檢測遠距離染色體相互作用的方法

2023-08-10 12:44:26

專利名稱：：檢測遠距離染色體相互作用的方法檢測遠距離染色體相互作用的方法發明領域本發明涉及監測外遺傳變化、診斷特定生理學狀況的方法及反義RNA用於治療生理學狀況的用途。
背景技術：
：真核基因組組織成複雜的高級結構；事實上，早先染色質的電子顯微照片揭示了形成徑向環的非組蛋白支架(EarnshawandLaemmli,1983,JCellBio96,84-93)哺乳動物基因組中不受約束的負超螺旋性提示染色體「域」大小在數萬鹼基的數量級(KramerandSinden，1997，Biochem36，3151-3158)。最近，使用3C技術(捕捉染色體構象)已經證明，在很多種真核細胞中都存在高級遠距離相互作用，包括釀酒酵母(S.cerevisiae)(Dekkeretal，2002，Science295,1306-1311)(Blantonetal，2003GenesDev17，664-675)、小鼠CTolhuisetal，2002，MolCell10，1453-1465)和人(Carrolletal,2005,Cell122，33-4細胞，一般大小為數千鹼基。在哺乳動物細胞中，已經在β-珠蛋白CTolhuisetal，2002，MolCell10，1453-1465)和C-反應性蛋白質(Choietal,2007,NucleicAcidsRes35，5511-5519)基因座中證明了增強子或位點控制區與活躍表達基因的結合，還證明了免疫球蛋白基因重組時一起成環(loopingtogether)(Skoketal,2007,NatImmunol8,378-387)在哺乳動物細胞中，有人提出正在進行的轉錄驅動基因組組織禾睡因成環(Chakalovaetal，2005NatRevGenet6,669-677；Marenduzzoetal,2007,TrendsGenet23，U6-133及其中的參考文獻)，但是最近的分析提示，至少對於β-珠蛋白基因座而言，一些遠距離DNA相互作用在轉錄受到抑制後仍然維持(Palstraetal,2008PLoSONE3，el661)，這對那些主張相關的RNA聚合酶發揮染色質環的聯結作用的模型提出了挑戰。在酵母基因組中，活躍的轉錄對於形成「基因環」(geneloops)，即聯繫活躍基因的5』和3』區域的遠距離相互作用而言，似乎確實重要(AnsariandHampsey,2005GenesDev19,2969-2978,0『Sullivanetal，2004，NatGenet36,1014-1018；SinghandHampsey，2007，MolCell27，806_816)。染色質免疫沉澱(ChIP)證明，TFIIB和磷酸化形式的RNAPII在啟動子和終止子二者上均有存在。此外，功能性TFIIB是形成這些遠距離相互作用所需要的(SinghandHampsey，2007，MolCell27,806-816)TFIIB能夠與非編碼RNA相互作用，而且由非編碼RNA促進的TFIIB丟失導致DFHR的遠距離相互作用丟失(Martianovetal，2007，Nature445,666-670)。整個基因組中普遍被轉錄的高水平的非編碼RNA包括與可讀框反義的轉錄物。它們是真核和原核基因組中都扮演重要角色(Johnsonetal,2005,TrendsGenet21，93-102，Kapranovetal，2007，NatRevGenet8，413-423；Selingeretal，2000，ProcNatlAcadSciUSA103，4192-4197)。在真核細胞中，許多這樣的轉錄物從未註定要翻譯成蛋白質，一些是由TRAMP複合物進行的外來體介導的降解的目標(BickelandMorris,2006MolCell22,309-316)在酵母中，這些隱秘不穩定轉錄物(crypticunstabletranscript,CUT)在啟動子處(Berrettaetal，2008，GenesDev22,615-626；DavisandAres,2006,ProcNatlAcadSciUSA103，3262_3洸7)、在基因間區域中(Wyersetal,2005,Cell121，725-737)檢測到，而且與基因反義(Camblongetal，2007Cell131，706-717；Uhleretal,2007,ProcNatlAcadSciUSA104,8011-8016)。使用基因組蓋瓦陣列(genomictilingarray)對來自釀酒酵母的RNA進行了詳細的表達譜分析實驗，顯示在酵母基因組的幾乎所有部分中均有轉錄發生(Perocchietal,2007,NucleicAcidsRes35,el28；Samantaetal,2006,ProcNatlAcadSciUSA103,4192-4197；Miuraetaletal，2006，PNAS103,17846-17851；Hongayetal，2006，Cell127,735-745；Davidetal,2006,ProcNatlAcadSciUSA103,5320-5325；Havilioetal,2005,BMCGenomics6,93)這些分析還表明，有100至370種基因至少部分地以兩種方向轉錄，生成穩定的多腺苷酸化有義和反義轉錄物。這些基因中的許多被活躍地轉錄。本發明的發明人使用GAL基因座作為模型系統來比較受誘導和受遏制的狀態，並觀察反義轉錄物的差異和外遺傳調節。發明人顯示，存在著控制GAL基因座處的誘導和遏制狀態二者的反義轉錄物，而且這些轉錄物的大小、位置和豐度有差異。被誘導的基因座處的高豐度的反義轉錄物與反義轉錄物自GALlO啟動子的生成是相關的。此外，反義轉錄物的水平與該基因座的相關Hdal的水平有強相關，但是與組蛋白乙醯化自身卻沒有。發明人還發現，被遏制的GAL基因座處的遠距離相互作用似乎需要Hdal，這提示遏制狀態下的反義轉錄物、外遺傳修飾和高級染色質結構之間的聯繫。已經鑑定了從遏制狀態變成誘導狀態的轉換時基因座構象的變化，以及涉及控制這種轉換的反義RNA。本發明基於如下的發現，即基因遏制是調節的先發制人狀態(proactivestate)，其涉及基因座處的反義轉錄和特定外遺傳變化的發生。發明概述依照本發明的第一個方面，提供一種監測外遺傳變化的方法，其包括監測至少一個染色體基因座處的條件性遠距離染色體相互作用的變化，其中該基因座處的遠距離相互作用譜與特定生理學狀況有關，所述方法包括下述步驟(i)體外交聯該至少一個染色體基因座處存在的所述遠距離染色體相互作用；(ii)從所述染色體基因座分離交聯的DNA；(iii)將所述交聯的DNA用在該至少一個染色體基因座內至少切割一次的酶進行限制性消化；(iv)連接經過切割的所述交聯的DNA的末端以形成DNA環；(ν)鑑定DNA環的存在；其中存在DNA環指示存在特定的遠距離染色體相互作用。應當理解，條件性遠距離染色體相互作用始終會存在於染色質中。還應當理解，這些相互作用是動態的，而且會隨染色體區域的狀態，即如果它正在響應於生理學狀況的變化而被轉錄或遏制，而發生變化。如本文中所使用的，術語「條件性遠距離相互作用」指染色體上的座位中遠離的區域之間的相互作用，所述相互作用是動態的，而且隨染色體區域的狀態而改變。如本文中所使用的，術語「遠距離相互作用譜」指給定染色體基因座處可存在的遠距離染色體相互作用的不同構象。應當理解，如上文中所描述的，這些相互作用是動態的，取決於位點的狀態，不同的遠距離相互作用被形成或破壞。還應當理解，遠距離染色體相互作用可以通過任何合適的手段來交聯。在一個優選的實施方案中，使用甲醛來交聯遠距離染色體相互作用。還應當理解，存在的DNA環可指示所述染色體基因座的轉錄或遏制，或者，可指示改變的產物從所述染色體基因座表達。DNA環的存在可如下文針對GAL位點的相關描述來鑑定。對技術人員顯而易見的是，關於此位點描述的方法能適用於其它任何被認為有遠距離相互作用發生的位點。這些環可以使用本領域已知的技術來檢測，如3C(捕捉染色體構象)測定法(Delcker，2006，NatMethods3,17-21；Dekkeretal，2002，Science295，1306—1311;0'Sullivanetal,2004，NatGenet36，1014-1018)等。技術人員知道很多能用於在目標染色體基因座內切割該DNA的限制酶。顯然的是，所使用的具體的酶會取決於所研究的位點和位於其中的DNA的序列。本發明基於發明人的驚人發現，即染色體上的給定位點處始終存在條件性遠距離染色體相互作用，而且條件性遠距離染色體相互作用譜隨該區域的實際狀態、其活性和生理學狀況而變化，即特定遠距離相互作用的有或無會提供對該區域的狀態的指示。此外，發明人發現，與較早的遺傳數據一致，這些條件性遠距離染色體相互作用可交疊且包括染色體上被證明編碼有關的或未記載的基因的區域，但是同樣可以是基因間區域。還應當注意，發明人發現，所有區域中的遠距離相互作用對於決定染色體基因座的狀態是同樣重要的。這些遠距離相互作用並不一定位於該位點處的特定基因的編碼區中，可以在基因間區域中。技術人員還應當理解，術語「外遺傳」(印igenetic)指細胞內基因功能的可遺傳(heritable)的變化，這樣的變化是由基礎DNA序列的變化以外的變化所導致的，這些變化可以是由例如環境因素、DNA甲基化、非編碼的反義RNA轉錄物、非誘變性致癌原、組蛋白修飾、染色質重塑和特定局部遠距離DNA相互作用引起的，所有這些因素都參與形成目標區域內的基因或非編碼性RNA轉錄單元上的特定轉錄活性的特定環境。應當理解，外遺傳變化可以是由基礎核酸序列的自身不直接影響基因產物或基因表達模式的變化引起的，此類變化可以是例如該基因之內和/或之外的SNP、基因融合，和/或基因間DNA的刪除。此外，顯然的是，術語「特定生理學狀況」指任何細胞的給定生理學狀態有變化的狀況。這可以是一種或多種基因的表達水平的變化、或者一種或多種基因產物的變化。此類狀況的例子包括癌症-良性或惡性生長、心血管病症、炎症狀況包括自身免疫性病症和對形成感染性疾病的炎症應答、受外遺傳機制調變的可遺傳性遺傳病、和神經變性性疾病。優選的是，DNA環的存在是使用PCR技術來鑑定的。應當理解，環的存在可以由這樣的PCR產物的存在來指示當不存在DNA環時該產物也不存在，反之亦然。還應當理解，生成的PCR產物的大小可以指示存在的特定DNA環，因此可以用它來鑑定位點的狀態。在一個優選的實施方案中，DNA環的存在指示改變的轉錄狀態，該改變的轉錄狀態指示特定的生理學狀況。在第二個優選的實施方案中，DNA環的不存在指示改變的轉錄狀態，該改變的轉錄狀態指示特定的生理學狀況。對技術人員而言顯然的是，第一個方面的方法不僅可用於監測染色體基因座處的6特定的遠距離染色體相互作用的存在，而且同樣可用於監測所述染色體基因座處的特定的遠距離染色體相互作用的不存在。優選的是，該生理學狀況選自癌症、心血管病症、炎性狀況包括自身免疫性病症和對感染性疾病的炎症應答、及受外遺傳機制調變的可遺傳性遺傳病。其它任何可導致至少一種遠距離染色體相互作用變化的狀況也可通過本方法來鑑定。應當理解，在本發明的任何方面，可以如下來監測樣品中條件性遠距離染色體相互作用的變化，即比較同一組織或細胞類型中不同時間點時位點處遠距離染色體相互作用的構象，或與相應的生理學狀態已知的樣品比較。此外，應當理解，本發明的遠距離染色體相互作用與基因及其調節元件之間的遠距離相互作用，諸如先前Chambeyronetal.，(2004),CurrOpinBiol.16，256-262;deLaatetal.，(20030Chromosomeres.11,447-459；及Dekker，(2003),J.TrendsBiochem.ki.觀，277-280的所記載的作用無關。本發明涉及特定位點內的遠距離相互作用的條件性變化，作為基因活動轉換的指示。依照本發明的第二個方面，提供一種監測外遺傳變化的方法，包括監測至少一個染色體基因座處的條件性遠距離染色體相互作用的變化，其中該基因座處的遠距離相互作用譜與特定生理學狀況有關，所述方法包括鑑定從該至少一個染色體基因座表達的反義RNA譜的變化的步驟。對技術人員而言顯然的是，反義RNA譜的變化可以是反義RNA轉錄物的大小、起始位置、和/或數目的變化。技術人員應當理解，在染色體上受到遏制的位點處生成反義RNA轉錄物的現象是已知的。然而，發明人令人驚訝地發現，來自染色體基因座的反義RNA轉錄物的譜因該位點是受到誘導的還是受到遏制的而變化，而且生成的反義RNA轉錄物對於控制有義RNA轉錄物自特定位點的轉錄及該位點處的外遺傳狀況(包括遠距離相互作用)發揮中樞作用。依照本發明的第三個方面，提供一種診斷受試者中與至少一處外遺傳變化有關的病症的方法，所述方法包括鑑定自該受試者分離的樣品中與所述病症有關的至少一個染色體基因座上的一種或多種遠距離染色體相互作用的變化；其中所述方法包括第一個或第二個方面的方法。優選的是，外遺傳變化導致來自該染色體基因座的轉錄改變。應當理解，轉錄改變可以是上調、遏制、或生成具有不同的起始位點和/或終止位點改變的其他轉錄物，或這樣的剪接變體。顯然的是，外遺傳變化會可引起基因組的非編碼部分內至少一個基因和/或轉錄單元的表達的變化。優選的是，所述病症選自癌症、心血管病症、炎性狀況包括自身免疫性病症和對感染性疾病的炎症應答、及受外遺傳機制調變的可遺傳性遺傳病(inheritablegeneticdisorders)。導致至少一種遠距離染色體相互作用變化的任何其它狀況也可通過本方法來診斷。依照本發明的第四個方面，提供一種調節患有與改變的基因表達有關的病症的患者中的至少一種基因的表達的方法，所述方法包括以可有效改變所述至少一種基因的轉錄的量對所述患者施用反義RNA。在一個實施方案中，病症是由所述至少一種基因的過表達所導致的。對技術人員而言顯然的是，病症同樣可以是由於所述至少一種基因的遏制，或者由於所述至少一種基因生成改變的基因產物而導致的。優選的是，病症選自癌症、心血管病症、炎性狀況包括自身免疫性病症和對感染性疾病的炎症應答、及受外遺傳機制調變的可遺傳性遺傳病。在一個優選的實施方案中，所述反義RNA靶向至少一個CTCF結合位點。CTCF是一種多功能因子，如下文所討論的，它參與高級染色質結構的建立和維持。在另一個優選的實施方案中，施用所述反義RNA導致對HDAC酶的調變(modulation)。已知轉錄調變涉及組蛋白乙醯化。有人提出這種調變也是藉由反義RNA而受到控制的。HDAC酶根據序列身份和域組織分成四類。在一個優選的實施方案中，所述HDAC酶選自i-iv類HDAC酶。I類HDAC酶包括HDACl、HDAC2、HDAC3、HDAC8；II類HDAC酶包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7A、HDAC9、HDAClO；III類HDAC酶包括Sir2在酵母釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的同源物和Sir2樣蛋白(sirtuins)在哺乳動物中的同源物(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6.SIRT7)；IV類HDAC酶包括HDACl1。依照本發明的第五個方面，提供一種調節患有與改變的基因表達有關的病症的患者中的至少一種基因的轉錄的方法，所述方法包括對所述患者施用與涉及所述基因的調變的反義RNA分子互補的幹擾RNA。對技術人員而言顯然的是，該病症可以是由於所述至少一種基因的過表達或遏制而導致的，或者是由於所述至少一種基因生成改變的基因產物而導致的。優選的是，該病症選自癌症、心血管病症、炎性狀況包括自身免疫性病症和對感染性疾病的炎症應答、及受外遺傳機制調變的可遺傳性遺傳病。依照本發明的第六個方面，提供用於治療與改變的基因表達有關的病症的反義RNA，其中所述反義RNA調節所述基因的轉錄。依照第七個方面，提供反義RNA在製備用於治療與改變的基因表達有關的病症的藥物中的用途，其中所述反義RNA調節所述基因的轉錄。優選的是，依照第五個或第六個方面的病症選自受外遺傳機制調變的癌症、心血管病症、炎性狀況包括自身免疫性病症和對感染性疾病的炎症應答、及可遺傳性遺傳病。在第一個優選的實施方案中，所述RNA遏制所述基因的轉錄。在第二個優選的實施方案中，所述RNA誘導所述基因的轉錄。在一個優選的實施方案中，所述反義RNA靶向至少一個CTCF結合位點。在另一個優選的實施方案中，所述反義RNA調變HDAC酶。對技術人員顯然的是，上述藥物可與合適的藥學可接受載體，如稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑、等一起配製成藥用劑型。劑型可含有其它藥學可接受賦形劑，用於調整PH、滲量、味道、粘度、無菌度、親脂性、溶解度等條件。合適的劑型包括固體劑型，例如片劑、膠囊劑、粉劑、可分散顆粒劑、扁囊劑和栓劑，包括持續釋放和延遲釋放配製劑。粉劑和片劑一般包含約5%至約70%的活性組分。合適的固體載體和賦形劑是本領域普遍知道的，而且包括例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、等。片劑、粉劑、扁囊劑和膠囊劑都是適合於口服施用的劑型。液體劑型包括溶液、懸浮液和乳狀液。液體形式製備物可通過靜脈內、腦內、腹膜內、胃腸外或肌肉內注射或輸注來施用。無菌可注射配製劑可包含活性劑在無毒的藥學可接受稀釋劑或溶劑中所成的無菌溶液或懸浮液。合適的稀釋劑和溶劑包括無菌水、Ringer氏溶液和等張氯化鈉溶液等。液體劑型還包括用於鼻內施用的溶液或噴霧。適合於吸入的氣霧劑製備物可包括溶液和粉末形式的固體，它們可與藥學可接受載體諸如惰性壓縮氣體組合。還涵蓋用於經皮施用的劑型，包括乳膏、洗劑、氣霧劑、和/或乳劑。這些劑型可包括在基質或儲庫類型的透皮貼劑中，這些是本領域普通知道的。藥物製備物可依照藥物配製的標準規程以單位劑型方便地製備。每個單位劑量的活性化合物量因活性化合物的性質和預定的劑量方案而變化。活性劑要以「治療有效量」對人受試者施用，「治療有效量」意思是足以在該患者中提供醫學上期望的結果的劑量。治療有效量的確切的給藥劑量和頻率會隨諸如活性物質的性質、劑型和施用路徑等因素而變化。依照本發明的第八個方面，提供一種鑑定染色體基因座的轉錄狀態的方法，所述方法包括下述步驟鑑定自所述染色體基因座表達的反義RNA轉錄物譜；並將所述譜與所述染色體基因座在已知狀態下的反義RNA轉錄物譜進行比較。優選的是，所述染色體基因座包含至少一種基因。優選的是，所述基因是已知或被懷疑涉及特定生理學狀況的基因。應當理解，所述狀況可以是任何與外遺傳變化有關的狀況，例如癌症、心血管病症、炎性狀況包括自身免疫性病症和對感染性疾病的炎症應答、及受外遺傳機制調變的可遺傳性遺傳病。優選的是，所述方法是在體外實施的。為了避免疑惑，在此說明，本文就本發明的任一方面描述的特徵同等地適用於本發明的所有其它方面。另外，在有多個特徵被指定為選項的場合，任何一個單獨的特徵應可別地適用，或與本申請中記載的任何其它特徵組合適用。附圖簡述現在參照下面的實施例和附圖進一步描述本發明。圖1。GALlO處的條件性反義轉錄物用GAL10的有義和反義特異性探針探查總RNA的Northern印跡。A、B。將菌株BY4741在半乳糖中培養(第1道)，清洗(第2道)、轉移至含有葡萄糖的培養基中保持15分鐘(第3道)、60分鐘(第4道)、120分鐘(第5道)、180分鐘(第6道)或360分鐘(第7道)。B中顯示了反義信號的兩次曝光。標示了rRNA條帶的位置。B中的左邊小圖和小圖A曝光相同時間。在15分鐘時，隨著活躍狀態向遏制狀態的轉換的發生，可檢測到2.251Λ和2.41ΛGALlOAS(見圖3B)二者。C。將在半乳糖中培養過夜的酵母清洗並轉移至含有所示糖的新鮮培養基。在此實驗中，在半乳糖中明顯可見高水平的GALlO和GAL10-7融合轉錄物，並有同等的(equivalent)反義轉錄物。有義曝光是反義的20%。泳道2*中加載兩倍的RNA。圖2。逆轉錄(RT)-PCR定位轉錄物於GAL基因座A，用於逆轉錄(RT)有義⑶或反義(AS)轉錄物的RT引物及用於PCR擴增的嵌套引物的位置。每套引物被設計用來擴增GAL基因座中的所示位點處的約200-300bp的區域。B，對三種碳源的總RNA中的有義和反義轉錄物在整個GAL7和GALlO上定位。針對在葡萄糖中製備的RNA的缺少逆轉錄酶的對照顯示於第7道。C，從在葡萄糖中培養的細胞製備的總RNA中的反義轉錄物在GAL7和GALlO上定位。對照包括省略RT步驟的對照及反映PCR引物對總DNA的效率的陽性對照(未顯示)。圖3。用鏈特異性探針對轉錄物在GAL基因座上定位。A，從在葡萄糖、棉子糖或半乳糖中培養的BY4741(第1道)、W303_la(第2道)和YMH147(第3道)製備總RNA並與單鏈特異性探針1_7(均設計用於檢測針對GALlO的反義轉錄物)雜交得到的放射自顯影照片。在整個放射自顯影照片(曝光M小時)上用黑色線標示rRNA(RDN25和RDW8)和tRNA的位置。B，圖2和圖3A中的數據的匯總，顯示了受到遏制(葡萄糖)或受到誘導(半乳糖)的基因座上的轉錄物。圖4。GALlO的3』端處的序列是誘導有義轉錄物所需要的。A的示意圖顯示了受到遏制或受到誘導的GALlO(WT)和GALlO衍生物(Mut)上的主要轉錄物的位置，該衍生物含有pTEF:KanMX:TEFter插入，導致在GALlO的3，端發生554bp的刪除。B和C，來自在所示碳源中培養的所示菌株的總RNA的Northern印跡。在B中，用虛線標示了rRNA的位置，而且使用了有義和反義特異性探針。放射自顯影照片曝光同等的時間。在C中，誘導培養物，並在自棉子糖(第1道)轉移至半乳糖(第2-6道)後以10分鐘間隔製備樣品。圖5。Hdal和與GALlO的結合與反義轉錄物的水平相關。細胞在半乳糖中培養過夜後轉移至含有半乳糖或葡萄糖新鮮培養基，20分鐘後製備染色質，進行免疫沉澱並使用針對GALlO的實時PCR檢測。A，Hdal-myc，相對於無標籤的對照標準化。B，Eaf3，相對於無標籤的對照標準化。C，H3K18ac，先後相對於H3K18R和組蛋白H3標準化。圖6。針對受遏制的GAL基因座的3C及免疫沉澱。A，DpnII限制性位點(垂直線)的定位，顯示了引物(箭號3』0H)的數目、位置和取向及誘導的有義轉錄物和受遏制的基因座上的反義轉錄物的大致位置。B，所示的菌株(BY4741背景)中針對所示位點的3C及IP(Rbpl頂部的三幅小圖，Myc底部小圖)。C，標準反應的對照，包括無甲醛交聯(-Form)、無消化(-dig)、無DNA連接酶、無ATP(-Iig)。凝膠上是一個3C產物(-IP步驟)和標準3C及免疫沉澱(Expt)。顯示了GALlO處的遠距離相互作用的PCR產物。所有其它相互作用顯示相似的依賴性(cbpendencies)(未顯示)。D，針對所示菌株(BY4741背景)中所示位點的3C及IP(Rbpl)。圖7。GAL基因座處的條件性遠距離相互作用。A，DpnII限制性位點(垂直線)的圖，顯示了引物(箭號3』0H)的數目、位置和取向及誘導的有義轉錄物和受到遏制的基因座處反義轉錄物的大致位置。B，從所示碳源中培養的BY4741細胞分離的染色質的所示位點處的3CIP(Iibpl)產物。C，在三種不同碳源中培養的WT菌株(BY4741背景)中GAL10-7和FMP27上的3CIP(Rbpl)。D，受到遏制的基因座處的動態遠距離相互作用的一種模型。我們認為來自GAL7(顯示)、GAL10的反義轉錄物和基因間區域處的其它非編碼轉錄物與Hdal和賴氨酸脫乙醯基酶一起形成適合於遠距離相互作用的環境。在葡萄糖中，可檢測到GAL10、GAL7和GAL10-7間的相互作用，而且顯示了可適用於該現象的一種模型。考慮到它們與RNAPII和TFIIB的結合，這些遠距離相互作用似乎代表著基因座上的一種平衡的但受到遏制的狀態，沒有活躍的轉錄。E，一種GAL基因座上的條件性遠距離相互作用模型。和在受遏制的基因座上一樣，遠距離相互作用表現出呈現基因上平衡的不活躍的狀態。當葡萄糖遏制除去時(即在棉子糖中)涉及GALlO和GAL7處遠距離相互作用的動態轉換的升高會導致GAL10-7上的遠距離相互作用丟失。活躍轉錄的啟動會促進表達和遏制狀態之間的動態轉換。我們設想，受到誘導的基因座處的反義轉錄物的生成可發揮兩種作用促進有義轉錄物生成，以及藉由和Hdal來引發該區域的遏制作用及形成遠距離相互作用(當該基因不是活躍表達時)。圖8。體內CTCF依賴性轉錄系統。a，整合的螢光素酶報告基因含有野生型90bpCTCF結合位點N-Myc(pN-MycLucwt)或CTCF結合缺陷的突變體(pN_MycLucwt)，代替啟動子13。b，整合構建物的放大圖，標示了引物的位置。用於ChIP測定的針對N-Myc位點的引物以紅色顯示，先前有說明13。5』處的引物以褐色顯示，3』端處的引物以藍色顯示；3C和4C測定中所用的引物以綠色顯示。這些引物在在線附錄中的「材料和方法」中有說明。有關TaqI限制性位點以淡藍色三角形顯示；標示了它們相對於螢光素酶轉錄起始位點的位置。c，在pN-MycLucwt中，野生型CTCF結合位點的存在足以驅動螢光素酶的表達；α-鵝膏菌素顯著降低螢光素酶活性。d，CTCF和PolII結合於pN-MycLucwt中而不是pN-MycLucmut中的N-Myc位點，如用所示抗體進行的ChIP測定所顯示的。e，α-鵝膏菌素處理導致PolII而非CTCF從N-Myc位點解離，如用所示抗體進行的ChIP測定所顯示的。在小圖「d」和「e」中，分析所用引物在圖Ib中以紅色顯示且先前有說明13。圖9。染色質構象捕捉(3C)和ChIP測定。a，5』和3』端(圖Ib中的綠色箭號)在pN-MycLucwt中被並置(第3道)，但是在N-MycLucmut中不然(第4道)，如3C測定所揭示的。第1道是經過連接的模板的陽性對照。第2道是陰性連接對照。分析所用引物在在線附錄中的「材料和方法」下有說明。b，pN-MycLucwt的5'(第3道)和3』(第5道)位點被PolII佔據，但是pN-MycLucmut不然(第4道和第6道)，如用抗PolII抗體進行的ChIP測定所揭示的。第1道-輸入。第2道-免疫前血清。C，pN-MyCLUCwt的5'(第3道)和3』(第5道)位點被CTCF佔據，但是pN-MycLucmut不然(第4道和第6道)。第1道-輸入。第2道-免疫前血清。在小圖「b」和「C」中，5』端特異性引物以褐色顯示，3』端特異性引物以藍色顯示。圖10。用抗PolII和CTCF抗體進行的4C測定(ChIP和3C測定的組合)。分析所用引物在圖Ib中以綠色顯示，而且在在線補充中的材料和方法下有說明。a，PolII存在於pN-MycLucwt的5』和3』位點的並置處(第3道)，但是pN-MycLucmut不然(第4道)。在pN-MycLucwt中，α-鵝膏菌素處理導致PolII自高級染色質結構消失(第5道)。b，CTCF存在於與pN-MycLucwt的5』和3』位點的並置的位置(第3道)，但是pN-MycLucmut不然(第4道)。在pN-MycLucwt中α-鵝膏菌素處理後CTCF仍與高級染色質結構結合(第5道)。圖11。一種顯示CTCF如何能將轉錄與高級染色質結構聯繫起來的模型。a，CTCF可結合至pN-MycLucwt的5』和3』端中的兩個位點。b，經CTCF在pN-MycLucwt的5』和113』端之間建立高級結構。c，PolII結合至CTCF並啟動轉錄。d，抑制轉錄並除去PolII後，剩餘的結構由於與CTCF的結合仍能被檢測到。實施例1:GAL基因座的外遺傳控制GALlO處的條件性反義轉錄物。向在半乳糖中生長的細胞的培養物添加葡萄糖導致對轉錄的快速抑制。正如預期的，在添加葡萄糖15分鐘內，2.25kbGALlO轉錄物和更長的4.IkbGAL10-7融合轉錄物(GregerandProudfoot,1998,EmboJ17，4771—4779;St.JohnandDavis,1981,JMolBiol152,285-315)二者的水平顯著下降(圖ΙΑ)。有人報告在受到遏制的GALlO基因處存在反義轉錄物(Perocchietal，2007，NucleicAcidsRes35，el28；Samantaetal,2006,ProcNatlAcadSciUSA103,4192-4197；Davidetal,2006,ProcNatlAcadSciUSA103,5320-5325；Miuraetal,2006,PNAS103，17846-17851)。發明人調查了反義轉錄物是否是GALlO基因的一般特徵，以及，如果是的話，這些轉錄物何時出現。在誘導的培養物中，觀察到三種反義轉錄物(圖1B)，其中兩種的大小與受到誘導的GAL基因座處的2.25kb和4.Ikb有義轉錄物相似(圖1A)。第三種可檢測得到的反義轉錄物更小，約1.5kb0將圖IA和IB中的放射自顯影照片與相似比活性的探針雜交並曝光相似長度的時間，提示在活躍的GALlO基因處，反義轉錄物佔總RNA的相當一部分。此外，甚至覆蓋這兩種基因的所述內源4.IkbGAL10-7轉錄物(圖1A、C)也有相當的反義轉錄物來匹配(圖1B、C)。在葡萄糖遏制期間，GALlO反義轉錄物的豐度顯著下降(圖1B)。因此為了清楚起見，顯示了圖IB中Northern印跡的兩次曝光。圖1中的數據證明了受到遏制的基因座處的反義轉錄物的大小也有變化。動力學研究指示向培養物添加葡萄糖後15分鐘，觀察到自4.lkb,2.25kb和1.5kb反義轉錄物向約3.5kb、2.4kb和1.5kb的三種轉錄物的轉換。2.25kb和2.4kb轉錄物二者在葡萄糖添加後15分鐘都能檢測到。因此，GALlO處的反義轉錄物的豐度和大小反映基因是受到誘導還是受到遏制，由此存在一種有趣的可能性，即反義轉錄物可能在這兩種條件下在GAL基因座處發揮調節作用。使用RT-PCR對轉錄物在GALlO上定位。使用鏈特異性引物逆轉錄(RT)偶聯PCR來測定在葡萄糖、棉子糖和半乳糖中培養的細胞中GALlO周圍有義和反義轉錄物的位置(圖2)。這裡使用的策略採用對於檢測有義(S)或反義(AS)轉錄物特異性的RT引物及嵌套PCR引物來生成大約200bp的產物(圖2A)。首先，分析2.251ΛGALlO有義轉錄物及其等價的反義物。它們是相當豐富的轉錄物，適合於通過RT-PCR來定位(圖2B)。只有在從半乳糖中培養的細胞製備的樣品中，用橫跨GALlO編碼區的引物組6S至8S能檢測到GALlO有義轉錄物(圖2B，第2道)。來自引物組6AS至8AS(它們被設計用於逆轉錄和擴增反義轉錄物)的信號也只在半乳糖中培養細胞時是明顯的(圖2B，第5道)。這提示受到誘導的GALlO處的有義和反義轉錄物覆蓋相同的區域。然而，在葡萄糖和棉子糖中，用反義特異性引物組7AS和8AS檢測到信號，但是用6AS或任何針對有義轉錄物的等價引物都沒有檢測到信號。這與全微陣列定位的結果一致，後者顯示在遏制條件下，轉錄物在GALlO編碼區內距3』端約500bp處產生(Perocchietal,2007,NucleicAcidsRes35,el28；Davidetal,2006,ProcNatlAcadSciUSA103，5320-5325)。這提示在GALlO上有兩種截然不同的反義轉錄物，對應於誘導和遏制狀態。如果受到遏制的基因座處的2.4kb反義轉錄物開始於GALlO編碼區內，那麼它很有可能延伸入GAL10-1基因間區域，來自引物組9和10的信號證實了這一點(圖2C)。位於GAL10-7基因間區域上的引物組5S和5AS的信號弱得多，提示大多數有義和反義轉錄物分別在此區域內終止或起始。值得注意的是，針對GAL7的有義和反義特異性引物組也揭示了有義和反義轉錄物的證據(圖2C)。在這裡，跨越ORF末端和3』區的引物組3S和3AS能夠檢測有義轉錄物，但不能檢測反義轉錄物，提示反義轉錄物是在更上遊處啟動的。數據指示轉錄物可能彼此抵消。結論是當用半乳糖誘導細胞時，GALlO和GAL7生成有義轉錄物和反義轉錄物，而且轉錄物大小相似。使用Northern印跡對反義轉錄物在GALlO上定位。使用鏈特異性探針進行Northern印跡來在葡萄糖、棉子糖和半乳糖中培養的細胞中鑑定反義轉錄物在來自三種不同菌株背景的GALlO上的大致位置(圖3)。Northern印跡的優點在於能夠將轉錄物的大小與它在GAL基因座上的位置關聯起來。探針2和3—般顯示較差的雜交及高背景信號，使得對長轉錄物的雜交難以辨別。在誘導的培養物中，明顯可見高水平的針對GAL7和GALlO的反義RNA(探針2和4)，證實了圖2中的RT-PCR數據。受到誘導的GALlO處的2.25kb反義顯示與探針3的輕微雜交，但是與探針5沒有雜交，提示它主要局限於GALlOORF區域。探針6與GALl有義轉錄物雜交，因為GALl在Watson鏈上。另兩種轉錄物只在受到誘導的細胞中生成。它們都在GALl內產生，並在有義鏈上延伸經過GALl終止子進入FUR4。一種轉錄物為大約>51Λ，而第二種大得多。在受到遏制的培養物中，2.4kb(GALlO)反義轉錄物顯示出與GAL10-1基因間區域中的一個短探針的強烈雜交及與一個GALl探針不太強烈的雜交。用自在半乳糖中培養的細胞製備的RNA沒有看到與這些探針的雜交，與圖2中的PCR定位結果一致。這提示受到遏制的基因座處的GALlO反義轉錄物在距GALlOORF的3，端約500bp產生，並延伸到GAL10-1基因間區域上。以類似的方式，更長的3.5kb反義GALlO轉錄物也顯示出與這些探針的強烈雜交，提示它也延伸跨越GAL10-1基因間區域並進入GALl(圖3A)。有四種小的非編碼轉錄物在遏制性和誘導性兩種條件中培養的細胞中是明顯的(圖3A)。值得注意的是，這些轉錄物主要存在於基因座處的基因間區域上。第一種是一種11Λ轉錄物，它可以用相對於GALlO和GAL7轉錄物的反義取向的探針(探針3)在GAL7-10基因間區域處檢測得到。第二種是一種大約600bp的轉錄物，它可與針對GALl終止子的有義方向的探針(探針7)雜交。第三種轉錄物為約1.71Λ，並自KAP104的5』區域反義延伸穿過GAL7終止子區域(探針1)。第四種為約1.51Λ，在GALlO內起始，延伸入GAL10-1基因間區域(探針5)。在此分析中，自三種不同菌株背景製備RNA。BW741(第1道)和W303_la(第2道)菌株在所有三種碳源中生成相似的譜(profile)。然而，在YMH147菌株(第3道)中，GAL基因座的表達似乎在棉子糖中被去遏制。在一些區域中，此菌株中的轉錄物譜與葡萄糖或半乳糖中轉錄物譜的不同(例如比較第1道和第3道，在三種碳源中，與探針3、6和7雜交定位數據(來自圖1-3)的匯總顯示於圖:3B。有三點值得注意。第一，當用半13乳糖誘導細胞時，對於每一種有義轉錄物有相對較高水平的反義轉錄物(GAL10、GAL7和GAL10-7)。受到誘導的基因座處的有義和反義轉錄物似乎是成對的且協同的。第二，遏制時(在葡萄糖中)反義轉錄物的大小變化與GALlO中的預測的起始和終止位點的變化偶聯。第三，在受到遏制的和受到誘導的基因座中，在基因間區域(GAL7終止子；GAL10-7基因間區域；GAL10-1基因間區域；GALl終止子)上均有轉錄物的存在。GALlO的3』區域處的序列是誘導有義轉錄物所需要的。數據提示反義轉錄物在GALlO上的位置反映該基因是受到遏制的還是受到誘導的。這些轉錄物有可能在不同位點處啟動(圖4A)。，發明人設計了一項實驗，通過將3』側翼區域與主基因分開來鑑定被誘導的反義轉錄(有可能在GALlO的3』側翼序列處或其附近發生)所需要的序列。利用此構建物可以測試推定啟動子並檢查它對誘導有義轉錄物的影響。刪除了鹼基M53和3007之間的554bp，保持剩下GALlOORF的3，端處的92bp及3，側翼序列完整。還用方向與GALlO表達相同的表達盒替換刪除的區域。自在棉子糖中培養後轉移至半乳糖中經15和60分鐘後(這足以在野生型中強烈誘導有義轉錄物並誘導出現2.3kb反義轉錄物)的細胞製備RNA(圖4B第5和7道)。在GALlO的3』端處的插入足以破壞2.4kb和3.5kbGALlO反義轉錄物二者的表達(圖4B，第6和8道)。重要的是，在這些樣品中觀察到的有義轉錄物水平很低(圖4B，第6和8道)。由此可見，在GALlO的3』端處有插入的菌株中，儘管有義轉錄的啟動子區域是完整的，但是有義RNA的生成受損。由此可以推測，反義轉錄物是來自GALlO啟動子的轉錄所需要的。還檢查了突變型菌株中GAL7和GALl處的誘導譜(圖4C)。沒有觀察到對GAL簇上受到遏制的水平的明顯影響。另外，此插入對GAL7或GALl處的轉錄物誘導有幾乎沒有影響。由此可見，GALlO的3』端處的序列是誘導的反義轉錄物生成所需要的，而誘導的反義轉錄物生成與誘導的有義轉錄物的有效轉錄有關。這提示誘導的基因的5』和3』端之間的事件的協調。GALlO的3』區域的序列不是受到遏制的基因座處的反義轉錄所需要的。在受到遏制的基因座中，反義轉錄物有可能在GALlOORF內的不同位置處啟動(圖4A)。GALlO的3』端處的插入讓我們提出這樣的問題，即受到遏制的基因座中的反義轉錄是否與受到誘導的基因座需要相似的序列(圖4B)。令人驚訝的是，我們注意到，與WT相比，突變體中的兩種反義轉錄物的大小只有少量縮小。長反義和短反義的水平以及二者之間相對大小的差異仍然與WT非常相似。這提示，這些轉錄物的正常啟動位置的序列已經被3』插入所破壞或刪除，這兩種轉錄物在新的、略微更接近GALlO的5』區域的位點啟動。考慮到這些轉錄物正常起始位點已被去除，這些轉錄物如何啟動就成為了問題。一種解釋是所插入的表達盒中的序列。然而，因為這些新轉錄物在誘導條件中不存在，所以它們不太可能是從所插入的盒內的序列啟動的。由此可見，誘導的反義轉錄物和受到遏制的基因座處的反義轉錄物有不同的序列要求。Hdal至GALlO的募集反映反義轉錄物的水平，但是H3K18ac不然因為與遏制狀況相比，當GALlO處於誘導狀態時生成顯著更多的反義轉錄物，所以進行實驗來確認Hdal在GALlO處的結合是否反映1)反義RNA的水平或者2)該基因的表達是受到誘導還是受到遏制。使用從受到誘導或受到遏制的細胞製備的染色質，通過ChIP評估了Hdal-myc與GALlO的結合(圖5A)。對照使用fef3，它是Rpd3S賴氨酸脫乙醯基酶和NuA4賴氨酸乙醯基轉移酶(Allardetal，1999，EMBOJ18,5108-5119)二者的成分。缺少的菌株在基因的啟動子處及編碼區內都顯示高水平的組蛋白乙醯化，而不是在啟動子處高、編碼區中下降的正常情況，提示的喪失特別對Rpd3S複合物有重大的影響(Reidetal，2004，MolCellBiol24,757-764)。在受到誘導的細胞中，Hdal-myc與GALlO的5』和3』區域二者結合。在受到遏制的染色質上Hdal-myc的信號下降約5倍。這種差異不是由於在遏制或誘導條件中培養的細胞中的Hdal-myc水平差異造成的(數據未顯示)。此數據與受到誘導的細胞中存在高水平反義轉錄物及整個GALlO上的高水平的Hdal—致。Eaf3顯示相似的趨勢，但沒有這麼明顯，其在遏制時顯示在GALlO的啟動子和3』端二者處的結合的水平變低(圖5B)。為了鑑定受到遏制和誘導的GALlO處的Hdal結合與組蛋白乙醯化之間是否有相關性，我們考察了H3K18aC，Hdal的一種已知底物。H;3K18aC在受到遏制的基因處的水平較低，與H3K18R菌株中的水平相似，這與Hdal進行的活躍的脫乙醯化是符合的。在受到誘導的細胞中，HIBKisac水平顯著高於受到遏制的細胞中的水平，儘管Hdal在受到誘導的菌株中有高水平(圖5C)。即使在考慮了伴隨著GALlO處的活躍轉錄的核小體丟失並將H3K18ac信號相對於H3水平標準化之後，此差異仍然存在。這提示GALlO處的Hdal結合和H3K18ac之間沒有直接關聯。如果Hdal活性與反義轉錄物相關，如Camblongetal,2007Cell131，706-717提出的，那麼在受到誘導的基因上，特別是5』區域處高水平的H3K18ac可以用有義轉錄物轉錄激活和延長過程中伴隨的組蛋白乙醯化來解釋。乙醯化和脫乙醯化的平衡會移動，導致在受到誘導的基因上的H3K18ac淨增加。GAL基因座處的遠距離染色質相互作用。已經記載了少數活躍酵母基因處的遠距離染色質相互作用(也稱作基因環)(AnsariandHampsey,2005,GenesDev19,2969-2978；0'Sullivanetal,2004,NatGenet36,1014-1018；SinghandHampsey,2007,MolCell27，806-816)。這些相互作用呈現酵母基因5』和3』區域的並置，而且與RNAPII、TFIIB和CPF轉錄終止機制有關。考慮到顯示受到遏制的GAL基因座處活躍反義轉錄及受到誘導的GAL基因座處3』至5』端通訊的數據，進行調查來確認遠距離相互作用是否涉及對GAL表達的反義調節。針對GAL基因座分析了遠距離相互作用的存在，並且，通過加入一個免疫沉澱步驟，分析了這些相互作用是否與RNAPII和TFIIB有關。使用一種改良3C(捕捉染色體構象)技術(Dekker，2006，NatMethods3，17-21；Dekkeretal，2002，Science295,1306-1311；0'Sullivanetal，2004，NatGenet36，1014-1018)來監測來自在葡萄糖、棉子糖和半乳糖中培養的細胞的GALlO5，和3，區域、GAL75，和3，區域及GALlO的5，區域與GAL7的3，區域之間的相互作用(圖6A)。作為對照，使用先前檢測到的FMP27處的遠距離相互作用，其與RNAPII有關，而且存在於所有三種生長條件中(見圖7C)。受到遏制的GAL基因座處的遠距離相互作用。在葡萄糖中培養的細胞中，能檢測到GALlO上、GAL7上及GALlO的5，區域和GAL7的3』區域之間(GAL10-7)的遠距離相互作用(圖6B)。此外，這些相互作用與RNAPII有關，因為用針對Rbpl的抗體能免疫沉澱3C相互作用。GALlO和GAL10-7相互作用的對照顯示了PCR產物是特異性的，而且依賴於下列因素甲醛交聯、染色質的DpnII消化、連接反應和PCR反應中模板的添加(圖6C)。在一些反應中，觀察到超過一種PCR產物。將這些PCR產物自凝膠分離，並分析DpnII接點上的序列。這揭示了例如下述情況GAL10_1基因間區域中與引物組6毗鄰的DpnII位點在交聯的染色質製備物中受到部分保護，結果，除了對GALlO上的遠距離相互作用預期的^Obp產物之外，還出現了約550bp的產物。對三個遠距離相互作用位點進行了類似的分析，結果證實了觀察到的所有PCR產物都依賴於甲醛交聯，而且與顯示遠端序列並置的有效遠距離相互作用是相符的。迄今為止有記載的有限數目的遠距離相互作用是在活躍轉錄的基因上觀察到的。本文記載的相互作用發生在這樣的基因座上，其GAL表達受到遏制的，但反義轉錄物的存在提示該基因座在轉錄上是活躍的。下一步是檢查在受到遏制的基因座處驅動環形成的機制是否與活躍基因處的機制相似。遠距離相互作用在一種攜帶sua7-l等位基因的菌株中降低，其表達具有Ε6Ι(穀氨酸62變成賴氨酸)替代的TFIIB(SinghandHampsey,2007,MolCell27,806-816)。此突變的活躍基因的3』區域處的相互作用缺陷，但是5』區域處不缺陷。在遏制條件下，GAL10、GAL7、GAL10-7和對照FMP27遠距離相互作用都顯示出對功能性TFIIB的依賴，提示受到遏制的基因座上的環與活躍基因上的環具有相同的要求(圖6D)。另外，與不帶標籤的菌株相比，在來自表達TFIIB-myc的菌株的免疫沉澱物中GALlO和GAL7遠距離相互作用能富集，但是GAL10-7不然(圖6B)。這提示TFIIB-myc與顯示GALlO和GAL7處遠距離相互作用的染色質區域密切有關。尚不清楚為什麼無法檢測到與GALlO和GAL7之間的遠距離相互作用相關的TFIIB，因為該相互作用是需要功能性TFIIB的。一種可能性是在此相互作用中表位標籤不可及。由此可見，在受到遏制的GAL基因座處能檢測到遠距離相互作用，而且這些相互作用顯示與活躍基因上的基因環相同的需要。GAL基因座處的條件性遠距離相互作用。在棉子糖(一種遏制性生長培養基)中及在半乳糖中，當GALlO和GAL7表達時，也觀察到了這些基因的遠距離相互作用(圖7B)。在這兩種情況下，相互作用都與RNAPII有關。然而，GALlO的5』區域和GAL7的3』區域之間的遠距離相互作用(GAL10-7)依賴於生長培養基中的碳源(圖7B、C)。最重要的是，這種遠距離相互作用在誘導條件(半乳糖)下丟失，甚至在除去葡萄糖遏制時(在棉子糖中)亦丟失。因此，不太可能簡單地用在誘導條件下觀察到的高水平有義轉錄來解釋遠距離相互作用的破壞。相反，GAL10-7遠距離相互作用的條件性似乎與葡萄糖遏制的喪失有關。GAL基因座處的遠距離相互作用受賴氨酸脫乙醯基酶影響。在遏制和誘導條件下的GAL基因座處都存在非編碼轉錄物和遠距離相互作用。我們考察了非編碼轉錄物的存在是否與遠距離相互作用相關。反義轉錄物與Hdal賴氨酸脫乙醯基酶關聯(圖5)(Camblongetal，2007Cell131,706-717)。在受到遏制和誘導的GALlO基因座上，染色質結合的Hdal(chromatinassociatedHdal)的水平與反義轉錄物的水平相關。有人提出了Hdal和是否為GAL基因座處和FMP27處的遠距離相互作用所需要的問題。在受到遏制的細胞中，Hdal的丟失對GAL10、GAL7和GAL10-7上的遠距離相互作用具有顯著影響(圖6B)。對FMP27的影響的顯著性低得多。相比之下，Eaf3是FMP27和GALlO處的遠距離相互作用所需要的，但是GAL7或GAL10-7對這種因子的需要少一些。一些基因座(如FMP27和GAL7)顯示出對一種或另一種複合物的特異性，而一些基因座(如GAL10)似乎同時需要這兩種活性。此數據暗示賴氨酸脫乙醯基酶Hdal和Rpd3S直接或間接參與遠距離相互作用的形成，並且提示這可能與反義轉錄物有關。討論發明人使用GAL基因座作為模型系統，比較其中誘導和遏制狀態及觀察反義轉錄物的差異和外遺傳調節。它們顯示出基因遏制是一種先發制人的狀態(proactivestate),其涉及反義轉錄物的受調節的生成，以及與之關聯的基因座的外遺傳變化。GAL基因座上的非編碼轉錄物圖是複雜且條件性的。基因間區域上相對較短的轉錄物的存在，令人想到與SER3(Martensetal，2004，TrendsGenet23,126-133),IMD2,LEU4(DavisandAres,2006,ProcNatlAcadSciUSA103,3262-3267)禾口Tyl(Berrettaetal，2008GenesDev22，615-6)等酵母基因或者DHFR(Martianovetal，2007，Nature445,666-670)等哺乳動物基因相關的啟動子關聯轉錄物(promoterassociatedtranscripts)。因為這些轉錄物既存在於受到誘導的GAL基因座，又存在於受到遏制的GAL基因座，所以它們不太可能具有與激活和遏制直接相關的調節功能，但是可能影響基因座拓撲學的其它方面。GALlO處的非編碼反義轉錄物的大小和位置隨生長條件而變化。在受到誘導的基因座處，有一種豐富的反義轉錄物，其水平與有義轉錄物協同地上升和下降。數據提示GALlO的3』側翼區域處的序列是推動此轉錄物表達所需要的。在調節子的結合位點(此區域還含有GAL7的啟動子)之外，此區域中還有Rebl結合位點。因為它是一種條件性轉錄物，所以在激活GAL7轉錄物和GALlO反義二者中起雙重作用是可能的。然而，發明人還定位了一種高水平反義轉錄物，其產生於受到誘導的GAL7的3』區域處，而且此區域中沒有結合位點。鑑於GALlO反義轉錄物的喪失與低水平的GALlO有義轉錄物有關，而且了GALlO和GAL7的3』和5』區域之間的遠距離相互作用已得以證明，另一種可能性是啟動子序列在反式(intrans)激活反義轉錄物的過程中發揮作用。受到誘導的GALlO處的反義轉錄物與先前被證明與反義RNA有關的兩種基因具有相同的特性。與PH05(Uhleretal，2007，ProcNatlAcadSciUSA104，8011-8016)一樣，受到誘導的GALlO處的反義轉錄物與有義轉錄物的轉錄有關聯。GALlO轉錄物與PH05處的轉錄物不同，因為它似乎沒有延伸到啟動子區中，因此不太可能採取PH05的假說作用方式，通過重塑啟動子染色質來發揮功能。與PH084(Camblongetal,2007Cell131，706-717)一樣，反義轉錄物的存在與Hdal賴氨酸脫乙醯基酶(KDAC)與染色質的結合相關。儘管賴氨酸脫乙醯基酶與基因表達的激活和遏制二者有關(Bernsteinetal,2000,ProcNatlAcadSciUSA97，13708-13713)，但是在PH084處，Hdal與反義轉錄物一起發揮功能來遏制有義啟動子(Camblongetal，2007Cell131,706-717)。看起來矛盾的是，在活躍的GAL10基因上維持著高水平的H3K18ac，這提示，伴隨著有義轉錄的乙醯化使得動態平衡向乙醯化移動。這背後存在著一個通過由KDAC和反義轉錄物起作用的活躍抑制基態。發明人認為，此基態部分地表現為GAL10和GAL7上的遠距離相互作用(圖7E)。在此模型中，遠距離相互作用儘管與RNAPII和TFIIB有關，但是會呈現平衡的但活躍的轉錄，如先前構想的那樣(AnsariandHampsey，2005，GenesDev19,2969-2978；0'Sullivanetal，2004，NatGenet36,1014-1018；SinghandHampsey,2007,MolCell27，806_816)。在酵母、蠅和哺乳動物中，許多基因以穩定的平衡狀態存在，在啟動子處有關聯的RNAPII和有關的外17遺傳修飾(Guentheretal,2007,Cell130,77-88；Radonjicetal，2005，MolCell18，171-18；Zeitlingeretal，2007，NatGenet39,1512—1516)。在受到誘導的GAL基因座處，反義轉錄覆蓋(extendover)與有義轉錄相同的通用區域上。一旦發生遏制，啟動位點中就發生轉換，驅動反義轉錄所需要的序列的性質也會發生變化。此外，反義轉錄物變成佔優勢。然而，長時間曝光的Northern印跡揭示了很低水平的同等大小的有義轉錄物，這提示有義和反義轉錄之間的相關性甚至在受到遏制的基因上也得到維持。這支持了「主動」(active)遏制的概念，而且支持了遏制狀態是激活時發生的事件的一種變化形式的觀點。反義轉錄物佔優勢的自然結果之一是經由KDAC(諸如Hdal和的主動遏制。有趣的是，在受到遏制的基因座處，反義轉錄物以與PH084處的由外來體調節的反義轉錄物相似的方式延伸覆蓋GAL10-1基因間區域(Camblongetal,2007,Cell131,706-717769)。此區域和其它基因間區域上的脫乙醯化可能促進或穩定該基因座處的遠距離相互作用，例如GAL10-7上的相互作用。圖上同樣突出的是從一種基因延伸至另一種基因的長轉錄物。這些轉錄物是條件性的，例如受到誘導的基因座處的GALl:FUR4長轉錄物或受到遏制的基因座處的GAL10-1反義轉錄物。在哺乳動物細胞中在珠蛋白基因座處觀察到長的非編碼轉錄物，它們可能涉及條件性轉換(Gribnauetal，2000，MolCell5,377-386)在酵母中，這些轉錄物可能僅僅反映較差的轉錄物加工。或者，它們可能是驅動或破壞酵母基因高級組織的兩種不同類型轉錄事件(遏制性的或激活性的)的最初跡象(firstindication)0實驗規程菌株此研究中使用了三種不同菌株背景BY4741(MATahis3A1leu2A0metl5A0ura3Δ0),W303-la(MATa,ura3_52，leu2_3_112，his3_ll，ade2_l，can卜100，trplA2)和YMH14(MATa，cycl-5000，cyc7_67，ura3_52，leu2_3_112，cyh2)。sua7_l等位基因在YMH14背景中(Pintoetal,1994,JBiolChem269,30569-30573)。菌株(包括帶表位標籤的衍生物、截短、和基因刪除)是使用PCR生成的DNA片段通過單步基因替換而構建的(Longtineetal，1998，Yeast14,953-961)將pTEF:KanMX:TEFter插入GAL10的3，區中，導致相對於ATG的第M53位和3007位殘基丟失。選擇標誌的轉錄方向與GAL10有義轉錄相同。在BY4741中，SUA7在C末端用myc表位標記。hdalΔ和eaf3Δ刪除是在ΒΥ4741背景中構建的。培養基和培養條件。生長培養基是使用標準方法製備的，根據需要，在YE中補充2%葡萄糖、棉子糖或半乳糖。酵母取自新鮮平板，並在50至100ml中培養至OD600為0.6至0.8。通過離心來收穫酵母，並在H2O中清洗，之後轉移至新鮮培養基。染色質免疫沉澱方案染色質免疫沉澱是如(MeluhandBroach,1999,Nature445,666-670；Morillonetal,2005,MolCell18，723-734)記載實施的。概括地說，ChIP是如下進行的，使用50ml培養物，用甲醛固定15分鐘，之後添加甘氨酸，最終為0.25mM。在MagnaLyser(Roche)上使用玻璃珠破碎酵母細胞，並使用Bioruptor(Diagenode)通過超聲處理來剪切經過固定的染色質。平均DNA片段長度為150至300bp。離心(30min，10K，4°C)後，將可溶性染色質與針對下述表位的抗體一起在1.5ml矽橡膠化Eppendorf管中於4°C溫育15-20小時5μ1針對H3的(Abeam)，5μ1針對H3K18ac的(Upstate)，20μ1針對Eaf3的(Abeam)，10μ1針對Υ80的(SantaCruz)和10μ1針對myc的(Sigma)，並用蛋白AS印harose於室溫免疫沉澱90分鐘。清洗後，於65°C30分鐘自珠子洗脫染色質。通過於65°C溫育6_20小時來解離交聯物，並用蛋白酶和RNA酶A處理。使用QiagenPCR迷你柱純化DNA，並在100μ1水中洗脫。使用未摻水的IP樣品和對照(例如無抗體、無標籤)，而對照DNA(輸入)相應力口以稀釋。使用CorbettRotorgene禾口SybrGreen混合物(Sensymix，Quantace)，將樣品進行實時PCR。使用實時PCR來擴增與GALlO處所示區域對應的區域。計算數據(IP-無抗體)/Τ0Τ，並表述成相對於輸入的百分比。誤差棒反映在不同實驗之間獲得的平均信號的標準偏差(n=2至4)。鏈特異性探針的生成使用PCR將Τ7啟動子摻到DNA特定區域的末端上。使用32PαUTP和AmbionMAXIscript試劑盒(產品目錄號ΑΜ1308-ΑΜ1326)，使用Τ7RNA聚合物來生成對DNA的有義或反義鏈具有特異性的單鏈探針。Northern印跡將15μg使用熱苯酚氯仿和玻璃珠從細胞製備的總RNA在1.1%甲醛凝膠上分開並轉移至Magna尼龍膜，於80°C烘烤2小時，然後在PerfectHybPlus(Sigma)中於64°C雜交過夜，在不含0.1%SDS的IXSSC中清洗兩次，在含0.1%SDS的0.2XSSC中清洗兩次，每次清洗20分鐘。通常將膜曝光M小時，除非另有說明。通過在各樣品中相等的rRNA種類來監測加載的總RNA的水平，除非指明。逆轉錄-PCR。對於圖2中GAL10-7中的10個位置中的每一個，有用於有義轉錄物(相對於GALlO表達的方向)的一種RT引物、用於反義轉錄物的一種RT引物、用於第一輪PCR的兩種備選引物和用於擴增的兩種備選嵌套引物。引物的詳情見附表1。第一條鏈的合成是使用ABgeneVersocDNA試劑盒及對有義或反義轉錄物特異性的引物進行的。標準反應設置如下2ulRNA；引物(25μΜ)1μ1;Η209μ1，加熱至70°C達5分鐘以消除任何二級結構，並立即放置在冰上。然後，添加緩衝液4μl、dNTP2μURTIyl和RT增強劑Ιμ，並將反應於52°C溫育50分鐘，然後於95°C溫育2分鐘。在RT對照中，反應中不添加逆轉錄酶。PCR擴增是在如下反應中使用TakaRaDNA聚合酶進行的嵌套反應2X緩衝液Ι，25μ1；dNTPQ.5mM)，8y1;cDNA，2y1；引物(25μΜ)，正向1μ1，反向1μ1;TakaRaLATaq聚合酶，0·5μ1；H2O12.5μ1，94°C_5min，24個循環的94°C_lmin、55°C-45sec、72°C-30sec,及72°C-5min。對於第二輪，在上述反應中使用2μ1第一輪產物及嵌套引物94°C-5min,18個循環的94°C-45sec,54°C-30sec、72°C_20sec，及最終的溫育72°C_5min。染色體構象捕捉結合免疫沉澱(3CIP)從在適宜培養基中培養至光密度A600=0.2的IOOml釀酒酵母培養物提取細胞核。添加甲醛至(2.44ml,41%)並振蕩10分鐘。通過添加甘氨酸至0.125M(5ml，2.5M)來淬滅甲醛。將細胞離心沉澱在Mg/K緩衝液(0.IMK2HP04/KH2P04(3565比)，5mMMgCl2,pH6.5)中清洗兩次，並在球形體緩衝液(含1.2M山梨醇、500U酵母裂解酶和25mMDTT的Mg/K緩衝液)中於室溫重懸浮15分鐘。將球形體在MES緩衝液(0.IMMES、1.2M山19梨醇、ImMEDTA、0.5mMMgCl2，使用NaOH調節至pH6.4)中於4°C清洗一次，並在IOmlMES裂解緩衝液(0.IMMESUmMEDTA、0.5mMMgCl2pH6.4)中重懸浮。使用手持式勻漿器打擊10次以裂解球形體。將溶胞物鋪層到蔗糖梯度(MES裂解緩衝液中的5ml1.8M蔗糖、IOml1.IM蔗糖，裝在Corex管中)上，並在BeckmanJA-17轉子中以10，000RPM離心10分鐘來進行分離。細胞核離心沉澱位於玻璃壁上的界面處。使用水清洗取出管底處的離心沉澱並丟棄。將細胞核離心沉澱用CSK緩衝液(IOOmMNaCl、300mM蔗糖、IOmMPIPES,3mMMgCl2,ImMEGTA.O.5%TritonX-100、IOM亮肽素、11000AEBSF)於4°C從玻璃上洗下，再次清洗並在ImlCSK緩衝液中重懸浮，並在冰上放置20分鐘。離心沉澱細胞核，留下約100μ1上清液其餘全部棄去。添加40μ15ΜNaCl，並在冰上溫育10分鐘。用1.^iilH2O稀釋粘稠的混合物。添加抗體，並將混合物於4°C旋轉過夜。通過下面的步驟準備約40μ1蛋白G-Sepharose漿(約20-30μ1珠子)在H2O中清洗兩次，再用Iml限制性清洗緩衝液(50mMTris-HCl(pH=8.1)UOOmMNaClUOmMMgCl2)清洗一次，再用2000rpm離心3分鐘收集珠子。將染色質混合物在旋轉條件下溫育60分鐘，然後通過以IOOOrpm離心3分鐘來收集珠子，如下進行3次清洗加Iml限制性清洗緩衝液於4V旋轉5分鐘，再以2000rpm離心3分鐘。添加10μ1IOX緩衝液3、50U限制酶和水至100μ1，並將染色質於37°C(DpnII)或250C(CviQI)溫育過夜，然後65°C10分鐘以滅活限制酶。對熱不敏感的酶(諸如CviQI)通過將珠子用限制性清洗緩衝液清洗兩次來除去。將混合物稀釋並用410μ1Η20、60μ1IOX連接緩衝液、30μ1(12000U)T4連接酶，於16°C溫育4小時來進行連接。將混合物於65°C溫育過夜以解交聯。添加1μ1lmg/mlRNA酶A並於37°C溫育30分鐘，接著添加60μ120mg/ml蛋白酶K並於42°C溫育1小時。使用660μ1苯酚氯仿異戊醇來提取DNA，再用30μ15ΜNaCl,0.5μ110mg/ml糖原和Iml冷的乙醇來沉澱並於_80°C溫育1小時。收集離心沉澱，清洗，再在20μ1H2O中重懸浮。按照他人推薦的方法(Dekker，2006，NatMethods3，17-21)，在方案中包括下述對照排除免疫沉澱步驟，直接進行3C程序。對於3C以及結合IP的3C二者，在連接步驟之前包括RNA酶或蛋白酶K處理以顯示對RNA或蛋白質的依賴。對沒有甲醛處理步驟而分離的細胞核進行了該方案。使用標準ChIP方案(見上文)在限制和連接步驟後進行免疫沉澱。反應產物通過嵌套PCR來檢測，使用TakaRa聚合酶、50μ1反應。引物原液為25μΜ。第一個反應含有25μ1GC緩衝液Ι、8μ1dNTP溶液(每種1.25mM)、1μ1模板、1μ1每種引物、13.5μ1H20,0.5μ1TakaRaDNA聚合酶(5U/μ1)，25個循環(94°C5min-[94°C45s,60°C30s,72°C20s]-72°C5min)。第二個反應含有25μ1GC緩衝液Ι、8μ1dNTP溶液(每種1.25mM)、2l·!1來自第一個反應的模板、1μ1每種引物、12.5μ1H20,0.5μ1TakaRaDNA聚合酶(5U/μ1)，18個循環(94°C5min_[94°C45s，61°C30s,72°C20s]-72°C5min)。因為每種遠距離相互作用有四種可能的產物，在初始分析中包括除正向正向外的所有引物組合。只顯示了一種引物組合的數據。引物的取向(正向F;反向R)是相對於ORF的方向規定的。每一套用內部⑴和外部(ο)引物進行嵌套(見表2)。省略模板或DNA聚合酶作為PCR反應的對照。用作引物效率的對照的模板是通過連接經DpnII限制酶切的基因組DNA而製備的。滴定對照模板和實驗模板以確定擴增的線性範圍；為每一份樣品只顯示了此範圍上的一種等同產物。M1用於RT-PCR分析的引物0155]RT有義基因特異性引物0156]5，3，0157]1.S1KAP104CTGTAAAAGAGTTGC0158]2.INF1GAL7CTGCAACATCCAAT0159]3.INF2GAL7AAGGACCACTCTTAC0160]4.S1GAL7CATGTGAAACCAAC0161]5.INFIGAL10CTACTTTACCAAACG0162]6.S1GAL10CAAGGTTACACAATC0163]7.S2GAL10CTTCACCAGCAGTC0164]8.S3GAL10GCAAGATAGCAAAC0165]9.S4GAL10TTAGCTCTACCACAG0166]10.INF1GAL1TGGTTATGAAGAGG0167]RT反義基因特異件引物0168]1.INR1GAL7CAAGGCTCATTGTC0169]2.INR2GAL7ACGGAGTGACAATA0170]3.AS2GAL7CTTGGTTGGTTTTG0171]4.AS1GAL7TGGTGCTTAGAATC0172]5.INR1GAL10CTACAGATTTTCCTG0173]6.AS1GAL10AGGTGATCTATTGGT0174]7.AS2GAL10GCAAGATTTGTGAC0175]8.AS3GAL10GTTTTGGTTACAGG0176]9.INR1GAL1GTGAAGACGAGGAC0177]10.SlGALlCAATCACTTCTTCTG0178]第一輪PCR引物0179]IFwd.FKAP1041ATAGTCTTCGGCGGGCTTC0180]IRev.RKAP1041CGATGGAAATCCTGCACCTA0181]2Fwd.FGAL71CGTAATAAACTTCAACAGAGCCTAAA0182]2Rev.RGAL71TTCTAGTTATGTAAGAGTGGTCCTTTC0183]3Fwd.FGAL73TTGTCACTCCGTTCAAGTCG0184]3Rev.RGAL73GCCTCAAAGAGATTTAACTTCG0185]4Fwd.FGAL75ACCAGTCGCATTCAAAGGAG0186]4Rev.RGAL75TGAAGTTTCGCAAGAATTGAAA0187]5Fwd.FGALlO1GCGCTTCGCAATAGTTGT0188]5Rev.RGALlO1TTGCCAGCTTACTATCCTTCTTG0189]6Fwd.FGAL103CATCAATGTATCTACCAGGCTCA0190]6Rev.RGAL103AAATTGACTGCTGGTGAAGC0191]7Fwd.FG10AS2ATTTTGAATGATGGGTCCC0192]7Rev.RG10AS2AGATTTCAAGCCACGTTTGC0193]8Fwd.FGAL105TGGCGTATTTCGTATGACCA0194]8Rev.RGAL105TGTTGCTGATAACCTGTCGAA0195]9Fwd.FGAL107TGGATGGACGCAAAGAAGTT0196]9Rev.RGAL107GCTCGGCGGCTTCTAATC0197]IOFwd.FGALllCGAATCAAATTAACAACCATAGGA0198]IORev.RGALllAATACAAACTGAAAATGTTGAAAGT0199]嵌套PCR引物0200]IFwd.FKAP1042AAAACCAAAGACTGCGGAAT0201]IRev.RKAP1042TCCGGGTTATAGAGTTTTGCTT0202]2Fwd.FGAL72TGTCAATAAAGTGGAAATGTGTCA0203]2Rev.RGAL72GAATTTTAGGAATACAATGCAGCTT0204]3Fwd.FGAL74GAAACCAGGCAGTTAATAGAAAAA0205]3Rev.RGAL74GCTGCTGAAAAACTAAGAAA0206]4Fwd.FGAL76TTAAAATCGAGGCGAGGTC0207]4Rev.RGAL76TGATTTGTTTGCCGATTACG0208]5Fwd.FGAL102GCGGCTCGTGCTATATTCTT0209]5Rev.RGAL102TTGCTGTATAACGAATTTTATGC0210]6Fwd.FGAL104CCAGCAGACAAGAAATCACC0211]6Rev.RGAL104TTGAGGGTACGGAGATTATGG0212]7Fwd.FGIOASlATTAACGCCGTTATTAACG0213]7Rev.RGIOASlTTCTTGGCTATGAAAATGAGG0214]8Fwd.FGAL106GGGAATCTCGTAGCATCACC0215]8Rev.RGAL106TGTGTGACCGAAAAGGTCTG0216]9Fwd.FGAL108TGTTGTGGAAATGTAAAGAGC0217]9Rev.RGAL108GCAATGAGCAGTTAAGCGTATT0218]IOFwd.FGAL12TTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAA0219]IORev.RGAL12AAGTGGTTATGCAGCTTTTCC0220]表20221]用於3C分析的引物0222]引物名稱序列(5』-3』)0223]1GAL7terminatorR(o)GCTCATTGTCGGTGTCGTTA0224]1GAL7terminatorR(i)CGATGGAAATCCTGCACCTA0225]2GAL7terminatorF(ο)TTGTCACTCCGTTCAAGTCG0226]2GAL7terminatorF(i)TCCGAAGTTAAATCTCTTTGAGG0227]3GAL10-7intergenicR(ο)TTGCTTTGCCTCTCCTTTTG0228]3GAL10-7intergenicR(i)CGTTTGGTAAAGTAGAGGGGGTA0229]4GAL10-7intergenicF(ο)CGCACCATAATCTCCGTACC0230]4GAL10-7intergenicF(i)CGCTTCACCAGCAGTCAAT0231]5GALlOpromoterR(o)GGGCCTACTAATCCGTATGGT0232]5GALlOpromoterR(i)TCCCAGAAGAATGTCCCTTAG6GALlOpromoterF(ο)GAGGAAAAATTGGCAGTAACCT6GALlOpromoterF(i)GCCCCACAAACCTTCAAAT7FMP27promoterF(ο)ATCAAAGCCACGCCAAAC7FMP27promoterF(i)CCTACACGCAAAGGAACTAGAGA8FMP27terminatorF(o)AGCAAACCGAACATCAAACCDpnII:引物對4+6,5+3和3+6會檢測GAL10上的遠距離相互作用。引物對2+4、3+1和1+4會檢測GAL7上的相互作用。引物對6+2和5+1和1+6會檢測GAL10-7上的相互作用。對於圖5中所示分析，只顯示了每種相互作用的最後一種引物組合。表3顯示Gal基因座上可發生遠距離相互作用的潛在染色體位置。為每一個染色體區域設計了一套正向和反向引物。通過為每一個染色體區域設計的引物之間的3C分析來監測gal基因座處的遠距離相互作用。例如，為了監測(ial7與(ial10區域之間的相互作用，使用第3行(274081-87)和第5行(278016-19)的引物。如果要監測其它區域的相互作用，則使用其它引物組合。表權利要求1.一種監測外遺傳變化的方法，包括監測至少一個染色體基因座處條件性遠距離染色體相互作用的變化，其中所述基因座處的遠距離相互作用譜與特定生理學狀況相關，所述方法包括下述步驟(i)體外交聯所述至少一個染色體基因座處存在的所述遠距離染色體相互作用；從所述染色體基因座分離交聯的DNA；(iii)用在該至少一個染色體基因座內至少切割一次的酶對所述交聯的DNA進行限制性消化；(iv)連接經過切割的所述交聯的DNA的末端以形成DNA環；(ν)鑑定所述DNA環的存在；其中DNA環的存在指示特定的遠距離染色體相互作用的存在。2.依照權利要求1的方法，其中DNA環的存在是使用PCR技術來鑑定的。3.依照權利要求1或權利要求2的方法，其中DNA環的存在指示改變的轉錄狀態，該改變的轉錄狀態指示特定的生理學狀況。4.依照權利要求1-4任一項的方法，其中所述生理學狀況選自癌症；心血管病症；炎性疾患，包括自身免疫性病症和對感染性疾病的炎症應答；以及受外遺傳機制調變的可遺傳性遺傳病。5.一種監測外遺傳變化的方法，包括監測至少一個染色體基因座處的條件性遠距離染色體相互作用的變化，其中所述基因座處的遠距離相互作用譜與特定的生理學狀況相關，所述方法包括鑑定從所述至少一個染色體基因座表達的反義RNA譜中的變化的步驟。6.依照權利要求5的方法，其中該反義RNA譜中的變化是反義RNA轉錄物大小、起始位置、和/或數目的變化。7.—種診斷受試者中與至少一處外遺傳變化相關的病症的方法，所述方法包括鑑定先前從該受試者分離的樣品中與所述病症相關的至少一個染色體基因座處的一種或多種遠距離染色體相互作用的變化；其中所述方法包括權利要求1-6任一項的方法。8.依照權利要求7的方法，其中所述外遺傳變化導致來自該染色體基因座的改變的轉錄。9.依照權利要求7的方法，其中該改變的轉錄的變化是上調、遏制、或生成另外的轉錄物。10.依照權利要求7-9任一項的方法，其中該外遺傳變化引起至少一個基因的表達的變化。11.一種在患有與改變的基因表達相關的病症的患者中調節至少一種基因的轉錄的方法，所述方法包括以可有效改變所述至少一種基因的轉錄的量對所述患者施用反義RNA。12.依照權利要求11的方法，其中所述病症是所述基因的過表達導致的。13.依照權利要求11的方法，其中所述病症是所述基因的遏制導致的。14.依照權利要求11的方法，其中所述病症是改變的基因產物的生成導致的。15.依照權利要求11-14任一項的方法，其中所述反義RNA靶向至少一個CTCF結合位點ο16.依照權利要求11-15任一項的方法，其中施用所述反義RNA導致HDAC酶的調變。17.用於治療與改變的基因表達相關的病症的反義RNA，其中所述反義RNA調節所述基因的轉錄。18.依照權利要求17的反義RNA，其中所述RNA遏制所述基因的轉錄。19.依照權利要求17的反義RNA，其中所述RNA誘導所述基因的轉錄。20.一種鑑定染色體基因座的轉錄狀態的方法，包括下述步驟鑑定從所述染色體基因座表達的反義RNA轉錄物譜；並比較所述譜與處於已知狀態下的所述染色體基因座的反義RNA轉錄物譜。21.權利要求20的方法，其中所述方法是在體外實施的。全文摘要本發明涉及一種監測外遺傳變化的方法，包括監測至少一個染色體基因座處條件性遠距離染色體相互作用的變化，其中所述基因座處的遠距離相互作用譜與特定生理學狀況相關，該方法包括下述步驟(i)體外交聯該至少一個染色體基因座處存在的所述遠距離染色體相互作用；(ii)從所述染色體基因座分離交聯的DNA；(iii)用在該至少一個染色體基因座內至少切割一次的酶對所述交聯的DNA進行限制性消化；(iv)連接經過切割的所述交聯的DNA的末端以形成DNA環；(v)鑑定所述DNA環的存在；其中DNA環的存在指示特定遠距離染色體相互作用的存在。文檔編號C12Q1/68GK102046813SQ200980120479公開日2011年5月4日申請日期2009年6月2日優先權日2008年6月2日發明者亞歷山大·阿孔利切夫,伊莉莎白·J·米勒,阿魯爾·S·拉馬達斯申請人:牛津生物動力有限公司