一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法
2023-09-16 11:52:35 2
專利名稱：一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法
技術領域：
本發明屬於擬穴青蟹遺傳標記檢測領域，特別是涉及一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法。
背景技術：
單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)分子標記幾乎存在於所有真核生物基因組中，是生物基因組中最豐富的遺傳變異資源。SNPs具有典型的二等位基因性，大多數生物基因組平均每200bp IOOObp核苷酸中就會存在一個SNP。由於SNPs具有眾多優點，因此被認為是遺傳學和進化學研究領域最具有潛力的一種遺傳標記。目前，已經在多種水產養殖動物中報導了 SNPs分子標記，如凡納濱對蝦、日本牙鮃、虹鱒、大西洋鮭、牡蠣等。擬穴青蟹(Scylla paramamosain)屬節肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Scylla),在我國主要分布於長江口及以南沿海海域，是我國重要的海洋漁業資源和海水養殖蟹類。擬穴青蟹具有體型大、生長速度快、肉味鮮美等優點，深受廣大消費者青睞。近年來，我國擬穴青蟹的人工養殖年產量一直穩定在10萬噸以上，保持了健康的發展勢頭。學者們圍繞擬穴青蟹繁殖生物學、養殖生物學等方面已經開展了較多的研究工作，但對遺傳學及育種學方面的研究還較少。目前，在擬穴青蟹中已經開展了線粒體DNA和微衛星分子標記的研究，而對SNPs標記的研究還甚少，限制了群體遺傳多樣性評估、遺傳圖譜構建及分子標記輔助育種等研究的開展。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，該方法具有實驗周期短、成本低、操作簡單等優點，能夠準確地檢測出不同個體的基因型，從而為擬穴青蟹分子遺傳學及分子輔助育種研究提供新型遺傳標記。本發明提供的20個SNPs分子標記可應用於擬穴青蟹遺傳變異分析、種質資源評估與保護及遺傳連鎖圖譜構建等領域。本發明的一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，包括(I)擬穴青蟹基因組DNA序列的獲取基因組序列可以通過兩種渠道獲得第一，利用已經構建的擬穴青蟹基因組文庫或轉錄組文庫中的序列；第二，利用GeneBank資料庫中的公開的擬穴青蟹功能基因序列。(2) DNA序列測序與候選SNPs鑑定首先，對所獲得的基因組序列分段設計引物，PCR擴增產物大小在500bp、00bp之間為宜；其次，採用上述引物對5 30個無親緣關係的擬穴青蟹個體進行PCR擴增；然後，選取擴增清晰、產量高、無非特異擴增的PCR產物送測序公司進行雙向、直接測序；最後，對測序結果進行分析，比較不同個體在同一鹼基位點的序列差異，鑑定出候選SNPs位點。
(3) SNPs驗證與基因分型首先，針對每一個候選SNPs位點設計3條引物，包括2條等位基因特異的上遊引物(Fl和F2)和I條通用的下遊引物(R)。2條上遊引物分別以SNP位點的2個不同的鹼基作為引物的3』末端，並且在5』端分別加上長度不同的人工序列(GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC);然後，以擬穴青蟹I個野生群體共30隻個體的基因組DNA為模板，採用上述引物進行實時螢光定量PCR擴增，分析其溶解曲線的差異，若出現2條溶解曲線，表明該SNP位點是雜合型的；若出現I條溶解曲線，表明該SNP位點是純合型的。由此，可獲得不同SNPs位點在所有個體的基因型。所述步驟(2)中的引物共設計11對，其序列和退火溫度如下第一對弓丨物FCAATGGCTGACGCTGCTACRGCGCTTGTTGGAGATATCG退火溫度58 °C第二對弓I物F GTGAGCACTGGGCTGTATGRGGTATGTGTTCTTTATTATTTCGT退火溫度58 °C第三對弓丨物FACACGAAGTAACGAGCCGRGATGACCAAAGCAGCAAAA退火溫度57 °C第四對引物FCCTGTTGACTGGGAGTGTCRAATGATGCAAGCCTAGTATGA退火溫度56°C第五對引物FCAACATGTGTGACGACGAAGTRAGGATGGCGTAGGGAAGG退火溫度60°C第六對引物FGCAGCATCATCTATATTTGTTCRGCTTGTAATGTTTAGTTGGTCA退火溫度59°C第七對弓丨物F GATGAAGGTCACGAGCAGARTGATGGCTGAAGCACAATAC退火溫度58°C第八對引物FTTTAGCACCATTAGGACTGRGAGGATGACCTGGAGAAG退火溫度56°C第九對引物FTAACGCACTAACAATTCTGCTRCAACCACATTCACTCATGGA退火溫度56°C第十對引物FGAACAAGAGTTTGGCCTAGTRTCAATATCATCAGAGTTATTTTATT退火溫度52°C
第^^一對引物FCACCTACCTTCTTCCTTCCAGTRCGGGGGTTGTCAAGAGTGT退火溫度60°C本發明設計的擬穴青蟹20個SNPs分子標記可應用於擬穴青蟹遺傳變異分析、種質資源鑑定與保護及遺傳連鎖圖譜的構建等方面。有益.效果(I)本發明的檢測方法具有實驗周期短、成本低、操作簡單等優點，能夠準確地檢測出擬穴青蟹不同個體的基因型，從而為擬穴青蟹分子遺傳學及分子輔助育種研究提供新型遺傳標·記；(2)本發明提供的20個SNPs分子標記可應用於擬穴青蟹遺傳變異分析、種質資源評估與保護及遺傳連鎖圖譜構建等領域。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例11、擬穴青蟹基因組DNA序列的獲得本實驗室前期開展了擬穴青蟹轉錄組測序研究，本發明從中隨機挑選不同的測序序列作為篩選SNPs的目標序列。2、序列測序與候選SNPs鑑定對上述挑選的序列設計PCR引物，產物的預期大小在500bp、00bp之間。以5個不同個體的DNA為模板，進行PCR擴增。將結果清晰、產量高、無非特異擴增的PCR產物送測序公司進行雙向、直接測序。對測序結果進行拼接、比對，鑑定候選SNPs位點。3、SNPs驗證與基因分型針對每一個候選SNPs位點設計3條引物，包括2條等位基因特異的上遊引物(Fl和F2)和I條通用的下遊引物(R)。2條上遊引物分別以SNP位點的2個不同的鹼基作為引物的3』末端，並且在5』端分別加上長度不同的人工序列(GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC)。以擬穴青蟹I個野生群體共30隻個體的基因組DNA為模板，採用上述引物進行實時螢光定量PCR擴增，分析其溶解曲線的差異。若出現2條溶解曲線，表明該SNP位點是雜合型的；若出現I條溶解曲線，表明該SNP位點是純合型的。由此，成功篩選到擬穴青蟹20個SNPs分子標記(表1)，並獲得了這些SNPs位點在每個個體的基因型數據。表I
權利要求
1.一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，包括(1)擬穴青蟹基因組DNA序列的獲取；(2)對所獲得的DNA序列設計引物，並在擬穴青蟹多個個體中進行PCR擴增，對擴增產物進行序列測定，再比較分析不同個體間序列差異，鑑定出候選SNPs位點；(3)針對候選SNPs位點設計等位基因特異引物，採用螢光實時定量PCR儀進行基因分型，並分析SNPs的基因型。
2.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，其特徵在於所述步驟(I)中的擬穴青蟹基因組DNA序列來源於測序獲得的基因組文庫或轉錄組文庫序列或GenBank資料庫中公開的擬穴青蟹基因組序列。
3.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，其特徵在於所述步驟(2)中的引物共設計11對，其序列和退火溫度如下第一對引物F CAATGGCTGACGCTGCTACRGCGCTTGTTGGAGATATCG退火溫度58°C ;第二對引物F GTGAGCACTGGGCTGTATGR GGTATGTGTTCTTTATTATTTCGT退火溫度58°C ;第三對引物F ACACGAAGTAACGAGCCGRGATGACCAAAGCAGCAAAA退火溫度57°C ；第四對引物F CCTGTTGACTGGGAGTGTCR AATGATGCAAGCCTAGTATGA退火溫度56°C ;第五對引物F CAACATGTGTGACGACGAAGTR AGGATGGCGTAGGGAAGG退火溫度60°C ;第六對引物F GCAGCATCATCTATATTTGTTCR GCTTGTAATGTTTAGTTGGTCA退火溫度59°C ;第七對引物F GATGAAGGTCACGAGCAGARTGATGGCTGAAGCACAATAC退火溫度58°C ;第八對引物F TTTAGCACCATTAGGACTGR GAGGATGACCTGGAGAAG退火溫度56°C ;第九對引物F TAACGCACTAACAATTCTGCTRCAACCACATTCACTCATGGA退火溫度56°C ;第十對引物F GAACAAGAGTTTGGCCTAGTRTCAATATCATCAGAGTTATTTTATT退火溫度52°C ； 第i^一對引物F CACCTACCTTCTTCCTTCCAGT RCGGGGGTTGTCAAGAGTGT 退火溫度60°C。
4.根據權利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，其特徵在於所述步驟(2)中的PCR擴增需在5 30個不存在親緣關係的個體中進行。
5.根據權利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，其特徵在於所述步驟(2)中的測序方法為PCR產物雙向直接測序。
6.根據權利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，其特徵在於所述步驟(2)中的候選SNPs的鑑定方法是通過比較分析不同個體測序峰圖，尋找不同個體在相同DNA鹼基位置上的單鹼基突變位點，即為候選SNPs。
7.根據權利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，其特徵在於所述步驟(3)中的等位基因特異引物的設計方法為每個位點設計3條引物，包括2條長度不一的上遊引物Fl和F2，且在其5』端分別連接長度不一的人工序列GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC ；1條下遊通用引物R。
8.根據權利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，其特徵在於所述步驟(3)中的SNPs位點及其等位基因特異引物序列特徵如下ScPaSNP28 F1 GCGGGCAGGGCGGCACTGGCCCACTGGTCGCF2 GCGGGCACTGGCCCACTGGCGGTRACACCAGGAAGGTCTTGTTGTCGTT ；ScPaSNP34 F1 GCGGGCAGGGCGGCCAGGTAGTGGCTGGTGAAGACATCF2 GCGGGCCAGGTAGTGGCTGGTGAAGACATTRTTGGATAGGATCACCGTCTGCTCGT ；ScPaSNP35 F1 GCGGGCAGGGCGGCAGGTCACGAGCAGACGGAGACF2 GCGGGCAGGTCACGAGCAGACGGAGATR TGGTAAATGAATTGTAATCCTCGTGCT ；ScPaSNP36 F1 GCGGGCAGGGCGGCGTGAGTGCGTCGTGTCTGGCF2 GCGGGCGTGAGTGCGTCGTGTGAGGARATGCAGATTGTATGGACTTTGACCTCC ；ScPaSNP39 F1 GCGGGCAGGGCGGCCGGTTCTATTTAATGCGTGCGF2 GCGGGCCGGTTCTATTTAATGCGTGCARCACAGTACAAAGACGTGGCCTCGAA ；ScPaSNP40 F1 GCGGGCAGGGCGGCGCCATAAGCAGCAGATAACCF2 GCGGGCAGCCATAAGCAGCAGATAATARCTTTGGTAGTCAGGTACTGCCTAAGTCA ；ScPaSNP41 F1 GCGGGCAGGGCGGCTCACCAGTGTGTGATGGCGF2 GCGGGCGTCACCAGGGTGTGATGGACRCCGACGTAGGCATCCTTCTGAC ；
全文摘要
本發明涉及一種擬穴青蟹SNPs分子標記的篩選方法，包括(1)通過測序獲得的基因組文庫或GenBank資料庫獲取擬穴青蟹基因組序列；(2)對獲取的基因組序列進行引物設計，經PCR擴增後進行測序，對不同個體的序列進行比對並鑑定候選SNPs；(3)對候選SNPs位點設計等位基因特異的引物，採用實時螢光定量PCR的溶解曲線方法對SNPs進行驗證與基因分型。本發明具有實驗周期短、成本低、操作簡單等優點，能夠準確地檢測出不同個體的基因型，從而為擬穴青蟹遺傳變異分析、種群遺傳多樣性評估及分子標記輔助育種提供新型遺傳標記。
文檔編號C12Q1/68GK103045739SQ20121055968
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者馬洪雨, 馮娜娜, 馬凌波, 馬春豔, 徐真 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所