TGF－β拮抗劑限制免疫抑制劑腎毒性的用途的製作方法

2023-07-17 01:47:36 3

專利名稱：TGF－β拮抗劑限制免疫抑制劑腎毒性的用途的製作方法
技術領域：
本發明的技術領域涉及器官移植學、臨床免疫學和腎臟學的領域。本發明涉及減少某些免疫抑制劑(包括環胞菌素)的腎毒性副作用的方法。
背景技術：
免疫抑制通常被用於減少組織/器官移植中發生排斥的風險以及自身免疫病和炎性疾病的療法。環胞菌素A(CsA)是目前最廣泛使用的免疫抑制劑。他克莫司(TAC)(也稱FK506)和西羅莫司(也稱雷帕黴素)是其它兩種常用的免疫抑制劑。有關各種免疫抑制療法的綜述參見例如Schuurman et al.(2001)Modern Immunosuppressives(Milestonesin Drug Therapy)，Birkhauser，Boston；和Sayegh et al.(2001)Current andFuture Immunosuppressive Therapies Following Transplantation，KluwerAcademic Publishers。
儘管開發出了改進的治療策略，免疫抑制劑伴隨產生的不良副作用仍是一個重大的挑戰。腎毒性是許多免疫抑制療法特別是採用鈣調磷酸酶抑制劑的療法的嚴重併發症。
急性環胞菌素(CsA)毒性會引起腎炎，其特徵是腎小球濾過率(GFR)和腎血流減少、低鎂血症和腎小管損傷。同樣，慢性CsA毒性會導致漸進的腎功能障礙，其特徵是腎間質纖維化、腎小管腔萎縮和血管變化如動脈局部缺血。這些變化最終導致晚期腎病和腎衰竭。腎毒性例如在用他克莫司(參見例如English et al.(2002)Am.J.Transplant.，2769-273)和西羅莫司(參見例如Fervenza et al.(2004)Nephrol.Dial.Transplant.，19(5)1288-1292)治療的移植接受者中觀察到。
最近的研究已暗示轉化生長因子-β(TGF-β)是某些免疫抑制劑的免疫抑制活性和/或腎毒性的介體，這些免疫抑制劑包括CsA、他克莫司和雷帕黴素(Khanna et al.(2000)Transplantation，70(4)90-694)。在CsA腎毒性的非移植模型中通過給予抗TGF-β抗體來阻斷TGF-β，已證實能極大地減少總體的組織纖維化(Khanna et al.(1999)Transplantation，67882-889；Islam(2001)59498-506；Ling et al.(2003)J.Am.Soc.Nephrol.，14377-388)，但是，該抗體也會使藥物的免疫抑制作用受到抑制。
已研究了許多實驗策略，目的在於減少這類藥物的腎毒性，同時保持其免疫抑制作用。可通過與TGF-β相關但間接的機制調節腎毒性的藥物包括麥考酚酸莫酯(MMF)(Shihab et al.(2003)Am.J.Transplant.，31550-1559)、螺內酯(Feria et al.(2003)Kidney Int.，6343-52)、氯沙坦(Yang et al.(2003)Transplantation，75309-315)、維生素E(Jenkins et al.(2001)Transplantation，71331-334)、吡非尼酮(Shihab(2002)Am.J.Transplantation，2111-119)和血管緊張素受體阻斷(Boffaet al.(2003)J.Am.Soc.Nephrol.，141132-1144)。但是，它們並非完全令人滿意。
因此，需要有這樣的治療方式，它能讓CsA或其它免疫抑制劑腎毒性減少，同時又能保持這些免疫抑制劑的免疫抑制活性。
發明概述TGF-β介導某些免疫抑制劑的免疫抑制作用和腎毒性作用。由於這種雙重活性，在本發明之前，不清楚使用直接的TGF-β拮抗劑(例如抗TGF-β抗體)的輔助療法是否能充分減少這些藥物的腎毒性作用，同時又基本上不幹擾它們的免疫抑制活性。
本發明提供減少免疫抑制劑腎毒性，特別是在器官移植或自身免疫病情形下減少免疫抑制劑腎毒性的方法和組合物。因此，所述方法可用於治療正進行免疫抑制療法的患者，以預防移植排斥或者治療自身免疫病。
本發明在部分基於以下發現和實證，即按同種異體移植存活率來判斷，低劑量而不是高劑量的抗TGF-β抗體能減輕CsA介導的腎毒性，而基本上不幹擾CsA的免疫抑制活性。
在所進行的與本發明有關的實驗中，給予接受心臟移植的CsA免疫抑制大鼠抗TGF-β抗體。用較低劑量(1mg/kg)的抗TGF-β抗體治療的大鼠顯示出腎毒性作用減少，而它們的移植存活率與只用CsA治療的對照相似。在相同的條件下，較高劑量的(2.5mg/kg)的抗TGF-β抗體則幾乎完全破壞CsA的免疫抑制作用。
因此，本發明提供用以改善免疫抑制劑腎毒性副作用的輔助療法，該免疫抑制劑至少部分通過TGF-β的上調介導其免疫抑制活性。通常，這種免疫抑制劑在給藥後會誘導TGF-β的表達。這種免疫抑制劑的實例包括但不限於環胞菌素、他克莫司和西羅莫司。本發明提供治療或預防由這種免疫抑制劑所誘導的腎炎的方法。
本發明的方法包括給予需要免疫抑制而用免疫抑制劑治療的哺乳動物TGF-β拮抗劑。TGF-β拮抗劑以治療有效量給予，其足以減輕免疫抑制劑腎毒性作用而又基本上不幹擾其免疫抑制活性。
TGF-β拮抗劑給予的劑量要使得免疫抑制劑腎毒性作用減少，同時保持免疫抑制劑的治療功效。通常，TGF-β拮抗劑給予的劑量比不用免疫抑制劑時會被給予以治療腎炎的建議劑量要低(例如低20％)。
在一些實施方案中，TGF-β拮抗劑是直接TGF-β拮抗劑，例如抗TGF-β抗體、抗TGF-β受體抗體或可溶性TGF-β受體。在具體的實施方案中，TGF-β拮抗劑是抗TGF-β抗體1D11、抗TGF-β抗體CAT192或抗TGF-βCAT152或者任何這些抗體的衍生物。在非限制性的優選實施方案中，TGF-β拮抗劑是美國臨時申請號60/651,343中所公開的人泛特異性抗體(pan-specific antibody)如PET1073G12、PET 1074B9或PET1287A10。
本發明進一步提供檢測免疫抑制劑腎毒性的方法，以及評估試驗化合物或組合物減少免疫抑制劑腎毒性作用的能力的方法。這些方法包括從用免疫抑制劑治療的哺乳動物獲得生物樣品，並測定一種或多種選自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子的表達水平。表達水平預示著免疫抑制劑腎毒性和/或所述化合物或組合物減少免疫抑制劑腎毒性的有效性。
附圖簡述

圖1顯示的Kaplan-Meier圖說明了高劑量的抗TGF-β抗體對CsA的免疫抑制作用的負面影響，及較低劑量的該抗體對腎毒性的有利影響。在用CsA的同時，接受者還每周三次用抗TGF-β抗體或對照抗體治療(各為2.5或1.0mg/kg)。包括以下組別同基因移植物(isograft)、未治療的同種異體移植物(allograft)、CsA治療的同種異體移植物、CsA+對照抗體(2.5mg/kg)、CsA+抗TGF-β抗體(2.5mg/Kg)、CsA+對照抗體(1.0mg/kg)、CsA+抗TGF-β抗體(1.0mg/Kg)和同種型抗體(isotype)對照。抗TGF-β抗體在2.5mg/kg劑量消除CsA的免疫抑制作用，但在1.0mg/kg下卻不會。CsA+對照抗體治療的接受者沒有顯示移植排斥，但加以處死以與抗TGF-β抗體治療的接受者進行比較。
圖2顯示圖1所述的各治療組中TGF-β、膠原和纖連蛋白mRNA的腎內表達水平。結果以TGF-β、膠原和纖連蛋白與持家基因β-肌動蛋白的比率表示。與同基因移植物相比，可看到CsA治療的接受者中TGF-β、膠原和纖連蛋白mRNA的表達統計學顯著增加。與CsA治療的動物組相比，可看到CsA+抗TGF-β抗體組中TGF-β、膠原和纖連蛋白mRNA的表達統計學顯著減少，而與CsA+對照抗體組卻沒有差別。(P值如下TGF-β*p＜0.02和**p＜0.003；膠原！p＜0.0001和！！p＜0.008；纖連蛋白#p＜0.0001和##p＜0.002.)。
圖3顯示MMP-2和TIMP-2 mRNA的腎內表達。結果以MMP-2和TIMP-2與持家基因β-肌動蛋白的比率表示。與同基因移植物相比，可看到CsA治療的接受者中MMP-2和TIMP-2的表達統計學顯著增加。與CsA治療的動物組相比可看到，CsA+抗TGF-β抗體組中MMP-2的表達統計學顯著減少，而與CsA+對照抗體組卻沒有差別。對於TIMP-2，與CsA治療的動物組相比可看到CsA+抗TGF-β抗體組中其表達減少(儘管統計學不顯著)。(P值如下MMP-2*p＜0.0002和**p＜0.004；TIMP-2！p＜0.03和！！p＜0.18)。
圖4顯示如圖1所述用1mg/kg抗TGF-β抗體治療的動物中TGF-β的血漿水平。與同基因移植物對照相比，用CsA治療的動物中觀察到血漿TGF-β水平統計學顯著增加。與CsA治療的動物組相比可看到，CsA+抗TGF-β抗體組中TGF-β水平統計學顯著減少。(P值如下p＜0.0001和**p＜0.003)。
圖5證明了TAC和/或抗TGF-β抗體對腎移植接受者中腎功能的影響。圖5A顯示了用0.25mg/kg TAC治療90天的動物中或同基因移植物對照中的BUN水平。接受者在用TAC治療的同時，還每周兩次用抗TGF-β抗體或對照抗體治療(各為1mg/kg)。包括以下組別同基因移植物對照、TAC治療的同種移植、TAC+對照抗體和TAC+抗TGF-β抗體。與同基因移植物對照(p＜0.0001)或對照抗體相比觀察到，TAC治療的動物中BUN水平統計學顯著增加。與只用TAC治療相比，用抗TGF-β抗體治療減少BUN水平(p＜0.01)。用對照抗體治療也稍微減少BUN水平，但該減少沒有統計學顯著性。圖5B顯示了用TAC治療的動物中或同基因移植物對照中的肌酸酐水平。動物按圖5A所述進行治療。與同基因移植物對照(p＜0.04)或對照抗體相比觀察到，只用TAC治療的動物中肌酸酐水平統計學顯著增加。與只用TAC治療相比，用抗TGF-β抗體治療減少BUN水平(p＜0.02)。用對照抗體治療也稍微減少肌酸酐水平，但減少沒有統計學顯著性。
圖6顯示抗TGF-β抗體對TGF-β、NOX-1、p22phox和Rac-1 mRNA的腎內表達的影響。動物按圖5A所述進行治療。抗TGF-β抗體抑制TAC誘導的腎內TGF-β、NOX-1、p22phox和Rac-1 mRNA表達，而對照抗體不行。
圖7顯示TAC對大鼠腎移植物中TGF-β、SOD和TRX mRNA表達的影響。動物按圖5A所述進行治療。在TAC治療的大鼠移植接受者中，發現TGF-β mRNA與SOD和TRX mRNA的表達情況相反。抗TGF-β抗體抑制腎內TGF-β，但能部分恢復SOD和TRX mRNA表達。
圖8顯示按圖5A所述治療的動物中p22phox和NOX-1表達的蛋白質印跡分析的結果。與未處理同種異體移植(最後兩泳道)和同基因移植物對照(前面兩泳道)兩者相比，用TAC治療後p22phox和NOX-1的腎內表達升高。
圖9顯示了TAC和/或抗TGF-β抗體對腎移植接受者中TGF-β蛋白質的循環水平的影響。動物按圖5A所述進行治療。血漿樣品中的TGF-β蛋白質的循環水平用ELISA進行定量。TAC治療的接受者與同基因移植物對照相比顯示出TGF-β表達的統計學顯著增高。與TAC治療的動物組相比，觀察到TAC+抗TGF-β抗體組中TGF-β水平統計學顯著減少；而與TAC+對照抗體治療的接受者相比，只用TAC治療的接受者中沒有觀察到TGF-β表達的統計學顯著差異。(P值如下*p＜0.01和**p＜0.01)。
序列簡述SEQ ID NO1-12表示如實施例所述用以評估腎臟中的基因表達水平的PCR引物。
發明詳述本發明的方法包括給予用免疫抑制劑治療的哺乳動物TGF-β拮抗劑。本發明的方法減少用免疫抑制劑治療所伴隨產生的腎毒性，但基本上不減少免疫抑制劑的免疫抑制活性。
TGF-β拮抗劑TGF-β是二硫鍵連接的二聚體，作為約400胺基酸(aa)的前蛋白原合成，經切割分泌產生為成熟的TGF-β。稱為「潛活相關肽」(latency-associated peptide，LAP)的N末端切割片斷可保持與二聚體的非共價結合，從而使TGF-β失活。體內分離出的TGF-β主要以這種失活的「潛活」形式即與LAP結合的形式存在。潛活TGF-β複合物可用幾種方式來激活，例如通過結合到名為陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸/胰島素樣生長因子II接受者的細胞表面接受者來激活。結合是通過甘露糖-6-磷酸殘基連接到LAP當中的糖基化位點而發生的。與接受者結合後，TGF-β即以其成熟形式釋放出來。然後成熟有活性的TGF-β就可自由地結合其接受者而發揮其生物功能。II型TGF-β接受者中的主要TGF-β結合結構域已作圖至19胺基酸序列(Demetriou et al.(1996)J.Biol.Chem.，27112755)。
本文所用術語「TGF-β」指TGF-β的任何一種或多種同種型(isoform)。同樣，術語「TGF-β接受者」指能結合至少一種TGF-β同種型的任何接受者，除非另外指明。目前已知有五種TGF-β同種型(TGF-β1～TGF-β5)，它們相互同源(60-80％同一性)，都能形成約25kDa的同型二聚體，且都對共同的TGF-β接受者(TβR-I、TβR-II、TβR-IIB和TβR-III)起作用。TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3見於哺乳動物。TGF-β及TGF-β接受者的結構和功能情況是本領域公知的(參見例如Cytokine Reference，eds.Oppenheim et al.，Academic Press，San Diego，CA，2001)。TGF-β在各物種中非常保守。例如，大鼠和人的成熟TFG-β1的胺基酸序列近乎相同。因此，預計TFG-β的拮抗劑具有很高的物種交叉反應性。
術語「TGF-β拮抗劑」及其相關詞如「抑制劑」、「中和」和「下調」是指充當TGF-β生物活性的拮抗劑的化合物(適當時指化合物的性質)。TGF-β拮抗劑可例如結合併中和TGF-β的活性；降低TGF-β表達水平；影響前體分子的穩定性和向有活性的成熟形式的轉化；幹擾TGF-β與一種或多種接受者的結合；或者可幹擾TGF-β接受者的胞內信號轉導。術語「直接TGF-β拮抗劑」一般指直接下調TGF-β的生物活性的任何化合物。某種分子如果通過與TGF-β基因、TGF-β轉錄物、TGF-β配體或TGF-β接受者發生相互作用來下調TGF-β的生物活性，則它就是「直接下調」TGF-β的生物活性。
用以評估TGF-β和TGF-β拮抗劑的中和生物活性的方法是本領域公知的。一些較為常用的體外生物測定法的實例包括以下(1)在軟瓊脂中於EGF存在下誘導NRK細胞的集落形成(Roberts et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，785339-5343)；(2)誘導原代間葉細胞分化以表達軟骨表型(Seyedin et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，822267-2271)；(3)抑制MvlLu貂肺上皮細胞(Danielpour et al.(1989)J.Cell.Physiol.，13879-86)和BBC-1猴腎細胞(Holley et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775989-5992)的生長；(4)抑制C3H/HeJ小鼠胸腺細胞的有絲分裂發生(Wrann et al.(1987)EMBO J.，61633-1636)；(5)抑制大鼠L6成肌細胞的分化(Florini et al.(1986)J.Biol.Chem.，26116509-16513)；(6)測量纖連蛋白產生(Wrana et al.(1992)Cell，711003-1014)；(7)誘導融合到螢光素酶報導基因的纖溶酶原激活物抑制劑I(PAI-1)(Abe et al.(1994)Anal.Biochem.，216276-284)；(8)夾心酶聯免疫吸附測定法(Danielpour et al.(1989)GrowthFactors，261-71)；(9)Singh et al.(2003)Bioorg.Med.Chem.Lett.，13(24)4355-4359中描述的細胞測定法。
可用於本發明方法的TGF-β拮抗劑的實例包括但不限於抗一種或多種TGF-β同種型的單克隆和多克隆抗體(美國專利第5,571,714號；WO 97/13844；WO 00/66631)；顯性陰性和可溶性TGF-β接受者或抗TGF-β接受者的抗體(Flavell et al.(2002)Nat.Rev.Immunol.，2(1)46-53；美國專利第5,693,607號；美國專利第6,001,969號；美國專利第6,008,011號；美國專利第6,010,872號；WO 92/00330；WO93/09228；WO 95/10610和WO 98/48024)；LAP(WO 91/08291)；LAP結合的TGF-β(WO 94/09812)；TGF-β結合糖蛋白/蛋白聚糖如胎球蛋白(美國專利第5,821,227號)；飾膠蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、纖調蛋白聚糖、腔蛋白聚糖和內皮糖蛋白(美國專利第5,583,103號；美國專利第5,654,270號；美國專利第5,705,609號；美國專利第5,726,149號；美國專利第5,824,655號；美國專利第5,830,847號；美國專利第6,015,693號；WO 91/04748；WO 91/10727；WO 93/09800和WO94/10187)；甘露糖-6-磷酸或甘露糖-1-磷酸(美國專利第5,520,926號)；促乳素(WO 97/40848)；胰島素樣生長因子II(WO 98/17304)；植物、真菌和細菌的提取物(EU 813875；JP8119984和美國專利第5,693,610號)；反義寡核苷酸(美國專利第5,683,988號；美國專利第5,772,995號；美國專利第5,821,234號；美國專利第5,869,462號和WO94/25588)；參與TGF-β信號轉導的蛋白質，包括SMAD和MAD(EP874046；WO 97/31020；WO 97/38729；WO 98/03663；WO 98/07735；WO 98/07849；WO 98/45467；WO 98/53068；WO 98/555 12；WO98/56913；WO 98/53830；WO 99/50296；美國專利第5,834,248號；美國專利第5,807,708號和美國專利第5,948,639號)；Ski和Sno(Vogel(1999)Science，286665和Stroschein et al.(1999)Science，286771-774)；以及保留有直接抑制TGF-β生物活性能力的上述分子的任何突變體、片斷或衍生物。
可用於本發明方法的TGF-β拮抗劑的實例包括小分子抑制劑，如絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑，例如WO 04/21989；WO 03/87304；WO04/26871；WO 04/26302；WO 04/24159；美國專利第6,184,226號；WO 03/97639和WO 04/16606中描述的絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑。
在一些實施方案中，TGF-β拮抗劑是直接TGF-β拮抗劑，例如阻斷TGF-β與其接受者結合的抗體。
本文所用的術語「抗體」指免疫球蛋白或其部分，涵括包含抗原結合位點的任何多肽，而不論來源、生產方法和其它特性如何。該術語包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變抗體和CDR移植抗體(CDR-graftedantibody)。術語「抗原結合結構域」指包含能與抗原的一部分或全部特異性結合或互補的區域的抗體分子部分。在抗原較大的情況下，抗體可只結合抗原的特定部分。「表位」或「抗原決定簇」是抗原分子中負責與抗體的抗原結合結構域發生特異性相互作用的部分。抗原結合結構域可包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。抗原結合結構域可由一個或多個抗體可變結構域(例如由VH結構域組成的Fd抗體片斷、由VH結構域和VL結構域組成的Fv抗體片斷及由VH結構域和VL結構域通過接頭連接組成的scFv抗體片斷)提供。術語「抗TGF-β抗體」或「抗至少一種TGF-β同種型的抗體」指特異性結合TGF-β的至少一個表位的任何抗體。術語「TGF-β接受者抗體」和「抗TGF-β接受者的抗體」指特異性結合TGF-β接受者(例如I型、II型或III型接受者)的至少一個表位的任何抗體。
可用於本發明方法的抗體要能特異性結合至少一種TGF-β同種型或結合至少一種TGF-β接受者的胞外結構域。本文所用的術語「特異性相互作用」或「特異性結合」或它們的相關詞，意思是兩個分子形成在生理條件下相對穩定的複合物。特異性結合的特徵是高親合力和低至中等的容量。非特異性結合通常具有低親合力和中等至高的容量。通常，當親合常數大於106M-1或優選大於108M-1時，則認為結合是特異性的。
在一些其它實施方案中，抗TGF-β抗體特異性結合至少一種選自以下的TGF-β同種型TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。在還其它的實施方案中，抗TGF-β抗體特異性結合至少(a)TGFβ1、TGF-β2和TGF-β3(「泛中和抗體『)；(b)TGF-β1和TGF-β2；(c)TGF-β1和TGF-β3；(d)TGF-β2和TGF-β。在各種實施方案中，TGF-β抗體對至少一種其特異性結合的TGF-β同種型的親合常數Ka優選大於106MU-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1。在另外的實施方案中，本發明的抗體特異性結合與人TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3基本相同的蛋白質。還設想用於人類的是所引用參考文獻中描述的來自任何脊椎動物物種的非人抗體的人源化形式和完全人形式及衍生物。產生這種變體完全在技術人員的平常技藝範圍內(參見例如Antibody Engineering，ed.Borrebaeck，2nd ed.，OxfordUniversity Press，1995)。
在非限制性示例性實施方案中，抗TGF-β抗體是雜交瘤1D11.16(ATCC保藏命名號HB 9849，也描述於美國專利第5,571,714號；第5,772,998號和第5,783,185號中)所產生的鼠單克隆抗體1D11。可以檢索號AAB46787獲得1D11重鏈可變區的序列。因此，在相關的實施方案中，抗TGF-β抗體是1D11的衍生物，例如所包含的CDR序列與AAB46787中相同的抗體，如人源化抗體。在另外的實施方案中，抗TGF-β抗體是通過噬菌體展示產生的完全人重組抗體，如WO00/66631、美國專利第6,492,497號及美國專利申請出版物2003/0091566和2003/0064069中所描述的CAT192和CAT152，或者是包含本文所公開的CDR序列的抗體。在還更多的實施方案中，抗TGF-β抗體是通過導向選擇從1D11、CAT192或CAT152產生的抗體。
在非限制性的優選實施方案中，抗TGF-β抗體是美國臨時申請號60/651,343中公開的人泛特異性抗體，如PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10。
1D11抗體特異性結合TGF-β的所有三種哺乳動物同種型，而CAT192隻特異性結合TGF-β1。1D11和CAT192的抗原親合力分別是大約1nM和8.4pM。針對1D11(Dasch et al.(1998)J.Immunol.，1421536-1541)和CAT192的表位已作圖至成熟TGF-β的C末端部分。
免疫抑制劑本發明提供用以改善免疫抑制劑腎毒性副作用的輔助療法，所述免疫抑制劑至少部分通過上調TGF-β介導其免疫抑制活性。本文所用術語「免疫抑制劑」指能誘導免疫抑制的化合物，即它能預防或幹擾免疫反應的發展。免疫抑制劑的實例包括但不限於SandimmuneTM(環胞菌素)；PrografTM；ProtopicTM(他克莫司)；RapamuneTM；NeoralTM(西羅莫司)；FTY720；CerticanTM(依維莫司、雷帕黴素)衍生物；CampathTM-1H(阿侖單抗、抗CD52抗體)；RituxanTM(利妥昔單抗、抗CD20抗體)；OKT4；LEA29Y(BMS-224818、CTLA4Ig)；吲哚基-ASC(他克莫司和子囊黴素的32-吲哚醚衍生物)；ImuranTM(硫唑嘌呤)；AtgamTM(抗胸腺細胞/球蛋白)；OrthocloneTM(OKT3；莫羅單抗-CD3)；CellceptTM(麥考酚酸莫酯)；ZenapaxTM(達克珠單抗)、CytoxanTM(環磷醯胺)、潑尼松、潑尼松龍和其它皮質類固醇丙二腈醯胺(MNAs(來氟米特、FK778、FK779))及15-脫氧精胍菌素(DSG)。
用以評估某種藥物的免疫抑制活性的方法是本領域公知的。如實施例中所述，在有和沒有藥理學幹預下移植器官在體內的存活時間長度可充當對免疫反應的抑制作用的定量度量。也可使用體外測定，例如混合淋巴細胞反應(MLR)測定法(參見例如Fathman et al.(1977)J Immunol.，118(4)1232-1238)；CD3測定(通過抗CD3抗體特異性激活免疫細胞(e.g.，OKT3))(參見例如Khanna et al.(1999)Transplantation，67(6)882-889 and Khanna et al.(1999)Transplantation，67(7)S58)及IL-2R測定(用外源加入的細胞因子IL-2特異性激活免疫細胞)(參見例如Farrar et al.，(1981)J.Immunol.，126(3)1120-1125)。
本發明對於至少部分通過上調TGF-β介導其免疫抑制活性的腎毒性免疫抑制劑特別有用。這種免疫抑制劑在給予後會誘導急性或慢性腎炎。通常，誘導作用與給予免疫抑制劑後TGF-β的表達升高有關。本發明提供治療或預防由這種免疫抑制劑誘導的腎炎的方法。
特定的免疫抑制劑是否通過上調TGF-β介導其免疫抑制活性可用本領域公知的方法來確定，例如實施例中所描述的方法。通過上調TGF-β介導其免疫抑制活性的免疫抑制劑的具體實例包括但不限於環胞菌素、他克莫司和西羅莫司(參見例如Khanna(2000)Transplantation，70(4)690-694；Khanna et al.(1999)Transplantation，67(7)S84和Khanna et al.(1999)Transplantation，67(6)882-889)。
環胞菌素A(CAS No.59865-13-3；美國專利第3,737,433號)命名為[R-[RR*(E)}]環(L-丙氨醯-D-丙氨醯-N-甲基-L-亮氨醯-N-甲基-L-亮氨醯-N-甲基-L-纈氨醯-3-羥基-N，4-二甲基-L-2-氨基-6-辛烯醯-L-α-氨基-丁醯-N-甲基甘氨醯-N-甲基-L-亮氨醯-L-纈氨醯-N-甲基-L-亮氨醯)。自1972年就知道其免疫抑制作用(Borel，J.F.Cyclosporine.InDale et al.(eds.)Textbook of Immunology(3rd ed.)，Blackwell Scient.Publ.Oxford 1994，pp 320-329)。還知道有許多顯示免疫抑制活性的其它環胞菌素及其衍生物和類似物。環胞菌素及其製劑描述於例如2004Physicians』Desk Reference(2003)Thomson Healthcare，58th ed.及以下各號美國專利中5,766,629；5,827,822；4,220,641；4,639,434；4,289,851；4,384,996；5,047,396；4,388,307；4,970,076；4,990,337；4,822,618；4,576,284；5,120,710；4,894,235。
他克莫司(FK506)是大環內酯，在其發揮各種作用的分子模式及其臨床功效兩方面很大程度上類似於CsA(Liu(1993)Immunol.Today，14290-295；Schreiber et al.(1992)Immunol.Today，13136-142)；但是，這些作用是在比CsA低20-100倍的劑量下顯示的(Peters et al.(1993)Drugs，46746-794)。在化學上，他克莫司是[3S-[3R*[E(1S*，3S*，4S*)]，4S*，5R*，8S*，9E，12R*，14R*，15S*，16R*，18S*，19S*，26aR*]]-5，6，8，11，12，13，14，15，16，17，18，19，24，25，26，26a-十六氫-5，19-二羥基-3-[2-(4-羥基-3-甲氧基環己基)-1-甲基乙烯基]-14，16-二甲氧基-4，10，12，18-四甲基-8-(2-丙烯基)-15，19-環氧-3H-吡啶並[2，1-c][1，4]氧雜氮雜環二十三烯-1，7，20，21(4H，23H)-四酮，一水合物。他克莫司及其製劑描述於例如2004 Physicians』Desk Reference(2003)Thomson Healthcare，58th ed.及美國專利第4,894,366號；第4,929,611號和第5,164,495號。
西羅莫司(雷帕黴素)是免疫抑制性內醯胺大環內酯，可例如由吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)產生。在化學上，西羅莫司是(3S，6R，7E，9R，10R，12R，14S，15E，17E，19E，21S，23S，26R，27R，34aS)-9，10，12，13，14，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十六氫-9，27-二羥基-3-[(1R)-2-[(1S，3R，4R)-4-羥基-3-甲氧基環己基]-1-甲基乙基]-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-23，27-環氧-3H-吡啶並[2，1-c][1，4]氧雜氮雜環三十一烯-1，5，11，28，29(4H，6H，31H)-五酮。西羅莫司的結構在例如Kesseler et al.(1993)Helv.Chim.Acta，76117中給出。
有多種西羅莫司衍生物和類似物及它們的製劑是公知的，在例如2004 Physicians』Desk Reference(2003)Thomson Healthcare，58thed.及WO 94/02136、WO 94/09010、WO 92/05179、WO 93/11130、WO 94/02385、WO 95/14023、WO 94/02136及美國專利第5,258,389號；第5,118,677號；第5,118,678號；第5,100,883號；第5,151,413號；第5,120,842號和第5,256,790號中有描述。
用途和給藥方法本發明的方法包括將TGF-β拮抗劑與腎毒性免疫抑制劑一起給予哺乳動物。
按本發明的方法進行治療的哺乳動物包括但不限於人類和其它靈長類動物、嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠)、兔、貓、狗、牛和豬。
按本發明的方法進行治療的哺乳動物包括需要免疫抑制的患者，例如患有自身免疫病的患者。適於本發明方法治療的自身免疫病的實例包括系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、多發性硬化、克羅恩氏病(炎性腸病)、I型糖尿病、重症肌無力、牛皮癬、格雷夫斯氏病、貝格氏病、硬皮病、斯耶格倫氏症候群、關節強直性脊椎炎、古德帕斯徹氏症候群、自身免疫性溶血性貧血、艾迪遜氏病、橋本甲狀腺炎、特發性血小板減少性紫癜、惡性貧血和自發性不育症。
按本發明的方法進行治療的哺乳動物還包括需要免疫抑制的患者，例如有器官或組織移植物而要進行免疫抑制治療的患者。「移植物(transplant)」指任何移植物(graft)或組織或者器官的全部或部分，或者對於接受者(宿主)而言外來的細胞。移植物的實例包括但不限於心臟、腎臟、肺、肝臟、角膜、骨髓、血管和胰島細胞移植物。移植物可來自與接受者相同的物種(同種異體移植物)，或者來自接受者物種以外的物種(異種移植物)。
對移植患者的免疫抑制處理是從圍手術期和緊接著移植後的誘導期開始的。誘導治療是緊接著手術後進行(不過往往緊接在手術前進行)的為期約兩周的加強免疫抑制過程，目的是在移植後「切斷」免疫系統，以減少發生加速排斥和急性排斥的可能性。然後在同種異體移植物的壽命期間內繼續進行維持治療。誘導策略和維持策略可能使用到特定劑量的不同免疫抑制劑，或者它們的劑量經過調整以便獲得能提供最佳移植存活率的治療水平。在某些實施方案中，TGF-β拮抗劑在免疫抑制治療的誘導期、在維持期或者在這兩期給予患者。
TGF-β拮抗劑以治療有效量給予，其足以減輕免疫抑制劑腎毒性作用而又基本上不幹擾其免疫抑制活性。
術語「足以減輕腎毒性作用」指減慢或逆轉因免疫抑制劑造成的腎功能損失或腎結構劣化。「腎功能」指腎臟執行其生理功能如壓濾、選擇性再吸收、腎小管分泌和/或全身血壓調節的能力。
用以評估腎功能的方法是本領域公知的，包括但不限於對全身血壓和腎小球毛細血管壓、蛋白尿(例如清蛋白尿)、微觀和宏觀血尿素、血清肌酸酐水平(例如估計人的腎功能的一個準則是把2.0mg/dl的肌酸酐水平等同於50％的正常腎功能，4.0mg/dl則等同於25％)、腎小球濾過率(GFR)(例如肌酸酐清除率)下降及腎小管損害程度的測量。
有關腎功能及疾病狀態的詳細綜述參見The KidneyPhysiologyand Pathophysiology，eds.Seldin et al.，3rd ed.，Lippincott WilliamsWilkins Publishers，2000。通常，每24小時排洩到尿中的蛋白質小於0.15g。幾乎所有類型的腎病都會造成輕度(最多500mg/天)至中度(最多4g/天)的蛋白質向尿液的洩漏。清蛋白在尿液中的正常濃度低於1.0mg/dl。通常認為尿清蛋白30-300mg/dl屬微量白蛋白尿，300mg/dl及以上屬大量白蛋白尿。血清肌酸酐的正常值男人是0.6-1.5mg/dl，女人是0.6-1.1mg/dl。肌酸酐水平、腎功能和腎病的階段之間的關係在表1中顯示。
表1

本發明的方法可特別適用於患有至少部分由免疫抑制劑腎毒性所致的腎功能不全、腎衰竭或晚期腎病的患者。在進行免疫抑制治療的患者中，其它指徵可包括肌酸酐清除水平低於97(男性)和88(女性)ml/min，血尿素20-25mg/dl或更高。此外，本發明治療法可用於患有微量白蛋白尿、大量白蛋白尿和/或每24小時周期的蛋白尿水平超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g或以上，和/或血清肌酸酐水平約1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10mg/dl或更高的患者。
本發明的方法可用來減慢或逆轉腎功能與對照受驗者相比低於正常值達25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更高的患者中腎病的進展。在一些實施方案中，與對照受驗者相比，本發明方法減慢腎功能的損失達至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。在其它實施方案中，與對照受驗者相比，本發明的方法改進患者的血清肌酸酐水平、蛋白尿和/或尿清蛋白排洩達至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更高。用以評估腎功能的非限制性示例性方法在本文中和例如WO 01/66140中有描述。
用以評估腎結構劣化的方法也是公知的。示例性方法在實施例中描述。這種方法包括腎顯像(例如MRI、超聲波)或腎活組織檢查的組織學評價。在一些實施方案中，本發明的方法例如按腎小管間質或腎小球損害的範圍和/或腎纖維樣變性(例如膠原和纖連蛋白的沉積)的程度來判斷，可減少腎結構的劣化。在一些實施方案中，本發明的方法改進結構變化達至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更高。
主治醫師須確定TGF-β的準確劑量和確切方案。一般來說，TGF-β拮抗劑的劑量應使得因給予拮抗劑所造成的排斥風險的增加不超過治療上可接受的程度(即拮抗劑基本上不幹擾免疫抑制劑的免疫抑制活性)。此外，劑量應使得免疫抑制劑腎毒性的減少是治療上可接受的。例如，維持期排斥率的增加不超過5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％可以是治療上可接受的。
在本發明的方法中，TGF-β拮抗劑通常以治療有效劑量給予，所述治療有效劑量比不存在免疫抑制劑時推薦給予的劑量要低。在某些實施方案中，該劑量比不存在免疫抑制劑時推薦治療腎炎的劑量低至少30％、40％、50％、60％、70％或更多。在某些實施方案中，TGF-β拮抗劑的治療有效劑量比不存在免疫抑制劑時所給予的最大治療有效劑量低至少30％、40％、50％、60％、70％或更多。
在某些實施方案中，TGF-β拮抗劑當在齧齒動物中給予，例如在如實施例所述的條件下給予時，所給予的劑量低於相當於1D11抗體的2、1.9、1.8、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2或1.0mg/kg體重的劑量。主治醫師須確定TGF-β拮抗劑的準確劑量和確切方案以及輔助療法。作為起點，抗TGF-β抗體、抗TGF-β接受者抗體、可溶性TGF-β受體或其它TGF-β拮抗劑的治療有效劑量可在0.005-50、0.05-5或0.5-5mg/kg/天的範圍內。
可用本領域公知的換算因子(參見例如Freireich et al.(1966)Cancer Chemother.Reports，50(4)219-244和表2的當量表面積劑量因子)，對在一種動物中獲得的治療有效劑量加以換算，以用於另一種動物，包括人類。
表2

「給予(給藥)」並不限於任何具體的製劑、傳遞系統或途徑，可包括例如胃腸外(包括皮下、靜脈內、骨髓內、關節內、肌肉內或腹膜內注射)、直腸、局部、透皮或口服(例如用膠囊劑、混懸劑或片劑)給藥。給藥於個體可以以單劑量或反覆給藥的方式進行，且可用多種藥物組合物的任何一種來進行，所述藥物組合物含有生理上可接受的鹽形式，和/或具有可接受的藥物載體和/或添加劑作為藥物組合物的一部分。生理上可接受的鹽形式及標準的藥物製劑技術和賦形劑是公知的(參見例如Physicians』Desk Reference2003，57th ed.，Medical Economics Company，2002和RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，eds.Gennado et al.，20th ed，Lippincott，WilliamsWilkins，2000)。
也可通過基因治療的手段實現拮抗劑向個體的給予，在基因治療中，將編碼拮抗劑的核酸序列體內給予患者，或者體外給予細胞後將細胞引入到患者中，拮抗劑(例如反義RNA、可溶性TGF-β受體)就由其編碼核酸序列的表達而產生。進行基因治療以遞送TGF-β拮抗劑的方法已有描述，參見例如Fakhrai et al.(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，932909-2914。如例如美國專利申請出版物2003/0180301中所描述，TGF-β拮抗劑的給予可通過使用包含其編碼cDNA的載體進行基因轉移來實現，最優選編碼TGF-β II型受體(rsTGFBIIR)或III型受體(rsTGFBIIIR)的胞外域的cDNA。
TGF-β拮抗劑和免疫抑制劑可同時給予或依次給予，依次給予的間隔可重疊或不重疊。在依次給予的情況下，TGF-β拮抗劑和免疫抑制劑可按任何順序給予。拮抗劑可作為單一活性化合物給予，或者與其它化合物或組合物聯合給予。可使用Physicians』Desk Reference中指明的免疫抑制劑的具體劑量。
本發明進一步提供在需要免疫抑制並已給予免疫抑制劑進行免疫抑制的哺乳動物中檢測免疫抑制劑(例如CsA、TAC、雷帕黴素或其它免疫抑制劑)的腎毒性的方法。該方法包括從哺乳動物獲得生物樣品，並測定一種或多種選自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子的表達水平。本發明進一步提供在需要免疫抑制並已給予免疫抑制劑進行免疫抑制的哺乳動物中檢測免疫抑制劑(例如CsA、TAC、雷帕黴素或其它免疫抑制劑)的腎毒性的方法。
本發明還進一步提供評估試驗化合物或組合物(例如TGF-β拮抗劑如抗TGF-β抗體)減少免疫抑制劑腎毒性作用的能力的方法。這些方法包括從已被給予免疫抑制劑和目標試驗化合物或組合物的哺乳動物獲得生物樣品，並測定一種或多種選自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子(一種、兩種、三種、四種、五種或所有六種)的表達水平。
表達水平超出適當的對照則預示著免疫抑制劑腎毒性和/或所述化合物或組合物減少免疫抑制劑腎毒性的有效性。例如，表達水平與適當的對照相差20％、30％、40％或5％，或者至少2、4、5或10倍，則表明免疫抑制劑已誘導了腎毒性和/或試驗化合物或組合物能有效減少該腎毒性。表達水平可例如通過任何合適的方法在蛋白質和/或mRNA水平上測定。
所獲得的生物樣品可例如是組織樣品(例如在一些實施方案中是腎活組織檢查樣品)、血液或血清。
以下實施例提供本發明的示例性實施方案。本領域普通技術人員會認識到，可作出多種修改和變化而不改變本發明的精神或範圍。這種修改和變化涵括在本發明的範圍內。實施例並不以任何方式限制本發明。
實施例材料和方法(第1部分)以下材料和方法用於實施例1和2。
實驗分組大鼠分成六組(每組n＝6)，包括(1)未處理的對照；(2)2.5mg/kg CsA；(3)2.5mg/kg CsA+2.5mg/kg對照抗體；(4)2.5mg/kg CsA+2.5mg/kg抗TGF-β抗體；(5)2.5mg/kg CsA+1.0mg/kg抗TGF-β抗體；(6)同基因移植物對照。
從移植日起在整個實驗過程中，用CsA以2.5mg/kg(肌肉內)的劑量實現免疫抑制。每隔三天通過腹膜內注射給予抗TGF-β抗體或對照抗體，至處死或發生器官排斥時為止。
預備和移植按Hosenpud et al.(2000)Transplantation，692173-2178中的描述，對整個研究群體進行異位心臟移植。供體大鼠進行肝素化(1000單位，腹膜內)，並用戊巴比妥鈉(50mg/kg，腹膜內注射)麻醉。作出腹部切口，從胸腔延伸，除去胸壁。對心臟、主動脈和肺動脈進行鈍器解剖。將肺靜脈和下腔靜脈結紮，將移植物切除，放入冰凍的生理鹽水中。然後用戊巴比妥鈉(50mg/kg，腹膜內注射)將接受者大鼠麻醉。進行中線剖腹手術。將腹部主動脈和腔靜脈切開，並用直血管夾夾住，防止出血。進行縱向主動脈切開術和靜脈切開術，長度大約5mm。用標準的微血管技術，以8-0脯氨酸縫線進行心臟主動脈與腹部主動脈和肺動脈與下腔靜脈的端側吻合。完成止血，並用3-0 VicrylTM縫線封住切口。
動物監測、處死、組織收穫每天監測大鼠同種異體移植的減慢和失敗的跡象。然後用戊巴比妥鈉(50mg/kg，腹膜內注射)將它們麻醉。通過自然心室內穿刺(native heart intraventricular puncture)給動物放血。用ELISA試劑盒(Promega，Madison，WI)測定血漿樣品的TGF-β蛋白質。獲取兩顆腎臟(一顆用於基因表達，一顆用於組織學和免疫組織化學)。
免疫抑制方案在適當的組別中使用CsA，實現免疫抑制。在整個研究過程中CsA以2.5mg/kg的劑量加或不加抗TGF-β抗體(1D11)或對照抗體來使用。每隔三天通過腹膜內注射給予抗TGF-β抗體或對照抗體進行處理，至處死或發生器官排斥時為止。
對照抗體(13C4)也是能特異性結合志賀毒素的鼠單克隆抗體(IgG1)。兩種抗體都由Genzyme Corporation生產和純化。確認抗體無可檢測出的內毒素。
大鼠血漿中TGF-β蛋白質的測量TGF-β蛋白質按先前的描述(Khanna et al.(1999)Transplantation，67882-889)測量。將得自大鼠的血漿分離並保藏於-70℃下。用市售的TGF-β1特異性試劑盒(Promega，Madison，WI)通過夾心ELISA對酸激活樣品測定TGF-β蛋白質。
TGF-β1的組織病理學和免疫組織化學每隻動物取一顆腎臟用福馬林固定並植入石蠟。用蘇木精、伊紅和Masson三色染色評估組織學變化。用標準的免疫組織化學方法(Khanna et al.(1999)Transplantation，67882-889)鑑定TGF-β。將用福馬林固定並植入石蠟的組織切成5μm切片，用二甲苯脫石蠟，用梯度的(graded)乙醇-PBS復水。用甲醇/過氧化物(18∶1vol/vol)封閉內源過氧化物酶活性30分鐘後，用稀釋於PBS(補加10％正常馬血清和3％BSA)的1.5％親合素/生物素封閉非特異性結合1小時。然後將組織切片與1D11 mAb(50mg/ml)一起在上述PBS中4℃溫育過夜。玻片用PBS多次洗滌後，在室溫下與1∶1000稀釋的生物素標記抗小鼠IgG馬抗血清溫育1小時，再在PBS中充分洗滌，接著在ABC溶液中洗滌30分鐘。然後將玻片在二氨基聯苯胺(DAB)中顯影10分鐘，用水清洗10分鐘。然後用蘇木精對玻片進行復染色，接著在梯度的乙醇-二甲苯中脫水。將玻片用PermountTM封片以便進行評估。對每組樣品的組織病理學變化和免疫組織化學染色情況進行評級。免疫染色的強度按0(無染色)到4+(最大染色)進行評級。
通過反轉錄和聚合酶鏈反應(PCR)檢測腎組織中的mRNA用SV TotalTMRNA分離系統(Promega Madison，USA)，從小塊的大鼠腎組織分離總RNA，通過260/280-nm比率鑑定RNA的質量。以用於RT-PCR的Superscript First Strand SynthesisTM系統(LifeTechnologies Rockville MD，USA)，將1微克RNA反轉錄成cDNA。用1μl的cDNA及各2μl的2.5mM編碼和非編碼寡核苷酸引物及Platinum PCR SupermixTM(Life Technologies，Rockville MD，USA)，進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增。所用的引物序列和對應的參考文獻如下所列。
1)TGF-β1(Qian et al.(1990)Nucleic Acid Res.，183059)
編碼ACG CCT GAG TGG CTG TCT TTT(SEQ ID NO1)非編碼ACG TGG AGT TTG TTA TCT TTG(SEQ ID NO2)2)β-肌動蛋白(Ponte et al.(1984)Nucleic Acids Res.，121687)編碼GAT CTG GCA CCA CAC CTT CTA(SEQ ID NO3)非編碼GCA GGA TGG CGT GAG GGA GAG(SEQ ID NO4)3)膠原I(Frankel et al.(1988)DNA，7347-354)編碼CCC ACG TAG GTG TCC TAA AGT(SEQ ID NO5)非編碼CCG TGG TGC TAA AAT AAT AAA(SEQ ID NO6)4)纖連蛋白(Schwarzbauer(1987)EMBO J.，62573-2580)編碼ATG ATG AGG TGC ACG TGT GT(SEQ ID NO7)非編碼GAT GGG GTC ACA TTT CCA TC(SEQ ID NO8)5)MMP-2(Pollock et al.(1995)J.Biol.Chem.，27018786-18796)編碼GTG CTG AAG GAC ACA CTA AA(SEQ ID NO9)非編碼TTG CCA TCC TTC TTT TCA AA(SEQ ID NO10)6)TIMP-2(Battaglia et al.(1994)Exp.Cell Res.，213398-403)編碼AAA CGA CAC TTA TGG CAA AC(SEQ ID NO11)非編碼ACA GGA AGC GTC ACT TCT CT(SEQ ID NO12)為了這種基因表達的半定量估計，要對每個引物對進行循環分析，以確定最佳擴增的循環數。將PCR產物在1％瓊脂糖凝膠電泳中拆分。在紫外光下顯現溴化乙錠染色的特定條帶並拍照。用Alpha-ImagerTM(Alpha Innotech Corp.，San Leandro，CA，USA)對特定條帶進行光密度分析，數據以特定基因與β-肌動蛋白的比率表示。
數據分析數據以平均值±SEM表示。然後運用方差分析對適當組別之間的差異進行分析。
實施例1 抗TGF-β抗體對CsA的免疫抑制作用的影響用於這些研究中的大鼠異位心臟移植模型應用了完全錯配的株系組合WF(RT1u)到LEW(RT11)，故需要長期進行免疫抑制以防止發生排斥。給予TGF-β中和抗體或同種型(isotype)匹配對照抗體，以確定TGF-β表達是否會影響在前30天內CsA治療動物中的同種異體移植物存活。
未治療的動物平均在移植後第11天發生移植物排斥(n＝6，11±1.5)。與此對比，CsA治療動物的移植物平均存活117天(n＝6，117±9，p＜0.001)。為更好地了解TGF-β在慢性排斥的發病機理中的角色，心臟移植接受者在移植後三天開始，每周三次給予1.0或2.5mg/kg的抗TGF-β抗體。對照抗體以相同的濃度和劑量方案給予。未治療同種異體移植物組和用CsA+2.5mg/kg抗TGF-β抗體治療的組之間在存活率上沒有觀察到統計學顯著差異，平均存活時間為12.7±1.2天(圖1)。CsA+2.5mg/kg對照抗體沒有發生排斥，但為比較組織學變化，該組和CsA+抗TGF-β抗體治療動物在相近的日期處死。
形成鮮明對比的是，注射1.0mg/kg抗TGF-β抗體的動物不像接受CsA+2.5mg/kg抗TGF-β抗體的動物那樣發生排斥，平均存活時間是99±8天。這與更高抗體組相比高度顯著(p＜0.01)。此時所得的數據強有力地支持了以下假設CsA的免疫抑制作用是通過TGF-β介導的，因為抗TGF-β抗體在2.5mg/kg的濃度下完全消除CsA的功效。目前所得的數據證明，注射較低劑量的抗TGF-β抗體的大鼠其腎病理學變化較不嚴重，這大概是因為TGF-β的纖維發生特性被抗TGF-β抗體中和。
實施例2 抗TGF-β抗體對CsA的腎毒性作用的影響進行這些實驗是研究TGF-β在CsA腎毒性作用中的角色。接受者在用CsA治療的同時，也用TGF-β或對照抗體(1.0mg/kg)每周三次進行治療，直到發生排斥時為止。包括以下組別未治療的同種異體移植物；CsA治療的同種異體移植物；CsA+對照抗體(1.0mg/kg)治療的同種異體移植物和CsA+抗TGF-β抗體(1.0mg/Kg)治療的同種異體移植物及同種型對照。
腎功能在所研究的所有實驗大鼠動物處死後，通過定量獲得血漿的肌酸酐和血尿素氮(BUN)水平來測量腎功能。定量用Sigma(St.Louis，USA)的試劑盒來進行。CsA治療動物與同基因移植物對照相比BUN水平升高(18.6±0.85對比12.6±0.4mg/dl；p＜0.0001)，CsA+抗TGF-β抗體治療的動物中觀察到BUN水平下降(13.8±0.63，p＜0.03)，但CsA+對照治療的動物卻沒有下降(17.8±0.45)。觀察到CsA治療的接受者與同基因移植物相比血清肌酸酐顯著增加(0.75±0.03對0.43±0.2mg/dl；p＜0.0001)。與BUN水平類似的是，用CsA+抗TGF-β抗體治療的動物(0.49±0.06.p＜0.003)顯示出肌酸酐水平下降，而對照抗體治療的動物沒有(0.68±0.08)。
TGF-β、膠原和纖連蛋白mRNA的腎內表達圖2的結果(表示為基因/β-肌動蛋白比率，每組n＝6)顯示了加或不加抗TGF-β抗體或對照抗體的CsA長期治療對TGF-β1、膠原和纖連蛋白的腎內mRNA表達的作用。
TGF-β與同基因移植物相比，CsA長期治療導致TGF-β mRNA的腎內表達增加(p＜0.01)。在同基因移植物和用CsA+抗TGF-β抗體(1.0mg/kg)治療的接受者之間TGF-β mRNA表達沒有差異(p＝0.12)；但在CsA治療的接受者和CsA+抗TGF-β抗體(2.5mg/kg)治療的接受者之間觀察到顯著差異(p＜0.003)。在CsA治療的接受者和CsA+對照抗體治療的接受者之間沒有觀察到差異。
膠原與同基因移植物相比，CsA長期治療導致膠原mRNA的腎內表達增加(p＜0.0001)。在CsA治療的接受者和CsA+抗TGF-β抗體治療的接受者之間觀察到顯著差異(p＜0.008)(圖2)。在CsA治療的接受者和CsA+對照抗體治療的接受者之間沒有觀察到差異。
纖連蛋白在纖連蛋白mRNA上也獲得相似的結果(圖2)，與同基因移植物相比，CsA長期治療導致纖連蛋白mRNA的腎內表達增加(p＜0.0001)。在CsA治療的接受者和CsA+抗TGF-β抗體治療的接受者之間觀察到顯著差異(p＜0.002)。在CsA治療的接受者和CsA+對照抗體治療的接受者之間沒有觀察到差異。
MMP-2和TIMP-2的腎內表達圖3的結果顯示，與同基因移植物相比，CsA長期治療導致MMP-2 mRNA的腎內表達增加(p＜0.0002)。在CsA治療的接受者和CsA+抗TGF-β抗體治療的接受者之間觀察到顯著差異(p＜0.004)。在CsA治療的接受者和CsA+對照抗體治療的接受者之間沒有觀察到差異。抗TGF-β抗體治療的接受者顯示出減少的TIMP-2 mRNA腎內表達，但沒有統計學差異。在CsA治療的接受者和CsA+對照抗體治療的接受者之間沒有觀察到差異。
抗TGF-β抗體對TGF-β蛋白質的循環水平的影響圖4的結果顯示，與同基因移植物相比，CsA長期治療導致TGF-β蛋白質的循環水平顯著增加(p＜0.0001)。同基因移植物和CsA+對照抗體治療的接受者之間TGF-β水平沒有差異；但是在CsA治療的接受者和CsA+抗TGF-β抗體治療的接受者之間則觀察到統計學顯著差異(p＜0.003)。
抗TGF-β抗體對TGF-β蛋白質的腎內表達的影響在CsA治療的接受者中觀察到腎內TGF-β蛋白質表達顯著更高(3+-4+)的染色，這在用對照抗體+CsA治療的組中也一樣。用CsA+抗TGF-β抗體(1.0mg/kg)治療的動物中TGF-β蛋白質染色降低，但仍比同基因移植物對照略高。
抗TGF-β抗體對腎組織學的影響用CsA治療導致的組織病理學變化與接受長期CsA治療的患者類似。用I)單獨CsA；II)CsA+對照抗體；和III)CsA+抗TGF-β抗體(1.0mg/kg)治療的心臟移植接受者大鼠中，對來自其的腎組織的PAS和HE染色玻片進行組織病理學分析。在CsA治療的動物和CsA+對照抗體治療的動物中發現了腎小管空泡形成和血管變化，包括血管結構的PAS染色增加。儘管不是所有的III組動物都具有完全正常的腎組織學結構，但在這組中變化只是偶然觀察到並且不突出。抗TGF-β抗體治療的接受者中PAS染色也減少。這些結果證實CsA治療的動物和CsA+對照抗體治療的動物中發生腎小管變化和血管變化，包括基膜增厚和空泡形成。
材料和方法(第2部分)以下材料和方法用於實施例3-9。
實驗分組將Lewis(LEW RT11)大鼠分成以下五組(1)未治療的同種異體移植對照；(2)未治療的同基因移植物移植對照；(3)TAC；(4)TAC+抗TGF-β抗體；(5)TAC+對照抗體。
TAC以0.25mg/kg肌肉內給予90天；抗TGF-β抗體1D11以1mg/kg每周給予兩次。所用的對照抗體是13C4。
大鼠腎移植將LEW RT1l或Wistar-Furth WF RT1u供體腎臟移植到LEW RT11接受者中分別進行同基因移植(isogeneic transplantation)和同種異體移植(allogeneic transplantation)。(LEW RT11和WF RT1u)大鼠代表了在主要和次要組織相容性基因座上的完全遺傳差異。
移植如下進行。腎供體大鼠腹膜內注射50mg/kg戊巴比妥誘導全身麻醉後，進行中線剖腹手術。左腎在其血管蒂上鬆動，分開輸尿管。左腎進行肝素化(1,000U，腹膜內注射)後取出，帶大量主動脈和腔靜脈血管頭(cuff)。然後用冰凍鹽水衝洗該腎臟，保存在冰上以備移植。接受者(如上所述進行麻醉)通過中線剖腹手術暴露出腎下主動脈和腔靜脈。用標準的微血管外科技術，使供體左腎與接受者血管發生端側吻合，恢復血液流動。輸尿管插入膀胱壁，用一小段PE50管固定。
動物監測、處死、組織收穫每天監測關在代謝籠中的大鼠發生移植排斥的跡象(即體重顯著增加和排尿量顯著減少)。腎功能通過血清肌酸酐和BUN水平的變化來檢測。在發生排斥時或者觀察期結束時，用戊巴比妥鈉(50mg/kg，腹膜內注射)將動物麻醉。通過心臟穿刺放血後，如下所述用常規的組織學方法、免疫組織化學方法、蛋白質印跡法和RT-PCR對同基因移植物和同種異體移植物進行分析。
BUN和肌酸酐水平為評估腎功能，分別用Wako Chemicals，Richmond，VA和OxfordBiomedical Research，Oxford，MI的市售試劑盒測定血清BUN和肌酸酐。
同種異體移植物組織學、免疫組織化學及組織病理學變化的定量每隻動物取移植腎臟的一部分用福馬林固定並植入石蠟。用蘇木精和伊紅(HE)及過碘酸希夫(PAS)染色評估組織學變化。用標準的程序對腎組織學變化進行定量。腎小球損傷的嚴重程度按Khannaet al.(2000)Transplantation，731543-1549的描述進行評分。簡言之，每個樣本每個視野計數至少50-60個腎小球，按五級分制對損傷進行評分(0，無增殖，組織學結構近乎正常；1，節段損傷約為25％；2，節段損傷大於25％但小於50％；3，纖維化損傷伴瀰漫性增殖；4，幾乎完全的纖維化變化)。PAS染色用來測定胞外基質蛋白質積累的程度(未評分)。對HE染色玻片中的小葉間動脈及損傷進行評分。
腎組織中的血漿TGF-β蛋白質和免疫化學血漿TGF-β蛋白質水平按Khanna et al.(1999)Transplantation，67882-889的描述進行測量。TGF-β蛋白質的腎內表達基本上如Khanna et al.(2000)Transplantation，731543-1549；Khanna et al.(2002)Kidney Intl.，622257-63和Khanna et al.(1999)Transplantaion，67614-619所述進行免疫組織化學法檢查。將用福馬林固定並植入石蠟的組織切成細小的切片，用二甲苯脫石蠟，用梯度的乙醇-磷酸緩衝鹽水(PBS)復水。用甲醇/H2O2(18∶1vol/vol)封閉內源過氧化物酶活性30分鐘後，用稀釋於PBS(補加10％正常馬血清和3％BSA)的1.5％親合素/生物素封閉非特異性結合1小時。然後將組織切片與特異性第一抗體(50mg/ml)一起在上述PBS中4℃溫育過夜。玻片在PBS中充分洗滌後，在室溫下與1∶1000稀釋的生物素標記抗小鼠IgG馬抗血清溫育1小時，再在PBS中充分洗滌，接著在ABC溶液中洗滌30分鐘。然後將玻片在二氨基聯苯胺(DAB)中顯影10分鐘，用水清洗10分鐘。然後用蘇木精對玻片進行復染色，接著在梯度的乙醇-二甲苯中脫水。
將玻片用PermountTM封片以便進行評估。對每組的樣品進行組織病理學變化和免疫組織化學染色的評級。免疫染色的強度按0(無染色)到4+(最大染色)進行評級。由兩個人按以下各參數對每隻動物的腎組織學嚴重程度進行盲評級腎間質纖維化、動脈變化和腎小球硬化。
通過實時PCR(RT-PCR)檢測mRNA用Bio-Rad iCyclerTM系統(Bio-Rad，Hercules，CA)進行RT-PCR。用Promega(Madison，NJ)的試劑盒從腎組織分離出RNA，並用Invitrogen(Carlsbad，CA)的cDNA合成試劑盒反轉錄成cDNA。對引物運行常規PCR，95℃ 20秒和60℃ 1分鐘，共40個循環，然後在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中分離，以檢測引物的特異性。實時PCR用SYBR Supermix試劑盒(Bio-RAD)來運行(95℃ 20秒和60℃ 1分鐘，共40個循環)。通過系列稀釋模板cDNA檢查PCR效率。收集解鏈曲線數據以檢查PCR特異性，每次測定中包括適當的陰性對照。將每個樣品的每個基因的mRNA水平歸一化到β-肌動蛋白mRNA，並按Khanna et al.(2005)Nephron Exp.Nephrol.，101119-126中的描述以2[(Ct/β-肌動蛋白-Ct/目的基因)]表示。
蛋白質印跡將冰凍的組織在用冰預冷的PBS中勻化，所述PBS含1％TritonX-100、1mM苯基甲基磺醯氟、35ng/ml抑胃酶肽A和10ng/ml亮抑蛋白酶肽。離心後，取50μg蛋白質按Khanna et al.(2005)NephronExp.Nephrol.，101119-126的描述進行SDS PAGE電泳。將印跡用多克隆抗p22phox抗體(R5554，由Marsh Lab，Bozeman，MT贈送)或抗NOX抗體(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的適當稀釋液探測，以1∶5,000稀釋度與辣根過氧化物酶綴合的第二抗體一起溫育，用增強化學發光顯示。
統計分析採用ANOVA和Student t檢驗評估各組TGF-β基因表達和血漿水平的平均值之間的差異。分析是用GraphPad，San Diego，CA的統計軟體程序進行的。結果以平均值±SEM表示，按p＜0.05的水平確定雙尾顯著性。
實施例3抗TGF-β抗體減少TAC對腎功能的影響治療90天後的TAC治療的大鼠與移植後90天收穫的同基因移植物對照相比，BUN水平升高(29.9±1.3對17.3±1.3mg/dl；p＜0.0001)(圖5A)。抗TGF-β抗體(21.3±0.9mg/dl，p＜0.01)而不是對照抗體(26.6±1.1mg/dl)降低BUN水平。類似地，觀察到TAC治療的接受者與時間相配的同基因移植物移植對照相比，血清肌酸酐顯著升高(0.83±0.06對0.52±0.09mg/dl；p＜0.04)。類似於BUN水平，抗TGF-β抗體(0.48±0.08mg/dl；p＜0.02)而不是對照抗體(0.78±0.09mg/dl)抑制TAC誘導的肌酸酐水平(圖5B)。
實施例4抗TGF-β抗體與TAC誘導的TGF-β、NOX-1、p22phox和RAC-1mRNA腎內表達通過RT-PCR分析來自(1)同基因移植物、(2)TAC、(3)TAC+抗TGF-β抗體和(3)TAC+對照抗體治療的動物在移植後90天腎組織中TGF-β、NOX-1和p22phox的腎內表達情況。用TAC治療增加了TGF-β(37倍)、NOX-1(18倍)、p22phox(31倍)和RAC-1(20倍)的mRNA表達。基因表達的增加被抗TGF-β抗體減少(分別為p＜0.01；p＜0.008；p＜0.04和p＜0.03)，而不被對照抗體減少(圖6)。結果通過對比同基因移植物對照來表示。
實施例5 TGF-β、SOD和TRX的差異化腎內mRNA表達為進一步研究用TAC長期治療對抗氧化劑基因的影響，測定了SOD和TRX的腎內mRNA表達情況。數據證實，與同基因移植物對照相比，TAC治療的大鼠中SOD和TRX mRNA下降，而TGF-βmRNA增加(圖7)。用TAC治療導致TGF-βmRNA增加37倍，而SOD和TRX的mRNA表達分別下降27倍和80倍。SOD mRNA被抗TGF-β抗體部分逆轉，而TRX mRNA則完全被逆轉。
實施例6 p22phox和NOX-1蛋白質的移植物內表達對來自同基因移植物、未治療的同種異體移植和用TAC治療的動物的腎組織中p22phox和NOX-1蛋白質的表達進行分析。蛋白質裂解液(10μg)電泳後轉移到硝基纖維素紙，用抗p22phox和抗NOX-1抗體探測。如圖8所示，用TAC治療導致p22phox和NOX-1的移植物內表達增加。
實施例7 用TAC治療導致腎移植物中的腎毒性特異性組織學變化通過對HE和PAS染色的腎薄層切片進行組織病理學檢查，評估TAC、TAC+對照抗體和TAC+抗TGF-β抗體治療對形態學變化的作用。
對照大鼠(同基因移植物)的腎臟的光學顯微鏡檢結果顯示正常的腎小球、入球小動脈和小管細胞。與此成鮮明對比的是，接受TAC的大鼠的腎組織顯示明顯的組織學變化，包括嚴重至中度的epicalblebbing、透明化作用、腎小球基膜增厚、腎小管間質纖維化圖案及入球小動脈和葉間動脈末端部分的動脈病。這些變化在共給予TAC和抗TGF-β抗體時沒有觀察到。但是，在用TAC+對照抗體治療的動物中看到類似的變化。PAS染色切片還顯示基膜增厚現象，而與此對比在抗TGF-β抗體治療的接受者中則近乎正常。觀察到了抗TGF-β抗體對TAC誘導變化的逆轉作用。TAC+對照抗體治療的動物的組織學結構與只用TAC治療的動物沒有不同。在TAC和TAC+對照抗體治療的接受者中觀察到透明化作用、動脈病腎小管間質纖維化和腎小球基膜增厚，但在TAC+抗TGF-β抗體治療的接受者中卻沒有觀察到。在TAC和TAC+對照抗體治療的大鼠移植接受者中看到腎毒性特有的近端腎小管上皮細胞特異性變化，但在同基因移植物或TAC+抗TGF-β抗體治療的大鼠中卻沒有看到。定量分析證明TAC治療的接受者與同基因移植物相比有統計學顯著(p＜0.036)的差異，而同基因移植物與TAC+抗TGF-β抗體治療的同種異體移植物之間沒有統計學差異。
實施例8 TAC增加TGF-β的腎內表達來自用TAC、TAC+抗TGF-β抗體、TAC+對照抗體治療的腎移植接受者或者未治療的同種異體移植接受者的腎組織中TGF-β蛋白質的腎內表達情況用免疫組織化學分析。按Khanna et al.(2004)Circulation，1103822-3829的描述用抗TGF-β抗體對腎切片進行染色。在TAC和TAC+對照抗體治療的接受者中除觀察到透明化作用、動脈病腎小管間質纖維化和腎小球基膜增厚外，還觀察到對TGF-β蛋白質的染色增加，但在TAC+抗TGF-β抗體治療的接受者中卻近乎正常(圖8)。
實施例9TAC對TGF-β的循環水平的影響圖9證明，與同基因移植物對照相比，長期用TAC治療導致TGF-β蛋白質的循環水平顯著增加(9.8±1.7對57±6ng/ml；p＜0.01)。同基因移植物和TAC+對照抗體治療的接受者之間在TGF-β水平上沒有差異(57±6對52±6ng/ml)，但是在TAC和TAC+抗TGF-β抗體治療的接受者之間觀察到統計學顯著的差異(9±1.3對57±6ng/ml；p＜0.01)。
根據本說明書中所引用的參考文獻的教導，可非常透徹地理解本說明書。本說明書中的實施方案旨在提供本發明實施方案的示例，不應被解釋為限制本發明的範圍。技術人員很容易就認識到，本發明還涵括許多其它實施方案。本公開中所引述的所有出版物、專利、專利申請和生物序列通過引用整體結合到其中。在本文中引述任何參考文獻並不意味著承認這些參考文獻是本發明的現有技術。
除非另外指明，說明書包括權利要求書中所用的表示成分數量、細胞培養物、治療條件等的所有數字，應理解為在所有情況下都被詞語「約」所修飾。因此，數字參數都是近似值，可根據本發明期望獲得的所需特性加以變動，除非另外指明並非如此。除非另外指明，位於在一系列要素前面的詞語「至少」應理解為修飾到該系列的每一個要素。本領域技術人員僅用常規實驗，就會確認出或者能夠確定本文描述的本發明具體實施方案的許多等同方案。這種等同方案也有意被所附權利要求所涵括。
序列表110Genzyme CorporationKhanna，AshwaniLedbetter，Steven120TGF-β拮抗劑限制免疫抑制劑腎毒性的用途13007680.0043-0030416012170PatentIn version 3.1210121121212DNA213人工220
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權利要求
1.一種在需要免疫抑制並用免疫抑制劑治療的哺乳動物中治療或預防由免疫抑制劑引起的腎炎的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的TGF-β拮抗劑，所述治療有效量足以減輕免疫抑制劑腎毒性作用而又基本上不幹擾其免疫抑制活性。
2.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物是人類。
3.權利要求1的方法，其中所述免疫抑制劑當給予所述哺乳動物時誘導TGF-β的表達。
4.權利要求1的方法，其中所述免疫抑制劑選自環胞菌素、他克莫司和西羅莫司或它們的藥物可接受衍生物。
5.權利要求1的方法，其中所述環胞菌素是環胞菌素A。
6.權利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗劑選自抗TGF-β抗體、抗TGF-β受體抗體和可溶性TGF-β受體。
7.權利要求6的方法，其中所述抗體是1D11或其人或人源化衍生物。
8.權利要求6的方法，其中所述抗體是CAT192或其衍生物。
9.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物患有自身免疫病。
10.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物具有移植物。
11.權利要求10的方法，其中所述移植物是同種異體移植物。
12.權利要求10的方法，其中所述移植物選自心臟、腎臟、肺、肝臟、角膜、骨髓、血管和胰島細胞移植物。
13.權利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗劑給予的劑量低於不存在免疫抑制劑時推薦治療腎炎的劑量。
14.權利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗劑給予的劑量比不存在免疫抑制劑時推薦治療腎炎的劑量低至少20％。
15.權利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗劑給予的劑量比不存在免疫抑制劑時通常給予的最大治療有效劑量低至少30％。
16.權利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗劑給予的劑量低於與給予大鼠時2mg/kg體重的1D11抗體相當的劑量。
17.權利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗劑給予的劑量與給予大鼠時1mg/kg體重的1D11抗體相當。
18.一種治療人類的方法，所述方法包括給予人類抗TGF-β抗體，其中所述人類具有移植物並正在經歷用免疫抑制劑進行的免疫抑制治療，所述免疫抑制劑選自環胞菌素、他克莫司和西羅莫司或它們的藥物可接受衍生物。
19.權利要求18的方法，其中因給予所述TGF-β抗體造成的排斥風險是治療上可接受的。
20.權利要求18的方法，其中所述免疫抑制劑腎毒性作用的減少是治療上可接受的。
21.TGF-β拮抗劑在治療或預防腎炎中的用途，所述腎炎由給予需要免疫抑制的患者的免疫抑制劑誘導。
22.TGF-β拮抗劑在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防由給予需要免疫抑制的患者的免疫抑制劑所誘導的腎炎。
23.一種檢測免疫抑制劑的腎毒性的方法，所述方法包括(a)從已被給予免疫抑制劑的哺乳動物中獲得生物樣品；(b)檢測一種或多種選自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子的表達水平，其中所述表達水平指示所述免疫抑制劑是否對所述哺乳動物具有腎毒性。
24.一種評估化合物或組合物減少免疫抑制劑腎毒性的能力的方法，所述方法包括(a)從已被給予免疫抑制劑和試驗化合物或組合物的哺乳動物中獲得生物樣品；(b)檢測一種或多種選自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子的表達水平，其中所述表達水平指示所述試驗化合物或組合物是否能有效減少所述免疫抑制劑的腎毒性。
全文摘要
本公開涉及改善通過上調TGF－β介導其免疫抑制活性的免疫抑制劑(例如環胞菌素(CsA))的腎毒性副作用的方法。本公開提供用於需要免疫抑制的患者中的治療方式，例如具有發生移植排斥的風險或患有自身免疫病的患者。在本發明的方法中，將TGF－β拮抗劑例如抗TGF－β抗體給予用免疫抑制劑進行治療的患者。這種TGF－β拮抗劑以治療有效量給予，該量足以減輕免疫抑制劑腎毒性作用而又基本上不幹擾其免疫抑制活性。
文檔編號A61K38/18GK101084007SQ200580039335
公開日2007年12月5日 申請日期2005年9月22日 優先權日2004年9月22日
發明者A·K·漢納, S·勒貝特 申請人:金齊姆公司, Mcw研究基金會公司