促進角膜內皮細胞粘附的藥劑的製作方法

2023-07-12 21:15:41 2

專利名稱：促進角膜內皮細胞粘附的藥劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及促進角膜內皮細胞粘附的藥劑(agent)，它用於角膜內皮細胞的粘附、 維護或保護。
背景技術：
當從角膜(在眼球的最前部的透明組織)進入的光線到達視網膜激發視網膜神經 細胞時，認識到視覺信息，並且所產生的電信號經由視神經被傳輸到腦視覺皮層。為了具有 良好的視力，該角膜需要是透明的。當利用角膜內皮細胞的泵吸功能和阻隔功能將水含量 保持在恆定水平時，維持角膜的透明度。人的角膜內皮細胞的密度在出生時是約3000個細胞/1mm2。一旦損傷，該細胞喪 失再生的能力。在由於各種原因引起的角膜內皮的功能性障礙所造成的內皮角膜營養不 良和大皰角膜病中，角膜會發生水腫和變得不透明，並且該視力明顯下降。目前，大皰角膜 病是通過其中角膜的上皮、主質和內皮的整個三層結構被移植的穿透性角膜成形術來治療 的。然而，角膜的捐獻在日本是不夠的，並且雖然有大約5500名的角膜移植術等待患者，但 是每年在日本進行約2700例角膜移植。近年來，僅僅移植損傷組織的「部分移植」的想法已經引起人們的注意以減少排異 反應和手術後併發症的風險，因此獲得更好的視覺功能。在角膜移植中，已經進行了僅僅 移植角膜上皮的上皮移植，移植口腔黏膜而不是移植角膜上皮的已培養的口腔黏膜上皮移 植，移植主質組織的深層式板層角膜移植術等等。也考慮了僅僅移植角膜內皮的方法。對 於角膜內皮的移植，由在膠原層培養的角膜內皮層組成的角膜內皮狀片是已知的(參見專 利文件1和2)。然而，至於角膜內皮細胞，特別地從人衍生的那些，因為角膜捐獻者的數量 是有限的並且離體培養是困難的，因此以移植所需的數量生產培養細胞需要花費時間和成 本。人胚胎莖(ES)細胞顯示出高自複製性和多潛能性，並且從藥物應用方面引起人 們的注意。然而，它具有急劇減少的細胞數的實際問題，因為在培養步驟中分散細胞的手術 容易引起細胞死亡。最近已經發現在人ES細胞的培養過程中發生的細胞死亡是由Rho激 酶(ROCK)的活化所引起，並且ROCK的抑制顯著地抑制細胞死亡，和報導說，通過使用ROCK 抑制劑如Y-27632等，人ES細胞的大量培養和腦細胞的產生能夠可行(非專利文件1)。Rho激酶(ROCK)抑制劑已知具有各種作用。例如，專利文件3公開了 Rho激酶抑 製劑促進角膜軸索形成並且Rho激酶抑制劑用作恢復角膜感知的藥劑。另外，專利文件4 公開了 Rho激酶抑制劑對於視網膜的神經節細胞具有軸突長出促進作用，並且用於視覺功 能紊亂的醫治。專利文件1 JP-A-2004-24852專利文件2 JP-A-2005-229869專利文件3 :W02005/118582專利文件4 :W02002/083175
非專利文獻1 :Nat Biotechnol. 2007，25，681本發明的公開
本發明解決的問題本發明的目的是提供能夠有效地粘附角膜內皮細胞的方式和穩定地供應角膜內 皮製劑的方式。解決問題的手段鑑於上述問題，本發明人已經進行了深入的研究並且發現角膜內皮細胞在培養底 物上的粘附能夠通過在Rho激酶抑制劑的存在下培養細胞而引人注目地得到促進，這導致 了本發明的完成。因此，本發明提供下列這些。[1]促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑，它包括Rho激酶抑制劑。[2]上述[1]的藥劑，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(l-氨基乙 基)-1_ (4-吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5-異喹啉磺醯基)高哌嗪(homopiperazine) 和其可藥用鹽中的至少一種。[3]上述[1]的藥劑，其中該角膜內皮細胞源自於人。[4]上述[1]到[3]中任何一項的藥劑，它是用於角膜內皮功能紊亂的預防或治療 的製劑。[5]上述[4]的藥劑，它是眼房內(intracameral)注射或眼內灌注流體的形式。[6]角膜內皮細胞的培養介質，它包括Rho激酶抑制劑。[7]上述[6]的培養介質，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(l-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[8]上述[6]的培養介質，其中該角膜內皮細胞源自於人。[9]角膜保存溶液，它包括Rho激酶抑制劑。[10]上述[9]的保存溶液，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基 乙基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的 至少一種。[11]上述[9]的保存溶液，其中該角膜源自於人。[12]生產角膜內皮製劑的方法，它包括使用上述[6]到[8]中任何一項的培養介 質培養角膜內皮細胞的步驟。[13]上述[12]的方法，其中角膜內皮細胞源自於人。[14]Rho激酶抑制劑用於生產促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑的用途。[15]上述[14]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(l-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[16]上述[14]的用途，其中角膜內皮細胞源自於人。[17]上述[14]到[16]中任何一項的用途，其中促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑 是用於角膜內皮功能紊亂的預防或治療的製劑。[18]上述[17]的用途，其中促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑是眼房內注射或眼 內灌注流體的形式。
[19]Rho激酶抑制劑用於生產角膜內皮細胞的培養介質的用途。[20]上述[19]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(l-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[21]上述[19]的用途，其中角膜內皮細胞源自於人。
[22]Rho激酶抑制劑用於生產角膜保存溶液的用途。[23]上述[22]的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+) _反式_4_(1_氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[24]上述[22]的用途，其中角膜源自於人。[25]促進角膜內皮細胞的粘附的方法，它包括讓有效量的Rho激酶抑制劑與需要 促進角膜內皮細胞的粘附的靶或角膜內皮細胞進行接觸。[26]上述[25]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+) _反式_4_(1_氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[27]上述[25]的方法，其中角膜內皮細胞源自於人。[28]上述[25]的方法，它為了防止或治療角膜內皮功能紊亂。[29]上述[25]的方法，包括施用有效量的眼房內注射或眼內灌注流體形式的Rho 激酶抑制劑。[30]培養角膜內皮細胞的方法，它包括使用包括Rho激酶抑制劑的培養介質培養 角膜內皮細胞的步驟。[31]上述[30]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[32]上述[30]的方法，其中角膜內皮細胞源自於人。[33]保護角膜的方法，它包括在包括Rho激酶抑制劑的角膜保護溶液中保留角膜 移植物或角膜內皮細胞的步驟。[34]上述[33]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+) _反式_4_(1_氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[35]上述[33]的方法，其中角膜源自於人。[36]生產角膜內皮製劑的方法，它包括使用包括Rho激酶抑制劑的培養介質培養 角膜內皮細胞的步驟。[37]上述[36]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+) _反式_4_(1_氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[38]上述[36]的方法，其中角膜內皮細胞源自於人。[39]治療大皰角膜病，角膜水腫或角膜白斑的方法，包括使用包含Rho激酶抑制劑的培養介質來培養角膜內皮細胞的步驟，和
將在上述培養步驟中獲得的角膜內皮製劑移植到需要角膜內皮移植的患者中的步驟。[40]上述[39]的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+) _反式_4_(1_氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。[41]上述[39]的方法，其中角膜內皮細胞源自於人。本發明的效果促進本發明的角膜內皮細胞的粘附的藥劑含有Rho激酶抑制劑作為活性成分。促 進本發明的角膜內皮細胞的粘附的藥劑促進角膜內皮細胞的粘附和使得形成具有良好細 胞形態和高細胞密度的角膜內皮細胞層。因此，它可用作伴有角膜內皮功能紊亂的疾病如 大皰角膜病和角膜內皮炎的治療劑或預防劑。本發明的促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑可 用作在伴有角膜內皮功能紊亂的疾病的治療或預防中保護角膜內皮的藥劑。此外，本發明 的促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑可用作在與眼內手術如白內障手術、玻璃體手術等等相 關的角膜內皮 功能紊亂，由增大的眼內壓引起的角膜內皮功能紊亂(特別地青光眼侵襲)， 或由接觸透鏡引起的不充足的氧氣所引起的角膜內皮功能紊亂的治療或預防中保護角膜 內皮的藥劑。因為本發明的培養介質或角膜保存溶液含有Rho激酶抑制劑，所以角膜內皮 細胞能夠很好地培養、維持或保存，並確保了角膜內皮製劑的穩定的供應、維持或保存。附圖簡述

圖1是兔子角膜內皮細胞的原始培養物的相差顯微照片(在培養起始後的24小 時之後，放大倍數100倍)。圖2是顯示了由MTS分析法測試的兔子角膜內皮細胞的原始培養物的生長的圖， 其中縱軸顯示在第一天相對於Rock抑制劑(_)組的吸收率的值。圖3是顯示了在培養起始後的24小時之後兔子角膜內皮細胞的原始培養物的粘 附的圖，其中該縱軸顯示了在培養起始後的24小時之後相對於Rock抑制劑(-)組的吸收 率的值。圖4是在培養起始後的第3天猴子角膜內皮細胞的原始培養物的相差顯微照片， 其中放大倍數是100倍。圖5是人角膜內皮細胞的原始培養物的相差顯微照片(第7天，放大倍數100 倍)。圖6顯示了猴子角膜內皮細胞的原始培養物的照片(A =ROCK抑制劑㈠，B =ROCK 抑制劑(+)，放大倍數20倍)和圖(C)顯示培養的細胞的總面積。圖7是顯示了猴子角膜內皮細胞的原始培養物的活細胞數的圖。圖8是顯示Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的傳代培養物的影響的圖。圖9是顯示了在猴子角膜內皮細胞的傳代培養過程中Y-27632對於細胞形態的影 響的相差顯微照片(放大倍數100倍)。圖10是顯示了在猴子角膜內皮細胞的傳代培養過程中Y-27632對於細胞形態的 影響的相差顯微照片(毒傘素螢光染色，放大倍數200倍)。圖11是顯示了 Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的細胞周期的影響的顯微照片 (抗_Ki67抗體染色，放大倍數200倍)。
圖12顯示了考察Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的細胞周期的影響的流式細胞 光度術的結果。圖12Α顯示ROCK抑制劑(-)組的傳代培養的第1天，B顯示ROCK抑制劑 (-)組的傳代培養的第2天，C顯示ROCK抑制劑⑴組的傳代培養的第1天，和D顯示ROCK 抑制劑⑴組的傳代培養的第2天。圖13是通過抗-Ki67抗體陽性細胞比率顯示了圖12的流式細胞光度術的結果的 圖。圖14是顯示Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的凋亡的影響的圖。圖15是由死細胞的數量顯示Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的凋亡的影響的圖。圖16是顯示Y-27632對於培養的猴子角膜內皮細胞的密度的影響的圖。圖17是顯示了在傳代培養後的24小時之後所培養的猴子角膜內皮細胞的粘附 的圖，其中該縱軸顯示了在傳代培養起始後的24小時之後相對於對照組的螢光度而言的 fasudil組的值。
實施本發明的最佳模式本發明的促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑(以下有時簡寫為「本發明的粘附促進 劑」)含有Rho激酶抑制劑作為活性成分。在本發明中，Rho激酶指與Rho的活化一起活化的絲氨酸/蘇氨酸激酶。例 子包括 ROKa (R0CKII :Leung，T. et al.，J. Biol. Chem.，270，29051-29054，1995)， P160R0CK(ROK^，ROCK-I Jshizaki, T. et al.，TheEMBO J.，15(8)，1885-1893，1996)和具
有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的其它蛋白質。在本發明中，一種類型的Rho激酶抑制劑可以單獨被含有，或幾種類型可以根據 需要而相結合被含有。Rho激酶抑制劑的例子包括公開在下面文獻中的化合物US4678783, Patent 3421217， W099/20620, W099/61403, W002/076976, W002/076977, W002/100833, W003/059913, W003/062227, W02004/009555, W02004/022541, W02004/108724, W02005/003101, W02005/039564, W02005/034866, W02005/037197, W02005/037198, W02005/035501, W02005/035503, W02005/035506, W02005/080394, W02005/103050,W02006/057270,ff02007/026664等等。此類化合物能夠根據在所公開的每 一篇文獻中描述的方法來生產。特定的例子包括1-(5-異喹啉磺醯基)高哌嗪(fasudil)， (+)_反式-4-(l-氨基乙基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷(Υ-27632)等等。作為這 些化合物，可優選使用商購的產品。這些當中，(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷， 1-(5-異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽是優選使用的，因為它們在角膜內皮細胞的粘 附的促進上是特別優異的。作為化合物的鹽，藥物學上可接受的酸加合鹽是優選的。該酸的 例子包括無機酸，如鹽酸，氫溴酸，硫酸等等，有機酸，如甲磺酸，富馬酸，馬來酸，苦杏仁酸， 檸檬酸，酒石酸，水楊酸等等。更優選的是(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4_吡啶基氨基 甲醯基)環己烷2鹽酸鹽和1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪鹽酸鹽。在本發明中，「角膜內皮細胞的粘附的促進」的例子包括在角膜內皮細胞之間的粘 附的促進和角膜內皮細胞對培養底物的粘附的促進兩者。本發明的粘附促進劑提供對於從哺乳動物(例如，人，小鼠，大鼠，倉鼠，兔子，貓，狗，牛，綿羊，猴子等等)的角膜組織中所分離的角膜內皮細胞或對於從其分離的並且傳代 (passaged)的角膜內皮細胞的粘附促進作用。因為本發明的粘附促進劑在來源於人的角膜 內皮細胞的粘附促進作用上是優異的，來源於人的角膜內皮細胞被認為特別難以培養和傳 代(passage)，人來源的角膜內皮細胞是優選的靶。角膜內皮細胞在維持角膜的透明度上起著作用。當內皮細胞的密度在某個範圍下 降時，該角膜產生溶脹並且變得無法維持透明度，據此產生了角膜內皮功能紊亂。本發明的 粘附促進劑促進角膜內皮細胞的粘附，使得具有良好細胞形態和高細胞密度的角膜內皮細 胞層能夠形成，並且進一步顯示出對角膜內皮細胞的凋亡抑制作用。因此，它可用作伴有角 膜內皮功能紊亂的疾病如大皰角膜病和角膜內皮炎的治療劑或預防劑。另外，本發明的粘 附促進劑可用作與眼內手術如白內障手術、玻璃體手術等等相關的角膜內皮功能紊亂，由 增大的眼內壓引起的角膜內皮功能紊亂(特別地青光眼侵襲)，或由因為接觸透鏡導致的 不充足的氧氣所引起的角膜內皮功能紊亂的治療劑或預防劑。儘管本發明的粘附促進劑沒有特別限制，只要它具有適合於局部給藥於眼睛的劑 型就行，但是它優選以眼房內注射或眼內灌注流體形式配製。它們能夠通過在本領域中廣 泛使用的普通方法來製備。當它以眼房內注射或眼內灌注流體形式被局部施用於眼睛時， Rho激酶抑制劑和角膜內皮細胞在身體內接觸，並且促進角膜內皮細胞的粘附。例如，當本發明的粘附促進劑用作眼房內注射或眼內灌注流體時，穩定劑(例如， 亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，依地酸鈉，檸檬酸鈉，抗壞血酸，二丁基羥基苯等等)，增溶劑(例 如，甘油，丙二醇，聚乙二醇，聚氧化乙烯氫化蓖麻油等等)，懸浮劑(例如，聚乙烯基吡咯烷 酮，羥丙基甲基纖維素，羥甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉等等)，乳化劑(例如，聚乙烯吡咯 烷酮，大豆磷脂，蛋黃卵磷脂，聚氧化乙烯氫化蓖麻油，聚山梨酸酯80等等)，緩衝劑(例如， 磷酸鹽緩衝劑，乙酸鹽緩衝劑，硼酸鹽緩衝劑，碳酸鹽緩衝劑，檸檬酸鹽緩衝劑，三羥甲基氨 基甲烷緩衝液，穀氨酸，氨基己酸等等)，增稠劑(例如，水溶性纖維素衍生物比如甲 基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素等等，硫酸軟骨素鈉，透明質酸 鈉，聚羧乙烯，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇等等)，防腐劑(例如，苯扎氯銨，氯化 苄乙氧銨，雙氯苯雙胍己烷葡糖酸鹽，氯丁醇，苄醇，脫氫醋酸鈉，對_羥基苯甲酸酯，依地 酸鈉，硼酸等等)，等滲劑(例如，氯化鈉，氯化鉀，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，硼酸，葡萄糖， 丙二醇等等)，ρΗ調節劑(例如，鹽酸，氫氧化鈉，磷酸，乙酸等等)，清涼劑(例如，L-薄荷 醇，d-莰酮，d-2-莰醇，薄荷油等等)等等能夠作為添加劑添加進去。這些添加劑的添加量 取決於添加劑的種類和用途以及其它因素來改變，並且以能夠實現添加劑的目的的濃度添 加。活性成分在本發明的粘附促進劑中的量通常是0. 00001-lw/v %，優選 0. 00001-0. lw/v %,更優選0.0001-0. 01w/v%。儘管劑量和給藥頻率將取決於症狀， 年齡，體重和給藥形式而變化，但是，當它用作成年人的眼房內注射劑時，例如，含有 0. 0001-0. lw/v %、優選0. 0001-0. 01w/v%的活性成分的製劑通常能夠通過0. 01-0. ImL/ 每次給藥的方式每天給藥幾次，優選1-2次，更優選1次。當角膜內皮細胞在試管中培養時，本發明的粘附促進劑也能夠被添加到培養介質 中。當通過向培養介質中添加Rho激酶抑制劑來繼續培養時，Rho激酶抑制劑和角膜內皮 細胞在活體外接觸，並促進角膜內皮細胞的粘附。
本發明提供角膜內皮細胞的培養介質，該介質含有Rho激酶抑制劑。在本發明的 培養介質中所含的Rho激酶抑制劑是如上所述。本發明的培養介質能夠含有一般用於內皮細胞(例如，DMEM(GIBC0 BRL)，血清 (例如，胎牛血清(FBS))，生長因子(例如，b-FGF)，抗生素(例如，青黴素，鏈黴素)等等的 培養的介質。在本發明的培養介質中Rho激酶抑制劑的濃度通常是1-100 μ Μ,優選5-20 μ Μ，更 優選10 μ Mo本發明的培養介質通過增大角膜內皮細胞的粘附來防止細胞的脫落，並且使得形 成具有良好細胞形態和高細胞密度的角膜內皮細胞層。因此，它能夠優選用於本發明的角 膜內皮製劑的下述生產方法中。另外，本發明的培養介質也用於維持角膜內皮細胞。本發明提供含有Rho激酶抑制劑的角膜保存溶液。在本發明的角膜保存溶液中所 含的Rho激酶抑制劑是如上所述。角膜保存溶液是用於保存從捐獻者所分離的角膜移植物 直至移植給接受者為止的液體。
本發明的角膜保存溶液的例子包括通常用於角膜移植術的保存溶液(角膜鞏膜 的外植體保存溶液(Optisol GS 註冊商標)，角膜移植術的眼球的保存溶液(ΕΡΙΙ 註冊商 標))，鹽水，磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)等等，它們中的每一種含有Rho激酶抑制劑。在本發明的角膜保存溶液中Rho激酶抑制劑的濃度通常是1-100μΜ，優選 5-20 μ Μ,更優選 10 μ Mo本發明的角膜保存溶液通過增大角膜內皮細胞的粘附來防止細胞的脫落，並且使 得形成具有良好細胞形態和高細胞密度的角膜內皮細胞層。因此，它能夠用作用於器官移 植等等的角膜保存溶液。另外，本發明的保存溶液也用作角膜內皮細胞的低溫保藏的保存 溶液。為了低溫保藏，甘油，二甲亞碸，丙二醇，乙醯胺等等可以進一步被添加加到本發明的 保存溶液中。本發明提供生產角膜內皮製劑的方法，它包括使用本發明的培養介質培養角膜內 皮細胞的步驟。該角膜內皮製劑特徵性地含有底物和在底物上的角膜內皮細胞層，該層已經在試
管中培養。在本發明中，底物沒有特別限制，只要它能夠承載所培養的角膜內皮細胞層並且 能夠在移植之後在體內維持它的形狀至少3天。另外，當在試管中培養角膜內皮細胞時底 物可具有支架(scaffold)的作用，或在培養之後可僅僅起著承載角膜內皮細胞層的作用。 優選地，底物用於培養角膜內皮細胞，並且作為支架，在培養完成之後直接用於移植。上述底物的例子包括從天然物質如膠原、明膠、纖維素等等衍生的聚合物材料，合 成聚合物材料如聚苯乙烯，聚酯，聚碳酸酯，聚(N-異丙基丙烯醯胺)等等，可生物降解的聚 合物材料如聚乳酸，聚乙醇酸等等，氫氧磷灰石，羊膜等等。儘管上述底物的形狀沒有特別限制，只要它支持角膜內皮細胞層並且適合於移植 就行，但是它優選是片。當本發明的製劑是片時，它能夠在移植過程中被切成適合於應用位 點的尺寸之後使用。還有可能將小片捲起，然後將它從傷口的口緣插入。優選的特定例子 包括覆蓋病變角膜內皮區域的約80%的圓形。也優選的是在上述圓的鄰近部分中形成狹 縫，這樣它能夠緊密地粘附於應用位點。
在優選的實施方案中，上述底物是膠原。作為膠原，可優選使用描述在 JP-A-2004-24852中的膠原片。該膠原片能夠根據描述在上述JP-A-2004-24852中的方法 從例如羊膜製備。上述角膜內皮細胞層優選顯示出下列特性中的至少一種。更優選，它顯示出下列 特性中的兩種或多種，更優選全部。(1)該細胞層具有單個層狀結構。這是在身體內角膜內皮細胞層的諸多特性中的一種。(2)該細胞層具有約1，000-約4，000個細胞/mm2的細胞密度。特別地，當成年人 是接受者(移植接受者)時，它優選是約2，000-約3，000個細胞/mm2。(3)構成細胞層的細胞具有基本上六邊形的平面圖。這是構成在身體內 的角膜內 皮細胞層的細胞的諸多特性中的一種。本發明的製劑類似於在身體內的角膜內皮細胞層， 顯示出與先天的角膜內皮細胞層的功能類似的功能，並且也能夠顯示出活體內增殖能力。(4)細胞在細胞層中規則地排列。在身體內的角膜內皮細胞層中，構成該層的細胞 規則排列，鑑於此原因，角膜內皮細胞被認為維持正常功能和高透明度並且該角膜被認為 適當地顯示出水控制功能。因此，具有該形態特徵的本發明製劑預計顯示出與在身體內角 膜內皮細胞層的功能類似的功能。本發明的生產方法包括使用本發明的培養介質培養角膜內皮細胞的步驟並且例 如能夠通過下列方法來進行。角膜內皮細胞的採集和在試管中的培養角膜內皮細胞是通過普通方法從接受者他自己/她自己或合適捐獻者的角膜中 採集的。考慮到在本發明中的移植條件，可以製備外源的角膜內皮細胞。例如，Descemet 膜和角膜組織的內皮細胞層是從角膜基質上剝離，放入到培養皿中，然後用中性蛋白酶 (dispase)等等處理。通過這一方法，從Descemet膜上分出角膜內皮細胞。保留在Descemet 膜上的角膜內皮細胞能夠通過移液管移取和類似方式被取出。在Descemet膜的取出後， 角膜內皮細胞在本發明的培養介質中培養。培養介質能夠例如通過適當地添加FBS(胎牛 血清)，b-FGF(basiC-fibloblast生長因子)，和抗生素如青黴素、鏈黴素和類似物到商購 DMEM(Dulbecco，s ModifiedEagle' s Medium)中，和進一步添加 Y-27632 或 fasudil 到其 中而獲得。優選使用在表面上具有I型膠原，IV型膠原，粘連蛋白，層粘連蛋白或牛角膜內 皮細胞的細胞外基質等等的塗層的培養容器(培養皿)。或者，可以使用用商購塗層劑如 FNC塗覆混合物(註冊商標)等等處理的一般培養容器。通過該塗層和本發明的培養介質 的結合使用，促進了角膜內皮細胞在培養容器的表面上的粘附，並且實現了良好生長。儘管角膜內皮細胞的培養的溫度條件沒有特別限制，只要角膜內皮細胞生長就 行，但是考慮到生長效率，例如，溫度是約25-約45°C，優選約30-約40°C，和進一步優選是 約37°C。該培養是在約5-10% CO2濃度的環境中在溼潤條件下在普通細胞培養器中進行。傳代培養傳代培養能夠在經受培養的角膜內皮細胞的生長之後進行。當細胞達到亞融合或 融合時優選進行傳代培養。傳代培養能夠如下進行。該細胞能夠通過用胰蛋白酶-EDTA等 處理從培養容器的表面上分離，並且回收。本發明的培養介質被添加到回收的細胞中得到 細胞懸液。在細胞的回收過程中或在回收之後優選進行離心處理。該離心處理獲得具有高細胞密度的細胞懸液。優選的細胞密度是大約1-2 X IO6個細胞/mL。作為這裡的離心處理的條件，例如能夠提及500rpm(30g)-IOOOrpm (70g)，1-10分鐘。按照與在上述初始培養中相同的方式將細胞懸液接種在培養容器上，然後培養。 儘管在傳代過程中的稀釋比率取決於細胞的條件，但是它是大約1 2-1 4，優選約 1 3。該傳代培養能夠在與上述初始培養的培養條件類似的培養條件下進行。儘管培養 時間取決於所使用的細胞的條件來改變，但是它例如是7-30天。以上傳代培養能夠根據需 要進行多次。通過使用本發明的培養介質，在培養的最初階段中細胞粘附會增大，據此培養 時間能夠縮短。角膜內皮細胞層的製備細胞懸液被接種在底物如膠原片等等上，然後培養。這裡，接種細胞的數量被控 制，使得最終生產的角膜內皮製劑具有具備所需細胞密度的細胞層。確切地說，接種細胞， 使得形成具有約1，000-約4，000個細胞/mm2的細胞密度的細胞層。培養能夠在與上述初 始培養的那些條件類似的條件和其它類似條件下進行。儘管培養時間取決於所使用的細胞 的條件來改變，但是它例如是3-30天。通過按照上述方式進行培養，能夠獲得其中在底物上已形成了在試管中所培養的 角膜內皮細胞層的角膜內皮製劑。在本發明中，該角膜內皮製劑可以含有本發明的培養介質以維持角膜內皮細胞。 另外，該角膜內皮製劑可以含有本發明的角膜保存溶液，直至它用於移植為止。本發明也提 供本發明的角膜內皮製劑和培養介質或保存溶液的結合物。由本發明的生產方法獲得的角膜內皮製劑能夠用作需要角膜內皮的移植的疾病 的治療用移植物，所述疾病例如是大皰角膜病，角膜水腫，角膜白斑，特別地，由於角膜營養 不良、創傷或眼內手術導致的角膜內皮功能紊亂所引起的大皰角膜病。本發明的粘附促進劑和角膜內皮製劑的給藥患者包括，例如哺乳動物(例如，人， 小鼠，大鼠，倉鼠，兔，貓，狗，牛，綿羊，猴子等等)。
實施例本發明在下面參見實施例來更詳細地進行解釋，這些實施例不認為是限制性的。 根據 the International Guiding Principles for BiomedicalResearch Involving Animals 以及 Act on welfare and management ofanimals 禾口與實驗雲力物的餵養、持有 等相關的標準來使用實驗動物。根據the Association for Research in Vision md Ophthalmology 針對 the Useof Animals in Ophthalmic and Vision Research 的指南來 進行這一實驗。實施例1ROCK抑制劑對於兔子角膜內皮細胞的培養的影響的研究從安樂死之後立即分離出的兔角膜組織上分離出粘附有角膜內皮細胞的 Descemet膜。Descemet膜與中性蛋白酶 11(1. 2U/ml,RocheApplied Science) 一起在37°C， 5 % CO2的條件下培養45分鐘，然後通過移液管移取手術以機械方式分離出角膜內皮細胞。 分離的角膜內皮細胞進行離心處理，ROCK抑制劑(+)組的細胞在添加有Υ_27632(10μΜ) 的用於角膜內皮的介質中進行攪拌以及ROCK抑制劑㈠組的細胞在沒有添加Y-27632的用於角膜內皮的介質中進行攪拌，達到相同的濃度，並且這些細胞是以約2000個細胞/孔 的密度被接種在96孔板上。作為用於角膜內皮的介質，使用添加有胎牛血清和2mg/ml bFGF (GibcoInvitrogen)的培養介質(DMEM，Gibco Invitrogen)。該板用 FNC 塗覆混合物 (Athena ES)預處理10分鐘。在從培養起始後的72小時，該培養介質被交換並且在72小 時後，ROCK抑制劑⑴組和ROCK抑制劑㈠組都在不含Y-27632的用於角膜內皮的常規介 質中培養，直到第5天為止。在培養起始後的24小時之後，兔子角膜內皮細胞的原始培養 物的相差顯微照片示於圖1中。從培養起始之後的第1天到第3天，這些細胞是每24小時 通過使用 CellTiter 96 (註冊商標)AQueous One Solution Ce 1 IProIiferation (Promega) 由MTS ([3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺基苯基)-2H-四 唑鐺])分析法來計數(圖2)。在ROCK裡抑制劑⑴組中(圖1B)，在細胞接種之後在24小時(1天)中的細胞 粘附顯著地增加到ROCK抑制劑㈠組(圖1A)的約2. 8倍(圖2和3)。在第3天當細胞 實現融合時，在兩個組之間沒有發現顯著差異(圖2)。從它可以清楚地看出，在兔子角膜內 皮細胞的原始培養物中傳代之後Y-27632具有在早期階段增大細胞粘附的作用。另外，在 使用兔子角膜內皮細胞的傳代培養的研究中也獲得類似的結果，因此，Y-27632被認為對於 在原始培養物和傳代培養中傳代之後的早期細胞粘附起作用。實施例2Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的培養的影響的研究從為了其它目的被安樂死的獼猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離 出粘附有角膜內皮細胞的Descemet膜。對於ROCK抑制劑(+)組，Descemet膜放入到添加 了 Υ-27632(10μΜ)的用於角膜內皮的介質中並在37°C，5% CO2的條件下培養10分鐘。對 於ROCK抑制劑(-)組，該膜被放入到沒有添加Y-27632的用於角膜內皮的介質中並且在相 同的條件下培養10分鐘。作為用於角膜內皮的介質，使用與實施例1中相同的細胞培養介 質。在培養之後獲得的Descemet膜與中性蛋白酶(Dispase) II (1. 2U/ml, Roche Applied Science) 一起在37°C，5% CO2的條件下培養45分鐘，然後通過移液管移取手術以機械方式 分離出角膜內皮細胞。分離的角膜內皮細胞進行離心處理並在Υ_27632(+)和Y-27632 (-) 達到相同濃度的用於角膜內皮的介質中攪拌，然後這些細胞以約20000個細胞/孔的密度 被接種在12孔板上。該板用FNC塗覆混合物(Athena ES)預處理10分鐘。在從培養起始 後的72小時，該培養介質被交換並且在72小時後，ROCK抑制劑⑴組和ROCK抑制劑(-) 組都在不含Y-27632的用於角膜內皮的常規介質中培養。從圖4，在從培養起始後的24小時之後在獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮 細胞的原始培養物中，顯然更多的細胞粘附於在ROCK抑制劑(+)中的板上(圖4b)，這是指 與ROCK抑制劑(-)相比而言(圖4A)。在達到融合之前的天數對於ROCK抑制劑(+)是3， 而對於ROCK抑制劑(-)是7。從其中可以表明，在培養起始之後的早期階段中Y-27632增 加細胞粘附並且是有用的藥物，該藥物甚至在認為與兔子相比體外培養比較困難的猴子角 膜內皮細胞中能夠進行細胞培養。實施例3Y-27632對於人角膜內皮細胞的培養的影響的研究在從US眼庫獲得的人角膜組織中，中心部分(直徑7mm)已經用於角膜移植術和使用剩下的外圍角膜組織。分離已粘附有角膜內皮細胞的Descemet膜。對於ROCK抑制劑(+)組，Descemet膜被放入到添加了 Y-27632 (10 μ M)的用於角膜內皮的介質中並且 在37°C、5%C02的條件下培養10分鐘。對於ROCK抑制劑(-)組，該膜被放入到沒有添加 Y-27632的用於角膜內皮的介質中並且在相同的條件下培養10分鐘。作為用於角膜內皮 的介質，使用與實施例1中相同的細胞培養介質。在培養之後的Descemet膜與中性蛋白酶 (Dispase) 11(1. 2U/ml, Roche Applied Science) 一起在 37°C，5% CO2 的條件下培養 45 分 鍾，然後通過移液管移取手術以機械方式分離出角膜內皮細胞。分離的角膜內皮細胞進行 離心處理並在Y-27632(+)和Υ-27632(_)達到相同濃度的用於角膜內皮的介質中攪拌，然 後這些細胞以約10000個細胞/孔的密度被接種在已用FNC塗覆混合物(Athena ES)預處 理的48孔板上。從外圍角膜組織獲得的人角膜內皮細胞的數量是極其少的，因此，一隻眼 睛的捐獻者角膜在一個孔中培養。用於該研究的捐獻者角膜是對於ROCK抑制劑(+)組， 在捐獻者(年齡69歲)的死亡之後的6天開始培養，和對於ROCK抑制劑(-)組，在捐獻者 (年齡51歲)死亡之後的7天開始培養。對於年齡和從捐獻者的死亡到細胞培養所消逝的 時間的影響被認為是幾乎相同的。在從培養起始後的72小時，該培養介質被交換，並且在72小時後，ROCK抑制劑 (+)組和ROCK抑制劑㈠組都在不含Y-27632的用於角膜內皮的常規介質中培養。為了研 究對於在培養起始後的早期階段中的細胞粘附以及細胞形態的影響，用相差顯微鏡觀察細 胞並且在培養起始後用數字式照象機拍取照片(圖5)。從圖5中，在培養起始後的第7天，由與正常角膜內皮細胞類似的細胞(均勻的 多角形細胞)組成的融合和高度緻密的單個細胞層是在ROCK抑制劑(+)組中形成的(圖 5B)，而具有低密度的成纖維細胞狀長條形內皮細胞僅僅在ROCK裡抑制劑(-)組中以小島 形狀存活(圖5A)。從這些結果可以認為，在已知極其難以培養的人角膜內皮的原始培養 中，具有在培養起始後的早期階段中增大細胞粘附的作用的Y-27632在培養介質中的添加 能夠實現具有良好細胞形態和高細胞密度的角膜內皮細胞層的形成。配方實施例1含有Rho激酶抑制劑的眼房內注射劑根據常規方法製備下列眼房內注射劑。Y-27632IOmg磷酸二氫鈉0. Ig氯化鈉0. 9g氫氧化鈉適量滅菌淨化水適量總量IOOmL(pH 7)使用由Wako Pure Chemicallndustries, Ltd 製造的 Y-27632。配方實施例2含有Rho激酶抑制劑的眼內灌注流體根據常規方法製備下列眼內灌注流體。Y-276321. Omg
OPEGUARD MA適量總量IOOmL使用由Senju Pharmaceutical Co. , Ltd.製造的 OPEGUARD MA 和由Wako Pure Chemical Industries, Ltd 白勺 Y—27632。配方實施例3角膜內皮片的製備用的含Rho激酶抑制劑的培養介質根據常規方法製備下列培養介質。Y-276320. 5mgFBSIOmL青黴素-鏈黴素溶液ImLFGF basic200ngDMEM適量總量IOOmL使用由Invitrogen製造的FBS，由Nacalai Tesque製造的青黴素-鏈黴素溶液 (含有青黴素 5000u/mL 和鏈黴素 5000 μ g/mL)，由 Invitrogen 製造的!7GF basic,由 Wako Pure Chemicallndustries, Ltd.製造的 Y-27632，和由 Invitrogen 製造的 DMEM。配方實施例4含有Rho激酶抑制劑的角膜保存溶液根據常規方法製備下列保存溶液。Y-276320. 2mgOptisol-GS適量總量IOOmL使用由 Bausch&Lomb，Inc.製造的 Optisol—GS，禾口 由 Wako PureChemical Industries, Ltd 製造的 Y-27632。實施例4Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的原始培養的影響的研究從安樂死的獼猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內 皮細胞的Descemet膜。按照與實施例2同樣的方式，對於ROCK抑制劑(+)組，Descemet 膜被放入到添加了 Υ_27632(10μΜ)的用於角膜內皮的介質中並且在37°C、5% CO2的條件 下培養10分鐘。對於ROCK抑制劑(-)組，該膜被放入到沒有添加Y-27632的用於角膜內 皮的介質中並且在相同的條件下培養10分鐘。作為用於角膜內皮的介質，使用與實施例1 中相同的細胞培養介質。在培養之後的Descemet膜與中性蛋白酶(Dispase) II (1. 2U/ml， Roche Applied Science) 一起在37°C，5% CO2的條件下培養45分鐘，然後通過移液管移取 手術以機械方式分離出角膜內皮細胞。分離的角膜內皮細胞進行離心處理並在Υ_27632(+) 和Y-27632 (-)達到相同濃度的用於角膜內皮的介質中攪拌，然後這些細胞以約2000個細 胞/孔的密度被接種在96孔板上。在從培養起始後的72小時，該培養介質被交換並且在 72小時後，ROCK抑制劑⑴組和ROCK抑制劑㈠組都在不含Y-27632的用於角膜內皮的 常規介質中培養。在培養的第10天，這些細胞用4%仲甲醛在室溫下固定10分鐘，然後用 甲苯胺藍染色(圖6A和6B)。細胞的總面積通過使用Image J(Nationallnstitutes ofHealth)測量和分析(圖6C)。在培養起始後的第10天的獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮細胞的原始培 養物中，通過促進在培養的早期階段中的粘附，ROCK抑制劑(+)(圖6B)顯著地使培養的 細胞的總面積增大到相當於ROCK抑制劑㈠(圖6A)的約1. 6倍(圖6C)。從它可以表明 Y-27632甚至在認為體外培養很困難的猴子角膜內皮細胞中是可用於原始培養的藥物。實施例5對於猴子角膜內皮細胞而言的Y-27632的最佳濃度的研究將按照與實施例2中相同的方式採集的猴子角膜內皮細胞(原始培養物)加 入到各自以1、10、33和ΙΟΟμΜ添加Υ-27632的用於角膜內皮的介質中，和加入到沒有 添加Υ-27632的用於角膜內皮的介質中，並且攪拌到相同的濃度，然後這些細胞以約 2000個細胞/孔的密度接種在96孔板上。在培養起始後的24小時，活細胞通過使用 CellTiter-Glo (註冊商標，Promega)(圖 7)來計數。當在培養起始後的第24小時的角膜內皮細胞在含有10 μ M Y-27 632的介質中培 養時，粘附於板上的細胞的數量是顯著高的(圖7)，這是指與在沒有添加Υ-27632的用於角 膜內皮的介質中以及含有不同濃度的Υ-27632的用於角膜內皮的介質中的細胞培養相比 而言。從其中表明，在10 μ M的濃度下Υ-27632對於猴子角膜內皮細胞是最有效的。實施例6Υ-27632對於猴子角膜內皮細胞的傳代培養的影響的研究從安樂死的獼猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內 皮細胞的 Descemet 膜。Descemet 膜與中性蛋白酶 II (1. 2U/ml，Roche Applied Science) 一起在37 °C，5 % CO2的條件下培養45分鐘，然後通過移液管移取手術以機械方式分離出角 膜內皮細胞。分離的角膜內皮細胞進行離心處理，然後接種在用於角膜內皮的介質上。實 現融合的角膜內皮細胞在37°C，5% CO2的條件下用0. 05%胰蛋白酶培養10分鐘，然後傳 代培養。在4到6代後，該角膜內皮細胞被加入到96孔板上達到1/2，1/6或1/8的稀釋 比。對於ROCK抑制劑(+)組通過使用添加了 Υ_27632(10μΜ)的用於角膜內皮的介質和對 於ROCK抑制劑(-)組通過使用沒有添加Υ-27632的用於角膜內皮的介質來繼續進行傳代 培養。在傳代後的24小時，按照與實施例5中同樣的方式通過使用CellTiter-Glo (註冊 商標，Promega)(圖8)來計數。當在傳代後的第24小時的已培養的獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮細胞 在含有Y-27632的介質中傳代培養時，粘附於板上的細胞的數量是顯著高的(圖8)，這是 指與在沒有添加Y-27632的用於角膜內皮的介質相比而言。從其可表明，除了原始培養外， Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的傳代培養也是有效的。實施例7Y-27632對於在猴子角膜內皮細胞的傳代培養中細胞形態的影響的研究按照與實施例6中相同方式傳代培養的獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮細 胞在載片上次代培養至1/4的稀釋比。在傳代培養後的24小時，用相差顯微鏡觀察細胞形 態(圖9A和9B)。此外，在載片上的角膜內皮細胞用4%仲甲醛在室溫下固定10分鐘，並 且肌纖蛋白纖維由毒傘素螢光染色法(圖IOA和10B)來染色。在傳代後的第24小時的已培養的獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮細胞中，當在含有Y-27632的介質中進行傳代培養時(圖9Β)，細胞在載片上的粘附增加，促進了展 平成角膜內皮細胞狀細胞，並且與不含Υ-27632的用於角膜內皮的介質相比也增加了細胞 的凝聚(圖9Α)。另外，通過毒傘素螢光染色，當在含有Υ-27632的介質中進行傳代培養 時(圖10Β)，與不含Υ-27632的用於角膜內皮的介質相比清楚地觀察到肌纖蛋白應力纖維 (圖10Α)，並且已發現Υ-27632促進細胞骨架的形成。實施例8Υ-27632對於猴子角膜內皮細胞的細胞周期的影響的研究
按照與實施例6中相同方式傳代培養的獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮 細胞在載片上次代培養1/4的稀釋比。添加了 Υ-27632(10μΜ)的用於角膜內皮的介質是 用於ROCK抑制劑(+)組以及沒有添加Υ-27632的用於角膜內皮的介質是用於ROCK抑制 劑(_)組。在傳代培養的第1，2和14天，在載片上的角膜內皮細胞在室溫下用4%仲甲 醛固定10分鐘，然後用抗_Ki67抗體進行免疫染色(圖11)。類似地，另外，獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮細胞在ROCK抑制劑⑴組和ROCK抑制劑㈠組當中的每一個中 傳代培養至1/4的稀釋比。在傳代培養的第1和2天，這些細胞通過使用0. 05%胰蛋白酶 被採集並且通過使用抗-Ki67抗體進行流式細胞光度術，然後測定細胞周期(圖12和13)。與ROCK抑制劑(_)組相比，在傳代培養的第1和2天，ROCK抑制劑(+)組含有許 多Ki67陽性細胞。然而，當在第14天這些細胞幾乎實現融合時，ROCK抑制劑(+)組的陽性 細胞的數量低於ROCK抑制劑㈠組的數量(圖11)。同樣在流式細胞光度術中，ROCK抑制 劑(+)組在傳代培養的第1和2天含有許多Ki67陽性細胞，這是指與ROCK抑制劑(-)組 相比(圖12和13)。因為在細胞增殖周期Gl中的細胞核中發現Ki67抗原，並且從S到M階段，已表明 Y-27632具有在獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮細胞的傳代培養之後的早期階段中 加速細胞周期的作用並且是可用於有效細胞培養的藥物。實施例9Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的凋亡的影響的研究按照與實施例6中相同方式傳代培養的獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮 細胞被次代培養至1/4的稀釋比。添加了 Υ-27632(10μΜ)的用於角膜內皮的介質是用於 ROCK抑制劑(+)組以及沒有添加Υ-27632的用於角膜內皮的介質是用於ROCK抑制劑(-) 組。在傳代培養的第1天，包括在介質中的那些細胞在內的全部細胞通過使用0. 05%胰蛋 白酶被採集並且通過使用Armexin V和PI (Propidium Iodide)進行流式細胞光度術，然後 測定細調凋亡(圖14和15)。ROCK抑制劑(+)組顯示了在傳代培養的第1天凋亡細胞與全部細胞的比率的顯 著減少(圖14)，這是指與ROCK抑制劑㈠組相比。此外，每IXlO4個細胞中凋亡細胞的 數量的比較揭示了在ROCK抑制劑(+)組中的顯著減少，這是指與ROCK抑制劑(-)組相比 (圖 15)。從其中可以表明，Y-27632在獼猴(Macaca fascicularis)角膜內皮細胞的傳代 培養中具有抑制凋亡的作用。實施例10Y-27632對於猴子角膜內皮細胞的密度的影響的研究
從安樂死的獼猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內 皮細胞的 Descemet 膜。Descemet 膜與中性蛋白酶 II (1. 2U/ml，Roche Applied Science) 一起在37 °C，5 % CO2的條件下培養45分鐘，然後通過移液管移取手術以機械方式分離出角 膜內皮細胞。分離的角膜內皮細胞進行離心處理，然後接種在用於角膜內皮的介質上。實 現融合的角膜內皮細胞在37°C，5% CO2的條件下用0. 05%胰蛋白酶培養10分鐘，然後傳代 培養。添加了 Υ_27632(10μΜ)的用於角膜內皮的介質是用於ROCK抑制劑⑴組以及沒有 添加Y-27632的用於角膜內皮的介質是用於ROCK抑制劑(-)組。在從培養起始後的72小 時，該培養介質被交換，並且在72小時後，ROCK抑制劑(+)組和ROCK抑制劑(-)組都在不 含Y-27632的用於角膜內皮的常規介質中培養。在每一次傳代中，用相差顯微鏡拍取細胞 的照片，測量細胞密度，以及研究Y-27632對於所培養的猴子角膜內皮細胞的密度的影響。該傳代重複7次，和該ROCK抑制劑(+)組在整個傳代培養的期間顯示出更高的細 胞密度(圖16)，這是指與ROCK抑制劑(-)組相比。從這一點可以認為正是Y-27632的使 用能夠實現具有高密度的角膜內皮細胞的培養，其未來將可用於再生藥物，如培養角膜內 皮片的移植。實施例11fasudil對於猴子角膜內皮細胞的培養的影響的研究從安樂死的獼猴(Macaca fascicularis)解離的角膜組織中分離出粘附有角膜內 皮細胞的 Descemet 膜。Descemet 膜與中性蛋白酶 II (1. 2U/ml，Roche Applied Science) 一起在37 °C，5 % CO2的條件下培養45分鐘，然後通過移液管移取手術以機械方式分離出角 膜內皮細胞。分離的角膜內皮細胞進行離心處理，然後在用於角膜內皮的介質中傳代培養。 作為用於角膜內皮的介質，使用與實施例1中相同的細胞培養介質。在通過0.05%胰蛋白 酶處理進行的傳代培養過程中所收集的已培養的猴子角膜內皮細胞被分離和離心處理，並 且在fasudil組中在添加了 fasudil(10yM，SIGMA-ALDRICH)的用於角膜內皮的介質中和 在對照組中在沒有添加fasudil的用於角膜內皮的介質中攪拌至相同的濃度，然後這些細 胞以約2000個細胞/孔的密度被接種到96孔板上。在培養起始後的24小時，粘附細胞通 過使用 CellTiter-Glo (註冊商標)Luminescent CellViability Assay (Promega)(圖 17) 來計數。通過使用fasudil (—種ROCK抑制劑)也發現了角膜內皮細胞的受促進的細胞粘 附的效果。配方實施例5含有Rho激酶抑制劑的眼房內注射劑根據常規方法製備下列眼房內注射劑。fasudilIOmg磷酸二氫鈉0. Ig氯化鈉0. 9g氫氧化鈉適量滅菌淨化水適量總量IOOmL(pH 7)配方實施例6
角膜內皮片的製備用的含Rho激酶抑制劑的培養介質根據常規方法製備下列培養介質。fasudil0. 5mgFBSIOmL青黴素-鏈黴素溶液 ImLFGF basic200ngDMEM適量
總量IOOmL使用由Invitrogen製造的FBS，由Nacalai Tesque製造的青黴素-鏈黴素溶 液(含有青黴素5000u/mL和鏈黴素5000 μ g/mL)，由Invitrogen製造的FGF basic,和由 Invitrogen 製造的 DMEM。本申請是基於在日本提交的專利申請No 2007-223141 (申請日2007年8月29 日)和2008-016088(申請日2008年1月28日)，它們的內容全部引入這裡供參考。
權利要求
促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑，它包括Rho激酶抑制劑。
2.根據權利要求1的藥劑，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(l-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
3.根據權利要求1的藥劑，其中該角膜內皮細胞源自於人。
4.根據權利要求1到3中任何一項的藥劑，它是用於角膜內皮功能紊亂的預防或治療 的製劑。
5.根據權利要求4的藥劑，它是眼房內注射或眼內灌注流體的形式。
6.角膜內皮細胞的培養介質，它包括Rho激酶抑制劑。
7.根據權利要求6的培養介質，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基 乙基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的 至少一種。
8.根據權利要求6的培養介質，其中該角膜內皮細胞源自於人。
9.角膜保存溶液，它包括Rho激酶抑制劑。
10.根據權利要求9的保存溶液，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基 乙基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的 至少一種。
11.根據權利要求9的保存溶液，其中該角膜源自於人。
12.生產角膜內皮製劑的方法，它包括使用權利要求6到8中任何一項的培養介質培養 角膜內皮細胞的步驟。
13.根據權利要求12的方法，其中該角膜內皮細胞源自於人。
14.Rho激酶抑制劑用於生產促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑的用途。
15.根據權利要求14的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
16.根據權利要求14的用途，其中該角膜內皮細胞源自於人。
17.根據權利要求14到16中任何一項的用途，其中促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑是 用於角膜內皮功能紊亂的預防或治療的製劑。
18.根據權利要求17的用途，其中促進角膜內皮細胞的粘附的藥劑是眼房內注射或眼 內灌注流體的形式。
19.Rho激酶抑制劑用於生產角膜內皮細胞的培養介質的用途。
20.根據權利要求19的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
21.根據權利要求19的用途，其中該角膜內皮細胞源自於人。
22.Rho激酶抑制劑用於生產角膜保存溶液的用途。
23.根據權利要求22的用途，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
24.根據權利要求22的用途，其中該角膜源自於人。
25.促進角膜內皮細胞的粘附的方法，它包括讓有效量的Rho激酶抑制劑與需要促進 角膜內皮細胞的粘附的靶或角膜內皮細胞進行接觸。
26.根據權利要求25的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(l-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
27.根據權利要求25的方法，其中該角膜內皮細胞源自於人。
28.根據權利要求25的方法，它為了防止或治療角膜內皮功能紊亂。
29.根據權利要求25的方法，包括施用有效量的眼房內注射或眼內灌注流體形式的 Rho激酶抑制劑。
30.培養角膜內皮細胞的方法，它包括使用包括Rho激酶抑制劑的培養介質培養角膜 內皮細胞的步驟。
31.根據權利要求30的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
32.根據權利要求30的方法，其中該角膜內皮細胞源自於人。
33.保護角膜的方法，它包括在包括Rho激酶抑制劑的角膜保護溶液中保留角膜移植 物或角膜內皮細胞的步驟。
34.根據權利要求33的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
35.根據權利要求33的方法，其中該角膜源自於人。
36.生產角膜內皮製劑的方法，它包括使用包括Rho激酶抑制劑的培養介質培養角膜 內皮細胞的步驟。
37.根據權利要求36的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
38.根據權利要求30的方法，其中該角膜內皮細胞源自於人。
39.治療大皰角膜病，角膜水腫或角膜白斑的方法，包括使用包含Rho激酶抑制劑的培養介質來培養角膜內皮細胞的步驟，和將在培養步驟中獲得的角膜內皮製劑移植到需要角膜內皮移植的患者中的步驟。
40.根據權利要求39的方法，其中該Rho激酶抑制劑是選自(+)_反式-4-(1-氨基乙 基)-1-(4_吡啶基氨基甲醯基)環己烷，1-(5_異喹啉磺醯基)高哌嗪和其可藥用鹽中的至 少一種。
41.根據權利要求39的方法，其中該角膜內皮細胞源自於人。
全文摘要
提供的是能夠有效地生長角膜內皮細胞的方法和穩定地供應角膜內皮製劑的方法。促進角膜內皮細胞的粘附的含有Rho激酶抑制劑的藥劑，含有Rho激酶抑制劑的用於角膜內皮細胞的培養介質，用於保存角膜的含有Rho激酶抑制劑的溶液，以及生產角膜內皮製劑的方法，該方法包括使用以上培養介質培養角膜內皮細胞的步驟。
文檔編號A61K31/4409GK101835491SQ20088011289
公開日2010年9月15日 申請日期2008年8月28日 優先權日2007年8月29日
發明者上野盛夫, 小泉範子, 木下茂 申請人:千壽製藥株式會社;木下茂