也包括光學可檢測標記(例如，在辣根過氧化物酶(HRP)的情況下)。合適的標記酶包括但不限於：HRP、鹼性磷酸酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶以及葡糖氧化酶。使用這些底物的方法是本領域熟知的。通過酶與標記酶底物的催化反應通常可揭示標記酶的存在，從而產生可識別的產物。這些產物是不透明的(例如辣根過氧化物酶與四甲基聯苯胺的反應)，並且可具有各種顏色。已經開發出諸如魯米諾(Luminol)(購自PierceChemicalCo.)的其他標記酶底物，其產生螢光反應產物。使用標記酶底物來識別標記酶的方法是本領域熟知的，並且可獲得許多市售試劑盒。使用各種標記酶的例子和方法描述在Savage等，Previews247：6-9(1998)，Young，J.Virol.Methods24：227-236(1989)中。在一些情況下，無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶包含放射性同位素。所謂「放射性同位素」是指任何放射性分子。在本發明中使用的合適的放射性同位素包括但不限於14C、3H、32P、33P、35S、1251、和131I。使用放射性同位素作為標記是本領域熟知的。在一些情況下，無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶連接(共價或非共價)至特異性結合對的成員(「結合對的配偶體」)。所謂「結合對的配偶體」或者「結合對的成員」是指第一和第二部分之一，其中第一和第二部分具有對彼此的特異性結合親和力。合適的結合對包括但不限於：抗原/抗體(例如，異羥基洋地黃毒苷元/抗-異羥基洋地黃毒苷元、二硝基苯基(DNP)/抗-DNP、丹醯基-X-抗-丹醯基、螢光素/抗-螢光素、螢光黃/抗-螢光黃以及若丹明和抗-若丹明)；生物素/抗生物素蛋白(或者生物素/鏈黴親和素)以及鈣調蛋白結合蛋白(CBP)/鈣調蛋白。在一些實施方案中，寡核苷酸探針包含提供對非特異性水解增加的抵抗性的修飾。這些修飾是本領域熟知的，並且包括例如抗核酸酶核苷間鍵合(nuclease-resistantinternucleosidiclinkage)、修飾的主鏈、鹼基修飾、鹼基取代、糖修飾等。其中包含磷原子的合適的修飾的寡核苷酸主鏈包括例如，硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；甲基和其他烷基磷酸酯，包括具有常規3′-5′鍵合的3′-亞烷基磷酸酯、5′-亞烷基磷酸酯以及手性磷酸酯；亞磷酸酯；氨基磷酸酯，包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯；二氨基磷酸酯；硫羰基氨基磷酸酯；硫羰基烷基磷酸酯；硫羰基烷基磷酸三酯；硒代磷酸酯以及甲硼烷磷酸酯；這些的2′-5′連接類似物，以及具有反向極性的那些，其中一種或多種核苷酸間鍵合是3′至3′、5′至5′或者2′至2′鍵合。具有反向極性的合適的寡核苷酸在3′-大部分核苷酸間鍵合處包括單個3′至3′鍵合，即，可以為鹼性的單個反向核苷酸殘基(核鹼基缺失或在其位置上具有羥基)。各種鹽(例如，鉀或鈉)、混合鹽和游離酸形式也包括在內。修飾的寡核苷酸可包含一種或多種硫代磷酸酯和/或雜原子核苷酸間鍵合，尤其是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(稱為亞甲基(甲基亞氨基)或者MMI主鏈)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯核苷酸間鍵合表示為-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-)。MMI類型核苷酸間鍵合公開在以上引用的美國專利號5,489,677中。合適的醯胺核苷酸間鍵合公開在美國專利號5,602,240中。修飾的寡核苷酸可包含如在例如美國專利號5,034,506中所述的一個或多個嗎啉代主鏈結構。例如，在一些實施方案中，修飾的寡核苷酸包含6-元的嗎啉代環而替代核糖環。在這些實施方案的一些中，二氨基磷酸酯或其他非-磷酸二酯核苷酸間鍵合替代磷酸二酯鍵。嗎啉代核酸(「嗎啉代」)包括結合嗎啉環而非脫氧核糖環的鹼基；此外，磷酸主鏈可包括非磷酸酯基團，例如，二氨基磷酸酯基團而非磷酸酯。Summerton(1999)Biochim.Biophys.Acta1489：141；Heasman(2002)Dev.Biol.243：209；Summerton和Weller(1997)Antisense&Nucl.AcidDrugDev.7：187；Hudziak等(1996)Antisense&Nucl.AcidDrugDev.6：267；Partridge等(1996)Antisense&Nucl.AcidDrugDev.6：169；Amantana等(2007)Bioconj.Chem.18：1325；Morcos等(2008)BioTechniques45：616。修飾的寡核苷可包含修飾的主鏈。其中不包括磷原子的修飾的多核苷酸主鏈具有通過短鏈烷基或環烷基核苷酸間鍵合、混合的雜原子和烷基或環烷基核苷酸間鍵合或者一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷酸間鍵合而形成的主鏈。這些包括具有嗎啉代鍵合和(部分從核苷的糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸和碸主鏈；甲醯基和硫代甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基和硫代甲醯基主鏈；核糖乙醯基主鏈；包含烯烴的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和磺醯胺主鏈；醯胺主鏈的那些；以及具有混合的N、O、S和CH2組分部分的其他主鏈。修飾的寡核苷酸可包含一種或多種取代的糖部分。合適的寡核苷酸包含選自以下的糖取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以為取代的或未取代的C1至C10烷基或者C2至C10烯基和炔基。同樣合適的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中n和m是1至約10。其他合適的寡核苷酸包含選自以下的糖取代基：C1至C10低級烷基；取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基；SH；SCH3；OCN；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；雜環烷基；雜環烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲矽烷基；RNA裂解基團；報告基團；嵌入劑(intercalator)等。合適的修飾基團包括：2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也稱為′-O-(2-甲氧基乙基)或者2′-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，即，烷氧基烷氧基。另外合適的修飾基團包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，也稱為2′-DMAOE以及2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領域中也稱為2′-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或者2′-DMAEOE)，即，2′-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。修飾的寡核苷酸可包含一個或多個核鹼基(在本領域中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文所使用，「未修飾的」或「天然的」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)；以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核鹼基包括其他合成的和天然的核鹼基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-滷代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶鹼基的其他炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-滷代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-滷代特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶以及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-氨基-腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤以及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤和7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鳥嘌呤和3-去氮腺嘌呤。另外的修飾的核鹼基包括三環嘧啶，例如吩噁嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶並(5，4-b)(1，4)苯並噁嗪-2(3H)-酮)；吩噻嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶並(5，4-b)(1，4)苯並噻嗪-2(3H)-酮)；G-夾子(G-clamps)，例如取代的吩噁嗪胞嘧啶核苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶並(5，4-(b)(1，4)苯並噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞嘧啶核苷(2H-嘧啶並(4，5-b)吲哚-2-酮)、吡啶並吲哚胞嘧啶核苷(H-吡啶並(3′，2′：4，5)吡咯並2，3-d)嘧啶-2-酮)。雜環鹼基部分還可包括其中嘌呤或嘧啶鹼基被其他雜環取代的那些，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤核苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。合適的無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶包括本文以下所述的無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶。例如，可使用如圖6所示的無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶。在一些實施方案中，靶多核糖核苷酸連接(共價或非共價)至固體支撐物(不溶性支撐物)。合適的不溶性支撐物包括但不限於：小珠、板(例如，多孔板)、條帶等，其中不溶性支撐物可包含各種材料，這些材料包括但不限於聚苯乙烯、聚丙烯、瓊脂糖等。寡核苷酸探針(「檢測寡核苷酸」)可以為RNA、DNA或者RNA或DNA的任何化學修飾形式，例如，肽核酸(PNA、鎖核酸(LNA)等。主題多核糖核苷酸測序方法可包括一個或多個洗滌步驟，例如從而去除諸如非特異性結合的寡核苷酸探針、任何非特異性結合的可檢測部分等的非特異性結合組分。如何進行主題多核糖核苷酸測序方法的非限制性例子如下。使靶多核糖核苷酸結合固體支撐物。靶多核糖核苷酸具有未知序列並且是「待測序的RNA」。四個不同的已知核苷酸序列的四種寡核苷酸探針各自包含不同的螢光團(螢光團1-4)。螢光團是FRET對的成員。FRET對的對應物成員是量子點。量子點連接無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶。無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶連接、但不裂解在寡核苷酸探針和靶多核糖核苷酸之間形成的雙鏈體。四種寡核苷酸探針中僅一種與靶多核糖核苷酸結合併且形成雙鏈體。洗滌步驟去除任何未結合的寡核苷酸探針。寡核苷酸探針-螢光團2的結合導致與靶多核糖核苷酸形成雙鏈體。因而將螢光團2引入鄰近連接無酶活性、序列特異性核糖核酸內切酶的量子點處，並且螢光被猝滅。裂解多核糖核苷酸的方法本公開提供以序列特異性方式裂解多核糖核苷酸的方法。本方法通常包括：在有利於多核糖核苷酸底物的序列特異性裂解的條件下使底物多核糖核苷酸與酶活性序列特異性核糖核酸內切酶(例如，Csy4核糖核酸內切酶)接觸。以序列特異性方式裂解多核糖核苷酸的主題方法可用於：1)從底物多核糖核苷酸中去除親和標記；2)在5′端處產生具有均勻性的產物多核糖核苷酸的群，例如，其中底物多核糖核苷酸是體外轉錄的mRNA；以及3)調節在體外或體內細胞中的基因表達。底物多核糖核苷酸術語「底物多核糖核苷酸」和「靶多核糖核苷酸」在本文可交換使用，其是指以序列特異性方式由序列特異性核糖核酸內切酶結合的多核糖核苷酸。底物多核糖核苷酸可以為單鏈的。在一些例子中，底物多核糖核苷酸是雙鏈的。核糖核酸內切酶以序列特異性方式結合併裂解底物多核糖核苷酸。因此，例如，核糖核酸內切酶在本文稱為「識別序列」或「識別位點」的特定序列處結合併裂解底物多核糖核苷酸。識別序列可以為四核苷酸序列、五核苷酸序列、六核苷酸序列、七核苷酸序列、八核苷酸序列或比八核苷酸更長的序列。例如，在一些實施方案中，識別序列的長度為9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14核苷酸、15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸或20個核苷酸。在一些實施方案中，序列特異性核糖核酸內切酶立即裂解識別序列的5′。在一些實施方案中，序列特異性核糖核酸內切酶立即裂解識別序列的3′。在一些實施方案中，序列特異性核糖核酸內切酶在識別序列內裂解。在一些情況下，識別序列立即裂解二級結構的5′。在一些情況下，識別序列位於二級結構的5′並且在二級結構的1個核苷酸(nt)、2nt、3nt、4nt、5nt或者5nt至10nt內。在一些情況下，識別序列立即裂解二級結構的3′。在一些情況下，識別序列位於二級結構的3′並且在二級結構的1個核苷酸(nt)、2nt、3nt、4nt、5nt、或者5nt至10nt內。在一些實施方案中，底物多核糖核苷酸包含結構XxX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15，其中核苷酸X1-X5與X11-X15鹼基配對，使得X1和X15形成莖結構的基礎，並且使得X6、X7、X8、X9和X10形成環；結構是常規A-形狀的螺旋結構。在一些實施方案中，底物多核糖核苷酸包含親和標記；並且主題方法提供從底物多核糖核苷酸中去除親和標記。序列特異性核糖核酸內切酶以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸的核糖核酸內切酶包括酶活性多肽，該酶活性多肽以金屬離子依賴性方式裂解(水解)底物多核糖核苷酸。以序列特異性和金屬離子依賴性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸的核糖核酸內切酶的結構特徵可包括以下的一種或多種：1)通過例如，R114、R115、R118、R119或其等同物的RNA大溝的RNA磷酸主鏈的序列非特異性識別的高鹼基α螺旋；2)R102和/或Q104或其等同物，使得氫鍵與RNA莖的大溝接觸；3)以及參與催化的His29、Ser148和Tyr176或其等同物的一種或多種；以及4)F155或其等同物。以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸的核糖核酸內切酶包括酶活性多肽，該酶活性多肽與圖4所示的胺基酸序列(Csy4胺基酸序列)具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％胺基酸序列同一性。以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸的核糖核酸內切酶包括酶活性多肽，該酶活性多肽與圖5所示的胺基酸序列(Csy4胺基酸序列)具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％胺基酸序列同一性。以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸的核糖核酸內切酶包括酶活性多肽，該酶活性多肽與Cas6胺基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％胺基酸序列同一性。以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸的核糖核酸內切酶包括酶活性多肽，該酶活性多肽與CasE胺基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％胺基酸序列同一性。以序列特異性方式結合和裂解底物多核糖核苷酸的核糖核酸內切酶包括酶活性多肽，該酶活性多肽通過1至20(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個胺基酸取代和/或插入和/或缺失而與圖4或5中任一圖中所示的胺基酸序列不同。反應條件序列特異性核糖核酸內切酶可在約15℃至約100℃的溫度範圍內以序列特異性方式水解底物多核糖核苷酸，所述溫度範圍例如為約15℃至約17℃、約17℃至約20℃、約20℃至約25℃、約25℃至約30℃、約30℃至約40℃、約40℃至約50℃、約50℃至約60℃、約60℃至約70℃、約70℃至約80℃、約80℃至約90℃或約90℃至約100℃。序列特異性核糖核酸內切酶可在pH為約4.0至約8.0的範圍內以序列特異性方式水解底物多核糖核苷酸，所述pH範圍例如為pH約4.0至約4.5、pH約4.5至約5.0、pH約5.0至約5.5、pH約5.5至約6.0、pH約6.0至約6.5、pH約6.5至約7.0、pH約7.0至約7.5、pH約6.5至約7.5、pH約7.5至約8.0、pH約6.5至約8.0或pH約5.5至約7.5。實施例示出以下例子以為本領域普通技術人員對如何進行和使用本發明提供完整公開和描述，並且以下例子並非旨在限制發明人所認定其發明的範圍，也並非旨在呈現以下實驗為進行的全部或僅有的實驗。對於使用的數值(例如數量、溫度等)，已經盡力確保其準確性，但還應當考慮到一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，部分是按重量計的部分，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，並且壓力為大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮略語，例如，bp，鹼基對；kb，千鹼基；pi，皮升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；kb，千鹼基；bp，鹼基對；nt，核苷酸；i.m.，肌肉內；i.p.，腹膜內；s.c，皮下等。實施例1：使用Csy4家族蛋白的直接RNA檢測和測序材料和方法野生型Csy4、點突變體和硒代甲硫氨酸(SeMet)-取代的Csy4在Rosetta2(DE3)細胞中表達為His6-麥芽糖結合蛋白(MBP)融合物或His6融合蛋白，並通過Ni-親和層析法，隨後為蛋白水解去除His(MBP)標記、進一步的Ni-親和步驟以及尺寸排阻層析法來純化。使用T7聚合酶將前體-crRNA體外轉錄並且在變性凝膠上純化。通過在30℃下將RNA與Csy4以2∶1的比率孵育30分鐘，然後通過尺寸排阻層析來形成複合物。使用懸滴方法在200mM檸檬酸鈉(pH5.0)、100mM氯化鎂、20％(w/v)聚(乙二醇)(PEG)-4000(野生型(WT)複合物)或者在150mM乙酸鈉(pH4.6)、17％PEG4000或160mM乙酸鈉(pH4.6)、18％PEG4000中(包含S22C的複合物)中來結晶複合物。通過使用SeMet-取代的結晶的多波長反常色散(MAD)來測定WTCsy4-RNA複合物的結構。通過分子置換來測定Csy4(S22C)-RNA複合物的結構。基因注釋、克隆、蛋白表達和純化。在物種中Csy4基因的對比序列分析識別在PA14基因組中注釋的起始密碼子上遊處保守區20密碼子。Lee，等GenomeBiol7，R90(2006)。將保守的Csy4(PA14_33300)序列使用Pal4Csy4_fwd：caccatggaccactacctcgacattcg和Pal4Csy4_rev：gaaccagggaacgaaacctcc從綠膿假單胞菌(Peeudomonasaeruginosa)UCBPP-PA14基因組DNA進行PCR擴增。使用Gateway體系將聚合酶鏈反應(PCR)產物克隆至pENTR/TEV/D-TOPO入門載體(Invitrogen)內，隨後進行位點特異性重組至表達載體pHGWA或pHMGWA內。Busso，等AnalyticalBiochemistry343，313-321，(2005)。使用QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene)將點突變引入Csy4內。將Pal4Csy4表達質粒轉化至大腸桿菌Rosetta2(DE3)細胞(Novagen)內或者與通過Geneart(Regensburg，Germany)合成的表達CRISPRRNA的pMK載體來共轉化。使Rosetta2(DE3)細胞在用氨苄青黴素和氯黴素補充的Luria肉湯(LB)中生長。使用～0.5OD的細胞密度的0.5mM異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Affymetrix)來誘導蛋白質表達，然後在18℃下振蕩16小時。將細胞在裂解緩衝劑(15.5mM磷酸氫二鈉；4.5mM磷酸二氫鈉；500mM氯化鈉；10mM咪唑；蛋白酶抑制劑；5％甘油；0.01％TritonX-100；100μ/mlDNaseI；ImMTris[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)；0.5mM苯甲基磺醯氟，pH7.4)中沉澱和再懸浮，然後在冰上以10秒脈衝聲處理兩分鐘，通過離心(24,000×g，30分鐘)使裂解物澄清，並與分批的氮川三乙酸鎳(Ni-NTA)親和樹脂(Qiagen)來孵育。使用高咪唑緩衝劑(15.5mM磷酸氫二鈉；4.5mM磷酸二氫鈉；500mM氯化鈉；300mM咪唑；1mMTCEP；5％甘油，pH7.4)來洗脫結合的蛋白質，然後在菸草蝕紋病毒(TEV)的存在下在透析緩衝劑(僅具有20mM咪唑的洗脫緩衝劑)中透析過夜，從而裂解His6或His6MBP標記。將蛋白質濃縮(Amicon)並在鎳親和柱(GE)上純化，隨後在凝膠過濾緩衝劑(100mMHEPESpH7.5；500mMKCl；5％甘油；1mMTCEP)中串聯Sup75(16/60)柱純化。然後將樣本通過僅包含150mM氯化鉀的凝膠過濾緩衝劑來透析。使用類似的方案來製備硒基甲硫氨酸(SeMet)-衍生蛋白，並且顯著差別僅在於表達介質。簡單地說，將使用Csy4(pHGWA)表達載體轉化的BL21(DE3)細胞在使用如前所述用氨苄青黴素補充的M9最小培養基中生長。Wiedenheft，等Structure17，904-912(2009)。核酸酶活性測定。在25℃下將75pmol的野生型或突變型Csy4與5pmol體外轉錄的Pa14前體-crRNA(如所述製備；Wiedenheft(2009)上文)在包含20mMHEPES(pH7.5)、100mM氯化鉀緩衝劑的10ul反應物中孵育五分鐘。加入50ul酸酚-氯仿(Ambion)來猝滅反應。加入10μl另外的反應緩衝劑，並且將樣本離心(16,000×g，30分鐘)，並且將16μl水性樣本去除，以1∶1與2X甲醯胺加樣緩衝液混合，然後在15％變性聚丙烯醯胺凝膠上分離。使用SYBRGold染色(Invitrogen)來觀察RNA。結晶。在18℃下使用懸滴蒸汽擴散方法通過混合等體積(1μl+1μl)的複合物和儲備溶液來進行所有結晶實驗。使野生型Csy4-RNA複合物的板狀結晶在200mM檸檬酸鈉(pH5.0)、100mM氯化鎂、20％(w/v)聚(乙二醇)-4000(PEG4000)中生長。這些晶體屬於空間群C2，其包含在不對稱單元中複合物的一個拷貝，並且在同步加速器X射線源下衍射至的解析度。使用經Csy4S22C點突變體再造的複合物，在150mM乙酸鈉(pH4.6)；17％(w/v)PEG4000和160mM乙酸鈉(pH4.6)；18％PEG4000中獲得兩種另外的晶形。開始，在24小時內出現六邊形晶體。這些晶體衍射至的解析度，其屬於空間群P61以及包含在不對稱單元中複合物的一個拷貝。48小時之後，相同結晶條件產生針狀晶體，其屬於空間群P212121，包含複合物的兩個拷貝以及衍射至多的解析度。對於數據收集，在液氮中快速冷卻之前通過浸漬在它們各自用30％甘油補充的母液中來對所有晶形進行冰凍保護。結構測定。在AdvancedLightSource(LawrenceBerkeleyNationalLaboratory)的光束線8.2.2和8.3.1的100K下收集所有衍射數據。使用XDS來處理數據，Kabsch，ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66，125-132(2010)。使用包含硒代甲硫氨酸取代的野生型Csy4的單斜Csy4-RNA晶體由三波長多波長反常色散(MAD)實驗來確定實驗階段(峰、彎曲和遠端數據集)。使用Phenix程序包的混合亞結構檢索(HybridSubstructureSearch)(HySS)模塊來定位兩個硒位置。Grosse-Kunstleve和Adams.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr59，1966-1973(2003)。使用AutoSHARP.Vonrhein，等MethodsMolBiol364，215-230(2007)來進行亞結構精細、定相和密度改變。所得電子密度圖表現出由蛋白質和RNA沿著c-軸交替導致的密度的透明層，其中RNA層由構成「吻環」交互作用中接合的兩同軸堆疊的RNA螺旋形成。通過使用PhenixAutoBuild模塊的自動構建來獲得Csy4蛋白的初始原子模型。Terwilliger，等ActaCrystallogrDBiolCrystallogr64，61-69，(2008)。通過在COOT(Emsley和Cowtan，ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60，2126-2132(2004))中手動構建的迭代循環以及使用Phenix.refine36(Adams，等ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66，213-221(2010))的精細化天然的解析度數據集來完成複雜模型，產生具有21.4％的結晶的Rwork因子和26.4％的Rfree因子的最終模型(表1)。模型包括RNA核苷酸C1-G15和核苷酸C16的磷酸基團以及蛋白質殘基1-104、109-120和139-187。由於在晶格中蛋白質和RNA的分層布置並且在RNA層內沒有橫向晶體接觸，如通過顯著增加的溫度因數以及沒有U9的核苷酸鹼基可解釋的密度所證實，RNA表現出顯著無序。與插入RNA的大溝的富含精氨酸的螺旋相對應，在蛋白質殘基109-120中無序也很明顯，因而僅能構建多肽主鏈(除了殘基Arg115和Arg118)。使用Csy4蛋白(沒有富含精氨酸的螺旋)和來自單斜晶形的RNA模型作為單獨的檢索系綜，通過在移相器(Phaser)(McCoy，等JApplCrystallogr40，658-674(2007))中分子置換來測定在六邊形和斜方晶形中Csy4(S22C)-RNA複合物的結構。在兩晶形中，富含精氨酸的螺旋和包含Csy4殘基105-108的接頭區域的電子密度在由分子置換方案獲得的2FO-FC圖譜中立即可見。將六邊形的Csy4(S22C)-RNA複合物的結構精細化至在的解析度下25.5％的Rwork因子以及27.9％的Rfree。最終模型包括Csy4殘基1-120和139-187和RNA核苷酸C1-G15以及核苷酸C16的磷酸基團。在的解析度下分析Csy4(S22C)-RNA複合物的斜方晶形並且精細化至具有極佳立體化學的18.7％的Rwork因子以及22.0％的Rfree。在不對稱單元中兩個複合物中，複合物1(鏈A和C)包含Csy4殘基1-187和RNA核苷酸C1-G15以及核苷酸C16的磷酸基團，而有序性更差的複合物2(鏈B和D)包含除了殘基13-15和135-138之外的Csy4殘基1-187，其顯示沒有有序的電子密度和RNA核苷酸C1-G15以及核苷酸C16的磷酸基團。Csy4的兩個拷貝與的rmsd在179Cα原子上疊加，最大不同在於富含精氨酸的螺旋的位置的輕微差別。在不對稱單元中兩個RNA分子與的rmsd疊加，最大偏差是由於凸出的核苷酸U9，其在兩個RNA中假定不同構象。在原稿中我們的討論和圖示均基於斜方晶形的複合物1。使用Pymol來產生所有結構圖示(http://www(dot)pymol(dot)org)。結果使CRISPR-介導的免疫發生在基於在測序的基因組中CRISPR基因座的存在下的約90％的古細菌以及40％的細菌基因組中。Horvath和Barrangou，Science327，167-170(2010)；Jansen，等MolecularMicrobiology43，1565-1575(2002)；Sorek，等NatRevMicrobiol6，181-186(2008)；Marraffini和Sontheimer，NatRevGenet11，181-190(2010)。屬於八種已知CRISPR/Cas亞型的CRISPR相關(Cas)的蛋白在基本序列水平上高度分散，使功能性同源物難於識別。Haft，等PLoSComputBiol1，e60(2005)；Makarova，等BiologyDirect1，1-26(2006)。綠膿假單胞菌UCBPP-PA14(以下稱為Pal4)、具有耶爾森(Yersinia)亞型的CRISPR/Cas體系的革蘭氏陰性條件致病菌包含通過兩個CRISPR元件側面相接的六種Cas基因(圖1A)。儘管在包含CRISPR的生物體中廣泛發現Casl，並且在大部分亞型中Cas3很明顯，但Csyl-4是耶爾森亞型所獨有的。CRISPR元件均包含在使用～32-核苷酸特有間隔序列穿插的CRISPR內均相同(除了一個核苷酸之外)的28-核苷酸重複序列的特徵性布置，在噬菌體或質粒中發現其的一些匹配序列。Grissa，等BMCBioinformatics8，172(2007)。在許多生物體中，已經顯示，CRISPR基因座被轉錄為單個長單元以及經轉錄後處理以生成各自包含與由重複元件衍生的序列側面相接一個特有序列的crRNA。Brouns等Science321，960-964(2008)；Carte，等GenesandDevelopment22，3489-3496(2008)；Tang，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，7536-7541(2002)；Lillestol，等Archaea2，59-72(2006)；Lillestol等MolMicrobiol72，259-272(2009)；Tang，等MolecularMicrobiology55，469-481(2005)。為了鑑定在耶爾森亞型中負責產生來自長CRISPR轉錄物(前體-crRNA)的蛋白質，將來自Pa14的六種Cas蛋白各自重組表達，並且使用體外轉錄的前體-crRNA來測試重組表達的蛋白質的內切核糖核水解(endoribonucleolytic)功能。基於序列特異性前體-crRNA處理活性，發現Csy4是導致crRNA生物生成的核糖核酸內切酶。如在兩種其他CRISPR/Cas亞型內觀察到的crRNA處理(Brouns等(2008)supra；Carte等(2008)上文)，CRISPR轉錄物裂解是快速、金屬離子依賴性反應。Csy4在重複元件內在預測的莖-環結構的鹼基處裂解前體-crRNA，生成由32個核苷酸特有(由噬菌體衍生的)序列組成的60個核苷酸crRNA，該特有序列在5′和3′端處分別側邊連接重複序列的8和20個核苷酸(圖1A)。對於Csy4發揮作用，據推測，其RNA識別機制必須高度特異性以僅靶向由CRISPR衍生的轉錄物，而不靶向包含髮夾序列和/或相關序列的其他細胞RNA。為了測試這個，將Csy4單獨表達在大腸桿菌中或者與Pal4CRISPRRNA共表達。儘管等電點高(PI＝10.2)，但Csy4不與細胞核酸締合；然而，當與Pal4CRISPR共表達時，蛋白質與crRNA締合(圖1B，C)。這些觀察強調Csy4識別的特異性，導致我們可以探索Csy4底物識別和裂解所需的蛋白質/RNA相互作用。使用對應28-核苷酸Pal4CRISPR重複序列的不同區域的RNA寡核苷酸體外進行Csy4結合和活性測定。使用該方法，鑑定由Csy4識別的由重複序列衍生的莖-環和一個下遊核苷酸組成的最小RNA片段。使用該最小RNA作為底物的裂解測定顯示Csy4活性需要在裂解位點的正上遊的核糖處的2』OH。在該位置處的2′-脫氧核糖完全中斷裂解，但不會破壞Csy4結合。為了了解crRNA識別和裂解的結構，將Csy4與最小RNA底物在複合物中共結晶。為了生成用於結構分析的穩定的複合物，使Csy4結合以上所述的不可裂解的16個核苷酸最小RNA底物，其中在裂解位點之前的核苷酸是2′-脫氧核苷酸。在三個特有空間群中獲得複合物的結晶，各自表現不同晶體包裝；一個包含野生型Csy4並且兩個包含Csy4點突變體。將Csy4-RNA複合物的晶體結構在的解析度下分析(圖2A，表1)，其揭示出人意料之外的機制，由此CRISPRRNA被識別並通過CRISPR-介導的沉默機制(silencingmachinery)來處理以供使用。Csy4使得與RNA莖的磷酸主鏈在CRISPR重複序列的莖-環的大溝中序列特異性接觸以及另外的序列非特異性接觸。大部分特徵化蛋白質/RNA相互作用通過RNA螺旋的小溝來介導；通過Csy4的RNA大溝的識別是蛋白質/RNA相互作用極其不尋常的機制。在基本序列水平下，Csy4與在crRNA生物生成中包括的其他已知核糖核酸內切酶(來自Thermusthermophiles(Ebihara，等ProteinSci15，1494-1499(2006)的CasE以及來自PyrococcusfuriosusCarte等(2008)上文的Cas6)極不相同，其僅有～10％的同一性。CasE和Cas6的晶體結構表明：這些蛋白質採用串聯鐵氧還蛋白樣摺疊(tandemferrodoxin-likefold)。顯然，Csy4與這些酶共享該摺疊；在Csy4-RNA複合物中，Csy4的N-末端結構域(殘基1-94)實際採用鐵氧還蛋白樣摺疊。然而，儘管C-末端結構域(殘基95-187)共享相同二級結構連通性作為鐵氧還蛋白樣摺疊，但是其構象顯著不同。引人注目的是，來自推定C-末端鐵氧還蛋白結構域的富含精氨酸的螺旋(殘基108-120)插入髮夾RNA的大溝內。使用DALI伺服器(Holm和Sander，JMolBiol233，123-138(1993))的結構疊加表明：在其RNA-結合構象中Csy4以(在111Ca原子上)以及(在104Ca原子上)的均方根偏差(rmsd)分別與CasE和Cas6疊加。Csy4、CasE和Cas6可以為單個原始核糖核酸內切酶的衍生物，隨著其CRISPR基因座的重複序列共同演變時，其在序列水平處顯著不同，但同時保持類似蛋白質重疊。如對crRNA重複序列的該亞類所預測(Kunin，等GenomeBiol8，R61(2007))，crRNA底物與核苷酸1-5和11-15鹼基配對形成髮夾結構，從而產生常規A-形螺旋莖。GUAUA五環包含經修剪的G6-A10鹼基對以及凸出的核苷酸U9，其結構類似在酵母U6小核RNA分子內莖-環(Huppler，等NatStructBiol9，431-435(2002))中以及在噬菌體λBoxBRNA(Legault，等Cell93，289-299(1998))中發現GNR(N)A五環。在Csy4-RNA複合物中，RNA莖-環跨在由Csy4的鏈β7-β8與C1-G15鹼基對形成的β-髮夾上，該C1-G15鹼基對直接堆疊在Phe155的芳香側鏈上(圖2B)。這錨定RNA莖並將以合適的角度定向以使得可在大溝中進行序列特異性相互作用。在接頭片段中連接Csy4主體至富含精氨酸的螺旋的兩個殘基，Arg102和Gln104，在RNA莖的大溝中形成氫鍵接觸，從而分別序列特異性識別G15和A14(圖2B)。通過將富含精氨酸的螺旋插入靠近凸出的核苷酸U9處RNA髮夾的大溝內來進一步穩定Csy4-crRNA相互作用(圖2C)。Arg114、Arg115、Arg118和Arg119的側連結觸核苷酸2-6的磷酸基團。此外，Arg115的側鏈與G6的鹼基接合作為在富含精氨酸的螺旋和RNA髮夾之間僅有的序列特異性相互作用。令人感興趣的是，該相互作用易令人想起某些病毒蛋白如何與dsRNA分子的大溝相互作用，例如在人免疫缺陷病毒(HIV)23中Tat/Tar相互作用以及在λ形噬菌體中λ-N/boxB複合物(Cai等NatureStructuralBiology5，203-212(1998))。在兩種情況下，採用高鹼基α螺旋用於使用RNA大溝的RNA的磷酸主鏈的序列非特異性識別。Csy4識別CRISPR重複序列的髮夾元件並立即裂解其下遊序列。在該例子中描述的結構包含底物-模擬RNA，其不能用於裂解。在該活性位點處，僅觀察倒數第二個核苷酸的磷酸基團3′的密度，而未觀察到末端糖基或鹼基的密度，預測這是由於該核苷酸的柔性(圖3A)。可剪切的磷酸酯在之前在Cas6和CasE中鑑定的位於一側的β7-β8髮夾的β-轉彎以及螺旋α1和富含甘氨酸的環之間的口袋中在另一側上結合。在磷酸基團近側的三個殘基(His29、Ser148和Tyr176)可能參與催化。這些殘基在12個Csy4序列之間是不變的，使用BLAST檢索(Altschul，等NucleicAcidsResearch25，3389-3402(1997))以及靠近CRISPR基因座(Grissa，等BMCBioinformatics8，172(2007))的人工驗證來識別該Csy4序列(圖4)。這些結構表明：在Csy4中多個殘基對於介導底物識別/結合和催化是重要的。產生這些殘基各自的點突變體；生化測定它們的裂解活性(圖3B)。設想的催化位點殘基His29或Ser148的突變破壞裂解活性。然而，Tyr176突變至苯丙氨酸並未破壞活性，這表明雖然它未直接參與催化，但Tyr176在定向His29中起決定性作用。Arg102突變至丙氨酸破壞crRNA的聚集，而Gln104至丙氨酸的突變並未顯著破壞活性，這表明識別末端鹼基對的Arg102對於正確定向RNA底物是重要的，但對於體內活性則無需Gln104。Phe155似乎在適當定向RNA底物中起重要作用，因為在該殘基處丙氨酸突變嚴重破壞crRNA生物生成。參與介導RNA裂解中的絲氨酸的鑑定是出人意料之外的。儘管His29突變至丙氨酸導致Csy4失去催化活性，但突變至賴氨酸部分恢復活性，這強有力地表明His29用作質子供體，而不是通過親核攻擊來起始裂解。CRISPR是依賴小的由CRISPR衍生的RNA來將免疫體系引導至與侵入遺傳元件相關的同源序列的基於核酸的免疫體系的遺傳存儲器。CRISPR重複序列的系統發育分析已經鑑定與特定組的Cas基因相關的不同的CRISPR種類(Kunin，等GenomeBiol8，R61(2007))。Cas基因與特異性CRISPR重複序列的共同變化表明：CRISPR重複序列與負責CRISPR適應性、crRNA的生成和入侵遺傳元件的沉默的Cas基因共同進化。在此所述結構詳述基於序列-和結構-特異性來辨別crRNA底物的非常規識別機制，這提供對Csy4及其同源物從所有細胞RNA中容易地辨別底物RNA的能力的較好的理解。圖1A-C。Pal4Csy4僅特異性識別其前體-crRNA底物。a，在Pal4中CRISPR/Cas基因座的示意圖。通過CRISPR基因座使六個Cas基因在兩側側面相接。放大的是顯示在通過32-核苷酸間隔序列(藍色)分隔的28-核苷酸直接重複序列(黑體字)中預測的莖-環的示意圖。紅色箭頭表示通過Csy4裂解的鍵。b，c，在具有(+)以及不具有(-)包含Pal4CRISPR基因座的質粒的大腸桿菌中Pal4Csy4表達之後蛋白質(b)和RNA內容物(c)的比較。將來自兩種製備物的純化的Csy4分成兩組。將一半在SDS-PAGE上分析並且使用Coomassie藍色染料觀察；將另一半用酸酚-氯仿萃取，在UREA-PAGE上分析，然後使用SYBRGold(Invitrogen)觀察。圖2A-C。結合RNA底物的Csy4的晶體結構。a，複合物的前和後視圖。將Csy4染成藍色以及將RNA主鏈染成橙色。b，在殘基R102和Q104以及核苷酸A14和G15之間的詳細相互作用。氫鍵使用虛線表示。c，在富含精氨酸的α螺旋以及RNA主鏈和G6之間的詳細相互作用。圖3A和3B。假定活性位點。a，催化中心的詳細視圖。b，Csy4的裂解活性。在25℃下將野生型(WT)Csy4和一系列單個點突變體與體外轉錄的前體-crRNA體外孵育5分鐘。使用酸酚-氯仿萃取產物並且在UREA-PAGE上分析，並且通過SYBRGold染色來觀察。實施例2：直接RNA測序可使用福斯特共振能量轉移(FRET)在單個分子水平對RNA進行測序。通過其3′核糖使待測序的RNA附接固體表面。應當將RNA放置在距離表面上鄰近RNA分子足夠距離以使得在單分子水平下可檢測。取決於發射光的波長，通過衍射限制方法來表示間隔。可選擇地，如果使用超高解析度顯像方法，RNA間隔可比衍射極限更靠近。在第一序列檢測步驟中，將已知核酸結合特異性的Csy4家族蛋白連同一組檢測寡核苷酸的池加入待測序的RNA。如果檢測寡核苷酸之一可與待測序的RNA形成4個鹼基對的雙螺旋，Csy4蛋白將僅結合待測序的RNA。此外，檢測核苷酸必須與在待測序的RNA中4個鹼基對的識別序列的3′的另外3個核苷酸鹼基配對，從而使Csy4蛋白穩定結合。檢測寡核苷酸將含有4個核苷酸的識別序列的3′的3個核苷酸的延伸。在檢測寡核苷酸的組中，3個核苷酸的延伸將具有確定的5′核苷酸，隨後為兩個隨機核苷酸位置；或者在5′位置處隨機核苷酸之後為確定的核苷酸和隨機核苷酸；或者在5′端處為2個隨機核苷酸，隨後為確定的核苷酸。在任意這些組中，已知確定的核苷酸基於所附的螢光分子，其發射或激發光譜由核苷酸限定。Csy4蛋白將附接量子點，這些量子點的激發光譜與附接至檢測寡核苷酸的螢光分子的發射光譜重疊。在結合檢測寡核苷酸和Csy4之後，將過量試劑洗滌掉。僅當檢測核苷酸與待測序的RNA形成7-核苷酸雙螺旋時，才可檢測到陽性結合現象。如果出現結合，從附接至檢測寡核苷酸的螢光分子至附接Csy4蛋白的量子點，通過FRET可檢測待測序的RNA、檢測寡核苷酸和Csy4蛋白的所得三元複合物。在各自結合循環之後，使用化學和/或熱變性和洗滌從樣本中去除Csy4蛋白和檢測寡核苷酸。在隨後的測序步驟中，以類似的方式將具有不同序列特異性的其他Csy4蛋白和它們對應的檢測寡核苷酸進行孵育。可設想在檢測寡核苷酸上3-核苷酸延伸的其他變形，例如在檢測寡核苷酸的5′端或3′端處具有不同長度的延伸。檢測寡核苷酸可以為RNA、DNA或這些聚合物的任意化學修飾形式，如PNA或LNA。實施例3：可誘導序列特異性核糖核酸內切酶通過生化和結構技術，生成缺乏裂解活性，但同時保留底物結合活性的Csy4的點突變體。例子是上述Csy4(H29A)突變體。在外源性咪唑的存在下可再活化另外的無催化活性的Csy4(H29A)突變體。將150mM至300mM的咪唑加入至反應緩衝劑中足夠刺激至接近野生型裂解活性。結果顯示在圖8中。圖8顯示咪唑再活化時的裂解活性測定。Csy4H29A是保留以＜1nM的kd結合其底物的能力的無催化活性的Csy4的突變體。反應詳細說明：每10μl反應物包含如所示的5pmol體外轉錄的前體-crRNA底物、100pmol的Csy4(WT或H29A，如圖8所示)、20mMHEPES(pH7.5)、100mMKCl以及150-300mM咪唑。在25℃下使反應進行30分鐘。將產物經酸酚-氯仿萃取，在15％變性凝膠上分離，並且使用SYBRGold來觀察。Csy4(H29A)的生化特徵顯示其以＜1nM親和力結合它的RNA底物。當無當前可選擇方法時，Csy4(H29A)可用於體內和體外施用。Csy4(H29A)(本文也稱為「誘導型」Csy4)可用於純化來自RNA和RNP的複合混合物(RNA/蛋白質複合物)的特定RNA/蛋白質複合物(RNP)。例如，研究者可能對何種蛋白質結合特定RNA轉錄物感興趣。使用該體系，研究者可工程化他們選擇的RNA的表達構建體，該表達構建體包括由莖-環Csy4靶序列組成的5′標記。研究者然後將該表達構建體轉染至他們選擇的細胞類型內，使得生成許多RNA和RNP。然後將細胞裂解，並且將裂解物施加至包含固定在瓊脂糖珠上誘導型Csy4的柱子。具有Csy4靶序列的RNA或RNP將結合。隨後洗滌步驟將去除非特異性結合RNA。使用咪唑(～300mM)的洗滌將活化誘導型Csy4，這將裂解靶序列並且釋放結合的RNA/RNP。該方法示意性圖示在圖9中。可使用類似方法來體外裝配RNP。例如，使用類似於對以上實驗所設計的表達質粒的構建體可體外轉錄選擇的RNA。(構建體必須在轉錄的RNA的5′端處引入Csy4莖-環靶序列)。然後可將該體外轉錄的產物與已知或懷疑結合特定轉錄物的蛋白質孵育。包含誘導型Csy4的柱子可用於純化體外形成的與游離蛋白分離的RNP。實施例4已經測定核糖核酸內切酶CasE的特異性底物識別機制和在大多數細菌和古細菌(vanderOost等，TrendsBiochemSci.34，401-7(2009))中發現的CRISPR免疫系統的主要組分。使用結構和生化方法，鑑定了最佳底物裂解所需的最小RNA序列，包括七個鹼基對莖-環，隨後為兩未配對核苷酸的20個核苷酸的序列(CRISPR重複序列的5-24)。使用X-射線結晶術在解析度下分析結合來自嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)的CasE的該RNA的結構。該結構揭示蛋白質和RNA之間的許多序列特異性接觸，包括在RNA的大溝中許多相互作用。在莖-環中末端鹼基對被破壞，其中A22翻轉出螺旋並與U23鹼基堆疊。通過與S34和E38的相互作用使該構象部分穩定化，這也賦予底物識別的序列特異性。通過定位末端核苷酸，G24，來實現A22和U23構象的進一步穩定化，該G24向後翻轉至具有莖-環的寄存結構(register)內，但正好位於結合口袋中的螺旋下方，所述結合口袋由殘基D18、E24和K31構成，其中在U23和G24之間R27接觸主鏈。A22的定位延長在可剪切磷酸處RNA的主鏈，其在兩活性位點殘基(Y23和H26)之間向外延伸。基於該觀察和通過G24證實的該RNA構象的明顯穩定化，據推測，在催化構象中可能需要G24用於定位RNA。與該假設一致，如同在G24結合中參與的蛋白質殘基突變，G24的缺失或突變導致裂解活性顯著降低。為了證實G24在誘導催化RNA構象中的作用，測定缺乏末端G24殘基的結合19個核苷酸的RNA的CasE的結構。該複合物以兩種不同形式結晶，其顯示在蛋白質的活性位點處兩種不同的RNA構象。在一種晶形(P21)中，在不對稱單元中結構包含8個分子。所有8個分子揭示：A22鹼基與G21堆疊，保持與莖-環的其他部分形成A-形幾何形狀。除了RNA結構的改變之外，蛋白質結構也不同於在結構中觀察到的催化構象。在該結構中，包含R158和K160的環與活性位點並列，這表明這些殘基可在催化或在過渡狀態中間體的穩定化中起作用。在結構中，該環遠離活性位點，並且部分無序化，這表明環的定位是靈活的。令人感興趣的是，在CasE的apo結構中，該環也無序化(Ebihara等，ProteinSci.15，1494-9(2006))，這表明對於該環的穩定需要正確的RNA構象。將對於CasE/19-核苷酸RNA複合物中獲得的第二晶形(P212121)用於測定結構，其揭示在催化構象中結合A22和U23的RNA翻轉出螺旋。然而，在該結構中包含R158和K160的環仍然無序，這表明對於該蛋白質結構的穩定可能也需要G24結合。對相同複合物的兩種不同的RNA構象的觀察表明RNA可取樣多種結構狀態，並且它需要G24將其鎖定至具催化能力的構象內。儘管參照其具體實施方案已經描述本發明，但本領域技術人員應當理解，在未背離本發明的真實精神和範圍下可進行各種改變並且等同形式可被替代。此外，可進行許多修改以使特定情況、材料、物質組分、工序、工序步驟適應本發明的主題、精神和範圍。所有這些修改旨在涵蓋在所附權利要求的範圍內。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp