肽的高效生產的製作方法

2023-07-08 09:08:11 2

專利名稱：：肽的高效生產的製作方法
技術領域：
：本發明涉及肽的生產方法及由此生產的肽。與現有技術方法生產肽相比，根據本發明生產肽可以更高效。本發明的生產方法具有產率、純度和/或價格上的優勢。還公開了營銷肽的方法。
背景技術：
：肽在基礎研究及臨床實踐中變得越來越有用。對肽的興趣可歸因於它們在許多生物途徑中作為介質的作用以及它們獨特的固有性質。例如，許多肽對於其靶標具有高度特異性，而與非靶標分子的非特異性結合低，因而藥物-藥物相互作用最小化，而且許多肽顯示隨時間推移在組織中的積累很少，因而減少了副作用。而且，肽通常在體內分解為構成它們的胺基酸，從而減少了有毒代謝中間產物帶來的併發症的危險。肽的市場價值在生命科學領域通常可歸為五大類細胞因子、酶、激素、單克隆抗體和疫苗。根據2008年的Frost&SulIivan市場調查報告,這些大類在美國可進一步細分為疫苗(34%)、單克隆抗體(30%)、重組激素和蛋白質(10%)、基因治療(6%)、細胞治療(4%)、反義(3%)、幹擾素(3%)、白介素(2%)、生長因子(1%)以及其它(7%)。這些類別的每一項都保持高速增長。例如，從2004年至2007年，僅單克隆抗體市場一項其收益就幾乎翻倍，從63億美元增加至126億美元。另外，幾項新產品，包括Bydureon(艾塞那肽LAR,用於治療糖尿病；Amylin/EliLilly)、Extavia(幹擾素運-lb,用於治療多發性硬化症；Novartis)以及Simponi(戈利木單抗,用於治療類風溼和銀屑病關節炎；Centocor),最近已被FDA批准。此外，肽市場很有可能會繼續增長。例如，在2008年開發的633種藥物中，幾乎一半是肽。分析師估計未來五年的混合年增長率為百分之八，使得2013年的收益可能達到200億美元，這幾乎佔了預測的生物醫藥市場總收益的百分之十五。肽作為基礎研究及診斷平臺的試劑也存在更多的機會。雖然肽科學領域的進步已經導致了令人矚目的商業增長，但仍有幾項障礙需要克月艮。例如，與傳統小分子治療劑相比，肽常常具有遞送和穩定性的問題。為解決這些問題，嘗試了包括經口、經鼻及肺部的遞送。然而，這些嘗試通常需要更高的肽劑量或者會產生不希望的藥物代謝動力學特徵。增加肽應用的一個最大的障礙是肽本身的成本，它通常比生產小分子治療劑的成本高的多。例如，NutropinAQ是由Genentech生產的一種形式的重組人生長激素，用來給予青春期生長缺陷的患者，其花費為每年30，000美元。當肽用於研究目的時，高價格成為獲得肽的更大障礙。例如，￠-澱粉樣蛋白(1-42)肽是一種研究用肽，它與阿爾茨海默病的發病強烈相關。一項對各個肽生產商的價格調查表明，研究級別的￠-澱粉樣蛋白(1~42)的價格區間從$225/mg(21stCenturyBiochemicals)至$1,490/mg(Sigma-Aldrich)，其中普遍價格為$300-$320/mg(AnaSpec,CaliforniaPeptide,Innovagen,rPeptide)(2009年估計價格取自商品目錄)。由於肽的重要性及其高價格，一直以來都存在期盼已久但尚未滿足的降低肽成本的需要。肽的工業及醫藥應用產生了對改進生產及純化手段的需要，這些改進可以是效率、價格和/或產品質量的改進。因此，本發明涉及肽的生產方法，以及生產的肽。也公開了營銷肽的方法。
發明內容在多個實施方案中，本發明涉及生產目標肽的方法。根據本發明的方法，生產包含親和標記物、可裂解標記物和目標肽的融合肽，其後，該融合肽與親和材料結合，裂解該融合肽以釋放出目標肽；從親和材料上移除目標肽。通常，在融合肽與親和材料結合後，洗滌親和材料以去除未結合的物質。此外，在從親和材料上移除目標肽之後，目標肽可進一步修飾或包裝以供分發。對目標肽沒有限制，可包括多種肽。例如，在多個實施方案中，所述目標肽選自由澱粉樣蛋白P、降鈣素、恩夫韋肽、依泊汀、依泊汀S、紅細胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖腦苷脂酶、胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長激素(hGH)、胰島素、胰島素A、胰島素B、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、幹擾素、利拉魯肽、促生長素抑制素、特立帕肽和組織纖溶酶原激活物(TPA)組成的組。在多個實施方案中，目標肽選自澱粉樣蛋白P、恩夫韋肽、艾塞納肽、胰島素和特立帕肽。融合肽可通過多種方法生產。在一個實施方案中，該融合肽在細菌表達系統例如大腸桿菌表達系統中產生。在替代實施方案中，表達系統是酵母表達系統或哺乳動物表達系統。在多個實施方案中，根據本發明的融合肽進一步含有包涵體指引肽。在這樣的實施方案中，在融合肽與親和材料結合之前，可通過將包涵體與表達系統中細胞的其餘部分分離而從表達系統中分離該融合肽。在最初的分離之後，可溶解融合肽以便進一步處理。在多個實施方案中，該包涵體指引肽選自為類固醇異構酶(ketosteroidisomerase)的包涵體指引肽、類固醇異構酶的包涵體指引功能片段、類固醇異構酶的包涵體指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵體指引功能片段、或BRCA2的包涵體指引功能同系物。在多個實施方案中，親和標記物選自由聚組氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸和聚穀氨酸組成的組。此外，可裂解標記物可選自由Trp、His-Met,Pro-Met以及非天然胺基酸組成的組。在融合肽含有一個以上的可裂解標記物時，各個可裂解標記物可以是正交的(orthogonal)，也就是說，它們對於任一特定的裂解劑有著不同的反應性。在多個實施方案中，裂解步驟由選自由NBS、NCS和Pd(H2O)4組成的組的試劑執行。根據本發明的方法還涉及評估目標肽的商業市場，包括a)根據本文描述的方法生產目標肽山)使樣品量的目標肽可無成本或以最低成本獲得；以及c)測量在一段時間內對目標肽的需求數量。除以上方法之外，本發明還涉及根據本發明生產的目標肽，尤其是純度大於99%的目標肽。另外，還涉及在根據本發明生產目標肽的表達系統中使用的載體。例如，根據本發明的載體可以包含編碼親和標記物的核苷酸序列；編碼可裂解標記物的核苷酸序列；以及編碼目標肽的核苷酸序列；其中這些核苷酸以可操作的組合排列，進一步地其中該可操作組合表達產生含有親和標記物、可裂解標記物和目標肽的融合蛋白。本發明另外的實施方案涉及包含本文所述載體的細胞以及根據本文所述方法生產的融合蛋白。本發明的各種特徵在所附權利要求書中詳細闡述。通過參考以下闡述，利用本發明原理的說明性實施方案的詳述和附圖，將獲得對本發明的特徵及優勢的更好的理解，在附圖中圖I顯示修飾形式的商業可得的pET_19b載體(pET_19bmhbl)。這樣的載體可用來生產在兩側有兩個NcoI限制酶切位點的KSI序列和在兩側有兩個XhoI限制酶切位點的組氨酸標記物-色氨酸-P-澱粉樣蛋白(1-42)序列。圖2顯示通過添加L-阿拉伯糖激活商業可得的pBAD啟動子的轉錄。阿拉伯糖與AraC(圖中為「C」)結合，並使蛋白質釋放O2位點並與緊鄰I1位點的I2位點結合。這釋放出DNA環並使得轉錄開始。第二水平的控制存在於cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP複合物中，該複合物與DNA結合併刺激AraC與I1和I2的結合。基礎表達水平可通過向生長培養基中引入葡萄糖來抑制，這降低了cAMP水平並因此降低了CAP的結合，從而降低了轉錄激活。圖3顯示在誘導前及誘導後2、4、6和16小時，從細胞培養物中採集的樣品的凝膠電泳的典型數據。當誘導培養物並生長過夜時發生最佳的融合蛋白合成。圖4A-D顯示類固醇異構酶的胺基酸序列的四個實施方案。圖5顯示類固醇異構酶的核酸序列的一個實施方案。圖6顯示通過對用高功率超聲處理裂解的細胞進行凝膠電泳來製備包涵體的各階段的典型數據。裂解的物質用一系列含有不同濃度的Tris、NaCl、PMSF、Triton-XlOO和尿素的緩衝液洗滌並收集上清液。21kD帶在連續步驟過程中消失及21kD帶在溶解包涵體後重現(泳道10)，表明包涵體已被正確製備。圖7顯示與蛋白質上6XHis標記物結合的固定化Ni-NTA樹脂的一個實施方案。圖8顯示在Ni-NTA親和色譜之後的凝膠電泳的典型數據。將包涵體上樣至已平衡的Ni-NTA柱上，用同樣的緩衝溶液衝洗，並收集流通液(泳道I)。該柱體然後用50%EtOH衝洗，以使得它與裂解緩衝液平衡(泳道2)。用3XNBS在室溫進行30分鐘柱上裂解，並收集流通液(泳道3)。用300mM咪唑衝洗柱體，以洗掉所有剩下的融合蛋白並收集流通液(泳道4)。圖9顯示用NBS(N-溴代琥珀醯亞胺)選擇性裂解色氨酸肽鍵的一種可能的機理。根據該機理，活化溴離子將色氨酸殘基的吲哚環滷化，接著通過一系列水解反應自發脫滷化。這些反應導致可促進分裂反應的羥吲哚衍生物的形成。在圖9中，Z-Trp-Y在Trp殘基的羧基端裂解，以獲得修飾的Z-Trp和在Y上的自由氨基(即H2N-Y).圖10顯示9個不同NBS裂解反應的凝膠電泳的典型數據。進行反應，將樣品在18%丙烯醯胺凝膠上電泳並進行銀染色。泳道(I):包涵體儲備液；泳道(2):0XNBS，0分鐘；泳道(3)=IXNBS,30分鐘；泳道(4)=IXNBS,60分鐘；泳道(5):3XNBS，0分鐘；泳道(6):3XNBS，30分鐘；泳道(7):3XNBS，60分鐘；泳道(8):6XNBS，0分鐘;泳道(9)6XNBS,30分鐘；泳道(10)6XNBS,60分鐘。圖11顯示與3XNBS反應30分鐘，然後被N-乙醯甲硫氨酸猝滅的包涵體的凝膠電泳的典型數據。同樣的樣品從10至25Ul以遞增的量上樣，以顯示5kD裂解產物的出現。圖12顯示多種非天然胺基酸的化學結構，這些胺基酸已通過細胞系統的遺傳修飾被細胞系統引入多肽和蛋白質中。參見Wang等，(2009)ChemBiol.16(3):323_36。圖13顯示對所用直接材料的估計生產成本分析。基於5克/升的平均包涵體製備、50%的裂解成功率和純化過程中的產品損失，用來合成￠-澱粉樣蛋白(1-42)的材料僅花費0.11美元/毫克。具體實施方式本發明提供生產能夠純化並裂解成所需肽的融合肽的方法，以及根據該方法生產的肽。在多個實施方案中，本發明的方法包括誘導、包涵體分離、親和柱純化和化學裂解。在多個實施方案中，本發明利用表達載體來製備根據本發明的肽。在某些方面，通過將使用遺傳可塑性微生物如大腸桿菌細胞來合成目的肽的分子表達技術與表達後分離和修飾相組合，能夠快速而有效地合成所需的肽。在多個實施方案中，本發明涉及融合肽的生產，該融合肽可通過親和分離純化並用化學試劑裂解以釋放目標肽。在多個實施方案中，本發明涉及一種載體，其編碼包涵體靶向序列，有助於純化的親和標記物，以及有助於選擇性化學裂解的特定的胺基酸序列。在多個方面，包涵體靶向胺基酸序列包含類固醇異構酶蛋白質的I至125個胺基酸。親和標記物序列可包含聚組氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸或聚穀氨酸。在一個實施方案中，載體還包含位於親和標記物序列的5』端的表達啟動子。在一個實施方案中，本發明涉及一種編碼特定序列的載體，該序列有助於選擇性化學裂解以在純化後產生感興趣的肽。這樣的可化學裂解的胺基酸序列包括Trp、His-Met或Pro-Met。在一個實施方案中，本發明涉及一種肽表達載體，其包含a)編碼親和標記物的胺基酸序列的第一核苷酸序列山)編碼包涵體靶向胺基酸序列的第二核苷酸序列；c)編碼可化學裂解的胺基酸序列的第三核苷酸序列；以及d)與第一、第二及第三核苷酸序列可操作組合的啟動子。在一個實施方案中，本發明涉及一種生產具有商業或治療意義的肽的方法，該方法包括以下步驟a)用限制性內切酶切割載體以產生酶切載體；b)將切割位點連接至一個或多個核酸，其中該核酸編碼所需的肽，在每一末端具有至少一個鹼基突出端，該鹼基突出端配置並排列以便與酶切載體連接，以產生適合表達融合肽的第二載體；c)將該第二載體轉化至合適的宿主細胞中；d)在適合表達融合肽的條件下培養該宿主細胞；e)從該宿主細胞中分離包涵體；f)溶解包涵體並從包涵體中提取融合肽；g)融合肽與合適的親和材料結合；h)洗滌結合的融合肽以除去雜質；和i)裂解融合肽以釋放所述目標肽。通過本發明方法生產的肽可具有明顯更低的成本和/或其他有益的特徵。這些可能較低的成本不僅可能是由於合成需要的原材料較便宜，還可能是因為與傳統固相肽合成法相比，該方法產生更少的化學廢物，又或是在更高效的加工中達到特定的純度，因此降低了材料成本。此外，沒有大量廢物生成也可對環境特別有益。在多個實施方案中,根據本發明的方法提供了高產率、高純度的肽。在多個實施方案中，根據本發明生產的肽可為R&D級肽或臨床級治療劑。定義除非另外定義，所有在本文應用的技術及科學術語均與本領域普通技術人員通常理解的意思一致。如此處所用，術語「肽」的意思是任何包含由肽鍵連接的胺基酸的聚合物。術語「肽」意在包括用核糖體裝配的聚合物以及用酶裝配的聚合物(即，非核糖體肽)以及用合成法裝配的聚合物。在多個實施方案中，術語「肽」可被認為與「蛋白質」或「多肽」同義。在多個實施方案中，術語「肽」可被局限於多於50個胺基酸的聚合物，或者可替代地，50個或更少的胺基酸的聚合物。在多個實施方案中，術語「肽」意在僅包括胺基酸作為聚合物的單體單元；而在多個實施方案中，術語「肽」包括對胺基酸骨架附加的成分和/或修飾。例如，在多個實施方案中，術語「肽」可用於胺基酸的核心聚合物以及該核心聚合物的衍生物，例如帶有懸垂聚乙二醇基團的核心聚合物或在胺基酸鏈的氨基端或羧基端帶有醯胺基團的核心聚合物。如此處所用，「基本由...組成」可能不包括那些此處未列出的，將會改變發明的操作的特徵。然而，短語「基本由...組成」的使用不排除那些不改變所需成分的操作的特徵。術語「聚合物」是包含由共價化學鍵連接的重複結構單元的分子(或大分子)。將用本發明的組合物處理的術語「患者」、「個體」或「宿主」可意為人或非人的動物。術語「哺乳動物」是本領域公知的，且典型的哺乳動物包括人類、靈長類、牛類、豬類、犬類、貓類及嚙齒類(例如，小鼠及大鼠)。I.目標肽I本發明的方法適用於眾多的肽，如分離的產物，其可被稱為目標肽。根據本發明的方法生產的肽可以是天然存在的肽，非天然存在的肽，或具有非天然置換、缺失或添加的天然存在的肽。在多個實施方案中，目標肽可在分離後用化學或生物學方法修飾以獲得目標肽的衍生物，例如一個或多個甲醯胺基團代替自由羧基的目標肽。在多個實施方案中，所述肽選自疫苗、抗體、重組的激素及蛋白質、幹擾素、白介素以及生長因子。在某些實施方案中，目標肽含有50個或更少的胺基酸。在某些實施方案中，目標肽含有多於50個胺基酸。本發明進一步的非限制性實施方案包括選自下組的肽及其類似物血管緊張素、精氨酸加壓素(AVP)、AGG01、糊精(IAPP)、澱粉樣蛋白P、N-乙醯半乳糖胺_4_硫酸酯酶(rhASB;戈硫酯酶)、禽胰多肽(APP)、B型利尿鈉肽(BNP)、降鈣素肽、降鈣素、粘菌素(多粘菌素E)、粘菌素共聚物I(Cop-I)、環孢菌素、促紅血球生成素(darbepoetin)、PDpoetin、阿法鏈道酶、依來多新、內啡肽、恩夫韋肽、腦啡肽五肽、依泊汀、依泊汀S、紅細胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、促卵泡激素(FSH)、a-半乳糖苷酶A(Fabrazyme)、生長激素釋放激素1-24(GHRH1-24)、3-珠蛋白、胰高血糖素、葡糖腦苷脂酶、胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長激素、B型肝炎病毒包膜蛋白、人生長激素(hGH)、胰島素、胰島素A、胰島素B、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、幹擾素、肛褶蛙肽、a-L-艾杜糖苷酸酶(rhIDU;拉羅尼酶)、乳三肽(Iactotripeptides)、瘦素、利拉魯肽(NN2211,VICT0ZA)、促黃體激素釋放激素、甲氧基聚乙二醇依泊汀P(MIRCERA)、肌紅蛋白、神經激肽A、神經激肽B、NN9924、NPY(神經肽Y)、奧曲肽、垂體腺苷酸環化酶激活肽(PACAP)、甲狀旁腺素(PTH)、肽組氨酸異亮氨酸27(PHI27)、阿黑皮素原(POMC)肽、強啡肽原肽、多粘菌素、多粘菌素B、胰多肽(PPY)、肽YY(PYY)、胰泌素、促生長素抑制素、P物質、特立帕肽(FORTEO)、組織纖溶酶原激活物(TPA)、血小板反應蛋白(TSP)、泛素、尿抑胃素、血管活性腸肽(VIP或PHM27)以及病毒包膜蛋白。在多個實施方案中，目標肽選自澱粉樣蛋白P、降鈣素、恩夫韋肽、依泊汀、依泊汀S、紅細胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖腦苷脂酶、胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長激素(hGH)、胰島素、胰島素A、胰島素B、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、幹擾素、利拉魯肽、促生長素抑制素、特立帕肽以及組織纖溶酶原激活物(TPA)。在多個實施方案中，目標肽選自澱粉樣蛋白P和胰島素。在多個實施方案中，目標肽是激素。例如，在多個實施方案中，目標肽選自激活蛋白、抑制素、脂連蛋白、脂肪衍生的激素、促腎上腺皮質激素、阿法諾肽、野灰蛋白信號傳遞肽、抑咽側體神經肽、糊精、血管緊張素、心房鈉尿肽、牛促生長素、緩激肽、腦神經營養因子、CJC-1295、降鈣素、睫狀神經營養因子、促腎上腺皮質激素釋放素、促皮質素(Cosyntropin)、內皮素、腸高血糖素、促卵泡激素、胃泌素、腸抑肽(Gastroinhibitorypeptide)、胰高血糖素、胰高血糖素激素家族、胰高血糖素樣肽-I、促性腺素、粒細胞集落刺激因子、促生長素、生長激素釋放激素、鐵調素(Hepcidin)、人絨毛膜促性腺激素、人胎盤催乳素、腸降血糖素、胰島素、甘精胰島素(Insulinglargine)、賴脯胰島素(Insulinlispro)、門冬胰島素(Insulinaspart)、胰島素樣生長因子2、胰島素樣生長因子、瘦素、利拉魯肽、黃體生成素、黑皮質素、促黑激素、美拉諾坦(Melanotan)II、小胃泌素(Minigastrin)、腦鈉肽的N端激素原、神經生長因子、神經營養蛋白_3、NPH胰島素、胰島素、肥胖抑制素(Obestatin)、食慾肽、骨鈣蛋白、胰腺激素、甲狀旁腺激素、YY肽、肽類激素、血漿腎素活性、普蘭林肽、前激素原、Proislet澱粉樣多肽、促乳素、鬆弛素、腎素、降鈣素(Salcatonin)、促胰液素、辛卡利特(Sincalide)、硬骨魚瘦素、促甲狀腺素、促甲狀腺釋放因子、尿皮素(Urocortin)、尿皮素II、尿皮素III、血管活性腸肽和卵黃生成素。在多個實施方案中，目標肽已可以通過不同於本發明方法的生產方法可從市場上購得。儘管不希望受理論所限制，相信根據本發明生產的肽將含有來自生產過程的不同程度的殘餘成分。例如，與根據傳統的重組方法生產的具有相同序列的肽相比，可以預計根據本發明生產的肽在初始純化後將具有較少的殘餘細胞汙染物。或者，與根據傳統的合成方法生產的具有相同序列的肽相比，可以預計根據本發明生產的肽在初始純化後將具有較少的殘餘化學汙染物。各種可商業購得的肽可在紙質目錄或在線目錄上找至丨J，例如，Sigma-Aldrich(sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/peptides_and-proteins.html),CaliforniaPeptide(californiapeptide.com/peptide_catalog_table),CPCScientific(cpcscientific.com/products/browseCatalog.asp),以及Bachem(shop,bachem.com/ep6sf/index,ep)，其中每一項的內容都在此引用作為參考。在多個實施方案中，目標肽在其序列中不包括色氨酸。II.包涵體指引肽包涵體由不溶性及變性形式的肽組成，其直徑約為5-1.3Pm。這些稠密且多孔的聚集物可幫助簡化重組蛋白生產，因為他們具有高均一性的表達的蛋白質或肽，導致表達的蛋白質或肽的降解較低，因為其對細胞蛋白酶的蛋白水解攻擊具有更高的抗性，同時由於其與其他細胞成分相比在密度和大小上不同，易於從細胞的其他成分中分離出來。在多個實施方案中，由於蛋白質或肽在被隔離在包涵體內後毒性降低，包涵體的存在允許產生濃度提高的表達的蛋白質或肽。一旦分離，可以溶解該包涵體以允許進一步的操作和/或純化。包涵體指引肽是一種胺基酸序列，其可以幫助指引新翻譯的蛋白質或肽進入宿主細胞內的不溶性聚集物。在最終分離之前，在本發明的多個實施方案中，目標肽作為融合肽產生，該融合肽包括作為其胺基酸序列一部分的包涵體指引肽。本發明的方法適用於多種不同的作為表達的融合蛋白或肽的組分的包涵體指引肽。在多個實施方案中，包涵體指引肽是類固醇異構酶(KSI)序列、其功能片段或其功能冋系物。在多個實施方案中，包涵體指引肽是BRCA-2序列、其功能片段或其功能同系物。III.親和標記物肽根據本發明，可以使用眾多的親和標記物。根據本發明有用的親和標記物可對於陽離子、陰離子、金屬或任何其他適合於親和柱的材料是特異性的。在一個實施方案中，任何不具有親和標記物的肽將被從親和柱上洗脫，通過親和標記物留下與親和柱接合的所需融合肽。根據本發明的特異性親和標記物可包括聚賴氨酸、聚組氨酸、聚穀氨酸、聚精氨酸肽。例如，親和標記物可以是5-10個賴氨酸、5-10個組氨酸、5-10個穀氨酸或5-10個精氨酸。在多個實施方案中，親和標記物是6個組氨酸的序列、6個賴氨酸的序列、6個穀氨酸的序列、或6個精氨酸的序列。或者，也可使用HAT-標記物(Clontech)。在多個實施方案中，親和標記物是Ni-親和標記物His-Trp。不希望被理論所局限，相信聚組氨酸標記物的組氨酸殘基與Ni-NTA或TALON樹脂以高親和力結合。這兩種樹脂皆含有二價陽離子(Ni-NTA樹脂包含Mg2+;TAL0N樹脂包含Co2+)，該二價陽離子可以與His標記物形成高親和力配位。在多個實施方案中，親和標記物的pi(等電點)與目標肽的Pl相差至少一個pH單位。該差異可以是在目標肽的Pl之上或之下。例如，在多個實施方案中，目標肽具有高pi，而親和標記物的pi至少低I個pH單位,至少低2個pH單位,至少低3個pH單位,至少低4個pH單位,至少低5個pH單位,至少低6個pH單位,或至少低7個pH單位。或者，目標肽具有低pl，而親和標記物的pi至少高I個pH單位,至少高2個pH單位,至少高3個pH單位,至少高4個pH單位,至少高5個pH單位,至少高6個pH單位,或至少高7個pH單位。在一個實施方案中，目標肽的Pl值約為10而親和標記物的pi值約為6。在多個實施方案中，親和標記物包含在包涵體指引肽的天然序列內。或者，將包涵體指引肽修飾為包含親和標記物。例如，在一個實施方案中，親和標記物是KSI或BRCA2序列被修飾後所包括的額外的組氨酸、額外的賴氨酸、額外的精氨酸或額外的穀氨酸。在多個實施方案中，可使用如FLAG(EastmanKodak)或myc(Invitrogen)的表位及其抗體對。IV.可裂解標記物本發明的方法適用於多種不同的可裂解標記物。在多個實施方案中，可裂解標記物是在目標肽的氨基端的色氨酸。在用裂解劑裂解後，用來連接色氨酸與目標肽的醯胺鍵斷裂，目標肽從親和柱上釋放出來。在多個實施方案中，可裂解標記物是目標肽的氨基端的色氨酸，其中該可裂解標記物在色氨酸的局部環境中包括具有帶電側鏈的胺基酸，所述色氨酸的局部環境例如是色氨酸上遊(即氨基)或下遊(即羧基)側的5個胺基酸以內。在多個實施方案中，在色氨酸氨基端5個胺基酸之內存在胺基酸側鏈，這允許選擇性裂解可裂解標記物的色氨酸而不裂解其他任何可能存在於融合肽中的色氨酸(例如，作為包涵體指引肽的一部分或目標肽的一部分的色氨酸)。例如，在多個實施方案中，具有帶正電荷的側鏈的胺基酸，例如賴氨酸、鳥氨酸或精氨酸，距可裂解標記物的色氨酸在5、4、3或2個胺基酸單位以內，或在氨基端與可裂解標記物的色氨酸相鄰。在多個實施方案中，穀氨酸在距可裂解標記物的色氨酸的5、4、3或2個胺基酸單位以內，或在氨基端與可裂解標記物的色氨酸相鄰。在多個實施方案中，可裂解標記物為His-Met或Pro-Met。在多個實施方案中，可裂解標記物是非天然胺基酸。已經可以修飾細胞以使得該細胞能夠產生含有非天然胺基酸的肽。例如，Wang等，(2001)Science292:498-500描述了對大腸桿菌的蛋白質生物合成機制的修飾，該修飾允許響應於琥珀終止密碼子(TAG)，位點特異性地引入非天然胺基酸-0-甲基-L-酪氨酸。Wang等(2009)ChemBiol.16(3):323-36提供了對大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞的蛋白質中位點特異性引入大量非天然胺基酸的綜述。不希望被理論所限制，相信引入一個或多個非天然胺基酸可以提供額外的裂解選擇性，從而在融合肽的非天然胺基酸處裂解而不在融合肽的其它位點處非特異性裂解。在多個實施方案中，非天然胺基酸選自圖12中的化合物1-27。在某些方面，本發明包括含有非天然胺基酸的融合肽的生產。在某些方面，蛋白質生物合成機制被修飾的原核細胞產生這樣的融合肽。這樣的原核細胞的例子包括大腸桿菌。在某些方面，該修飾包括加入正交的tRNA/合成酶對。在某些方面，4個鹼基密碼子編碼新的胺基酸。在某些方面，大腸桿菌允許響應於包括在表達載體中的琥珀終止密碼子(TAG)，位點特異性地向肽內引入非天然胺基酸0-甲基-L-酪氨酸。V.融合肽的合成許多肽生產方法可適用於本發明。各種方法在此處詳細描述。A.核糖體合成在多個實施方案中，可通過核糖體合成來生產肽，該方法利用轉錄和翻譯的基礎方法來表達肽。核糖體合成通常通過操縱多種表達系統的遺傳密碼子來進行。某些肽可以在真核宿主例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)內以其原始形式表達。動物細胞培養可能需要較長的生長時間以達到最大的細胞密度，而且可能會比原核細胞培養達的細胞密度低(參見Cleland,J.(1993)ACSSymposiumSeries526,ProteinFoldingInVivoandInVitro,AmericanChemicalSociety)。細菌宿主表達系統例如大腸桿菌可能比動物細胞培養具有更高的生產能力，且對於打算治療使用的肽而言可能具有較少的管理上的障礙。有許多關於重組蛋白的普通細菌表達的美國專利，包括美國專利4，565，785。在一個實施方案中,表達系統是微生物表達系統。例如，在一個實施方案中，該方法使用大腸桿菌細胞。I.載體的構建在多個實施方案中，本發明的方法包括DNA載體的構建，該DNA載體包括某些選擇性標記(例如在大腸桿菌情況下的抗生素抗性)，該選擇性標記使得能夠針對不包含帶有目的基因的構建載體的細胞進行選擇性篩選。根據本發明的載體可包含雜合啟動子和用於引入不同基因的多克隆位點。不同的表達載體可包括PET系統和pBAD系統。pET系統在標準pET載體上包括超過40種不同的變異。在多個實施方案中，pET系統採用可以被I7RNA聚合酶特異性識別的T7啟動子。該聚合酶可以比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍地轉錄DNA，從而允許轉錄水平增高。在多個實施方案中，大腸桿菌是蛋白酶缺陷的。在一個實施方案中，載體被設計成帶有編碼融合肽的序列，該融合肽包含包涵體指引肽、親和標記物肽、可裂解的肽和目標肽。例如，在一個實施方案中，載體為pET-19b載體，其被修飾為包括類固醇異構酶(KSI)序列作為包涵體指引肽。因此，在切割諸如NcoI限制酶切位點的限制位點和插入KSI序列之後，KSI序列兩側有兩個NcoI限制酶切位點。此外，這樣的載體可被修飾為包含組氨酸標記物序列作為編碼親和標記物的序列，該序列鄰近作為編碼可裂解肽序列的色氨酸編碼性標記物序列，後者進一步鄰近編碼目標肽的序列，例如澱粉樣蛋白(1-42)序列。如果XhoI限制酶切位點用來作為插入點，新插入序列的兩側為兩個XhoI限制酶切位點。圖I顯示了修飾的pET-19b(pET-19bmhbl)載體的一個實施方案，其可用來產生在兩側有兩個NcoI限制酶切位點的KSI序列，以及在兩側有兩個XhoI限制酶切位點的組氨酸標記物-色氨酸-￠-澱粉樣蛋白序列(1-42)序列。這樣，根據本發明的載體，例如修飾的pET_19b載體，包含具有四部分序列的所需融合肽KSI序列或功能片段，將合成的融合蛋白隔離到包涵體內；親和標記物，諸如六組氨酸；裂解標記物，諸如色氨酸；以及目標肽。2.接種及誘導或激活在構建適當的載體後，該載體可按照任何方法引入宿主細胞內，且所需融合肽的表達可通過本領域中的任何方法誘導或激活。在一些實施方案中，根據本發明的載體一旦構建，就將其接種或將其轉化入感受態細胞中。在多個實施方案中，感受態細胞可以是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞，或微生物細胞，例如大腸桿菌細胞。舉例來說，所述細胞可從市場上購得，例如DH5-ot大腸桿菌細胞(可從Invitrogen購得)。在多個實施方案中，已轉化的細胞可以塗布到含有抗菌劑的瓊脂上，以防止任何不含有抗性基因的細胞的生長，從而選擇那些已被轉化的細胞。在某些實施方案中，將已轉化的大腸桿菌細胞塗布到含有氨苄青黴素的瓊脂上，以阻止任何不含構建的pET-19b載體的大腸桿菌菌株的生長，並且選擇一個菌落以備進一步擴增。從平板培養法得到的菌落可根據標準細胞培養技術在起子培養物或肉湯中生長。例如，在某些實施方案中，從瓊脂平板上選取的一個菌落在肉湯起子培養液中生長，其可任選地包含抗菌劑。典型地，細胞生長到預先選擇的光密度，然後進一步加工以獲得融合肽。例如，細胞可生長至光密度(OD)為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9，所有的數值均為大約值。在某些實施方案中，細胞生長至光密度(OD)大約為0.5。在細菌表達系統中，一旦含有載體的細菌細胞被分離出來，就可以利用誘導型轉錄來生產所需的融合肽。例如，在大腸桿菌細胞中，Iac操縱子可作為在特定環境條件下激活的誘導型啟動子。大腸桿菌總是能夠代謝單糖葡萄糖。然而，為了代謝二糖乳糖，該細胞需要一種叫作￠-半乳糖苷酶的酶。因此，細胞外的低葡萄糖濃度和高乳糖濃度誘導Iac操縱子，￠-半乳糖苷酶的基因被轉錄。相應地，在多個實施方案中，諸如Iac操縱子的誘導型啟動子位於編碼融合肽序列的上遊。在誘導Iac操縱子後，發生編碼所需融合肽的序列的轉錄。術語「激活」指的是去除阻抑蛋白。阻抑蛋白通常是變構的，意指當其被誘導物分子結合後會改變形狀並從啟動子上解離下來。這種解離允許轉錄複合物在DNA上裝配，並啟動啟動子下遊的任何基因的轉錄。因此，通過將在體外產生的基因剪接到細菌基因組中，人們可以控制新型基因的表達。在處理包涵體時，如果包涵體的產生及積累變得足夠有毒性而殺死大腸桿菌，則可有利地利用該特性。例如，可以推遲所需融合肽的表達，直到培養出足夠的細胞群體，然後可以誘導啟動子以通過去除阻抑蛋白從而表達大量的融合肽。因此，L-阿拉伯糖操縱子可根據本發明激活，以便在所需時間點增加蛋白質表達。具體地，可通過將阿拉伯糖加入生長培養基中和加入IPTG來激活L-阿拉伯糖操縱子，IPTG是作為激活劑從操縱基因DNA上解離阻抑蛋白的分子。圖2顯示一個實施方案，通過加入L-阿拉伯糖來激活pBAD載體中的轉錄。不希望被理論所限制，相信L-阿拉伯糖與AraC二聚體結合，使蛋白質釋放DNA上的O2位點，並與I2位點結合。這些步驟用於釋放DNA環並使其能夠轉錄。此外，cAMP激活蛋白(CAP)複合物刺激AraC與I1和I2的結合-由IPTG啟動的過程。3.將表達的肽靶向至包涵體在某些情況下，只表達具有親和標記物、可裂解標記物及目標肽的融合肽的細胞不能產生大量融合肽。低產率的原因可能不一。例如，融合肽可能對於細菌來說有毒性，因此導致細菌在產生一定量的融合肽後死亡。或者，目標肽可能表達較差或在細菌系統中迅速降解。在各種情況下，目標肽可能被宿主細胞修飾，包括諸如糖基化的修飾。為解決一些或全部的這些問題，所需融合肽可被引導至包涵體中，從而在物理上將目標肽與細胞胞質中的降解因子隔離開來。或者，在目標肽對宿主有毒性諸如肽抗生素的情況下，在物理上隔離目標肽以避免對宿主的毒性效應。此外，通過在包涵體中物理聚集融合肽，接下來可以更容易和高效地從宿主細胞的成分及培養基(即細胞培養基或肉湯)中分離融合肽。目標肽可通過下列方法被引導至包涵體產生作為融合肽一部分的目標肽，其中目標肽直接地或經由中間肽間接地與包涵體指引肽連接。在多個實施方案中，除沒有包涵體指引肽外都相同的融合肽在表達系統中沒有或具有最低的被引導進入包涵體的趨勢。或者，除沒有包涵體指引肽外都相同的融合肽在表達系統中具有一定的被引導入包涵體的趨勢，但是通過產生帶有包涵體指引肽的融合肽增加了包涵體的數量、體積或重量。在多個實施方案中，當目標肽自身可將本發明的融合肽引導至包涵體時，可不包括單獨的包涵體指引肽。任何包涵體指引肽可根據本發明的方法使用。例如，已經描述了允許在大腸桿菌中合成穩定形式的a-人心房鈉尿肽(a-hANP)的方法。合成的a-hANP基因的8個拷貝串聯連接，由編碼含4個胺基酸的連接體的密碼子隔開，該連接體具有賴氨酸殘基，該賴氨酸殘基位於含28個胺基酸的激素的真正N端和C端的側翼。然後該序列與片段的3』端相連，該片段包含Iac啟動子及編碼P-半乳糖苷酶的前7個N端胺基酸的前導序列。表達的多區域蛋白在細胞內積累進入穩定的包涵體內，並通過尿素提取不溶性細胞成分而純化。純化的蛋白質通過用蛋白內切酶IysC消化而裂解為單體，並進行修整以通過羧肽酶B消化而暴露真正的C-端。參見Lennick等，「High-levelexpressionofa-humanatrialnatriureticpeptidefrommultiplejoinedgenesinEscherichiacoli,，，Gene,61:103-112(1987)，在此引入作為參考。在多個實施方案中，通過產生作為融合肽的一部分的目標肽將目標肽引導至包涵體可導致更高的肽產量。例如，在多個實施方案中，所需融合肽以大於100mg/L的濃度產生。在多個實施方案中，所需融合肽以大於約200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L、450mg/L、500mg/L、550mg/L、600mg/L、650mg/L、700mg/L、750mg/L、800mg/L、850mg/L、900mg/L、950mg/L和lg/L的濃度產生，所有數字前都冠以「大於約」。在多個實施方案中，所需融合肽的產率大於約I.5g/L，大於約2g/L，或大於約2.5g/L。在多個實施方案中，所需融合肽的產率在約500mg/L至約2g/L之間，或約lg/L至約2.5g/L之間。在一個實施方案中，所需融合肽的產率等於或大於500mg/L培養基。在一個實施方案中，包涵體指引肽是類固醇異構酶(KSI)或其包涵體指引功能性片段。在某些實施方案中，包涵體指引功能性片段含有至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100個胺基酸。也包括類固醇異構酶的同系物。這樣的同系物與類固醇異構酶的胺基酸序列具有至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列一致性。在多個實施方案中，表達系統對於具有類固醇異構酶的功能片段或同系物的融合肽所產生的包涵體量為同一表達系統對於含有完整類固醇異構酶肽序列的融合肽所產生的包涵體量的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或大於100%。B.固相蛋白質合成在一個實施方案中，所需融合肽通過固相肽合成法(SPPS)製備。SPPS包括將短肽共價連接至不溶性聚合物上，該聚合物為肽的伸長提供了結構支持。為達到肽伸長的目的，操作者施行一系列的重複循環將胺基酸的化學反應部分脫保護，將脫保護的自由末端胺(N)連接至一個N-保護的胺基酸，將新加入的殘基的N-端胺脫保護，並重複該過程直至所需肽已建立。對於長度約為50個或更多胺基酸的肽，可能需要附加措施。在一個實施方案中，固相肽合成法使用Fmoc保護基團。Fmoc保護基團使用鹼不穩定的a-氨基保護基團。在一個替代實施方案中，固相肽合成法使用Boc保護基團。Boc保護基團是酸不穩定的a-氨基保護基團。每種方法可包括獨特的樹脂添加，胺基酸側鏈保護，以及隨之而來的裂解/脫保護步驟。通常，Fmoc化學法比Boc化學法產生更高質量和更高產率的肽。Boc-合成的肽中的雜質主要歸結於裂解問題、脫水及叔丁基化。一旦在固體支持物上裝配，使用強酸條件，通常使用三氟乙酸(TFA)，將該肽從樹脂上切下。然後使用反相高壓液相色譜法或RP-HPLC純化，RP-HPLC是這樣一個過程，其中，樣品通過緊密填充的柱擠出，並記錄不同樣品通過該柱所花費的時間長度(稱為保留時間)。於是，根據較小的肽通過柱的保留時間較短而反之亦然的原理從樣品中分離出雜質。因此，純化的蛋白質以與樣品中其他雜質不同的特有的保留時間洗脫，從而獲得所需蛋白質的分離。固相肽合成通常可提供高產率，因為可使用過量的試劑推動反應完成。可溶性副產物的分離通過在合成中將肽與不溶性支持物連接而得到簡化。由於在整個過程中在同一容器中發生合成，原料的機械損耗較低。在多個實施方案中，可不包括包涵體指引肽。或者，可包括包涵體指引肽以提供有益的摺疊性質和/或可溶性/聚集性質。C.非核糖體合成在多個實施方案中，肽可通過非核糖體合成產生。這樣的肽包括環肽和/或縮肽(depsipeptide)。非核糖體肽通過一種或多種非核糖體肽合成酶(NRPS)合成。這些酶獨立於信使RNA0非核糖體肽通常具有環狀的和/或分支的結構，可以包含非蛋白質胺基酸(包括D-胺基酸)，帶有諸如N-甲基和N-甲醯基的修飾，或被糖基化、醯化、滷化或羥基化。通常相對肽骨架將胺基酸環化，形成噁唑啉和噻唑啉；它們可進一步被氧化或還原。有時，可對絲氨酸進行脫水反應以獲得脫氫丙氨酸。NRPS的酶被組織在負責引入一個額外胺基酸的模塊中。每個模塊由幾個具有限定功能的結構域組成，這些結構域由大約15個胺基酸的短間隔區分開。雖然不期望被理論所限制，認為一個典型的NRPS模塊如下組織起始模塊，一個或多個延長模塊，和終止模塊。針對某種肽的NRPS基因通常在細菌中被組織在一個操縱子中或在真核生物中被組織在基因簇中。在多個實施方案中，可不包括包涵體指引肽。或者，可包括包涵體指引肽以提供有益的摺疊性質和/或可溶性/聚集性質。VI.融合肽從生成培養基中的分離在產生所需融合肽後，需要從生產培養基中將其分離。任選地，在分離後，可濃縮所需融合肽及載體以去除過量的液體。許多從生成培養基中分離融合肽及後續處理的方法可適用於本發明。在此詳述幾種方法。A.靶向包涵體的融合肽在多個實施方案中，可裂解用來生產所需融合肽的細胞以釋放融合肽。例如，當所需融合肽聚集在包涵體中時，可以裂解細胞，然後將包涵體從生產培養基及細胞碎屑中分離出來。根據本發明可使用任何細胞裂解方法。在多個實施方案中,用大功率超聲處理,在裂解緩衝液中破壞細胞。例如,在裂解前可加入含有Tris、氯化鈉、甘油及蛋白酶抑制劑的裂解緩衝液。在一個實施方案中，可在裂解前加入含有大約25mMTrispH8.O、大約50mMNaCl、大約10%甘油和蛋白酶抑制劑1000XPMSF的裂解緩衝液。不可溶的包涵體可通過使用一個或多個洗漆步驟和離心步驟進行收集。洗滌緩衝液可包含任何用來穩定和分離蛋白質的試劑。例如，在多個實施方案中，使用含有不同濃度的TrispH8.O、NaCl和TritonXlOO的洗滌緩衝液。在本發明的一個實施方案中，將所需融合肽靶向至包涵體可在細胞裂解後形成較高的起始純度。例如，在一個實施方案中，裂解細胞和通過諸如離心分離的物理手段分離包涵體，可導致所需融合肽的起始純度大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%或大於約95%。在一些實施方案中，細胞裂解後，包涵體形成小球並保持在小球而不是上清夜內直到溶解步驟。在多個實施方案中，將小球清洗乾淨，去除其餘的細胞成分，將不可溶的包涵體溶解於緩衝液中以便進一步處理。溶解緩衝液可包含尿素或任何其他溶解融合肽必需的離液劑。不期望被理論所限制，相信溶解步驟包括將包涵體溶於離液劑中，該離液劑通過幹擾任何穩定的分子內相互作用來破壞肽。在多個實施方案中，溶解緩衝液包含尿素、胍鹽或有機溶劑。例如，溶解緩衝液可包含約25mMTrispH8.0，約50mMNaCl，約0.ImMPMSF，以及約8M尿素。在某些實施方案中，當加入8M尿素作為唯一的離液劑而排除其他離液劑時,包涵體溶解。或者,溶解緩衝液可不包含尿素或胍鹽。例如，在一個實施方案中，溶解緩衝液不包含胍鹽以避免幹擾在離子交換柱上進一步的加工。作為一個附加的例子，在一個實施方案中，不包含諸如約8M尿素的高濃度尿素以避免使可能包括在溶解緩衝液內的蛋白酶變性。在多個實施方案中，使用最少量的溶解緩衝液。當存在過量的溶解緩衝液時，可加工該溶液以便在進一步純化前移除過量的溶劑。B.非靶向包涵體的融合肽在多個實施方案中，融合肽並未被引導至包涵體內。在這樣的實施方案中，融合肽可保留在細胞的胞質溶膠中，或者根據本發明的融合肽可從細胞中分泌出來。可溶性的融合肽可通過任何方法分離，例如離心分離、凝膠電泳、PH或離子交換色譜法、大小排阻色譜法、反向色譜法、透析、滲透、過濾和萃取。VII.通過親和色譜法純化在細胞裂解並初始分離和溶解本發明的融合肽後，通過親和色譜法進一步純化融合肽，這是一個高度選擇性的過程，它依賴於固定化的固定相與將要被純化的融合肽之間的生物相關的相互作用。在多個實施方案中，固定化的固定相是樹脂或基質。不希望被理論所限制，認為親和色譜法是通過將來自混合物的所需成分與固定化的固定相選擇性結合，然後洗滌固定相以去除任何未結合的材料來進行的。根據本發明，可使用多種親和色譜法系統。例如，聚組氨酸以高親和力和特異性與鎳結合，因此鎳的親和柱，例如QIAGEN鎳柱，可用於純化。參見，例如，Ausubel等.，eds.,CurrentProtocolsinMolecularBiology10.11.8(Johnffiley&Sons1993)。或者，可使用Ni-NTA親和色譜樹脂(可從Invitrogen購得)。圖7提供了與蛋白質上的6XHis標記物相結合的固定化Ni-NTA樹脂的一個實例的示意圖。金屬親和色譜已用作蛋白質分離的基礎。參見Arnold,「MetalAffinitySeparationsANewDimensionInProteinProcessing^io/Technology,9:151-156(1991)。還可參見Smith等,「ChelatingPeptide-immobilizedMetalIonAffinityChromatographyJ.Biol.Chem.,2637211-7215(1988)，此文描述了蛋白質NH2末端上的特異性金屬螯合肽，其可通過固定的金屬離子親和色譜法來純化。根據本發明，親和柱用緩衝液平衡，該緩衝液可以與溶解融合肽的緩衝液相同。接下來向該柱裝入溶解的融合肽，並在緩衝液流過柱體時收集緩衝液。在多個實施方案中，相繼衝洗該柱以去除尿素和/或其他雜質如內毒素、多糖和來自細胞表達系統的殘餘汙染物。VIII.通過裂解從親和柱中移除目標肽從親和柱上裂解融合肽的多種方法可適用於本發明。通常，通過引入裂解劑進行裂解步驟，該裂解劑與融合肽的裂解標記物相互作用，導致融合肽的裂解和目標肽的釋放。在裂解後，可衝洗親和柱以洗脫目標肽，而含有親和標記物的融合肽部分仍與親和柱結合。在目標肽洗脫後，洗脫溶液可濃縮至所需濃度。目標肽可進一步處理和/或包裝以供分發或銷售。可通過化學選擇性控制裂解反應。例如，裂解標記物可包括獨特的化學部分，該部分不存在於融合肽的其他部分，因此裂解劑與裂解標記物的獨特的化學部分選擇性相互作用。在多個實施方案中，裂解反應的控制通過獨特的局部環境進行。例如，裂解標記物可包括化學部分，該化學部分存在於融合肽的其他部分，但局部環境不同，導致在裂解標記物處發生選擇性裂解反應。例如，在多個實施方案中，裂解標記物包括色氨酸和距色氨酸5個胺基酸內的帶電荷的胺基酸側鏈。在多個實施方案中，帶電荷的胺基酸位於色氨酸的氨基端。在多個實施方案中，裂解反應的控制可通過融合肽的二級或三級結構實現。例如，在多個實施方案中，當相同的部分存在於裂解標記物和融合肽的其他部分時，融合肽的其他部分可摺疊成二級或三級結構，諸如a-螺旋、￠-摺疊和類似的結構，以在物理上保護易受影響的部分，導致在裂解標記物處的選擇性裂解。在多個實施方案中，裂解反應對於裂解標記物相比對於融合肽上其他位置的選擇性方面的次要或甚至主要的差異，可通過控制裂解反應的動力學得到放大。例如，在多個實施方案中，裂解劑的濃度通過調整含有裂解劑的洗脫溶劑的流速得到控制。在多個實施方案中，裂解劑的濃度保持在低水平上以放大選擇性的不同。在多個實施方案中，用來接收洗脫溶劑的容器含有猝滅劑，以停止進一步裂解已從柱上釋放出來的目標肽。此外，可排除多種從親和柱上移除肽的方法。例如，根據本發明的方法可特別排除使用在無裂解反應時具有競爭親和力的化合物溶液來衝洗親和柱的步驟。在一個實施方案中，特別排除使用咪唑溶液作為置換劑來衝洗親和柱以幫助從親和柱上移除融合肽的步驟。在多個實施方案中，設想多次裂解。例如，已知胰島素從胰島素原前體產生，這需要兩個裂解事件。兩個裂解事件都是必需的，以便使成熟的胰島素正確地摺疊。因此，在多個實施方案中，根據本發明的方法可包括兩個裂解標記物。優選地，當存在多於一個裂解標記物時，不同的裂解標記物是正交的，或者能夠被不同的裂解劑特異性裂解。例如，在一個實施方案中，一個裂解標記物是甲硫氨酸而另一個裂解標記物是色氨酸。在多個實施方案中，裂解劑選自NBS、NCS、溴化氰、Pd(H20)4、2_鄰碘苯甲酸、DMSO/硫酸或蛋白水解酶。多種方法和裂解劑在此詳述。A.NBS裂解在一個實施方案中，根據本發明的裂解反應包括使用溫和的溴化劑N-溴代琥珀醯亞胺(NBS)來選擇性裂解目標肽氨基端的色氨醯肽鍵。不希望被理論所限制，相信在含水及酸性條件下，NBS氧化色氨酸側鏈的暴露吲哚環，從而啟動可導致該位點肽鍵斷裂的化學轉化。圖9顯示了一個可能的用N-溴代琥珀醯亞胺選擇性裂解色氨酸肽鍵的機理。根據該機理，活化的溴離子將色氨酸殘基的吲哚環滷化，接下來通過一系列水解反應自發脫滷化。這些反應導致可促進裂解反應的羥吲哚衍生物的形成。B.NCS裂解在一個實施方案中，根據本發明的裂解反應包括使用溫和的氧化劑N-氯代琥珀醯亞胺(NCS)來選擇性裂解目標肽氨基端的色氨醯肽鍵。不希望被理論所限制，相信在含水及酸性條件下，NCS氧化色氨酸側鏈的暴露吲哚環，從而啟動可導致該位點的肽鍵斷裂的化學轉化。C.酶裂解在多個實施方案中，可應用酶來裂解融合蛋白。例如，蛋白酶的使用是多樣而選擇性的，因為有很多蛋白酶識別特定的胺基酸序列。在多個實施方案中，絲氨酸或蘇氨酸蛋白酶的活性位點會分別與絲氨酸或蘇氨酸結合，並且啟動導致蛋白質水解的催化機制。其·他的酶包括膠原酶、腸激酶因子Xa、凝血酶、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶和ala枯草桿菌蛋白酶(alasubtilisin)。參見Uhlen和Moks,Meths.inEnz.，185:129-143(1990)和Emtage,「Biotechnology&ProteinProduction，，inDeliverySystemsforPeptideDrugs,pp.23-33(1986)。D.另外的化學試劑在多個實施方案中，裂解劑是諸如溴化氰、鈀(II)水絡合物(例如Pd(H2O)4)、甲酸和羥胺的化學試劑。例如，溴化氰可用於在目標肽氨基端的甲硫氨酸處選擇性裂解融合肽。IX.下遊處理在多個實施方案中，根據本發明方法生產的目標肽可進一步修飾。例如，在多個實施方案中，目標肽的C-端與a-羥基甘氨酸相連。在所需時間，目標肽(或者作為分離的目標肽，或者作為融合肽的一部分)暴露於酸催化，以獲得乙醇酸和在目標肽羧基端的甲醯胺基團。位於羧基端的甲醯胺基團在多種神經肽中存在，並且認為其可以延長各種肽在體內的半衰期。在多個實施方案中，根據本發明生產的目標肽可進一步修飾以改變其體內活性。例如，在多個實施方案中，可在目標肽上添加聚乙二醇(PEG)基團。X.肽的營銷根據本發明的方法也涉及營銷根據本發明的方法生產的目標肽。例如，在一個實施方案中，本發明涉及一種評估目標肽的商業市場的方法。這樣的方法可以包括生產如這裡描述的目標肽，使樣品量的目標肽可無成本或以最低成本獲得，以及測量一段時間內對目標肽的需求數量。以這種方式製備目標肽，其優勢包括改進對未來需要的供給量和/或付費顧客未來的需求量的計算。或者，無成本或以最低成本提供目標肽最初可能會引起對目標肽的興趣並發現能刺激未來銷售的肽的有利特徵。最低成本可包括接近於生產成本的價格，基本不包含涉及的盈利。在多個實施方案中，最低成本可以是競爭對手產品價格的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%或約70%。參考引入所有在本說明書中提到的出版物、專利及專利申請在此通過引入併入本文，其程度與每一個出版物、專利或專利申請被專門及單獨地通過弓I入併入本文的程度相同。實施例本文中的實施例提供了一些根據本發明的非限制性實施例。以下實施例包括真實的實施例和預言性的實施例。實施例I如下所述用ImMIPTG(Invitrogen)和0.2%L-阿拉伯糖(Calbiotech)誘導細胞以啟動KSI-AP(1-42)的合成。平板接種的細胞在37°C溫育過夜，然後來自該平板的一個菌落在8mLLB培養基+氨苄青黴素的起子培養液中生長過夜。第二天早晨，將起子培養物接種到ILLB培養基+氨苄青黴素中並生長至光密度(OD)為0.5。在此時，用ImMIPTG(Invitrogen)和0.2%L-阿拉伯糖(Calbiotech)誘導細胞以啟動KSI-AP(1-42)的合成。為優化細菌中KSI-AP(1-42)的產量，在誘導細菌前，然後在誘導後2、4、6和16小時(過夜生長)，採集IL接種的樣品。利用12%丙烯醯胺凝膠分析樣品，因為融合肽的分子量約為21kD。圖3顯示了在誘導前及誘導後2、4、6和16小時從細胞培養物中採集的樣品的凝膠電泳典型數據。在誘導培養物並生長過夜時發生最佳的融合肽合成。在誘導8小時後，用同樣濃度的IPTG和L-阿拉伯糖及IOOmg氨苄青黴素再次誘導細胞以防止任何新的大腸桿菌菌株的生長。實施例IA重新設計構建體以便在KSI序列上遊而不是下遊放置His標記物。實施例2在誘導大腸桿菌產生KSI-AP(1-42)之後，在細胞裂解前加入含有25mMTrispH8.0、50mMNaCI、10%甘油和蛋白酶抑制劑1000XPMSF的裂解緩衝液。通過洗滌和離心，分離收集不可溶的包涵體。使用三種不同的洗滌緩衝液，其中含有不同濃度的TrispH8.0、NaCl和TritonX100。一旦洗淨殘留的細胞成分，將不可溶的包涵體溶解在含有25mMTrispH8.0、50mMNaCl,0.ImMPMSF和8M尿素的緩衝液中。8M尿素作為溶解蛋白質所需的離液劑。將未誘導和誘導的細菌、通過高輸出超聲處理產生的細胞裂解產物和包涵體製備過程中每一洗滌步驟產生的上清液在12%丙烯醯胺凝膠上電泳。凝膠用考馬斯藍試劑染色。在誘導的樣品中出現21kD，這提供了誘導導致包涵體合成的證據。圖6顯示典型的數據，通過細胞的凝膠電泳表明包涵體製備的各階段，其中所述細胞通過高功率超聲處理裂解並用一系列含有不同濃度的Tris、NaCl、PMSF、Triton-XlOO和尿素的緩衝液洗滌。在連續步驟過程中21kD帶消失和在溶解包涵體後21kD帶重現(第10泳道)表明包涵體被正確製備。因此，含有細胞裂解物的泳道幾乎完全是藍色的，因為在細胞破裂時，相對大量的各種蛋白質被提取出來。當反覆洗滌裂解物中的雜質時，泳道變得清晰起來。實施例3溶解的包涵體內的蛋白質濃度通過Bradford試驗進行測定。運行一系列NBS裂解反應，以決定色氨醯肽鍵裂解的最佳條件。在用過量N-乙醯甲硫氨酸(Acros)猝滅之前，從TCIAmerica購買的3種濃度(等摩爾、3X和6X)的NBS與KSI-AP(1-42)反應不同的時間(0、15和30分鐘)。由於澱粉樣蛋白P，裂解產物只有5kD，利用較高百分比的丙烯醯胺凝膠(18%)確定溶液中的NBS裂解是否成功。凝膠表明，當6XNBS與KSI-A^(1-42)在室溫下反應0至30分鐘時發生最佳裂解。圖10顯示9種不同NBS裂解反應的凝膠電泳的典型數據。樣品在18%丙烯醯胺凝膠上運行並進行銀染色。泳道(I):包涵體儲備液；泳道(2)OXNCS,Omin;泳道(3):lXNBS，30min;泳道(4):lXNBS，60min;泳道(5)3XNBS，0min;泳道(6):3XNBS，30min;泳道(7):3XNBS，60min;泳道(8)6XNBS,Omin；泳道(9):6XNBS，30min;泳道(10):6XNBS，60min。實施例4從Invitrogen購買的Ni-NTA親和色譜樹脂用與製備包涵體相同的溶解緩衝液平衡。接著，向樹脂中充滿溶解的包涵體，並收集流通液。之後柱體用5倍柱體積的50%EtOH衝洗，以移除尿素和流通液。之後，上載3XNBS，並將柱體放置在振蕩器上30分鐘。此時，用過量的乙醯甲硫氨酸粹滅反應，並收集流通液。接著用300mM咪唑衝洗柱體，以釋放剩下的聚合蛋白並收集流通液。SDS-PAGE分析表明，很少量的包涵體附著在Ni-NTA柱體上，其證據是在第一洗出液中出現大的21kD帶。圖8顯示在如下所述的Ni-NTA親和色譜後的凝膠電泳典型數據。將包涵體上樣到平衡的Ni-NTA柱上，並用同樣的緩衝液衝洗，收集流通液(泳道I)。柱體接下來用50%EtOH衝洗，以使其與裂解溶液緩衝液平衡(泳道2)。在室溫下用3XNBS進行30分鐘的柱上裂解，並收集流通液(泳道3)。該柱體用300mM咪唑衝洗，以洗去所有剩餘的融合肽並收集流通液(泳道4)。用EtOH第二次衝洗以便為了柱上裂解而平衡柱體後，出現了更窄的條帶。剩餘的KSI-AP(1-42)發生非常少量的裂解。在振蕩器上溫育包涵體過夜不會改善柱上裂解，雖然此舉確實改善了KSI-AP(1-42)與柱體的初始結合。實施例5對NBS溶液裂解的SDS-PAGE分析表明，在溶液中的裂解取得成功。圖11顯示與3XNBS反應30分鐘然後用N-乙醯甲硫氨酸猝滅的包涵體的凝膠電泳的典型數據。同樣的樣品以遞增的量(從10至25yl)上樣，以顯示5kD裂解產物的出現。由於最佳裂解速度在35%-45%範圍內，只產生少量的KSI-AP(1-42)。由於凝膠中含有少量的稀釋的樣品，該試驗通過考馬斯藍染色沒有檢測到5kD的裂解產物。因此，顯現裂解產物需要過量上載樣品及過度顯影銀染色。見圖11，在最右邊的兩個泳道模糊地出現5kD帶。實施例6對所用直接材料的生產成本分析表明，通過重組表達、化學操縱和純化的組合合成￠-澱粉樣蛋白(1-42)的成本顯著低於其它製造商所定的價格(注意他們價格的組成包含日常開支、生產費用、人工成本等)。假設I升培養液的包涵體平均產率是大約5克/升，裂解率為50%NBS，而且考慮到純化過程中的產品損失，估計材料中的0.11美元是合成Img￠-澱粉樣蛋白(1-42)需要的全部成本。即使把所有其它諸如設施、儀器及人工等生產成本都包含在價格中，用本方法合成￠-澱粉樣蛋白(1-42)對消費者來說也會花費更少。見圖12。儘管在此已經顯示和描述了本發明優選的實施方案，但對於本領域技術人員來說很明顯這樣的實施方案只作為範例提供。在不背離本發明的情況下，本領域技術人員將會想到大量的變更、改變和替換。應當理解，在此描述的本發明實施方案的各種替代方案可用來實施本發明。權利要求1.一種生產目標肽的方法，其包括a)生產包含親和標記物、可裂解標記物和目標肽的融合肽；b)使所述融合肽與親和材料結合；c)裂解所述融合肽以釋放目標肽'及d)從親和材料上移除所述目標肽。2.權利要求I的方法，其中所述目標肽選自由澱粉樣蛋白P、降鈣素、恩夫韋肽、依泊汀、依泊汀S、紅細胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖腦苷脂酶、胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長激素(hGH)、胰島素、胰島素A、胰島素B、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、幹擾素、利拉魯肽、促生長素抑制素、特立帕肽和組織纖溶酶原激活物(TPA)組成的組。3.權利要求I的方法，其中所述生產融合肽的步驟在細菌表達系統中進行。4.權利要求3的方法，其中所述細菌表達系統是大腸桿菌表達系統。5.權利要求3的方法，其中所述融合肽進一步包含包涵體指引肽。6.權利要求5的方法，其中在所述融合肽與親和材料結合前，所述方法進一步包括從細菌表達系統中移除含有該融合肽的包涵體和溶解包涵體中的該融合肽。7.權利要求5的方法，其中所述包涵體指引肽選自由為類固醇異構酶的包涵體指引肽、類固醇異構酶的包涵體指引功能片段、類固醇異構酶的包涵體指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵體指引功能片段、和BRCA2的包涵體指引功能同系物組成的組。8.權利要求I的方法，其中在所述融合肽與親和材料結合之後，所述方法進一步包括洗滌所述親和材料以去除未結合的材料。9.權利要求I的方法，其中所述親和標記物選自聚組氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸或聚穀氨酸。10.權利要求I的方法，其中所述可裂解標記物選自由Trp、His-Met>Pro-Met和非天然胺基酸組成的組。11.權利要求I的方法，其中所述裂解步驟通過使用選自由NBS、NCS和Pd(H2O)4組成的組的試劑施行。12.—種評估目標肽的商業市場的方法，包括a)根據權利要求I的方法生產目標肽；b)使樣品量的目標肽可無成本或以最低成本獲得；及c)測量在一段時間內對目標肽的需求次數。13.根據權利要求I的方法生產的目標肽，其中所述肽的純度大於99%。14.一種載體，包含a)編碼親和標記物的核苷酸序列；b)編碼可裂解標記物的核苷酸序列'及c)編碼目標肽的核苷酸序列；其中所述核苷酸以可操作的組合排列，且進一步其中該可操作的組合的表達產生含有親和標記物、可裂解標記物和目標肽的融合蛋白。15.權利要求14的載體，其中所述親和標記物是聚組氨酸、聚賴氨酸、聚天冬氨酸或聚穀氨酸。16.權利要求14的載體,其中所述可裂解標記物是Trp、His-Met、Pro-Met或非天然胺基酸。17.權利要求14的載體，其中所述目標肽選自由澱粉樣蛋白P、降鈣素、恩夫韋肽、依泊汀、依泊汀S、紅細胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖腦苷脂酶、胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長激素(hGH)、胰島素、胰島素A、胰島素B、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、幹擾素、利拉魯肽、促生長素抑制素、特立帕肽和組織纖溶酶原激活物(TPA)組成的組。18.權利要求14的載體，其進一步包含編碼包涵體指引肽的核苷酸序列。19.權利要求18的載體，其中所述包涵體指引肽選自由為類固醇異構酶的包涵體指引肽、類固醇異構酶的包涵體指引功能片段、類固醇異構酶的包涵體指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵體指引功能片段、或BRCA2的包涵體指引功能同系物組成的組。20.含有權利要求14的載體的細胞。21.包含親和標記物、可裂解標記物和目標肽的融合蛋白。22.根據權利要求21的融合蛋白，其中所述可裂解標記物選自由Trp、His-Met、Pro-Met和非天然胺基酸組成的組。全文摘要本發明涉及生產肽的方法和由此生產的肽。與現有技術方法生產肽相比，根據本發明生產肽可以更高效。本發明的生產方法具有產率、純度和/或價格上的優勢。還公開了營銷肽的方法。文檔編號C12P21/04GK102762739SQ201080059570公開日2012年10月31日申請日期2010年11月9日優先權日2009年11月9日發明者喬納森·卡拉瑟斯,布萊恩·海斯特爾,特拉維斯·涅姆科夫,米哈伊爾·普拉姆,萊斯利·布克斯,麥可·H·B·斯託威爾申請人:科羅拉多州立大學董事會(法人團體),阿米德生物有限公司