特別適於維持骨細胞活性的人造穩定的磷酸鈣相組合物的製作方法

2023-08-07 05:47:56

專利名稱：特別適於維持骨細胞活性的人造穩定的磷酸鈣相組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠維持其上的骨細胞活性的具生物活性的人造穩定的燒結磷酸鈣相組合物。本發明可用於評價正常和異常骨細胞活性的醫學診斷和醫學治療，包括骨和牙組織更換和修復以及體外的骨移植片組織工程。
背景技術：
骨是由無機或礦物相、有機基質相和水組成的複雜礦化體系。無機礦物相由結晶的磷酸鈣鹽組成，而有機基質相主要由膠原蛋白質和其它非膠原蛋白質組成。骨的鈣化作用取決於形成礦化組織的有機相和無機相之間的緊密聯繫。
骨生長的過程要調整到滿足結構和功能的需要。與骨形成、維持、和吸收有關的細胞是成骨細胞、骨細胞和破骨細胞。成骨細胞合成骨的有機基質和類骨質，該類骨質在磷酸鈣晶體生長和骨膠原結合以後礦化。骨細胞調節骨礦物和細胞外液之間的鈣和磷酸鹽的流動。破骨細胞的功能是吸收骨並且是骨修復過程中必不可少的。骨形成和骨吸收的天然平衡受到幹擾會導致各種骨紊亂。已經證明提高破骨活性將導致骨密度降低的骨疾病，例如常見的骨質疏鬆、纖維性骨炎和Paget氏病。所有這些疾病都是骨吸收增加的結果。
為了了解骨細胞功能調節的機理，重要的是能夠測定骨細胞的正常功能和在各種骨疾病中這種活性的紊亂程度。這樣才可以找到可以使異常骨細胞活性恢復到正常水平以內的藥物。除了識別異常和正常骨細胞活性的病因和測定該活性以外，人們還需要開發出用來治療由於導致骨組織損傷的疾病、外科切除或生理外傷的原因而導致的異常骨細胞活性的組合物和方法。更換和修復骨組織(例如用骨植入物)的治療更是人們所需要的。
幾個研究機構已經研製了直接觀察體外分離破骨細胞活性的方法。已經在天然材料例如抹香鯨牙質(Boyde等人，Brit.Dent.J.156，216，1984)或骨(Chambers等人，J.Cell Sci.66，383，1984)的薄片上培養從骨髓細胞群分離的破骨細胞。後面一個小組已經能顯示出其它的單核吞噬細胞系不具有吸收活性(Chambers Horton，CalcifTissue Int.36，556，1984)。近來使用其它的細胞培養技術來研究破骨細胞系的嘗試依然依賴於使用皮層骨片(Amano等人和Kerby等人，J.Bone Min.Res.7(3))，在這種情況下，吸收活性的定量取決於深度可變的吸收凹痕區域的二維分析或取決於吸收體積的定位。這種技術當測定比較厚的基體時提供的最高精確度為約50％。另外這些分析技術耗時過長並需要高級的專門設備並需要培訓。此外，骨或齒質片的製備和隨後的檢查是一種既不容易也不實用的測定破骨細胞活性的方法。
使用人造磷酸鈣製品作為破骨細胞培養的基體幾乎沒有取得成功。Jones等人(Anat.Embryol 170，247，1984)報導了破骨細胞在體外吸收合成磷灰石，但是沒有提供支持這種觀測結果的實驗證據。Shimizu等人(Bone and Mineral 6，261，1989)已經報導說分離的破骨細胞僅吸收早衰的骨表面，而不合成鈣基羥基磷灰石。這些結果表明有功能的破骨細胞難以在體外培養。
有幾個機構已經嘗試提供適於治療替代骨組織的組合物。美國專利US4871578公開了一種形成可用作植入物的無孔平滑羥基磷灰石塗層的方法。美國專利US4983182公開了一種陶瓷植入物，它們含有氧化鋯的燒結體和α-TCP和氧化鋯的塗層或羥基磷灰石和氧化鋯。美國專利US4988362公開了一種用於將一種生物陶瓷與另一種生物陶瓷熔合在一起的組合物。美國專利US4990163公開了一種用於生產由α-TCP和β-TCP組成的生物陶瓷的塗層。儘管這些不同種類的組合物可用作植入物等的生物適應性塗層，但是，這些組合物中沒有一種表明能以可靠和重現的方式(例如能定量測定骨基質中破骨細胞吸收和成骨細胞分泌的特異活性)培養活性破骨細胞和成骨細胞。此外，已開發出的現有組合物中沒有一種能被控制以便能可靠地生產具有常規的組成和形態，使之與在體內和體外具有相似的生物活性性能的各種膜、較厚的塗層和整體陶瓷件。
申請人已公開的國際PCT專利申請WO94/26872公開了一種形成具有骨細胞功能的磷酸鈣相的薄膜的燒結方法。這是在其上破骨細胞能顯示出長久活性和成骨細胞可分泌骨基質的第一種合成材料薄層。正如在該申請中所描述的，在製備具有所需比例的羥基磷灰石與磷酸三鈣薄膜時，應考慮到許多因素。這些參數包括1)用於製備溶膠—凝膠羥基磷灰石物質的反應物質的用量；2)反應物質結合的速率；3)當製備溶膠—凝膠時的混合時間和速率；4)沉澱和分離的速率和方法；5)在製備溶膠—凝膠時的工藝環境條件；6)在浸漬塗覆膜時從溶膠—凝膠體系中取出基體的速度；7)燒結溫度；8)在受控氣氛例如惰性氣體、真空或有水蒸汽存在的氣氛中的燒結；9)基體的性質，石英是產生透明基體的優選實施方式，其基體上塗覆有穩定的磷酸鈣相。
在該PCT專利申請中提出為了在石英基體上達到寬範圍的羥基磷灰石與磷酸三鈣的比例，要使其比值達到10∶90-90∶10，需要考慮到這些參數中的許多因素。指出在空氣氣氛下的燒結溫度為約800-1100℃。證實在800℃時，膜的主要成分是羥基磷灰石。燒結溫度為約900℃時，達到的比例為約70∶30。在1000℃時，達到的比例為約10∶90，而在1100℃時膜的主要成分是磷酸三鈣。它還指出燒結在真空中1000℃下進行時達到的比例為約66∶34。目前已經發現優選的比例是50∶50-20∶80。最佳比例約為333∶666。為了達到這些比例，可以考慮上面給出的幾個因素。但是，人們要求使上述幾個因素的可變性達最小，並以精確可重現的方式達到最佳膜組成所要求的比例。令人驚奇地是，儘管人們認為α-磷酸三鈣在水中是可溶的，但是膜在各種含水介質中是穩定的。
本申請人已經發現穩定本體的存在，能夠穩定組合物並防止它們在生理液體中發生降解。因此，磷酸三鈣本體在該組合物的膜、塗層或整體陶瓷件中消失主要是由於破骨細胞的活性，而不是由於溶解過程。穩定的人造生物活性組合物首先是這樣的一種組合物，即它們能維持破骨細胞和成骨細胞活性並能容易地測定這兩種細胞的生理活性以及能制定診斷和治療對策。穩定本體能穩定在燒結期間形成的磷酸鈣相內的α-磷酸三鈣，以提供穩定形式的α-磷酸三鈣，這種物質不會在生理液體中降解，而且它會形成具有維持和促進骨細胞活性的細胞相容形態的磷酸鈣相。
本發明的概況本發明提供了一種穩定的組合物，該組合物能廣泛地應用於各種診斷和治療。按照本發明的一個方面，所述的穩定組合物可以用來產生薄膜、塗層、粉末和整體陶瓷構件，它們具有同樣的表面球狀微孔和內部微孔。另外，為了提供與體內發現的相類似的三維骨組織，該整體陶瓷的結構內部也可存在大孔。按任何方法製成的組合物能促進在其上培養的骨細胞的活性並生長出用作骨移植物的體外工程人造骨組織。
按照本發明的一個方面，提供了一種具生物活性的人造燒結組合物，用來提供能穩定地維持其上的骨細胞活性的形態，所述組合物含有穩定的磷酸鈣相，它們是在穩定本體的存在下，在燒結溫度下由羥基磷灰石物質轉變成難溶和穩定的磷酸三鈣而產生的。
按照本發明的另一方面，提供了用來穩定人造燒結的磷酸鈣相組合物的方法，所述的磷酸鈣相具有適合於維持其上的骨細胞活性的形態，該方法包括通過燒結將羥基磷灰石物質主要轉變成α磷酸三鈣，並提供使所形成的α-磷酸三鈣穩定和難溶於磷酸鹽相的穩定本體。
按照本發明的另一個方面，提供了用來維持骨細胞活性的燒結人造微孔多晶結構，所述結構含有經過燒結的穩定磷酸鈣相，而所述的磷酸鈣相具有鬆散的內連圓形顆粒的球狀表面形態，並且在結構內有內連微孔。
按照本發明的又一個方面，提供的是可植入的鈣化骨基質，它含有a)用來維持基質的結構；b)穩定的磷酸鈣相層，該磷酸鈣相是在穩定本體的存在下，在燒結溫度下由羥基磷灰石物質轉變成磷酸三鈣而產生的，其中穩定本體使磷酸鈣相不溶和穩定。
c)由在穩定磷酸鈣相層上培養的成骨細胞沉積而成的界面層；和d)由這類培養的成骨細胞分泌出的礦化膠原基質。
按照本發明的另一方面，提供了培養有功能的骨細胞的方法，所述的方法包括—向基體上的穩定的磷酸鈣相人造燒結膜上塗覆懸浮在生理介質中的骨細胞懸浮液，所述的燒結膜含有穩定和難溶的α-磷酸三鈣複合物。
按照本發明的又一方面，提供了監測和定量測定骨細胞活性的試劑盒，該試劑盒包括—具有磷酸鈣相燒結膜的基體，所說的磷酸鈣相含有穩定和難溶的α-磷酸三鈣，—粘附到所述基體上的多孔骨細胞培養裝置。
按照本發明的再一個方面，提供了用來體外礦化膠原基質的組織工程的方法，該方法包括下列步驟—提供一種具有鬆散內連的圓形顆粒的球狀表面形態並且在結構內有內連微孔的人造穩定的組合物，—向組合物上施加懸浮在生理介質中的成骨細胞懸浮液，—培育由成骨細胞在培養液中選出的礦化膠原基質；和—向患者體內植入分離出的膠原骨基質。
附圖的簡要描述

圖1是CaO活性對羥基磷灰石和磷酸三鈣的穩定性影響的主要區域示意圖。
圖2是在穩定的矽本體存在下通過轉變本發明的羥基磷灰石物質形成的磷酸鈣本體相的曲線圖。
圖3是CaO/Al2O3對CaO活性影響的曲線圖。
圖4是CaO/TiO2和CaO/B2O3的比對CaO活性影響的曲線圖。
圖5包括圖(a)、(b)和(c)，表示(a)在組合物與基體的界面處；(b)剛好在界面以上和(c)在膜的頂部的能量分散X射線光譜的結果。
圖6是由活性成骨細胞在本發明的穩定薄膜組合物上沉積的礦化膠原骨基質的橫截面SEM。
圖7(a)是由在穩定的組合物上培養的成骨細胞產生的螢光鈣化骨基質沉積的照片。
圖7(b)是在穩定的薄膜組合物上未培養成骨細胞和沒有看到螢光鈣化骨基質的對照照片。
圖8是在由人造生物活性穩定組合物組成的整體三維固體陶瓷上的破骨細胞吸收凹坑的SEM。
圖9是在人造生物活性穩定組合物的薄膜上的破骨細胞吸收凹坑的SEM。
圖10是在表示石英基體上的人造穩定組合物的薄層形態的橫截面TEM的放大顯微照片。
圖11是作為薄膜而塗覆的穩定組合物的SEM顯微照片，表示表面微孔結構。
圖12(a)是在無穩定本體存在時燒結的市售羥基磷灰石的SEM顯微照片。
圖12(b)是在矽穩定本體存在下燒結的市售羥基磷灰石的SEM顯微照片。
圖13是天然骨上的破骨細胞的SEM，表示天然吸收凹坑。
圖14是說明用本發明方法製備的整體陶瓷的球表面形態的SEM顯微照片。
優選實施方案的詳細描述磷酸鈣物質的組成按申請人的已公開的共同未決PCT申請WO94/26872中所述。該方法持續可靠地提供了一種磷酸鈣相薄膜，該相的羥基磷灰石與α-磷酸三鈣的比例在合適的50∶50-20∶80比例範圍內。目前已經發現有穩定本體存在時，能夠顯著地和意想不到地穩定磷酸鈣相中的α-TCP，從而提供了能維持和提高成骨細胞和破骨細胞活性的生物活性組合物，該組合物可以以可重複再現的方式給這種活性定量，並且制定了診斷和治療骨組織損傷的對策。
應該明白，本文所使用的術語「穩定的」是指通過轉變羥基磷灰石而形成的磷酸鈣相，當將它們置於室溫條件下或在體內或體外的生理環境下時能保持穩定不變的結晶和化學結構。還應該明白，術語「生物活性」是指在基本上或完全由本發明的組合物製成的結構中能維持成骨細胞骨生長，同時促進由破骨細胞自然控制的組合物的細胞外吸收並且在與正常骨代謝極相似的過程中避免非特異性化學和/或細胞溶解和/或降解的能力。這種生物活性在有骨細胞存在下在體外和體內使用這些物質時存在。術語「磷酸鈣相」包括在燒結產品中的各種磷酸鈣，例如羥基磷灰石α-TCP、β-TCP、八磷酸鈣、磷酸四鈣和磷酸二鈣。
最初認為為了體外維持骨細胞活性，適用的磷酸鈣產品是純的或基本上是純的羥基磷灰石，並且認為在制膜時要選擇磷酸鈣。現在已經確定羥基磷灰石佔主要量的材料不能促進破骨細胞和成骨細胞的正常功能，實際上，在有破骨細胞存在時可觀察到的活性極小。但是，已經發現由於提供了包含羥基磷灰石和α-磷酸三鈣的磷酸鈣相混合物，所以在更寬的範圍內提高了吸收程度，而主要由α-磷酸三鈣組成的膜提供了最高程度的吸收，而主要由羥基磷灰石組成的膜所提供的吸收程度可被忽略。正是這個關於α-磷酸三鈣存在的認識，它部分說明了為什麼目前研製的磷酸鈣材料可以促進在這類材料上培養的骨細胞的功能特性。以薄膜形式如可以透過光或反射光的形式提供穩定磷酸鈣相使得可以實施診斷方法，以此評價在該膜上培養的骨細胞的幾種功能特性。
令人驚奇地是，已經發現使羥基磷灰石溶膠—凝膠物質的製備標準化並選擇非常特定範圍的燒結溫度不僅實現了所要求的比例，而且還發現通過將按溶膠—凝膠法製得的羥基磷灰石轉變成α-磷酸三鈣可以形成最佳的組合物。在這些優選的最佳膜組合物中只檢測到很少或未檢測到β-磷酸三鈣。無需製備羥基磷灰石和α-磷酸三鈣各自相的混合物。採用在公開的PCT申請WO94/26872中所述的技術來製備溶膠—凝膠羥基磷灰石就足已。用於在具有較高pH的介質中製備這類羥基磷灰石物質的化學反應如下
起始溶液由水溶液組成，反應物完全溶解於該溶液中並且進行很好地混合。羥基磷灰石以細顆粒的形式懸浮在懸浮液中，在製備後老化溶膠—凝膠物質24小時後，由光散射實驗獲得的顆粒大小從平均大小為0.3微米到1微米。
羥基磷灰石物質在中性和/或鹼性介質中是穩定的。優選的反應介質的pH值較高，通常在約12的範圍內。向第二種鈣溶液中滴加第一種磷酸鹽溶液，以防止形成三磷酸一氫四鈣，由此得到所要求的羥基磷灰石產物。過濾溶膠—凝膠物質，乾燥成粉末，在氧化鋁坩堝中於1000℃下進行煅燒和燒結，形成在潮溼環境的正常條件下呈穩定狀態的鈣基羥基磷灰石。在1200℃以上的燒結溫度下，該相主要轉變成α-磷酸三鈣，只有少量的其它相例如β-TCP、八磷酸鈣、磷酸四鈣或磷酸二鈣形成。對於本領域熟練的專業人員來說應該清楚在燒結的穩定磷酸鈣相中還會形成其它的「摻雜」物質。這類物質也可在燒結前就加入到羥基磷灰石物質中。存在或加入這類摻雜物最好對組合物和穩定組合物的形態沒有影響，它們會影響對其上的骨細胞活性的維持。
就燒結過程而言，已經發現羥基磷灰石物質乾燥膜的燒結可以在標準型高溫爐中進行，無需控制爐內氣氛。在使用新的爐子或使用以前用於其它目的已被汙染的爐子時，最好使爐子在燒結溫度以上的範圍內循環空燒結幾次。這樣預處理後的爐子除去了任何揮發性物質並準備投入使用。無需另外的步驟。在試運轉期間和用來燒結塗層物質的正常使用期間可以有外界空氣存在，只要存在的外界空氣對方法無不利影響並且所要求的比例結果恆定。在這種條件下，在所需的比例為50∶50-20∶80，在有石英物質存在時，燒結溫度的範圍可以是920-1100℃。已經發現，當溫度增加時，羥基磷灰石向α-磷酸三鈣的轉化率也增加。當燒結溫度的範圍為920-950℃時，比例可以由50∶50改變成333∶666。在燒結溫度選擇在950-1000℃的範圍內時，比例大約為333∶666。溫度增加到超出1000℃以上高達1100℃時，進一步提高了轉化率並生成比例在333∶666-20∶80範圍內的組合物。優選的燒結溫度大約為975℃，此時可達到的比例為333∶666。
羥基磷灰石向α-磷酸三鈣的轉變過程通過如下的反應進行；
在任何溫度下的轉變程度與周圍氣氛中水的分壓和改變CaO濃度的因素有關。
形成的磷酸三鈣的性質是重要的。對於非化學計量的Ca/P比例為1.5-1.60的羥基磷灰石來說(Nakamura，Thermochimica Acta，第165卷，1990)，以及於許多市售羥基磷灰石粉末(Aldrich化學公司)來說，在將粉末加熱到1100℃，然後冷卻到低於1000℃時，經常形成β-磷酸三鈣。β-TCP是一種穩定的難溶化合物，它會呈現出象礦物白磷鈣石那樣的性質。在由如上描述的水溶液形成的通過溶膠—凝膠法產生的羥基磷灰石物質的轉變過程中以及在由另一種沉澱反應形成的鈣基羥基磷灰石粉末中，發現在低於1000℃的溫度下，在有穩定本體存在時形成較多α-磷酸三鈣。在開發磷酸鈣基塗層產品時，α-TCP已經不很引人注意，其原因在於它們具有較高的溶解度而在生理液體中降解，結果只能通過在1250℃以上的溫度下高溫轉變純羥基磷灰石而產生。
由該轉變反應式，可以看出控制體系中CaO活性的任何因素將改變羥基磷灰石的轉變溫度和可逆性。據信加入的諸如SiO2的穩定本體與CaO反應，反應式如下
從而使轉變在低溫下進行。在反應中每1摩爾CaO需1摩爾SiO2才能使反應完全。也可能存在形成具有其它CaO/SiO2比的不同矽酸鹽的其它反應。
當通過用二氧化矽形成矽酸鈣來除去CaO時，如圖1所示，形成TCP相的溫度被降低到與轉變製得的羥基磷灰石組合物的數據相一致的溫度。加入矽本體使轉變線向右移動，即向形成主要是α-TCP的低溫方向移動。
所提出的二氧化矽直接起著與其它的相例如β-磷酸三鈣比較，促進α-磷酸三鈣形成的作用的機理是矽本體進入羥基磷灰石晶體結構並相對於β相來說更加穩定α相。根據一個優選的實施方案，現已證實起始羥基磷灰石物質的性質和二氧化矽的加入方式是重要的。當向市售的純羥基磷灰石粉末中加入二氧化矽粉末並共同研磨促進混合時，在1000℃以上的高燒結溫度下觀察到的轉變產品是β-TCP。相反，在向用本發明方法製備的粉末中加入金屬有機溶液的二氧化矽時，主要轉變成穩定的α-磷酸三鈣，如圖2所示，該相存在於950℃線的低溫下。這種轉變是不可逆的。在高溫下，摻雜粉末的轉變溫度被降低，從純粉末的1200℃以上降低到摻雜二氧化矽的粉末的約950℃。如上所述，可以認為這種結果是由於形成了矽酸鈣，從而在冷卻至低溫時保持了產生穩定相的組成。
按本發明方法製備的摻入穩定本體的粉末具有可重現且穩定的相組成並且該相組成具有所要求的表面形態和內部微孔結構的一個原因是，羥基磷灰石物質原本是用溶膠—凝膠法作為非常細的顆粒而製備的。穩定本體例如金屬有機溶液形式的矽本體的加入使這些顆粒的每一個與矽本體層密切接觸，致使混合充分。在燒結時，二氧化矽與轉化反應中釋放的CaO極為靠近。為此可以認為在各個顆粒的表面上形成的難溶矽酸鈣本體限制了反應的可逆性並防止α-磷酸三鈣在含水生理介質中溶解。
與二氧化矽類似，可以推斷鈦、鋁和硼也可降低轉化溫度，因此可作為穩定劑使用。圖3和4示出了溫度降低與形成CaO/Al/Ti/Ba複合物的關係。這些金屬也可用來除去羥基磷灰石中的CaO，從而產生穩定的α-TCP。選擇穩定劑(摻雜劑)和分散化合物的重要因素是(a)需要與所形成的形成穩定鈣化合物的CaO相配合，(b)必須能優選地以圍繞在新形成的顆粒外表面上的方式在整個溶膠—凝膠物質中均勻地分散，(c)應該不會穩定磷酸鈣體系中不需要的相，和(d)當在生物領域中應用時，必須無毒性。適用於本發明的穩定本體是形成氧化物(優選形成金屬氧化物)的那些物質。優選的金屬氧化物選自能形成所要求的組成和形態的那些氧化物，例如鋁、鋯、鍺、鉻、釩和鈮的氧化物，更優選地選自氧化矽和氧化鈦。這類穩定本體的混合物也是適用的。
燒結是在穩定本體的存在下進行的。穩定本體可以在燒結過程中通過羥基磷灰石由基體擴散而提供或在燒結前向羥基磷灰石中加入穩定本體來提供。無論是以擴散形式還是以加入形式來提供穩定本體，其用量都應足以穩定磷酸鈣相，而所述的磷酸鈣相是以薄膜、粉末、厚的塗層、整體陶瓷件和具有內部巨孔的整體陶瓷的形式存在的。優選地，為了維持和促進骨細胞活性，要形成可以重現的並且在燒結過程中是存在的穩定本體的函數的獨特生物活性表面形態和內部微孔結構。
根據其欲使用的用途，可以提供各種形式的組合物，例如以用於診斷的薄膜形式或用於骨或牙植入物上的厚塗層的形式存在的組合物。這裡，所述薄膜的厚度為0.1-5微米，用於其它基體的厚塗層的厚度為5微米。整體陶瓷件是指其功能與基體無關的較大的整體三維結構。
一個優選的實施方案是在石英基體表面上燒制羥基磷灰石物質。石英基體提供足夠的能擴散到磷酸鈣相中並產生足夠量矽本體的矽本體源。如圖5(a)在組合物與基體的界面處，圖5(b)剛好在界面上和圖5(c)在膜的頂部所示，矽本體可以存在於整個膜組合物中。在燒結期間，矽本體從石英表面上釋放出來並擴散通過羥基磷灰石物質層的表面。在羥基磷灰石轉變成α-磷酸三鈣(羥基磷灰石與α-磷酸三鈣的比例在優選的範圍內)的過程中，矽本體與CaO反應，形成矽酸鈣，矽酸鈣與α-磷酸三鈣形成穩定的複合物。對於本領域熟練的技術人員來說，應該清楚在燒結期間釋放出穩定本體進入磷酸鈣相中的其它的基體或添加劑也可在本發明中使用。該穩定本體可以選自金屬氧化物和非金屬氧化物，例如矽、鋁、鋯、硼、鈦、鍺、鉻、釩、鈮的氧化物和其混合物。含有或由鋁、鋯、硼、鈦和這些物質的各種混合物製成的基體可作為用於提供穩定本體的源。
按照本發明，施加在合適載體上的薄膜明顯地有助於研究和理解骨細胞的功能特性。正如本發明所提供的，穩定膜的組成使得它們可以在其上培養各種類型的骨細胞。在研究破骨細胞活性時，可以調節表面組成，以促使膜材料的磷酸鈣本體從顯著的吸收程度調節到磷酸鈣本體的吸收達到可忽略的程度。類似地，通過測定鈣化骨基質的構成來研究成骨細胞的活性。提供足夠薄的薄膜從而使破骨細胞對本體的吸收可以通過所吸收的磷酸鈣本體的消失來測定，這就提供了一種與現有技術的方法相比簡單、價廉的分析方法。按本發明製成的膜組成維持了骨細胞的生物功能。在透明的支承基體例如石英或玻璃上施加這種膜的優點是導致了包括自動機器閱讀在內的簡易判斷診斷方法的技術。
理想的膜厚大於0.1微米，原因是已經發現膜厚小於0.1微米時難以獲得均勻的無間隙的覆蓋膜。至於如何限制膜的上限，任何所需的厚度將取決於其最終用途。正如將要討論的，吸收程度可以通過透光率來測定，優選地，它要求膜的厚度小於10微米。基體是容易耐所需燒結溫度並具有所需透明度的石英，從而可以通過透光率實驗來測定膜材料中磷酸鈣本體的吸收程度。
研製的薄膜可以在試劑盒及其類似物中使用，用來評價骨細胞的活性。可將膜以「試劑盒」的形式裝配，它包括石英基體、其上預塗覆有磷酸鈣的薄膜，它們可以在細胞培養容器(可能地是24孔，任選地為無菌的多孔板，直徑為約15mm)中使用，作為適合於培養混合骨細胞群體的體系。該裝置簡單並僅依賴於常規的實驗設備和使用技術，適合於進行定量分析，該裝置的造價低，但強度足以承受正常的操作水平並可在塑料盒中進行多個包裝，例如分24個試樣包裝。薄膜表面有明確和可重現的化學性，當使用適宜的包裝材料包裝時，其機械強度足以承受運輸壓力。
在每一種情況下，培養條件應使單核細胞或多核細胞形式的破骨細胞在功能狀態下存活，並能吸收膜中的人造磷酸鈣。同樣地，成骨細胞在這樣的培養條件下也能活性分泌鈣化骨基質。
這些基體可以用來評定破骨細胞的吸收活性，監測由於疾病或在培養介質中所含的藥劑例如會直接或間接影響破骨細胞吸收活性的藥物而導致的吸收活性量的改變。這種基體還適用於培養活性成骨細胞，以觀察和測定其分泌的骨基質以及使用沉積的礦化基質進行體內移植。如圖6所示，通過在穩定薄膜12的表面(如在石英基體14上提供的)上培養的成骨細胞來沉積礦化膠原基質10。圖中示出了一個類似於膠凝線的良好結合的邊界層16，並與相同類型的由成骨細胞在體內在新骨和老骨的界面上形成的膠凝線類似。這清楚地表明加壓穩定的組合物具有成骨細胞生理活性，從而進一步證實這種穩定的組合物可以用作為重要的骨修復產品。
所述裝置可作為定量測定破骨細胞的吸收活性或由於成骨細胞的活性而造成的骨類材料的累積量。這類活性分析可以在連續的實時監控、延時時間間隔或終點測定的情況下進行。測定骨細胞活性的步驟是上述監控方法中常用的，其中骨細胞(動物或人)是在一個或多個裝置中在特定條件下培養的。培養周期為幾小時到許多天，優選地為約2-10天(最佳時間取決於細胞種類和方案)，在此期間，可以連續地監控、周期地監控破骨活性的範圍或在正在進行的基礎上對其簡單地不進行監控，這樣有利於最終點的測定。同樣地，通過測定鈣化骨基質積累的程度可以觀測成骨細胞活性。如圖7所示，塗覆有本發明的穩定膜和同時與成骨細胞一起培養的石英盤顯示出大量的螢光，這表明有礦化骨基質存在。相反，在只有介質(b)存在的情況下塗覆在石英上的穩定膜未顯示出螢光。鈣化骨基質的量直接與可測定的發射出的螢光量成正比。四環素是天然的螢光材料。當細胞吸收四環素時，四環素可被代謝，分泌出它們的代謝物並被摻入到新形成的骨基質中。四環素僅僅在被成骨細胞代謝時產生螢光。這表明成骨細胞在穩定的組合物上活性分泌出骨基質。
一旦製備了溶膠—凝膠羥基磷灰石物質，就可用各種技術將其作為薄膜塗覆在所需基體上。例如，浸塗法(C.J.Brinker等人，Fundamentalsof Sol-Gel Dip Coating，Thin Solid Film，第201卷，第1期，97-108，1991)由一系列步驟構成以恆定的速度從溶膠或溶液中取出基體，在適當的溫度下乾燥塗覆的液體膜，將膜燒製成最終的陶瓷。
在旋轉塗覆時，將溶膠—凝膠滴在板上，板以一定的速度旋轉，通過離心作用足以使溶液均勻地分布。隨後按與浸塗法相同的方法進行處理。
應該認識到有各種技術可以用來向基體上施加溶膠—凝膠的薄膜。其它的技術包括噴塗溶膠—凝膠、滾塗溶膠—凝膠、塗鋪溶膠—凝膠和塗抹溶膠—凝膠。
塗覆統一尺寸的單個盤的另一種方法是用溶膠—凝膠膜覆蓋大的基體。燒結基體上的整個膜。然後可以在膜上採用諸如柵格類的裝置，將其分成多個獨立的實驗區。
在塗覆溶膠—凝膠物質的各種技術中，所形成的膜的厚度和質量(氣孔率、微結構、結晶狀態和均勻性)受多種因素影響。這些因素包括起始溶膠的物理特性、組成和濃度、基體表面的清潔度、基體的取出速度和燒成溫度。對於浸塗法來說，厚度通常主要取決於取出速率和溶膠粘度。由於溶膠的不均勻性會導致形成微孔和破裂，所以塗層操作應在清潔的室內進行，以避免溶膠的顆粒汙染。在熱處理階段，要求溫度要高，以產生所需的微結構和所需的羥基磷灰石向α-磷酸三鈣的轉變。
用浸塗法製備磷酸鈣膜的目的有下面兩個方面(a)製備具有所需質量(均勻性、厚度和氣孔率等)的膜；和(b)製備用於生物試驗的在透明基體上的半透明磷酸鈣膜。
還發現本發明穩定的人造組合物不僅適用於製備薄膜和厚膜，還適合於製備粉末和整體陶瓷。陶瓷是用本文所述的溶膠—凝膠法製備的燒結粉末來製備的，其中添加二氧化矽形成所需的穩定的羥基磷灰石/α-磷酸三鈣相混合物。在一個實施方案中，磨細經過燒結的粉末，使其足以形成0.5-1mm厚的圓片，然後與滴加的具有相同摻雜物組成的溶膠-凝膠物質混合形成有助於保持顆粒的潮溼粉末。在試驗膜中在大約5噸/cm2的壓力下單軸壓制潮溼的粉末。所製成的整塊材料具有極好的生坯強度，然後將其在1000℃於空氣中燒制1小時。這類陶瓷保持了所有與用作薄膜或塗層的穩定組合物相同的特性。對於SiO2穩定的組合物來說，X射線衍射表明在初始粉末和最終陶瓷之間相組成幾乎沒有變化。如圖8的平面圖所示，表面構型與圖9所示的塗覆在石英基體上的組合物有驚人的相似之處。破骨細胞在薄膜和整體陶瓷上的吸收能力很類似。通過在整體陶瓷上存在的吸收凹坑18，可以觀察到破骨細胞的吸收，它們與在薄膜(圖8和9)上所示的吸收凹坑相似。
正如本專業領域熟練的技術人員所認識到的，通過將陶瓷製成整件的形狀可以製成用於所需目的的大型整件陶瓷。所製成的整件產品保持了所需的穩定磷酸鈣相組成以及促進其上的骨細胞活性的微孔球形表面形態和內部微孔結構。
製備用於生物領域的陶瓷的一個特定方面是製備在內部結構中具有導致生物活性的細的球形表面微孔和內部微孔和孔徑為50-1000微米或更大的大尺寸結構的陶瓷件。這促使體系中的骨修復與體內生理骨修復更為接近。處在該範圍下限的這種巨孔特別適合於所要求的骨基質的快速生長，而處在該範圍上限的這種巨孔使得細胞進入其內部，從而例如進行骨移植片的體外組織製備。在採用諸如二氧化矽的穩定本體摻雜並在使用前進行燒結的粉末時，通過將這種粉末與所需大小的苯乙烯球混合可製備多孔陶瓷。在所需壓力下壓制摻有苯乙烯球的溼粉末後，通過在約400-600℃的溫度下熱解除去苯乙烯。接著按以前所說的常規方法在1000℃下燒制多孔陶瓷。這種工藝的結果是所形成的具有外層球形微孔結構、亞外層內部微孔結構和內部巨孔結構的整體陶瓷，從而使得細胞通過整個整體陶瓷部件中遷移並起作用。
作為本領域熟練的普通技術人員應該清楚，為了使陶瓷結構內具有氣孔，也可使用與苯乙烯類似的物質。能夠在正常的燒結溫度下的溫度範圍內進行熱解的其它物質也可用來形成微孔結構。所使用的物質還應該不留有任何毒性殘餘物。還應該清楚其它的方法也可用來形成微孔，例如機械鑽孔、使用雷射器或使用發泡劑。
由於本發明的一個顯著方面是提供羥基磷灰石和α-磷酸三鈣相的混合物，這些物相通過由溶膠—凝膠羥基磷灰石形成的摻雜粉末產生的表面形態而連接，所以本領域內熟練的技術人員應該清楚用該粉末製備膜、塗層和整體構件的其它的方法也可在本發明中使用。這包括使用已知技術例如等離子或熱噴塗或電泳沉積。
參見圖10，橫截面TEM顯微照片示出了石英基體(a)，包含小晶粒的界面層(b)和包括膜表面的上層(c)形式的層梯度，其中的膜表面由包埋在顆粒中的小晶體構成，所述的顆粒提供球形微孔結構。在燒結過程中，矽本體從石英中釋放出來，在羥基磷灰石轉變成燒結薄層的α-磷酸三鈣時在羥基磷灰石中擴散。界面層(b)結晶結構要比具有大的磷酸鈣相的多晶顆粒表面的小。
該人造燒結組合物的形態獨特，以前未曾報導或經證實過。現在，我們所揭示的表面形態具有鬆散內連的圓顆粒球形表面，其中的圓形顆粒具有內連的微孔結構。在本發明一個優選的實施方案中，所具有的形態成功地維持了功能性破骨細胞和成骨細胞的培養。
塗層表面形態具有特定的形式，包括有類似於珊瑚狀的鬆散內連的球形結構(圖11)。顆粒的大小在約0.5-1微米的範圍(橫向尺寸)內改變。塗層在與基體垂直的方向上是多孔的，它們在接近表面處所具有的平面密度要比接近基體處的大。這種形態使得塗層內的液體介質和其它生理液體可以滲透。相反，用其它共同沉澱方法製備的羥基磷灰石的表面形態不會產生由本發明提供的微孔結構。參見圖12(a)和12(b)，在無穩定本體(a)和有穩定本體(b)存在的情況下製備的羥基磷灰石膜的表面形態與圖11中用本發明組合物製備的相比無微孔。另外，已有報導合成的多晶羥基磷灰石不會被破骨細胞吸收(Shimizu，Bone and Minerology，第6卷，1989)。
球形表面形態是由大小可與最初由成骨細胞在形成骨的過程中形成的附聚沉積物相比的圓形顆粒構成。本發明的組合物提供的表面形態與細胞在體內預期接觸的形態相匹配。圖13中示出了典型的破骨細胞吸收凹坑，其中基體是骨。如圖9所示，在本發明人造組合物上由破骨細胞20形成的吸收凹坑18與圖13天然骨中看見的極為類似，圖13說明破骨細胞在兩個體系中起類似的作用。這就是說人造燒結組合物的表面形態與細胞在體內預期接觸的形態相匹配。
穩定組合物的整體微孔可確保接近人造材料表面處的鈣或磷酸鹽離子的濃度限定在細胞在體內與天然骨細胞接觸時細胞所期望的範圍內，所述的天然骨細胞由羥基磷灰石、膠原和其它纖維組織構成。在導致吸收的由破骨細胞參與的細胞外溶解過程中，這種複合材料致使溶解產品有一個特定的局部濃度。在無機人造羥基磷灰石或α-TCP溶解或吸收期間，所產生的限定某些細胞行為的濃度被限定在較窄的範圍內，為了使細胞在人造表面上達到可與天然骨相匹配的活性，必須採用一些手段來調節元素例如鈣的局部濃度。組合物的氣孔率可以通過介質的流動或擴散來實現這一目的。
本發明的穩定的生物活性人造組合物提供了獨特的化學組合物，它具有獨特的表面形態和以前從未證實過的內部微孔結構。在體內和體外具有穩定的骨細胞生物活性的組合物並且這種組合物在體內能夠容易、精確和可重複地定量以前從未報導過。穩定組合物的性質是通用的，可將它們製成粉末、薄膜、厚塗層、整體陶瓷件或巨孔整體陶瓷件。在各種情況下，獨特的表面形態、內部微孔率以及穩定的磷酸鈣相組成得到保持。如圖14所示，用本發明的穩定組合物製成的整體陶瓷的微孔表面形態得到保持。
本發明的穩定組合物適合於體外診斷，以便以大規模和自動方式表徵異常骨細胞的功能。穩定的人造組合物還易於用作骨和牙植入物的塗層，以促進組織再生和修復。該組合物的結構應使其與體內骨組織和細胞極為相似，因此可與體內骨組織和細胞相匹配，以避免帶來排斥外來材料的問題。
本發明的組合物具有所需的物理特性以及與體內硬組織的親合性/相匹配性，致使它們能用於各種治療領域中，例如用於提供體內植入物以及體內再生和修復骨組織，例如替代髖部和膝蓋、骨折和牙的植入物。所述組合物還可用於在體外進行的各種組織工程應用，以提供人造骨材料，然後將這種材料作為體內骨移植物而被植入，用於骨組織替代、再生和修復。病人可提供用於在組合物上培養的破骨細胞和成骨細胞，以降低組織排斥的機會，由此產生完全相匹配的骨移植物。另外，供體骨細胞也可用於該目的。可以在有或沒有用於產生骨組織的骨細胞的存在下製備這種移植物，用於組織移植。但是，優選地是含有細胞的移植物來自於自體供體，使得與組織排斥有關的問題減至最小。粉末形式的穩定組合物還可用作醫學治療。穩定的粉末可以混合併懸浮在與組織相匹配並且無毒的聚合物中，然後在體內施用以填充骨組織上的孔隙。
可使用本發明組合物的所有用途都具有優點，即破骨細胞和成骨細胞可以通過任何形式的組合物而起作用，由此使骨組織體系更接近體內存在的體系。本發明的人造生物活性組合物促進了骨質傳輸和吸收，以便可以發生正常組織的癒合和再生，同時在正常骨組織重建過程中吸收人造材料。
下面的方法舉例說明提供生物活性人造燒結組合物的本發明的有關方面，所述的組合物具有穩定的磷酸鈣本體，它還顯示出維持其上的骨細胞活性的獨特形態。方法1.製備羥基磷灰石溶膠—凝膠物質下面的方法是製備足夠量的用於製備目的的溶膠—凝膠羥基磷灰石。溶液A含有硝酸鈣四水合物和溶液B含有正磷酸二氫銨(一價鹼)。混合溶液A和溶液B，生成所需的溶膠—凝膠即溶液C。向4.722g硝酸鈣(Ca(NO3)2)中加入40ml二次蒸餾水以製備溶液A。以中等速度攪拌該溶液達足夠的時間以溶解全部的硝酸鈣，攪拌時間通常在3分鐘以內。向該溶液中加入3ml氫氧化銨(NH4OH)，再攪拌約3分鐘。測定溶液的pH值，要求pH值約為12。向該溶液中加入37ml二次蒸餾水，使溶液的總體積達到約80ml。再攪拌溶液7分鐘並蓋上該溶液。
向250ml裝有1.382gNH4H2PO4的燒杯中加入60ml二次蒸餾水以製備溶液B。蓋上燒杯並以中等速度攪拌3-4分鐘，直到全部的NH4H2PO4溶解。向該溶液中加入71ml NH4OH，然後蓋上燒杯，再連續攪拌約7分鐘。測定溶液的pH值，要求pH值約為12。向該溶液中再加入61ml二次蒸餾水，蓋上溶液以使溶液的總體積達到約192ml。再攪拌溶液7分鐘並蓋上溶液。
接著合併溶液B和溶液A，以製備所需的溶膠—凝膠。將所有的溶液A加入到500ml試劑瓶中。以中等速度開始攪拌，並以大約256ml/小時的速率向試劑瓶中加入溶液B，直到將全部的192ml溶液B供入溶液A中。過量的溶液B可用於補償在250ml燒杯中保留的或在轉移過程中管子中的任何溶液。在完成加料和溶液A與溶液B的合併以後，以中等速度連續攪拌所製成的溶液大約23-24小時。觀察產生的溶膠—凝膠是否有任何異常的沉澱或附聚。如果發生了任何異常的沉澱或附聚，那麼必須丟棄溶液並次開始製備過程。然後小心地將該溶膠轉移到另一個500ml試劑瓶中，以避免混入可能存在在原始試劑瓶的壁上的任何顆粒附聚物。向離心瓶中加入大約240ml的溶液C即生成的溶膠—凝膠，並在室溫下以500rpm的速度離心20分鐘。離心後，在不幹擾沉降物的情況下倒掉180ml上清液。通過以平穩轉動的方式混合使沉降物緩慢地再懸浮約30分鐘。然後測定溶膠—凝膠的粘度，優選地為20-60cP。隨後就可以將溶膠—凝膠用於浸塗所選擇的基體或用於其它應用。方法2.製備摻雜二氧化矽的羥基磷灰石物質按如下方法製備二氧化矽溶液。所確定的量為每4ml溶液中大約含有0.168gSiO2。將4ml二氧化矽溶液加入到60ml在方法1中製備的經離心的羥基磷灰石溶膠—凝膠物質中，並與轉變反應中生成的0.168gCaO反應。矽溶液組分正矽酸四丙酯Si(OC3H7)47.32gm2-甲氧基乙醇CH3OCH2CH2OH34.5gm將二氧化矽溶液加入到由方法1製備的羥基磷灰石物質中，以使SiO2的濃度與在燒結轉變過程中產生的CaO的濃度的比為1M SiO2/l摩爾CaO。方法3.製備薄膜根據基體的性質，可用方法1或方法2製備羥基磷灰石溶膠—凝膠物質的方法來製備薄膜。如果基體能提供燒結膜中所需的穩定本體的話，那麼可以採用方法1。如果基體不能提供這類穩定本體，那麼將需要採用具有摻雜添加劑的方法2。
在將薄膜塗覆到基體上之前，需要徹底地清潔基體，以確保膜具有令人滿意的覆蓋度。在基體是石英的情況下，通過將盤放置在玻璃燒杯中並向玻璃燒杯中加入鉻酸清洗溶液並覆蓋整個盤來實現清潔。然後蓋上燒杯。接著在水浴中聲處理該盤1小時。用自來水衝洗酸20分鐘。通過三次更換二次蒸餾水除去殘餘的自來水。在最後一次更換二次蒸餾水後，用不起毛的抹布擦乾各單個盤並檢查石英表面上的毛病。需要時用壓縮氮氣或空氣清除表面上的任何殘餘顆粒。將所述盤在無菌環境下存放在帶蓋容器中。這種方法可用來清潔任何類型的石英基體。
將具有適當組成的石英盤基體或其它基體浸漬在方法1製備的溶膠—凝膠中。抓住盤的邊緣以避免觸及表面。將盤浸漬在溶膠中，優選地是通過機械方法進行。按預定的取出速度從溶膠中取出盤。除去盤一側上的塗層。然後將塗覆的基體置於清潔的陪替式培養皿中，蓋上蓋並在室溫下乾燥。在燒結前形成的膜應該是均勻，無裂紋、塊或孔隙。應該清楚塗覆盤表面的浸塗工藝也可用來塗覆其它形狀的基體，例如平面矩形石英基體。方法4.製備羥基磷灰石乾粉將按方法1或2製備的溶膠—凝膠物質在100℃乾燥約8小時。然後採用研缽、研杵和其它能研磨和產生細顆粒的機械方法研磨乾燥的物質。隨後按下面如方法7所述的標準的燒結過程燒結粉末，其不同之處在於將粉末置於坩堝中進行燒結，然後在冷卻後再次研磨。可用相同的方法製備摻雜或穩定的羥基磷灰石。方法5.生產整體陶瓷件按照下面的方法用摻雜二氧化矽的羥基磷灰石粉末製備陶瓷(三維整件)。摻雜的溶膠—凝膠物質是按方法2製成的。貯存部分溶膠—凝膠物質並將剩餘的一部分過濾。在120℃下乾燥粉末，研磨製成細粉末。將約0.09gm的粉末置於塑料盤中。使用玻璃滴管形成初始溶膠—凝膠物質的滴液，所述的溶膠—凝膠當與粉末混合時重量約為0.055gm。將溶膠與粉末混合成潮溼狀，但不是溼的漿料。將該潮溼狀漿料裝入到直徑為6.25mm的不鏽鋼模中，以2千公斤/分鐘的壓力壓制。從壓模中取出整件，在空氣中乾燥，並按方法7在帶蓋的氧化鋁坩堝中進行燒制。其表面形態與圖14所示的人造燒結薄膜的形態極為相似。方法6.製備具有微孔結構的整體陶瓷件將按方法2製備的摻雜有穩定本體例如二氧化矽並在1000℃下燒結的羥基磷灰石粉末與大小合適的苯乙烯球混合，用另外的溶膠—凝膠物質溼潤粉末，在約1噸/cm2的壓力下壓制，以便不會擠壓苯乙烯。採用剩餘溶膠和2.5％(重量)的聚乙烯醇溶液溼潤混合物，壓實粉末/苯乙烯以增加其生坯強度。在空氣或氧氣中加熱到550℃進行熱解，除去苯乙烯。然後按方法7所描述的標準燒結的方式將微孔陶瓷燒制到1000℃。方法7.燒結羥基磷灰石物質下面的燒結過程可以在各種尺寸，能在環境溫度至1100℃的溫度下進行操作的標準實驗室窯爐內進行，該窯爐被設計成可以使其內部溫度保持在精確和穩定的狀態，尤其使溫度處在800-1100℃的範圍內，例如使用Lindberg型51744或894-Blue M爐子。將按方法3、4、5或6製備的組分小心地轉移到標準陶瓷板上(如在Lindberg爐中通常進行的)。陶瓷板在燒結過程中用作載體，從而可以容易地向爐子中裝入和取出多個基體。將爐溫設置到可以達到所需的HAα-TCP比例的溫度。使用可以用程序控制的爐子例如Lindberg型894-Blue M的爐子，可使爐子被程序控制，以保持所要求的溫度，溫度通常被設置在920-1100℃，燒結時間最長為1小時，以確保矽本體擴散通過由羥基磷灰石和α-磷酸三鈣所形成的梯度層。在使用不能用程序控制的爐子的情況下，可以使用獨立式計時器，旨在在選擇的溫度下在所需的燒結時間結束時提醒操作者關閉爐子。在將爐內溫度冷卻到手可以接觸並安全的溫度(大約60℃)後，在任何時間取出帶有燒結基體的陶瓷板。然後可以包裝或貯存單個基體用於最終的應用。
根據該方法，羥基磷灰石/α-磷酸三鈣的薄膜和增厚塗層可以按穩定的方式來生產，其產品具有所需的組成，結果使得各種工藝參數的變化程度達到最小，以確保這種穩定性。
儘管在本文中詳細描述了本發明優選的實施方式，但是對於本領域內那些熟練的技術人員來說應該清楚在不違背本發明精神或所附的權利要求書範圍的情況下可改變本發明。
權利要求
1.用來提供能穩定地維持其上的骨細胞活性形態的生物活性人造燒結組合物，所述的組合物含有穩定的磷酸鈣相，該磷酸鈣相是在有穩定本體存在的情況下，通過在燒結溫度下將羥基磷灰石物質轉變成難溶並且穩定的磷酸三鈣而產生的。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述的穩定的磷酸三鈣主要是α-磷酸三鈣。
3.根據權利要求2的組合物，其中所述的組合物為粉末、薄膜、厚塗層或三維整體材料。
4.根據權利要求3的組合物，其中所述的膜厚約0.1-10微米。
5.根據權利要求3的組合物，其中所述的羥基磷灰石物質在燒結前就被施加在基體上，所述基體含有選自矽本體、鋁本體、鋯本體、鋇本體、鈦本體和它們的混合物的組分。
6.根據權利要求5的組合物，其中所述的穩定本體是在燒結期間從所述的基體中釋放出來的或者是在燒結前添加到羥基磷灰石物質中的。
7.根據權利要求3、5或6的組合物，其中所述的穩定本體選自矽、鍺、鉻、釩、鈮、鈦、硼、鋁、鋯和其混合物。
8.根據權利要求2的組合物，其中所述的組合物被塗覆到石英基體上，矽本體是在燒結期間從石英中釋放到所形成的磷酸鈣相中以穩定α-磷酸三鈣。
9.根據權利要求3的組合物，其中所述的矽本體是在燒結前以溶液形式加入到羥基磷灰石物質中的。
10.根據權利要求1或9的組合物，其中所述的矽本體是正矽酸四丙酯。
11.根據權利要求1的組合物，其中所述的磷酸鈣相中羥基磷灰石與α-磷酸三鈣的比例為50∶50-20∶80。
12.根據權利要求1的組合物，其中所述的組合物難溶於pH值為約6.4-7.3的生理液體中。
13.用來提供能穩定地維持其上的骨細胞活性形態的生物活性人造燒結組合物的製備方法，所述的方法包括通過燒結使羥基磷灰石物質主要轉變成α-磷酸三鈣，和提供起穩定作用的本體以使所形成的α-磷酸三鈣穩定並在磷酸鹽相中難溶。
14.根據權利要求13的方法，其中所形成的組合物為粉末、薄膜、塗層或三維固體。
15.根據權利要求14的方法，其中所述所羥基磷灰石物質被施加在基體上，所述基體含有選自矽本體、鋁本體、鋯本體、鈦本體、硼本體、鍺本體、鉻本體、釩本體、鈮本體和它們的混合物的組分。
16.根據權利要求15的方法，其中所述的穩定本體是從所述的基體中釋放到在燒結期間形成的羥基磷灰石相中的。
17.根據權利要求14或16的方法，其中所述的穩定本體選自矽、鋁、鋯、鈦、硼、鍺、鉻、釩、鈮和其混合物。
18.根據權利要求17的方法，其中所述的羥基磷灰石物質被塗覆到石英基體上，矽本體是在燒結期間從石英中釋放到所形成的磷酸鈣相中以穩定α-磷酸三鈣。
19.根據權利要求13的方法，其中在燒結前以溶液的形式將矽本體加入到羥基磷灰石物質中。
20.根據權利要求13或19的方法，其中所述的矽本體是正矽酸四丙酯。
21.根據權利要求13的方法，其中所述的磷酸鈣相中羥基磷灰石與α-磷酸三鈣的比例為50∶50-20∶80。
22.根據權利要求13的方法，其中羥基磷灰石物質的燒結是在900-1100℃的溫度下進行的。
23.用來維持骨細胞活性的燒結人造微孔多晶結構，所述的結構含有燒結的穩定磷酸鈣相，該磷酸鈣相在所述的結構中具有內連微孔的鬆散內連圓形顆粒的球形表面形態。
24.根據權利要求23的多晶結構，其中所述的結構具有如圖10所示的球形表面形態。
25.根據權利要求24的多晶結構，其中所述的圓形顆粒的橫向尺寸在0.5-1微米的範圍內。
26.一種可植入的鈣化骨基質，含有a)用來維持所述基質的結構；b)穩定的磷酸鈣相層，該磷酸鈣相是在穩定本體的存在下，通過在燒結溫度下將羥基磷灰石物質轉變成磷酸三鈣而產生的，其中穩定本體使磷酸鈣相不溶並穩定；c)由在上述的穩定的磷酸鈣相層上培養的成骨細胞沉積而成的界面層；和d)由這種培養的成骨細胞分泌的礦化膠原基質。
27.權利要求26所述的可植入的鈣化骨基質，其中所述的骨基質不含包括成骨細胞在內的骨細胞。
28.權利要求26所述的可植入的鈣化骨基質，其中所述的基質包含患者的包括成骨細胞在內的骨細胞。
29.權利要求26所述的可植入的鈣化骨基質，其中所述的基質能被破骨細胞吸收。
30.用權利要求1或2的組合物製成的整體陶瓷微孔結構。
31.根據權利要求30所述的整體陶瓷微孔結構，其中所述的結構具有內部巨孔。
32.一種用權利要求1或2所述的燒結組合物塗覆的可植入的裝置。
33.一種主要由權利要求1所述的組合物組成的可植入的裝置。
34.培養有功能的骨細胞的方法，所述方法包括將懸浮在生理介質中的骨細胞懸浮液施加到在基體上的穩定磷酸鈣相的人造燒結膜上，所述的膜含有穩定且難溶的α-磷酸三鈣複合物。
35.一種用來監測和定量測定骨細胞活性的試劑盒，所述的試劑盒包含具有磷酸鈣相燒結膜的基體，所述的磷酸鈣相含有穩定和難溶的α-磷酸三鈣，粘附到所述基體上的多孔骨細胞培養裝置。
36.一種用於體外對礦化膠原基質進行處理的方法，該方法包括如下的步驟—提供一種具有鬆散內連圓形顆粒的球狀表面形態並且在結構內有內連微孔的人造穩定的組合物，—向該組合物上施加懸浮在生理介質中的成骨細胞懸浮液，—培育由成骨細胞在培養液中選出的礦化膠原基質；和—將分離出的膠原骨基質植入病人體內。
全文摘要
本發明涉及提供能穩定地維持其上的骨細胞活性形態的生物活性人造穩定的燒結磷酸鈣相組合物。所述組合物含有穩定的磷酸鈣相,它們是在有穩定本體存在的情況下在燒結溫度下通過將羥基磷灰石物質轉變成難溶和穩定的磷酸三鈣而產生的。本發明在評價異常骨細胞活性以及醫學治療的醫學診斷,包括骨和牙組織更換和修復以及體外骨接肢組織工程方面有許多用途。
文檔編號C04B38/00GK1195336SQ96196686
公開日1998年10月7日 申請日期1996年8月30日 優先權日1995年9月1日
發明者雪梨·M·皮尤, 蒂莫西·J·N·史密斯, 麥可·塞耶, 薩拉·多西·蘭斯塔夫 申請人:米列姆·貝爾羅吉克公司