檢測豬圓環病毒2型特異性抗體的合成肽偶聯抗原及試劑的製作方法

2023-08-07 10:12:01 1

專利名稱：：檢測豬圓環病毒2型特異性抗體的合成肽偶聯抗原及試劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及動物檢疫，尤其涉及一種豬圓環病毒2型的合成肽偶聯抗原製備，以及基於合成肽偶聯抗原的豬圓環病毒2型抗體檢測方法和檢測試劑。
背景技術：
：豬圓環病毒2型(PCV2)是新近發現的一種圓環病毒，可導致斷奶仔豬多系統衰竭症候群(PMWS)。世界許多國家都有該病發生，近幾年我國也有該病流行。PMWS主要侵害68周齡的仔豬，發病率一般為10%20%，病死率高達50%100%，並能造成免疫抑制降低抗病力，給養豬業帶來了嚴重的經濟損失。成年豬一般為隱性感染，不表現任何症狀，但可以傳染給仔豬。目前，針對該病尚未開發出商品化的疫苗，通過檢疫排除感染豬是最有效的防控措施。因此，建立一種準確、快速檢測PCV2感染的方法，是當前該病防控工作中急待解決的問題。豬圓環病毒包括兩種血清型PCV1和PCV2。豬群中PCV1感染非常普遍(尤其是在我國)，感染率遠超過PCV2，雖不引起發病，但會交叉幹擾PCV2感染的檢測。免疫學試驗表明，PCV1病毒與PCV2病毒有明顯的交叉反應。因此，檢測PCV2感染的關鍵技術在於如何儘可能地排除PCV1的幹擾。研究表明，PCV2基因組有兩個主要閱讀框0RF1和0RF2。0RF1編碼與病毒複製有關的R印蛋白，0RF2編碼的結構蛋白Cap蛋白是病毒的主要免疫原性物質，並含有型特異性的抗原表位，這些表位在Cap蛋白65位87位，113位139位和193位207位胺基酸區域內。因此，0RF2編碼的C即蛋白最有希望用於PCV2抗體的特異性檢測。但是，國內外研究表明，PCV1和PCV2的Cap蛋白的胺基酸序列同源性為62X，兩者的部分抗原表位相同。此前，國內外運用基因工程技術獲得的重組表達PCV2C印蛋白，可以檢測出PCV2抗體，但未見重組PCV2Cap蛋白與PCVl抗體的交叉試驗數據。實際應用表明，用這種表達蛋白作為抗原來檢測PCV2抗體，其結果與豬群實際發病情況及病原學診斷結果往往出現較大差異，存在較多的假陽性結果。申請人研究發現，重組表達的PCV2Cap蛋白(包括截短的Cap蛋白及以此開發的試劑盒)，與PCV1抗體有明顯的交叉反應，因此，檢測結果會受到PCV1的幹擾。這是由於重組表達的PCV2C即蛋白肽鏈較長(長度一般在30個胺基酸以上)，其中包含與PCV1相似的抗原表位。為了尋找更為特異的PCV2抗體檢測方法，儘量排除普遍存在的PCV1抗體的交叉幹擾，申請人針對我國流行的PCV2毒株的Cap蛋白胺基酸序列，採用人工合成肽技術，合成了多條備選的短肽(長度在20個胺基酸以下)，並與KLH血蘭素蛋白偶聯，製成大分子偶聯抗原;採用PCV1和PCV2分別感染實驗豬，製備了可靠的PCV1血清抗體和PCV2血清抗體；在此基礎上，用ELISA方法篩選出型特異好、反應活性優良的合成肽偶聯抗原PCV2-Mix;用PCV2-Mix抗原研製成檢測PCV2抗體的ELISA試劑盒和免疫微球快速檢測試劑。原有的重組表達PCV2Cap蛋白抗原及基於重組抗原的PCV2抗體檢測試劑，存在以下技術缺陷1、重組表達的PCV2Cap蛋白抗原與PCVl抗體存在交叉反應，因此，用重組抗原檢測PCV2抗體，會受到普遍存在的PCV1感染的影響，出現大量的假陽性結果；2、重組的PCV2Cap蛋白抗原含有表達系統的細胞等雜質成份，遠不如合成肽抗原純淨，容易出現非特異性反應，需要用較高的提純工藝來降低非特異反應。3、表達的重組PCV2Cap蛋白抗原，批次之間質量的穩定性受多種因素影響，不易控制，不如用儀器自動化生產的合成肽抗原的質量均一。因此，採用經篩選獲得的人工合成短肽，製備合成肽偶聯抗原，研製高度特異的PCV2抗體檢測試劑，具有良好的應用前景。
發明內容本發明所解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種能特異性地檢測豬圓環病毒2型抗體的合成肽偶聯抗原(命名為PCV2-Mix)以及使用該抗原製成的ELISA試劑盒和免疫微球快速檢測試劑，其特異性優於常見的重組表達PCV2Cap蛋白抗原及其試劑盒。本發明提供的合成肽偶聯抗原PCV2-Mix包含以下胺基酸序列或其截短序列的多肽，以及載體蛋白。SEQIDN0:1:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDN0:2:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDN0:3:AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerSEQIDN0:4:SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeVal進一步地，載體蛋白優選KLH血蘭素蛋白。本發明提供的檢測豬圓環病毒2型抗體的ELISA試劑盒，其中包含合成肽偶聯抗原PCV2-Mix包被的ELISA反應板，進一步地包括ELISA試劑盒常用的其他組分如樣品稀釋液、酶結合物、洗滌液、底物溶液和終止液。本發明提供的檢測豬圓環病毒2型抗體的免疫微球快速檢測試劑，其中包含合成肽偶聯抗原PCV2-Mix和微球顆粒(可以是金屬顆粒、塑膠微粒)，進一步包括免疫學試劑常用的其他組分如樣品稀釋液、纖維素膜等組分。本申請還提供一種製備豬圓環病毒2型合成肽偶聯抗原PCV2-Mix的方法。本申請還涉及上述合成肽偶聯抗原在製備檢測豬圓環病毒2型感染的試劑盒中的應用。本申請還涉及上述合成肽偶聯抗原在製備檢測豬圓環病毒2型感染的免疫微球凝集試劑中的應用。本申請還涉及上述合成肽偶聯抗原在製備檢測豬圓環病毒2型感染的免疫微球快速檢測試紙條中的應用。本發明是通過以下技術途徑實現的一、所用材料和試劑1、兔抗豬酶標抗體辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗豬IgQ，購自Sigma公司；2、ELISA板96孔聚苯乙烯微量反應板，購自廈門怡新美公司；3、膠體金按《現代免疫學實驗技術》第二版(湖北科學技術出版社，2002年1月)所述方法製備；4、塑膠微粒直徑約l陶的聚苯乙烯膠乳微粒，見《現代免疫學實驗技術》第二版。二、短肽合成參考國內外檢測到的PCV-20RF2的基因序列，推導0RF2的胺基酸序列，並用計算機輔助分析其主要抗原表位，設計多肽的胺基酸序列。多肽採用FMOC固相合成法，參見《現代免疫學實驗技術》第二版和《多肽的固相合成法研究進展》(安徽農業科學，2006年22期)，由多肽合成儀自動完成。其合成過程包括(1)胺基酸活化；(2)去F-nioc保護反應；(3)肽鏈合成反應；(4)純化；(5)與固相載體分離；(6)凍幹保存。三、製備偶聯抗原採用戊二醛偶聯法製備偶聯抗原(參見《現代免疫學實驗技術》第二版)。取載體蛋白和多肽，共同溶解在硼酸溶液中，加入戊二醛溶液混合後反應2h，再加甘氨酸溶液封閉未反應的戊二醛，然後用硼酸透析純化。四、篩選偶聯抗原用PCV1、PCV2標準毒株分別感染SPF試驗豬，在感染後0、7、14、21、35、49天採集豬血清,作為評價用血清。將製備的所有偶聯抗原，包被在ELISA板上，分別與PCV1、PCV2感染豬血清反應，用兔抗豬酶標抗體和TMB(四甲基聯苯胺)底物進行檢測，篩選出4個反應活性較好、能明確區分PCV1、PCV2感染的偶聯抗原。將篩選出的偶聯抗原按等體積混合，獲得偶聯抗原PCV2-Mix。五、製備ELISA試劑盒將偶聯抗原PCV2-Mix包被ELISA板，並用兔抗豬酶標抗體作為第二抗體，經方陣試驗優ELISA反應體系，建立了檢測PCV-2抗體的間接ELISA方法。用該方法檢測PCV-1和PCV-2人工感染豬，測定抗體消長曲線，結果表明，與基因工程表達的抗原介導的ELISA相比，該合成肽抗原ELISA方法能特異地檢測PCV-2血清抗體，與PCV-1陽性血清無交叉反應，可用於兩者的鑑別檢測。將配製好的ELISA反應試劑，包括合成肽偶聯抗原PCV2-Mix包被的ELISA反應板，以及ELISA試劑盒常用的其他組分樣品稀釋液、酶結合物、洗滌液、底物溶液和終止液按一定的規格分裝、包裝，加入說明書，組裝成試劑盒。六、製備免疫微球快速檢測試劑方法l製備免疫微球凝集試劑將PCV2-Mix包被到膠體金或塑膠微粒表面，在緩衝液中製成均勻的懸液。該懸液可以作為凝集抗原試劑，與被檢血清混合後，通過觀察懸液中是否產生凝集塊，判定血清中是否存在PCV2抗體。該試劑可與PCV2陰性、陽性對照血清配套使用。方法2製備免疫微球快速檢測試紙條製備結合物墊將PCV2-Mix包被到膠體金或塑膠微粒表面，在緩衝液中製成均勻的懸液，將標記好的膠體金結合物均勻地噴在條狀的玻璃纖維膜上，冷凍乾燥。噴制檢測膜在同一塊硝酸纖維膜上，用Bio-dotXYZ3000噴膜機將稀釋好的兔抗豬IgG噴成檢測線(T帶)，在間隔210mm處，平行地噴上PCV2抗體作為質控線(C帶)。放於溫箱內乾燥，取出後密封保存備用。組裝試紙條將樣品吸收墊(玻璃纖維膜)、結合物墊、噴有檢測線(T帶)和對照線(C帶)的硝酸纖維素膜、吸收墊(吸水紙)依次粘貼在PVC底板(PVC等硬質薄板)上，用Bio-dot切割機將組裝好的試紙切成36mrn寬的試紙條，裝入有乾燥劑的鋁箔袋內，密封，室溫保存。七、PCV2抗體檢測方法方法lELISA檢測方法取豬全血樣品，按常規方法分離血清，在稀釋板上稀釋待檢血清。分別在ELISA板相應孔中加入陽性對照血清、陰性對照血清、稀釋好的待檢豬血清。置2038。C孵育3060分鐘；棄去各孔中液體，洗滌；每孔加入酶結合物液100uL，貼上封板膜，置2038t;孵育3060分鐘；棄去各孔中液體，洗滌；每孔加入底物液A50100uL，再加入底物液B50100uL，置2038。C避光顯色1015分鐘；每孔加入終止液50100uL，用酶標儀測定各孔的吸光度值，根據吸光度值判定結果。方法2免疫微球凝集試驗取豬全血樣品，按常規方法分離血清。取凝集抗原一滴、被檢血清一滴，充分混合後，在20分鐘內觀察懸液中是否產生凝集塊。出現肉眼可見的凝集塊，判定血清中存在PCV2抗體，說明豬被PCV2感染；否則，判定血清中不存在PCV2抗體，說明豬未被感染或在急性感染期。方法3快速檢測試紙條取豬全血樣品，按常規方法分離血清。取被檢血清一滴，滴在試紙條的樣品吸收墊上，在20分鐘內觀察紙條上是否同時出現檢測線和對照線。同時出現檢測線和對照線，判定血清中存在PCV2抗體，說明豬被PCV2感染；僅出現對照線，判定血清中不存在PCV2抗體，說明豬未被感染或在急性感染期；對照線未出現，判定試驗失敗，可能是試劑失效。下列實施方式僅用於舉例說明本發明的目的，但不構成對本發明的限制。附圖1試紙條組裝方式示意圖。具體實施方式實施例1備選短肽合成參考國內外檢測到的PCV-20RF2的基因序列，推導0RF2的一級結構胺基酸序列，並用計算機輔助分析其主要抗原表位，設計一系列的多肽胺基酸序列。包括SEQIDNO:5SEQIDNO:26.SEQIDNO:5:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:6:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnA印pHeValProProGlyGlyGlyThrSEQIDNO:7:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlySEQIDNO:8:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuSEQIDNO:9:TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnSEQIDNO:10:AspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:11:ArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:12:lieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO:13:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaSEQIDNO:14:AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSEQIDNO:15:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrSEQIDNO:16:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnSEQIDNO:17:AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuSEQIDNO:18:ValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:19:SerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:20:lieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO:21:ArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaSEQIDNO:22:GlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysSEQIDNO:23:ValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrSEQIDNO:24:GlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValSEQIDNO:25:SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValSEQIDNO:26:GlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHe多肽採用F-moc固相合成法，由多肽合成儀自動完成，其合成過程如下1、胺基酸活化胺基酸與1-羥基苯並三唑(簡稱HOBT)合成胺基酸-HOBT酉旨。2、去保護反應用哌啶清洗胺基酸-OBTE酯數次，以除去F-moc保護基。用二氮己環(醒P)清洗，除去殘餘的哌啶。3、合成反應啟動多肽合成儀自動合成程序，儀器自動加入活化的胺基酸與二異丙基碳二亞膠至反應器中，合成的過程是由C端開始至N端，依照上述序列不斷地重複合成步驟。反應完成後，用醒P清洗，以除去殘餘的胺基酸。4、純化加入2.5%乙醯咪唑，對未合成的肽鏈進行乙醯化處理，終止多餘的肽鏈生成，並使肽鏈純化。用NMP清洗，除去剩餘的乙醯咪唑。按步驟2的方法，除去多肽胺基酸端的F-moc保護基。用隨P洗滌固相板，乾燥備用。5、多肽與固相載體分離反應配製含90%三氟乙酸(TFA)、4%異硫氨酸丙酯、5%苯酚和1%去離子水的反應溶液。將乾燥的肽一樹脂放入玻璃燒杯內。將反應溶液緩慢加入燒杯內，勻速攪拌。將燒杯置O'C下反應10分鐘，反應結束後取出，置室溫下，使其逐漸恢復至室溫(2025°C)。用分液漏鬥將TFA/肽混合物從樹脂中萃取出來。利用真空揮發技術將TFA及其餘保護試劑分離除去。將所有成分移至漏鬥內，用叔丁基甲醚及二乙醚洗滌肽，以除去保護劑及其它雜質。6、凍幹及保存將多肽在真空乾燥機中冷凍乾燥3日，形成凍幹品，-2(TC保存。用此方法，共合成22條短肽。實施例2偶聯抗原製備採用戊二醛偶聯法製備偶聯抗原，具體方法如下-1、取載體蛋白10mg，以0.lmol/LpH10的硼酸溶液充分溶解，加入多肽15mg混勻；2、邊振蕩邊加新鮮配製的0.3%(V/V)戊二酸溶液,室溫作用2h，倒轉試管數次；3、加lmol/L甘氨酸，以封閉未反應的戊二醛，繼續反應30min;4、0.lmol/LpH8.5的硼酸透析過夜，換透析液，繼續透析4h，-20。C保存備用。用此方法，將實施例1的22個多肽製備成22個偶聯抗原備選。實施例3篩選和製備PCV2-Mix偶聯抗原陽性血清製備取PCV抗原及抗體陰性的SPF試驗豬10頭，分成5頭/組，各組分別隔離飼養。用PCV1、PCV2標準毒株分別感染一組豬(5頭)，在感染後0、7、14、21、35、49天採集豬血清，作為評價抗原用的血清。用ELISA試驗方法篩選抗原用PH9.6的碳酸鹽緩衝液，將備選的偶聯抗原稀釋成5Pg/mL，分別包被ELISA板，25X:過夜反應。將不同時間採集的豬血清,用含2%BSA的PBST(0.02mol/L,PH7.2)稀釋5倍，按每孔加入IOO化的量，分別加入到各種ELISA抗原板中，37。C反應60分鐘。PBST洗板5次。用含2%BSA的PBST按1:10000稀釋兔抗豬酶標抗體，每孔加入IOO叱,37°C反應60分鐘。PBST洗板5次。每孔加入TMB底物IOOML，37。C顯色反應15分鐘。每孔加入50叱2mol/L^04終止反應。結果篩選出4個反應活性較好、能明確區分PCV1、PCV2感染的偶聯抗原(PC1、PC9、PC10、PC21)。將篩選出的偶聯抗原按等體積混合，獲得偶聯抗原PCV2-Mix。篩選出4個偶聯抗原檢測5頭PCV1感染豬的血清，結果均為陰性；檢測PCV2感染豬的血清結果見表l:表14個偶聯抗原在感染後不同時間對PCV2抗體的檢出比例tableseeoriginaldocumentpage9ProGlyGlyGlySerPC90/51/52/54/55/55/5AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrPC100/51/53/53/54/54/5AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerPC210/51/52/53/55/55/5SerSerAlsVallieLeuAspAspAsnpHeVal實施例4用偶聯抗原PCV2-Mix製備ELISA試劑盒1、建立ELISA方法將偶聯抗原PCV2-Mix包被微量反應板，並用兔抗豬酶標抗體作為第二抗體，經ELISA方陣試驗，優選ELISA反應體系，建立了檢測PCV_2抗體的間接ELISA方法。確定的ELISA反應體系如下PCV2-Mix抗原板製備方法用PH9.6的碳酸鹽緩衝液，將PCV2-Mix抗原稀釋成5Pg/mL，按lOO^L/孔的量包被ELISA板，在室溫下(2030°C)過夜反應。用含2%BSA的PBST(0.02mol/L,PH7.2)在室溫下(2030°C)過夜封閉。棄去ELISA板中的封閉液，PBST洗滌一次，室溫下充分晾乾，裝入鋁箔袋，密封保存。ELISA反應條件將被檢豬血清用樣品稀釋液作5倍稀釋，按100化/孔的量，分別加入到PCV2-Mix抗原板中，同時設立PCV2陰性和PCV2陽性豬血清對照孔，37。C反應30分鐘。PBST洗板5次。按100A/孔加入兔抗豬酶標抗體溶液，37'C反應30分鐘。PBST洗板5次。每孔加入TMB底物A溶液和B溶液各50A，37'C顯色反應15分鐘。每孔加入終止液50化。在酶標儀上，測定ELISA板孔的0D450nm值。判定結果被檢樣品0D450值<陽性對照孔OD450nm值XO.25，為PCV-2抗體陰性；樣品OD450值》陽性對照孔OD450nm值XO.25，為PCV-2抗體陽性。2、溶液配製PCV2陰性豬血清無菌採集SPF豬的血液，分離血清，56。C滅活30分鐘。用0.2pm濾膜濾過，無菌分裝，每瓶1.2mL;PCV2陽性豬血清取感染後1428天的5頭豬的血清等體積混合均勻，進行系列稀釋後用ELISA方法檢測，選擇0D450nm值在1.5左右的稀釋度，用0.2pm濾膜過濾，無菌分裝，每瓶1.2mL;樣品稀釋液0.02mol/L,PH7.2PBST含2%BSA，加入萬分之一疊氮鈉，分裝成每瓶15mL;20倍PBST濃縮洗滌液的製備稱取Na2HP04358.1g，KH2P0424.5g，NaCl818.2g，KC120.1g，硫柳汞5g，加入4000mL去離子水，用磁力攪拌器混合，使其充分溶解，加入100mLTween20，再加水定容至5000mL用，分裝成每瓶30.0mL。使用時稀釋20倍。兔抗豬酶標抗體溶液用0.02mol/L,PH7.2PBST含2%BSA的溶液，按1:10000稀釋兔抗豬酶標抗體(Sigma公司產品)，加入萬分之一疊氮鈉，分裝成每瓶12mL;TMB底物A溶液往容器內依次加入1000mL甲醇和5g3，3'，5，5'-四甲基聯苯膠(TMB)，混合均勻，分裝成每瓶8.0mL;TMB底物B溶液往容器內加入600mL的無菌去離子水，持續攪拌的同時，加入16.7g醋酸鈉、2g檸檬酸和3.4g過氧化脲，混合溶解後，用去離子水定容至1000mL，分裝成每瓶8.0mL;終止液用去離子水將硫酸稀釋成2mol/L，分裝成每瓶8.0mL。3、組裝ELISA試劑盒將配製好的ELISA反應試劑各組分，按表2組裝成試劑盒。組裝試劑盒的環境必須潔淨無塵，室溫應低於25t:，組裝好的試劑盒應及時放入4'C冰庫保存。tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12實施例5製備免疫微球(膠體金)凝集試劑將PCV2-Mix包被到膠體金微粒表面，在緩衝液中製成均勻的懸液。具體方法為取2ml的WHAuC14溶液加熱沸騰，加入2.5ml的1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續加熱5min，冷卻後於4'C保存備用。按2ixl/ml的量加入0.2mol/LK2C03，攪拌10min。用0.01MpH7.4PBS稀釋PCV2-Mix多肽抗原，按3.75ug/ml的量加入膠體金溶液中，繼續攪拌30min。按5u1/ml的量加入20%BSA水溶液，攪拌5min;按10"1/ml加入腦PEG20000水溶液，攪拌5min，4"C靜置過夜。以17000rpm離心20min，再用懸浮液(含5%BSA、5%PVP40的PBST溶液)懸浮至原體積的1/2。該懸液可以作為凝集抗原試劑，與被檢血清混合後，通過觀察懸液中是否產生凝集塊，判定血清中是否存在PCV2抗體。該試劑可與PCV2陰性、陽性對照血清配套使用。以塑膠顆粒為載體時，按《現代免疫學實驗技術》(第二版)，採用常規的EDCI法將PCV2-Mix多肽抗原與塑膠顆粒連接，用懸浮液(含5%BSA、5%PVP40的PBST溶液)製成懸液。實施例6製備免疫微球(膠體金)快速檢測試紙條製備結合物墊將PCV2-Mix包被到膠體金微粒表面，在緩衝液中製成均勻的懸液，將標記好的膠體金結合物均勻地噴在條狀的玻璃纖維膜上，冷凍乾燥。噴制檢測膜在同一塊硝酸纖維膜上，用Bio-dotXYZ3000噴膜機將稀釋好的兔抗豬IgG噴成檢測線，在間隔37mm處，平行地噴上PCV2抗體作為質控線。放於溫箱內乾燥，取出後密封保存備用。組裝試紙條按圖1所示的方式，將樣品吸收墊(玻璃纖維膜)、結合物墊、噴有檢測線(T帶)和對照線(C帶)的硝酸纖維素膜、吸收墊(吸水紙)依次粘貼在PVC底板(PVC等硬質薄板)上，用Bio-dot切割機將組裝好的試紙切成36m寬的試紙條，裝入有乾燥劑的鋁箔袋內，密封，室溫保存。實施例7合成肽偶聯試劑與市售重組抗原試劑的應用效果比較1.被檢血清採用實施實例3中製備的，PCV1、PCV2標準毒株分別感染5頭豬、在其後0、7、14、21、35、49天採集的豬血清，作為被檢血清。2.試劑偶聯抗原PCV2-Mix製備的ELISA試劑盒、免疫膠體金凝集試劑、免疫膠體金快速檢測試紙條；市售重組表達PCV2C即蛋白抗原製備的ELISA試劑盒。3.檢測方法(1)用偶聯抗原PCV2-Mix製備的ELISA試劑盒來檢測洗滌液配製使用前將20倍PBST濃縮洗滌液恢復至室溫，並搖動使沉澱的鹽溶解，然後用去離子水或雙蒸水作20倍稀釋。洗滌工作液應在配製後儘快使用，在28"C下可保存2d，再次使用時應恢復到室溫。樣品稀釋取出試劑盒中提供的樣品稀釋板，在稀釋板孔中按1:5的體積比稀釋待檢血清(120uL樣品稀釋液+30uL待檢血清)和對照豬血清。操作步驟①剪開抗原反應板的包裝袋，取出PCV2-Mix抗原板，在記錄表上記錄陽性對照、陰性對照和樣品的位置。②別在相應孔中加入PCV2陰性豬血清對照(2孔)原液和PCV2陽性豬血清對照(2孔)、稀釋好的待檢血清各100iiL。充分混勻後，貼上封板膜，置37D孵育30分鐘。③小心揭掉封板膜，棄去各孔中液體、拍淨。每孔加滿洗滌液，靜置約30秒，重複洗滌5次，最後在吸水紙上拍淨。④每孔加入兔抗豬酶標抗體100uL，貼上封板膜，置37'C，孵育30分鐘；⑤重複步驟③。(D每孔加入TMB底物A溶液50uL，再加入TMB底物B溶液50uL，輕振混勻，置37'C避光顯色15分鐘。⑦每孔加入終止液50uL,輕振混勻，立即置酶標儀450nm波長處測定各孔A450nm值(注意加終止液後應在15分鐘內讀取A450nm值)。判定結果a.試驗結果同時符合下列條件，方為有效①兩孔陰性對照A450nm平均值應<0.15;②每孔陽性對照A450nm值均》0.60;b.臨界值的計算臨界值=陽性對照孔A450nm均值XO.25c.結果判定①被檢樣品A450nm值<臨界值，判為PCV-2抗體陰性；②樣品A450nm值》臨界值，判為PCV-2抗體陽性。(2)用免疫膠體金凝集試劑檢測操作方法用一次性塑料吸管，吸取凝集抗原一滴(約30uL)、被檢血清一滴(約30uL)，用一次性牙籤在玻片上攪拌，充分混合，在20分鐘內觀察懸液中是否產生凝集塊。同時設陰性、陽性血清對照。判定方法當陰性、陽性血清對照成立，樣品出現肉眼可見的凝集塊，判定血清中存在PCV2抗體，說明豬被PCV2感染；否則，判定血清中不存在PCV2抗體，說明豬未被感染或處在急性感染期。(3)用免疫膠體金快速檢測試紙條檢測操作方法用一次性塑料吸管，吸取被檢血清一滴(約100UL)，滴在試紙條的樣品吸收墊上，在20分鐘內觀察紙條上是否同時出現檢測線和對照線。判定方法同時出現檢測線和對照線，判定血清中存在PCV2抗體，說明豬被PCV2感染；僅出現對照線，判定血清中不存在PCV2抗體，說明豬未被感染或處在急性感染期；未出現對照線，判定試驗失敗，可能是試劑失效。(4)用市售重組表達PCV2Cap蛋白抗原製備的ELISA試劑盒檢測市售ELISA試劑盒購自北京測迪生物技術公司，按試劑盒的說明書操作、判定結果。4.檢測結果四種試劑盒對PCV1、PCV2感染豬的檢測結果見表3、表4。特異性比較從對PCV1、PCV2感染豬的檢測結果來看，市售重組表達PCV2C邵蛋白抗原製備的ELISA試劑盒，能檢出PCV1、PCV2感染，因此與PCV1存在交叉反應；偶聯抗原PCV2-Mix製備的ELISA試劑盒、免疫膠體金凝集試劑、免疫膠體金快速檢測試紙條僅能檢出PCV2感染，因此特異性較好。敏感性比較從PCV2感染後不同時間的檢出結果來看，重組表達PCV2C鄰蛋白抗原製備的ELISA試劑盒與偶聯抗原PCV2-Mix製備的ELISA試劑盒敏感性相似；免疫膠體金凝集試劑、免疫膠體金快速檢測試紙條的檢出時間較晚，因此敏感性較低。但後者具有操作簡單、適合在現場操作的優點。表3各種試劑盒在PCV1感染後不同吋間的檢出情況tableseeoriginaldocumentpage14tableseeoriginaldocumentpage15〈110〉中國動物疫病預防控制中心〈120〉一種檢測豬圓環病毒2型特異性抗體的合成肽偶聯抗原及試劑〈160〉4〈170〉PatentInVersion3.0〈210〉1〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉1TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnlieAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySer〈210〉2〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉2AspArgGlyValGlySerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThr〈210〉2〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉3AspArgGlyValGlySerThrAlaVallieLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSer〈210〉2〈211〉11〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉4SerSerAlaVallieLeuAspAspAsnpHeVal權利要求1、一種豬圓環病毒2型的合成肽偶聯抗原，包含載體蛋白和以下胺基酸序列或其截短序列的多肽SEQIDNO1TrpAlaValAspMetMetArgpHeAsnIleAsnAsppHeLeuProProGlyGlyGlySerSEQIDNO2AspArgGlyValGlySerSerAlaValIleLeuAspAspAsnpHeValThrLysAlaThrSEQIDNO3AspArgGlyValGlySerThrAlaValIleLeuAspAspAsnpHepHeProLysAlaSerSEQIDNO4SerSerAlaValIleLeuAspAspAsnpHeVal。2.如權利要求1所述的豬圓環病毒2型的合成肽偶聯抗原，其特徵在於所述載體蛋白是KLH血蘭素蛋白。3、一種檢測豬圓環病毒2型抗體的ELISA試劑盒，其中包含權利要求l所述的合成肽偶聯抗原包被的ELISA反應板。4、一種豬圓環病毒2型抗體的免疫微球快速檢測試劑，其中包含權利要求l所述的合成肽偶聯抗原和微球顆粒，優選微球顆粒是膠體金顆粒或塑膠微粒。5.如權利要求4所述的豬圓環病毒2型抗體的免疫微球快速檢測試劑，其特徵在於包括免疫微球凝集試劑或免疫微球快速檢測試紙條。6.如權利要求1所述的豬圓環病毒2型的合成肽偶聯抗原的製備方法，包括(1)按照SEQIDNO:1SEQIDNO:4的胺基酸序列，採用F-moc固相合成法分別合成四條多肽；(2)採用戊二醛偶聯法，將這四條多肽分別與載體蛋白連接，形成四種偶聯抗原；(3)將這四種偶聯抗原按等體積混合，獲得豬圓環病毒2型的合成肽偶聯抗原。7、如權利要求1或2所述的豬圓環病毒2型的合成肽偶聯抗原在製備檢測豬圓環病毒2型感染試劑盒中的用途。8.如權利要求1或2所述的豬圓環病毒2型的合成肽偶聯抗原在製備檢測豬圓環病毒2型感染免疫微球快速檢測試劑中的用途。全文摘要本申請涉及一種豬圓環病毒2型的合成肽偶聯抗原，以及用合成肽偶聯抗原研製的ELISA試劑盒和免疫微球檢測試劑，用於特異性地檢測豬圓環病毒2型抗體。文檔編號G01N33/569GK101357945SQ200810118570公開日2009年2月4日申請日期2008年8月19日優先權日2008年8月19日發明者振曹,王傳彬,田克恭,萍金,陳西釗申請人:中國動物疫病預防控制中心