一種檢測細胞凋亡信號通路的試劑及其pcr檢測方法

2023-08-10 00:38:31

專利名稱：一種檢測細胞凋亡信號通路的試劑及其pcr檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，尤其涉及一種檢測細胞凋亡信號通路的試劑及其 PCR檢測方法。
背景技術：
細胞凋亡本質上是一種由死亡信號誘發的受調節的細胞程序性死亡過程，是細胞生理性死亡的普遍形式。是機體在生理或病理條件下，啟動自身內部機制，經過多途徑的信號傳遞，結束其自身生命的過程。細胞凋亡具有特徵性的形態學及生物化學改變。凋亡早期主要表現為胞質空泡，染色質濃縮並沿核膜排列；凋亡細胞與細胞外基質或周圍細胞分離。 隨著凋亡過程的進展，胞質空泡與胞膜融合，導致膜發泡，隨後空泡與細胞分離，引起水分丟失，細胞皺縮，同時染色質進行性固縮，並碎裂成塊狀結構，最後細胞也碎裂成凋亡小體。 目前誘導腫瘤細胞的凋亡已經成為治療腫瘤的一種關鍵手段。但是細胞凋亡具有複雜的信號途徑，如何能從龐雜的細胞凋亡信號途徑中，找出明確的凋亡信號途徑從而開發腫瘤相關藥物，以便於進一步誘導腫瘤細胞的凋亡，現在已經成為腫瘤藥物研發領域的急需解決的重要問題。

發明內容
本發明針對現有技術中誘導腫瘤細胞凋亡遇到的困難，提供了一種檢測細胞凋亡信號通路的試劑及其PCR檢測方法，本發明將涉及細胞凋亡的信號分子集中在一個平板上，通過做一次實時螢光定量PCR反應，反應細胞的生存狀態，探討引起細胞凋亡的可能途徑，為研究關鍵蛋白的凋亡信號通路提供最直接的證據。為實現上述發明目的，本發明採用下述技術方案予以實現 一種檢測細胞凋亡信號通路的試劑，它包括以下引物
(1)檢測BAX基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-GGGTGGTTGGGTGAGACTC-3』 ；
5』-AGACACGTAAGGAAAACGCATTA-3』 ；
(2)檢測ANGPTL4基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-GTCCACCGACCTCCCGTTA-3』 ；
5』-CCTCATGGTCTAGGTGCTTGT-3』 ；
(3)檢測ILlA基因的的PCR反應引物，其引物序列如下 5，-ATCATGTAAGCTATGGCCCACT-3'；
5，-CTTCCCGTTGGTTGCTACTAC-3，；
(4)檢測MYBL2基因的的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-ATCGCCAAGATGTTGCCAGG-3』 ；
5』-GGACTCGCTCAAGAAGCCT-3』 ；
(5)檢測PEA15基因的的PCR反應引物，其引物序列如下
45』-CCTGACCTACTCACTATGGTGG-3』 ； 5』-GCTGCCGGATAATGTCTTTGTA-3』 ；
(6)檢測PRKAAl基因的的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-GCGACAAGCCCACCTGATT-3』 ；
5' -TGTTTCAGCAACCAAGAATGGTA-3'；
(7)檢測BIRC5基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5' -AGGACCACCGCATCTCTACAT-3'；
5'-AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3'；
(8)檢測CASPl基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5'-TCCAATAATGGACAAGTCAAGCC-3'；
5' -GCTGTACCCCAGATTTTGTAGCA-3'；
(9)檢測DAPK3基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5'-TCACTACCTGCACTCTAAGCG-3'；
5，-TTCCCCGCCTCGATCTTGT-3，；
(10)檢測NUDT2基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5' -GCCTTGAGAGCATGTGGCTT-3'；
5'-ATGAATGCCATCTGATGCCTG-3'；
(11)檢測內參GAPDH控制基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5'-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3'；
5' -GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。本發明還提供了用所述檢測試劑檢測細胞凋亡信號通路的PCR檢測方法，所述 PCR檢測方法為實時螢光定量PCR方法。對上述技術方案的進一步改進所述實時螢光定量PCR的反應體系為Taq聚合酶反應混合液20 μ 1，上遊引物0. 1-0. 5 μ mol，下遊引物0. 1-0. 5 μ mol，cDNA模板50_200ng， 滅菌蒸餾水補足到40 μ 1。對上述技術方案的進一步改進所述Taq聚合酶為2 X STOR Premix Ex Taq聚合酶。對上述技術方案的進一步改進所述實時螢光定量PCR的反應程序為95°C預變性，5分鐘；98°C變性，10秒，550C，20秒，72°C、15秒，進行40個循環。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是本發明提供了檢測細胞凋亡信號通路的試劑，藉助於所述檢測試劑可以通過實時螢光定量PCR在轉錄水平快速檢測出與細胞凋亡相關的基因，在此基礎上分析研究腫瘤相關藥物的作用機理過程，從而快速準確的找到腫瘤相關藥物的凋亡信號通路，為抗癌藥物篩選、新靶向藥物的機制探討等提供了有力的工具。同時本發明還提供了檢測的PCR方法，所述實驗體系可以在任何一臺實時螢光定量PCR儀器上進行，實驗操作簡便，費用低廉，結果重複性好，有利於減少下遊不必要的檢測，是研究腫瘤相關藥物作用機理的一種重要手段。結合附圖閱讀本發明的具體實施方式
後，本發明的其他特點和優點將變得更加清林疋。


圖1表明了本發明利用Ad5. TRAIL腺病毒研究目的基因TRAIL引起肺癌細胞系 A549凋亡的相關基因的表達水平的變化。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例1
本發明通過用TRAIL基因誘導非小細胞肺癌的凋亡來闡述檢測細胞凋亡的試劑， TRAIL中文名稱為腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體，它是一種細胞凋亡誘導配體。本發明中所用的限制性內切酶購於寶生物工程(大連)有限公司和NEB公司，腺病毒穿梭載體pAd5-Track-CMV、骨架載體pAdEasy-Ι購自於美國Agilent公司。T4 DNA連接酶購自美國promega公司。HEK293細胞、A549細胞和BJ5183菌株均購買於中科院上海細胞庫(http://WWW. cellbank. org. cn/mulu. asp)。質粒提取試劑盒購自上海華舜公司。瓊脂糖膠回收試劑盒購自於北京博大泰克公司。利用本發明所述試劑檢測細胞凋亡信號通路包括以下具體步驟 一、構建含目的基因TRAIL的腺病毒穿梭載體
1、酶切
將腺病毒穿梭載體pAd5-Track-CMV和質粒載體pGEMT/TRAIL按照下列體系進行雙酶
切
成分pAc^-I^ack-CMVpGEMT/TRAIL
IOXbuffer K7. 5 μ 7. 5 μ
DNA2 Pg5 Pg
Sail2 μ 2 μ
HindIII2 μ 2 μ
去離子水補足至50 μ 50 μ 輕輕混勻後於37 °C溫育2 h。
2、回收
將酶切後的樣品全量上樣於1.0%瓊脂糖凝膠電泳，按照北京博大泰克公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收，具體步驟如下 a取Eppendorf管，稱重，標記；
b割取儘量小的含目的DNA的瓊脂糖塊，放入管中，再次稱重，求得瓊脂糖質量； c每100 mg瓊脂糖加入300 μ 溶膠液；
d 50 °C水浴7 min，每2 min顛倒混勻一次，使瓊脂糖完全溶化； e將溶化後混合液移入吸附柱，12，000 g離心30 s，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一收集管中；
f在吸附柱中加入650 μ 洗滌液，靜置2 min後，12，000 g離心30 s，倒掉收集管中的液體；
g再將吸附柱放入同一收集管中，重複上一步驟；h將吸附柱重新放入收集管中，離心2 min；
i將吸附柱放入一乾淨的Eppendorf管中，在吸附膜中央加入30 PL洗脫液，室溫靜置 2 min 後，12，000 g 離心 1 min ；
j 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收的片段，將回收得到的DNA於-20 °C保存。
3、連接
應用T4 DNA連接酶進行連接反應，體系如下
2 X Rapid連接緩衝液5 μ
pAd5-Track-CMV vector(50 ng) 1 μ
Τ4 DNA連接酶1 μ
TRAIL 基因(300 ng)2 μ
總體積至10 μ
置於4°C連接16 h以上。
4、轉化
pAd5-Track-CMV與TRAIL基因的連接產物轉化DH5 α感受態步驟如下
(1)取100μ 的DH5 α感受態細胞置於冰浴上融化；
(2)將10PL連接產物加入100 PL的DH5a感受態細胞中，輕輕旋轉混勻內容物，在冰浴上放置40 min ；
(3)置於42°C水浴中90 s，勿搖動；
(4)迅速將離心管轉移到冰浴中，放置2min;
(5)加入400μ 的液體LB培養基，置於37 °C搖床，100 rpm培養45 min ；
(6)將菌液吸到含有30mg · L-I的卡那的LB固體培養基平皿上，用無菌彎頭玻璃棒輕輕地將菌液均勻塗開；
(7)封口膜將平皿封口，倒置，37°C，烘箱過夜培養16 h。5、轉化重組載體後的DH5 α單菌落培養和質粒的提取
從轉化平皿上隨機挑取白色單菌落，接種到含有卡那抗生素(30 mg/L)的10 mL LB液體培養基的三角錐形瓶中，將每管進行編號，置於37 °C搖床，180 rpm培養10 h ；對呈混濁的菌液用質粒提取(小量)試劑盒(上海華舜)抽提質粒，剩餘菌液取800 μ 加15%甘油200 PL，保存於-70 °C冰箱。將提取後的質粒進行酶切和測序驗證，證明目的基因TRAIL已轉入質粒中，將測序正確的質粒命名為pAd5-Track-CMV-TRAIL。二、pAd5. TRAIL 載體的構建
1、pAd5-Track-CMV-TRAIL 載體用 PmeI 線性化 pAd5-Track-CMV-TRAIL載體按照下列體系進行單酶切 IOXbuffer 45 μ
DNA2 Pg
PmeI2 μ
去離子水補足至50 μ 輕輕混勻後於37 °C溫育2 h，每管全量上樣於1.0%瓊脂糖凝膠電泳，按照上述回收步驟進行回收。2、電擊轉入
a將PmeI線性化的pAd5-Track-CMV_TRAIL用15 μ L的去離子水溶解並混合均勻； b啟動電穿孔儀，並設原核細胞的工作狀態，設置程序為U=1650 V、T=4 ms，並準備1 mL 瓊脂培養基於離心管中；
c將腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι轉入BJ5183菌株中，再將含有pAdEasy-Ι的BJ5183製成感受態細胞，取BJ5183感受態細胞50 μ L，在冰中約融化4_5 min ；
d吸取1 μ L的RneI線性化的pAd5-Track-CMV_TRAIL，加入已融化的BJ5183中，並混勻加入電穿孔杯中，將電穿孔杯外周擦拭乾淨後，放入電穿孔儀中，按START鍵，開始細胞的電穿孔反應；
e吸取1 mL的LB培養基加入電穿孔杯中衝洗步驟d的電穿孔反應體系，將混合液再吸回離心管中；
f將此菌液於37 V，225 rpm條件下搖菌1_1. 5 h ；
g分別吸取100 μ L、200 μ L的上述菌液塗LB平板(此LB平板含卡那黴素30 mg/L), 37 °C培養過夜；
h第二天，觀察菌斑生長狀況，挑取單克隆菌落。經卡那黴素篩選出陽性菌落，提取陽性質粒，該質粒經EcoRI酶切鑑定，以及送樣測序正確後命名為pAd5. TRAIL, pAd5. TRAIL即為線性化pAd5-Track-CMV_TRAIL與骨架載體pAdEasy-Ι經同源重組形成的腺病毒載體。三、製備腺病毒Ad5. TRAIL 和 Ad5. eGFP 1、用 PacI 線性化 pAd5. TRAIL
將I^cI按照下列體系進行線性化 IOXbuffer 45 μ
DNA10 Pg
PacI2 μ
去離子水補足至50 μ
按照上述方法進行DNA酶切產物的電泳並回收。
2、用線性化的pAd5. TRAIL轉染HEK293細胞
回收的線性化pAd5. TRAIL按照invitrogen公司的脂質體2000步驟轉染70%貼壁的 HEK293細胞(購買自中科院上海細胞庫)，轉染後更換為含10% FBS的DMEM培養基，隔2_3 天換一次培養液，繼續培養10-14天，第3飛天在螢光顯微鏡下觀察螢光。待細胞有噬斑病變(Cytopathic effect, CPE)時收集細胞懸液，2000 r/min離心5 min，細胞沉澱用無菌 PBS洗滌2 3次後，將細胞懸液在_80°C -37°C間反覆凍融3次，釋放出病毒，2000r/min離心5min，取上清，經多輪感染後獲得高滴度重組腺病毒Ad5. TRAIL，該病毒同時含有eGFP基因和TRAIL基因(因其中pAd5-Track-CMV載體本身含有eGFP的表達，所以同源重組後形成的腺病毒載體加入目的基因後，也會同時表達eGFP和目的基因)，通過0擬60 nm測得病毒滴度(pt/mL)為5. 5X IO120對照病毒即只含有eGFP基因的病毒命名為Ad5. eGFP, eGFP為CN 6/12 頁
增強型綠色螢光蛋白的縮寫，於_80°C凍存該病毒。四、Ad5. TRAIL 和 Ad5. eGFP 感染 A549 細胞
UA549細胞的培養將A549細胞置於10%胎牛血清的DMEM培養液中，於37°C CO2孵箱中培養；待細胞密度長至70-80%時，傳代培養。2、接種細胞取對數生長期的人非小細胞肺癌細胞(AM9)，0. 1%胰酶消化後接種於25cm2的培養瓶中，37°C，5% C02孵箱孵育M小時。細胞數約為IX 103。3、病毒處理將Ad5. TRAIL和Ad5. eGFP分別感染A549細胞，48小時後，收集細胞進行下遊檢測。五、總RNA提取和逆轉錄反應 1、提取總RNA
a取CO2孵箱中處於對數生長期60 mm平皿的細胞一盤，吸掉培養液後，用無菌IXPBS 清洗2次後，在細胞表面加1 mL Trizol，用槍頭反覆抽吸均勻，轉入無菌管中。b室溫培育5 min，以溶解核蛋白。加0. 2 mL酚/氯仿(1 1 )，劇烈振蕩15 sec, 室溫孵育2-3 min。c 4 "C, 12000 g離心15 min，細胞會產生分層。d將上層液體轉至無RNase的離心管中，加入0. 5 mL異丙醇，顛倒混勻3次，室溫培育10 min。e 4°C, 12000 g 離心 10 min, RNA 形成底部沉澱。f棄上清，用無RNase的75%乙醇1 mL洗滌沉澱。4 °C，7000 g離心5 min。g空氣中乾燥RNA約5-10 min。不宜太幹。h 用 30-50 μ L DEPC 水溶解 RNA。2、cDNA 的合成
a在預冷的試管中加入下列反應混合物 總 RNA1-5 μ g
oligo(dT) (0. 5 μ g/μ 1)IyL
用RNase-free水定容至 12 μ L。b 混勻，離心 3-5 sec。c 70 °C作用 5 min 後冰浴 30 sec，離心 3-5 sec。
d將試管冰浴，再加入如下組分
5X反應緩衝液4 yL
Rnase Inhibiter (20 U/μ L) IyL dNTP mix (10 mM)2 μ L
e輕輕混勻，離心3-5 sec。f 37°C7jC浴5 min,力口 1 μ L 的M—MuLV Reverse Transcriptase (20 U/μ L)，混勾。g 37°C作用60 min。70 °C孵育10 min結束反應，置冰上進行下遊試驗。六、實時螢光定量PCR反應檢測細胞凋亡信號通路
本發明通過用檢測細胞凋亡信號通路的試劑結合實時螢光定量PCR來檢測，所述檢測試劑包括一組檢測抗細胞凋亡基因的核苷酸序列、一組檢測半胱氨酸和天冬氨酸酶活性基因的核苷酸序列、一組檢測誘導細胞凋亡基因的核苷酸序列和一個檢測內參GAPDH控制基因的核苷酸序列。所述抗細胞凋亡基因的核苷酸序列可以檢測抗細胞凋亡的基因的表達； 半胱氨酸酶和天冬氨酸酶是細胞凋亡最後的表達產物，所述半胱氨酸和天冬氨酸酶活性基因的核苷酸序列可以檢測細胞凋亡下遊基因的表達；所述誘導細胞凋亡基因的核苷酸序列可以檢測激活細胞凋亡相關基因的表達。本實驗共分兩組，即Ad5. TRAIL和Ad5. eGFP組。每組分別設置36個孔，其中12 孔為獨立樣本，每個樣本各有3個重複。每組11個孔中分別加入BAX基因、ANGPTL4基因、 ILlA 基因、MYBL2 基因、PEA15 基因、PRKAAl 基因、BIRC5 基因、CASPl 基因、DAPK3 基因、NUDT2 基因和內參GAPDH控制基因的引物，另一孔加入水作為對照。1、一組用於實時螢光定量PCR檢測抗細胞凋亡基因的核苷酸序列
(1) BAX基因，SPBCL2家族相關X蛋白(BCL2-associated X protein)基因，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下 BAX 正向引物 5，-GGGTGGTTGGGTGAGACTC-3，(SEQ ID No: 1) BAX 反向引物 5，-AGACACGTAAGGAAAACGCATTA-3，(SEQ ID No:2) 擴增出BAX基因，Genbank登錄號為NM_004324，片段長度為191bp。(2) ANGPTL4基因，即血管生成素相似蛋白4 (angiopoietin-like4)基因， 使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下 ANGPTL4 正向引物 5，-GTCCACCGACCTCCCGTTA (SEQ ID No: 3)
ANGPTL4 反向引物 5，-CCTCATGGTCTAGGTGCTTGT (SEQ ID No:4)
擴增出ANGPTL4基因，Genbank登錄號為NM_001039667，擴增片段長度為2Ubp。(3) ILlA基因，即白介素1A，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下
ATCATGTAAGCTATGGCCCACT (SEQ ID No:5) CTTCCCGTTGGTTGCTACTAC (SEQ ID No:6)
擴增出ILlA基因，Genbank登錄號為NM_000575，擴增片段長度為131bp。(4) MYBL2基因，即ν-myb禽成髓細胞瘤病毒致癌基因同源物樣2，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下
ATCGCCAAGATGTTGCCAGG (SEQ ID No:7) GGACTCGCTCAAGAAGCCT (SEQ ID No:8)
擴增出MYBL2基因，Genbank登錄號為NM_002466，擴增片段長度為102bp。(5) PEA15基因，即星形膠質細胞豐富磷蛋白15，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下
CCTGACCTACTCACTATGGTGG (SEQ ID No:9) GCTGCCGGATAATGTCTTTGTA (SEQ ID No:10)
擴增出PEA15基因，Genbank登錄號為NM_003768，擴增片段長度為127bp。(6) PRKAAl基因，即AMP激活的蛋白激酶阿爾法1催化亞基，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下
GCGACAAGCCCACCTGATT (SEQ ID No:11) TGTTTCAGCAACCAAGAATGGTA (SEQ ID No:12)
擴增出PRKAAl基因，Genbank登錄號為NM_006251，擴增片段長度為87bp。
2、一組實時螢光定量PCR檢測半胱氨酸和天冬氨酸酶活性基因的核苷酸序列
(1) BIRC5基因，即杆狀病毒IAP重複區域5，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下
AGGACCACCGCATCTCTACAT (SEQ ID No:13) AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG (SEQ ID No:14)
擴增出BIRC5基因，Genbank登錄號為NM_001012270，擴增片段長度為118bp。(2) CASPl基因，即半胱氨酸天冬氨酸酶1，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下
TCCAATAATGGACAAGTCAAGCC (SEQ ID No:15) GCTGTACCCCAGATTTTGTAGCA (SEQ ID No:16)
擴增出CASPl基因，Genbank登錄號為NM_001223，擴增片段長度為139bp。3、一組實時螢光定量PCR反應檢測誘導細胞凋亡基因的核苷酸序列
(1) DAPK3基因，即死亡相關蛋白激酶3，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下
TCACTACCTGCACTCTAAGCG (SEQ ID No:17) TTCCCCGCCTCGATCTTGT (SEQ ID No:18)
擴增出DAPK3基因，Genbank登錄號為NM_001348，擴增片段長度為13^p。(2) NUDT2基因，即核苷二磷酸連接的X成份型基元2，使用人工設計的一對聚合酶鏈式反應引物，進行擴增，其核苷酸序列如下
GCCTTGAGAGCATGTGGCTT (SEQ ID No:19) ATGAATGCCATCTGATGCCTG (SEQ ID No:20)
擴增出NUDT2基因，Genbank登錄號為NM_147173，擴增片段長度為l(^bp。4、一組實時螢光定量PCR反應檢測內參GAPDH控制基因(甘油醛_3_磷酸脫氫酶) 的核苷酸序列
TCATGGGTGTGAACCATGAGAA (SEQ ID No:21) GGCATGGACTGTGGTCATGAG (SEQ ID No:22)
擴增出內參GAPDH控制基因，Genbank登錄號為NM_002046，擴增片段長度為146bp。用上述引物進行實時螢光定量聚合酶鏈式反應，其反應體系如下2XSTOR Premix Ex Taq聚合酶反應混合液20 μ 1，上遊引物0. 2 μ mol，下遊引物0. 2 μ mol，cDNA模板50ng，滅菌蒸餾水補足到40 μ 1。混勻後進行如下反應程序95°C、5分鐘，一個循環；98 °C、10秒，55 °C、20秒， 72 °C、15秒，40個循環。溶解曲線分析程序95 °C、0秒，65 °C、15秒。該聚合酶鏈式反應在實時螢光定量聚合酶鏈式反應儀的運行。將各種基因的表達量做成圖1，其中高於2的為高表達，低於0. 5的為低表達，圖1 中表明了 BAX基因、ANGPTL4基因和MYBL2基因為高表達，ILlA基因、PEA15基因、PRKAAl 基因、BIRC5基因、CASPl基因和NUDT2基因均為中表達，DAPK3基因為低表達。本發明將表達載體pAd5-Track-CMV用Mil和HindIII雙酶切後獲得載體，帶有目的基因TRAIL的pGEMT/TRAIL質粒經MlI與HindIII雙酶切後回收目的片段，連接轉化獲得陽性克隆命名為 PAds-jTrack-CMv-TRAlI^pAds-jTrack-CMv-TRAIL 經RneI 酶切後，電轉
11入BJ5183中，經卡那篩選出陽性質粒，命名為pAd5. TRAIL。將I3acI線性化的pAd5. TRAIL 轉染HEK293細胞，7-10天後胞核增大，細胞變圓，隨著時間的延長，因表達eGFP而出現大量綠色螢光，並出現細胞病變現象(Cytopathic effect, CPE)，說明同源重組成功並已存在感染性腺病毒粒子。繼續對腺病毒進行擴增、純化得到病毒原液Ad5. TRAIL，通過0擬60 nm 測得病毒滴度(pt/mL)分為5. 5X 1012。對照質粒命名為Ad5. eGFP。將Ad5. TRAIL和Ad5. eGFP感染A549細胞後，提取總RNA和逆轉錄反應，利用本發明提供的檢測細胞凋亡信號通路的試劑通過螢光定量PCR可以擴增獲得特異信號通路基因的圖譜，為研究目的基因的凋亡信號通路提供了最直接的證據。以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換；而這些修改或替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和範圍。SEQUENCE LISTING
青島大學醫學院附屬醫院
一種檢測細胞凋亡信號通路的試劑和PCR檢測方法 22
PatentIn version 3. 3
1
19
DNA
人工序列
1
gggtggttgg gtgagactc19
2
23
DNA
人工序列
2
agacacgtaa ggaaaacgca tta23
3
19
DNA
人工序列
3
gtccaccgac ctcccgtta19
4
21
DNA
人工序列 4
cctcatggtc taggtgcttg t21
5
22
DNA
人工序列
5
atcatgtaag ctatggccca ct22
6 21 DNA 人工序列 6
cttcccgttg gttgctacta c21
7
20
DNA
人工序列
7
atcgccaaga tgttgccagg20
8 18 DNA 人工序列 8
gactcgctca agaagcct18
9
21
DNA
人工序列
9
cctgacctact cactatggtg g21
10
21
DNA
人工序列
10
gctgccggata atgtctttgt a21
1119
DNA 人工序列
11
gcgacaagcc cacctgatt19
12
23
DNA
人工序列
12
tgtttcagca accaagaatg gta23
13
20
DNA
人工序列
13
aggaccaccgc atctctacat20
14
20
DNA
人工序列
14
aagtctggctc gttctcagtg20
15
22
DNA
人工序列
15
tccaataatgg acaagtcaag cc22
16
23
DNA
人工序列
16
gctgtacccc agattttgta gca23
17
21
DNA
人工序列
14 17
tcactacctg cactctaagc g21
18
19
DNA
人工序列
18
ttccccgcct cgatcttgt19
19
20
DNA
人工序列
19
gccttgagag catgtggctt20
20
21
DNA
人工序列
20
atgaatgcca tctgatgcct g21
21 22 DNA 人工序列 21
tcatgggtgt gaaccatgag aa22
22
21
DNA
人工序列
22
ggcatggact gtggtcatga g2權利要求
1.一種檢測細胞凋亡信號通路的試劑，其特徵在於它包括以下引物(1)檢測BAX基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-GGGTGGTTGGGTGAGACTC-3』 ；5』-AGACACGTAAGGAAAACGCATTA-3』 ；(2)檢測ANGPTL4基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-GTCCACCGACCTCCCGTTA-3』 ；5』-CCTCATGGTCTAGGTGCTTGT-3』 ；(3)檢測ILlA基因的的PCR反應引物，其引物序列如下 5，-ATCATGTAAGCTATGGCCCACT-3'；5，-CTTCCCGTTGGTTGCTACTAC-3，；(4)檢測MYBL2基因的的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-ATCGCCAAGATGTTGCCAGG-3』 ；5』-GGACTCGCTCAAGAAGCCT-3』 ；(5)檢測PEA15基因的的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-CCTGACCTACTCACTATGGTGG-3』 ；5』-GCTGCCGGATAATGTCTTTGTA-3』 ；(6)檢測PRKAAl基因的的PCR反應引物，其引物序列如下 5』-GCGACAAGCCCACCTGATT-3』 ；5' -TGTTTCAGCAACCAAGAATGGTA-3'；(7)檢測BIRC5基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5' -AGGACCACCGCATCTCTACAT-3'；5'-AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3'；(8)檢測CASPl基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5'-TCCAATAATGGACAAGTCAAGCC-3'；5' -GCTGTACCCCAGATTTTGTAGCA-3'；(9)檢測DAPK3基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5'-TCACTACCTGCACTCTAAGCG-3'；5，-TTCCCCGCCTCGATCTTGT-3，；(10)檢測NUDT2基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5' -GCCTTGAGAGCATGTGGCTT-3'；5'-ATGAATGCCATCTGATGCCTG-3'；(11)檢測內參GAPDH控制基因的PCR反應引物，其引物序列如下 5'-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3'；5' -GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。
2.一種用權利要求書1所述試劑檢測細胞凋亡信號通路的PCR檢測方法，其特徵在於， 所述PCR檢測方法為實時螢光定量PCR方法。
3.根據權利要求書2所述的一種檢測細胞凋亡信號通路的PCR檢測方法，其特徵在於，所述實時螢光定量PCR的反應體系為Taq聚合酶反應混合液20 μ 1，上遊引物 0. 1-0. 5 μ mol，下遊引物0. 1-0. 5ymol, cDNA模板50_200ng，滅菌蒸餾水補足到40 μ 1。
4.根據權利要求書3所述的一種檢測細胞凋亡信號通路的PCR檢測方法，其特徵在於， 所述Taq聚合酶為2XSTOR Premix Ex Taq聚合酶。
5.根據權利要求書3所述的一種檢測細胞凋亡信號通路的PCR檢測方法，其特徵在於， 所述實時螢光定量PCR的反應程序為95°C預變性，5分鐘；98°C變性，10秒，55°C，20秒， 72 °C、15秒，進行40個循環。
全文摘要
本發明提供了一種檢測細胞凋亡信號通路的試劑及其PCR檢測方法，本發明所述檢測試劑包括檢測BAX基因、ANGPTL4基因、IL1A基因、MYBL2基因、PEA15基因、PRKAA1基因、BIRC5基因、CASP1基因、DAPK3基因、NUDT2基因和內參GAPDH控制基因表達的PCR反應引物。本發明將涉及細胞凋亡的信號分子集中在一個平板上，通過做一次實時螢光定量PCR反應，反應細胞的生存狀態，探討引起細胞凋亡的可能途徑，為研究關鍵蛋白的凋亡信號通路提供最直接的證據；本發明從轉錄水平快速準確的找到相關凋亡信號通路，為抗癌藥物篩選、新靶向藥物的機制探討等提供了有力的工具。
文檔編號C12N15/11GK102251050SQ20111022820
公開日2011年11月23日 申請日期2011年8月10日 優先權日2011年8月10日
發明者劉世海, 劉相萍, 姚如永, 楊堃, 隋愛華 申請人:青島大學醫學院附屬醫院