內切－β－N－乙醯葡糖胺糖苷酶基因的製作方法

2023-07-09 00:57:31

專利名稱：內切－β－N－乙醯葡糖胺糖苷酶基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase)基因，具體地說涉及得自毛黴菌屬的基因。此外，本發明涉及包含所述基因的重組質粒、用所述質粒轉化的生物體以及使用所述轉化體生產新型內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的方法。
背景技術：
糖蛋白廣泛見於動物組織、植物組織以及真核微生物的細胞膜和細胞壁等。
在近些年，糖蛋白的糖鏈在諸如細胞分化、致癌作用和胞間識別的機制中起重要作用已變得越來越清晰。為了闡明這些機制，對糖鏈結構及其功能之間的相關性進行了研究。作為達到這一目的的手段，當切割糖蛋白的糖鏈或當鑑定糖鏈的結構時，使用各種糖苷酶。這其中，內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶對連接天冬醯胺的糖鏈(N連接的糖鏈，N-糖鏈)起作用，並具有切割存在於所述糖鏈中的雙乙醯-幾丁二糖部分的作用，從而釋放出所述糖鏈。
因為內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶可以由蛋白部分中釋放出糖蛋白的糖部分，所以認為分析糖蛋白中的糖鏈功能和結構很重要。
可以將天冬醯胺連接的糖鏈根據其結構分為高甘露糖型(甘露聚糖(mannane)型糖鏈)、雜合型或複合型。
已知的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶包括Endo H(A.L.Tarentino和F.Maley，J.Biol.Chem.，249，811(1974))、Endo F(K.Takegawa等，Eur j.Biochem.，202，175(1991))和Endo A(K.Takegawa等，Appl.Environ.Microbiol.，55，3107(1989))。然而，這些酶僅對具有特定結構的糖起作用，並不對糖蛋白起作用，除非存在變性劑。
得自凍土毛黴(Mucor hiemalis)的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶能夠切割三觸角的複合型糖鏈，該糖鏈不僅涉及高甘露糖型(甘露聚糖型糖鏈)和雜合型鏈，而且涉及複合型鏈。此外，對於脫唾液酸(asialylated)型，切割能力擴展到四觸角雜聚糖鏈。而且，已知有可能使糖鏈由糖蛋白中釋放出來，而不使所述蛋白經受變性處理(S.Kadowaki等，Agric.Biol.Chem.，54，97(1990))。因此認為得自凍土毛黴的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶可用於研究糖蛋白的糖鏈和蛋白的功能和生理作用。
在另一方面，將得自酵母的甘露聚糖型糖鏈轉變成適於人類的糖鏈形式在工業上具有非常重要的意義。作為用於此轉變的方法，可以考慮通過用基因操作改善酵母糖鏈生物合成系統的體內轉變以及使用轉糖基反應的體外轉變。對於糖轉變，內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶需要具有如下特徵1)底物特異性，即既能切割甘露聚糖型又能切割複合型的能力；和2)進行為分解反應的反向反應的轉糖基反應的能力。因此認為得自凍土毛黴的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶可以成為實施所述轉變的適合酶。
本發明人已經提出了使用得自凍土毛黴的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的糖鏈轉變技術，該技術可以改變酵母糖鏈為適於人的形式(日本專利申請公開第Hei 7-59587號)。
為進行諸如以上的糖鏈轉變，需要製備大量高純度的可信酶。在此情況下，已經考慮了通過使用黴菌細胞的常規繁殖方法提高酶產量。然而，因為常規繁殖方法明顯受限於由使用紫外燈或誘變劑獲得的突變株中選擇所述酶的方法，所以難以分離穩定的突變體。此外，常規繁殖方法常常伴隨不良轉化。而且，因為黴菌通常產生蛋白酶，所以它們通常不適於生產用於糖轉變的酶。鑑於此，為了解決這些問題，必須進行許多純化步驟，此工作複雜且產量低。例如，培養屬於毛黴菌屬(一類絲狀黴菌)的微生物，即使對此培養物的上清液進行純化，仍不能防止蛋白酶汙染，並由於所述微生物的酶產量低而難以大量製備，因此該方法幾乎沒有實用價值。
據此，為了大量生產內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶，希望獲得所述酶的基因並通過使用基因工程生產該基因。此外，如果可以獲得該基因，可以預期能夠使用蛋白工程技術獲得提高了抗熱性和pH抗性並增加了反應速率的酶。然而，至今尚未報導基因克隆方面的嘗試。
發明公開本發明的一個目的是提供內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶、內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因、包含所述基因的重組載體、用所述載體轉化的生物和生產內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的方法。
本發明人通過他們對解決上述問題的深入細緻的研究，基於得自凍土毛黴的所述內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列信息，已成功獲得編碼來自cDNA文庫的所述酶的基因，所述cDNA文庫由生產所述酶的細菌—凍土毛黴製備，本發明人進一步在酵母中成功表達了此基因，從而完成了本發明。
因此，本發明提供以下(a)或(b)的重組蛋白(a)包含SEQ ID NO3表示的胺基酸序列的蛋白；和(b)包含衍生自缺失、置換、插入或添加至少一個胺基酸的SEQ IDNO3表示的胺基酸序列的胺基酸序列並具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
此外，本發明提供編碼以下(a)或(b)的蛋白的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因，以及在嚴格條件下與所述基因雜交並包含編碼具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA的基因。
(a)包含SEQ ID NO3表示的胺基酸序列的蛋白；和(b)包含衍生自缺失、置換、插入或添加至少一個胺基酸的SEQ IDNO3表示的胺基酸序列的胺基酸序列並具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
此外，本發明提供包含以下(c)或(d)的DNA的基因(c)由SEQ ID NO2表示的核苷酸序列組成的DNA；和(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2表示的核苷酸序列組成的DNA雜交並編碼具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA。
所述基因包括得自屬於毛黴菌屬的微生物的基因。
此外，本發明提供包含所述基因的重組載體。
此外，本發明提供包含所述重組載體的轉化體。
此外，本發明提供生產內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的方法，該方法包括培養所述轉化體並由獲得的培養產物中收集內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
以下將詳細描述本發明。
本發明的特徵在於培養產生內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的微生物，由獲得的培養物中純化內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶，根據所述酶的部分胺基酸序列設計簡併探針，通過進行PCR克隆編碼所述酶的基因，並進一步克隆編碼來自產生內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的微生物的cDNA文庫的所述酶的基因。此外，本發明的特徵在於通過引入克隆的基因到載體中獲得重組載體，以及通過引入所述重組載體到宿主細胞中獲得轉化體。此外，本發明的特徵在於通過培養所述轉化體大量生產內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。1.培養產生內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的微生物用於生產內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的微生物包括屬於毛黴菌屬的微生物，優選凍土毛黴，更優選是保藏在國立生命科學和人體技術研究所，工業科學和技術局(1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)的凍土毛黴(保藏號FERM BP-4991)。
用於培養這些菌株的培養基組分可以是通常用於培養微生物的任何類型培養基組分。
碳源包括例如糖，諸如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖、麥芽糖、可溶性澱粉和糊精。氮源包括酵母提取物、胰蛋白腖等。至於無機鹽，除包含於上述氮源中的無機鹽之外，還可以使用諸如所有種類的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和磷酸鹽的鹽。可任選地加入維生素。
所述培養基通過常規方法滅菌，並將所述菌株接種到該培養基中。此後於20-30℃、pH 5-7振蕩培養或通氣攪拌培養2至4天。
在本發明中，優選於25-30℃、pH 6、良好通氣條件下，用半乳糖作為碳源，用酵母提取物和胰蛋白腖作為氮源，進行3至4天的培養，每種碳源和氮源的濃度都為2-3％，碳源與氮源的比率為2∶3。當在上述條件下進行培養時酶產量最大，與已知方法(S.Kadowaki等，Agric Biol.Chem.，54，97(1990)；葡萄糖0.5％，酵母提取物1％，蛋白腖1％)相比，可以獲得約10倍高的產量。
此外，在本發明中，為確保培養所述微生物時的通氣條件，最好使用小型發酵罐(jar fermenter)。2.純化內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶由上述細菌菌株生產的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的特徵在於保有以下活性。換句話說，其特徵可能在於以下活性即作用於糖蛋白中的連接天冬醯胺的糖鏈，切割在所述糖鏈中的雙乙醯-幾丁二糖部分，並由此釋放出所述糖鏈。
可以通過適當組合已知用於分離和純化的方法，進行內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的純化。所述方法的實例包括利用溶解性差異的方法，諸如鹽沉澱和溶劑沉澱；利用分子量差異的方法，諸如透析、超濾、凝膠過濾和SDS-聚丙烯醯胺電泳；利用靜電電荷差異的方法，諸如離子交換層析；利用疏水性差異的方法，諸如疏水層析和反相層析，以及利用等電點差異的方法，諸如等電聚焦。
在本發明中，通過採用改進了上述已知方法(S.Kadowaki等，Agric Biol.Chem.，54，97(1990)的培養方法，並進行多步純化，可以有效純化內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶，並有可能獲得足量的蛋白，以測定獲得所述基因必需的胺基酸序列。由純化和對下文將描述的基因的分析結果可知，獲得的酶由分子量約85,000的單一基因產物組成，並在翻譯後部分消化所述基因產物之後發現其由2個或2個以上的包括分子量約60,000和14,000的肽的亞單位組成。3.克隆新的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因顯然，得自凍土毛黴的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶由至少2個或2個以上的肽組成。
一般來說，當分離編碼特異性蛋白的基因時，測定該蛋白的部分胺基酸序列，並可用由簡併密碼子組成的寡核苷酸的混合物作為探針，從基因文庫中分離目的基因。此外，通過諸如在本發明中的PCR獲得片段後，可以使用此片段作為探針由基因文庫中分離目的基因。
然而，由於內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶是由2個或2個以上的亞單位組成的雜寡聚物分子，所以存在每個亞單位分別由它們各自不同的基因編碼的可能性。而且，即使內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶衍生自一個基因，其結構，例如在結構基因中編碼所述兩個亞單位的區之間的位置關係，仍不明確。
因此，本發明人測定了2個亞單位的部分胺基酸序列，然後在通過PCR獲得部分片段後，使用所述片段作為探針獲得cDNA克隆，並通過分析基因結構，闡明所述基因編碼的這2個亞單位。即，很明確是由編碼內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的基因生產為一個多肽的新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶，並通過部分分解將其加工成為2個或2個以上的亞單位。
本發明所述基因通過例如以下方法克隆。(1)克隆內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因在本發明中，包含編碼新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的基因的DNA片段的實例是由圖2所示的限制酶圖譜表示的DNA片段。此片段可以使用基因工程方法(參見例如在Molecular CloningALaboratoy Manual(Sambrook，Maniatis等，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989))中描述的方法)，採用mRNA模板從cDNA文庫中分離，所述mRNA模板由屬於毛黴菌屬的微生物製備，優選由凍土毛黴製備，更優選由保藏在國立生命科學和人體技術研究所保藏號為FERM BP-4991的凍土毛黴菌株製備。
可以按照典型方法進行mRNA的製備。例如，在培養所述mRNA源凍土毛黴後，用可在市場上購買的試劑盒(ISOGEN(Nippon GeneCompamy))由培養的細胞中獲得總的RNA，然後用可在市場上購買的純化試劑盒(mRNA純化試劑盒(Pharmacia Biotech))純化。在mRNA製備中，最好是使培養時間短，以控制mRNA的分解。
將由此獲得的mRNA用作模板，使用寡脫氧胸苷酸引物和逆轉錄酶合成單鏈cDNA。於是由所述單鏈cDNA合成雙鏈cDNA。然後通過將所述雙鏈cDNA摻入到合適的克隆載體中，構建重組載體。可以通過用所獲得的重組載體轉化大腸桿菌(E.Coli)，並用四環素抗性和氨苄青黴素抗性作為指徵選擇轉化體，獲得cDNA文庫。
在本文中，按照諸如Hanahan法(Hanahan，D.J. Mol.Biol.166557-580(1983))的方法進行大腸桿菌的轉化。當準備用質粒作為載體時，它必需包括抗諸如四環素或氨苄青黴素的藥物的基因。此外，可以使用非質粒的克隆載體，例如λ噬菌體等。
從由此獲得的轉化體中選擇(篩選)具有目的DNA的菌株。篩選方法包括例如合成對應於內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列的有義和反義引物，並使用其進行聚合酶鏈式反應(PCR)的方法。模板DNA可以包括例如基因組DNA或通過逆轉錄由以上提及的mRNA合成的cDNA。至於所述有義鏈的引物，例如可以使用基於胺基酸序列PSLQLQPDDK(SEQ ID NO4)合成的5′-CARTTRCARCCNGAYGAYAA-3′(SEQ ID NO5)，以及基於胺基酸序列SYRNPEIYPTDQNIK(SEQ ID NO6)合成的5′-CCHACNGAYCARAAYATYAA-3′(SEQ ID NO7)。此外，關於所述反義鏈，可以使用基於胺基酸序列SYRNPEIYPTDQNIK(SEQ ID NO6)合成的3′-GGDTGNCTRGTYTTRTARTT-5′(SEQ ID NO8)，以及基於胺基酸序列GQRFNHRESHDVETEI(SEQ ID NO9)合成的3′-TTYCCDGTYGCDAARTTRGT-5′(SEQ ID NO10)。然而，本發明不限於這些引物。
這樣，用例如32P、35S或生物素標記所獲得的DNA擴增片段，並將其作為探針，然後使其與所述轉化體的cDNA文庫雜交，所述文庫已經變性並在硝化纖維素膜上固定，然後可以通過查找所獲得的陽性菌株進行篩選。(2)測定所述核苷酸序列對所獲得的克隆的核苷酸序列進行測定。可以通過已知的方法，諸如Maxam-Gilbert化學修飾法或雙脫氧法，對所述核苷酸序列進行測定，儘管典型的序列測定是使用自動化核苷酸測序儀(例如PERKIN-ELMER 377A DNA測序儀)進行。
SEQ ID NO1表示所述內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的全長序列。其中，本發明所述基因的優選實施例為SEQ ID NO1表示的核苷酸序列的位置71至位置2305的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。此外，本發明所述基因不僅包括編碼SEQ ID NO3表示的胺基酸序列或下文描述的具有等價序列的胺基酸序列的序列，而且包括編碼同一多肽的簡併異構體(僅在於簡併密碼子不同)。
使用諸如定點誘變的方法，可以製備編碼具有等價序列的胺基酸序列的核苷酸序列。即可以通過已知方法，諸如Kunkel法或缺口雙鏈體法(Gapped duplex method)，或其它的等價方法，使用例如使用定點誘變的突變產生試劑盒(例如Mutant-K(Takara)，Mutant-G(Takara))等，或使用Takara的LA PCR體外誘變系列試劑盒，產生突變。
此外，內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因不僅包括由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2表示的核苷酸序列組成的DNA，而且包括在嚴格條件下與所述DNA雜交並編碼具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA。嚴格條件意指例如鈉濃度為50-300mM(優選150mM)和溫度為50-68℃(優選65℃)的條件。
一旦鑑定了所述內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，則由於測定了具有所述核苷酸序列的位置71至2305的序列(可讀框)的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO2)，所以可通過化學合成；通過使用基因組DNA作為模板以及使用所述可讀框(SEQ ID NO2)的5′和3′末端序列(例如5′-ATGCCTTCACTTCAATTGCAACC-3′(SEQ ID NO11)和5′-CTAGTTTAATGACAAATCTATGC-3′(SEQ ID NO12))作為引物的PCR；或通過與作為探針的具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列的DNA片段雜交，獲得所述內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因。
將包含本發明所述基因的質粒pZL-Endo(參見下文實施例3)引入到大腸桿菌DH10B中(命名為DHBpZL-Endo)，並於1998年4月28日保藏於國立生命科學和人體技術研究所(1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，獲得保藏號為FERM BP-6335。
在本發明中，提供SEQ ID NO3表示的胺基酸序列或包含等價序列的多肽，作為重組新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的優選實例。在本文中，「等價序列」是指包含SEQ ID NO3表示的胺基酸序列並在其中插入、置換、缺失或添加至少一個胺基酸至任一端並保留所述新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的序列。在此等價序列中保留新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性是指所述序列保持的活性足以使其以和具有SEQ ID NO3表示的全長序列的多肽幾乎相同的方式在與該多肽相同的條件下，以利用該活性的實際應用形式使用。顯然，對於本領域的技術人員而言，可以選擇和生產這種相對於SEQ ID NO3表示的序列的等價序列，而沒有特別的困難。例如，在SEQ ID NO3表示的胺基酸序列中，可以缺失至少1個、優選1-10個、更優選1-5個胺基酸；可以添加或插入至少1個、優選1-10個、更優選1-5個胺基酸；或可以置換至少1個、優選1-10個、更優選1-5個胺基酸。因此，本發明所述蛋白包括具有在序列表中SEQ ID NO3表示的胺基酸序列的位置2至744的胺基酸序列的多肽(其中SEQ ID NO3表示的胺基酸序列的位置1的蛋氨酸已經缺失)。在本文中，通過對本發明的部分胺基酸序列的分析和基因結構分析，明確的是，通過在SEQ ID NO3表示的胺基酸序列中的至少位置510的組氨酸和位置627的天冬醯胺的C端側切割前體多肽，產生2個或2個以上的天然類型的亞單位。2.構建重組載體和轉化體本發明提供包含本發明所述基因的DNA分子，尤其是表達載體。此DNA分子可以通過將編碼按照本發明的新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的DNA片段摻入到載體分子中獲得。因此，如果用DNA分子、尤其是為表達載體形式的DNA分子，進行宿主細胞的轉化，則有可能使本發明所述新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶在所述宿主細胞中生產，所述DNA分子包括編碼本發明所述新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的DNA片段，該片段的形式使得其可在所述宿主細胞中複製以及所述基因可表達。
可以基於在以上引用的Molecular CloningA Laboratory Manual(上文)中描述的方法構建按照本發明的DNA分子。(1)構建重組載體要用於本發明的載體可根據要使用的宿主細胞類型，適當選自病毒、質粒、粘粒載體等等。
例如，當所述宿主細胞為大腸桿菌時，可以使用λ噬菌體系的噬菌體、pBR系(pBR322、pBR325等)和pUC系(pUC118、pUC119等)的質粒；當所述宿主細胞為枯草桿菌(Bacillus subtilis)時，可以使用pUB系(pUB110等)的質粒；而當所述宿主細胞為酵母時，可以使用YEp和YCp系(例如YEp13、YEp24、YCp50等)的載體或用於以下實施例的pG-3-Not。此外，可以使用動物病毒(諸如逆轉錄病毒或痘苗病毒)載體或昆蟲病毒(諸如杆狀病毒)載體。
為將本發明所述基因引入到所述載體中，使用連接所述基因至所述載體的方法，諸如首先用合適的限制酶切割純化的DNA，然後在合適的限制位點或所述載體DNA的多克隆位點插入所述基因。
必須將本發明所述基因插入到所述載體中，以便顯示此基因的功能。因此，本發明所述載體最好包括選擇標記。藥物抗性標記和營養缺陷型標記可以用作選擇標記。
此外，用作本發明所述表達載體的DNA分子最好具有表達所述新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因必需的DNA序列，諸如轉錄調節信號和翻譯調節信號，例如啟動子、轉錄起始信號、核糖體結合位點、翻譯終止信號和轉錄終止信號。(2)構建所述轉化體可以通過將本發明所述重組載體引入到允許題述基因表達形式的宿主中，獲得本發明所述轉化體。對於可以使用的所述宿主沒有特別限制，只要其允許本發明所述基因表達。實例包括諸如大腸桿菌的埃希氏桿菌屬細菌、諸如枯草桿菌的桿菌屬細菌或諸如惡臭假單胞菌(Pseodomonas putida)的假單胞桿菌(Pseudomonas)屬細菌等，以及諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的酵母。
至於宿主細胞，除了大腸桿菌、枯草桿菌和酵母之外，還可以使用諸如COS細胞和CHO細胞等的動物細胞以及諸如Sf9和Sf21等的昆蟲細胞。
當使用諸如大腸桿菌的細菌作為宿主時，本發明所述重組載體最好在所述細菌中自主複製，並包含啟動子、核糖體結合位點、本發明所述基因以及轉錄終止序列。還可以包括控制所述啟動子的基因。
大腸桿菌的實例包括大腸桿菌K12、DH1、DH5α、JM109等。枯草桿菌的實例包括枯草桿菌MI 114、207-21等。已知存在分泌蛋白至微生物體外的枯草桿菌菌株。還已知幾乎不分泌任何蛋白酶的菌株。最好使用這些菌株作為宿主。
至於啟動子，當然可以使用即使在所述宿主中也能夠起作用的在插入片段中的啟動子。在大腸桿菌中的啟動子的實例包括乳糖操縱子(lac)和色氨酸操縱子(trp)等。
至於將所述重組載體引入到細菌中的方法，可以使用任何將DNA引入到細菌中的方法，對其沒有特別限制。實例包括使用鈣離子的方法[Cohen，S.N.等Proc.Natl.Acad Sci.，美國，692110-2114(1972)]和電穿孔。
當酵母要作為宿主時，可以使用釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、博伊丁假絲酵母等。在此情況下，對可以使用的啟動子沒有特別限制，只要其可以在酵母中表達。例如，可以優選使用諸如醇脫氫酶(ADH)啟動子、酸性磷酸酶(PHO)啟動子、半乳糖基因(GAL)啟動子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)啟動子、熱激蛋白啟動子、MFα1啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子和AOX1啟動子的啟動子。
至於將所述重組載體引入到酵母中的方法，可以使用任何將DNA引入到酵母中的方法，對其沒有特別限制。實例包括電穿孔[Backer，D.M.等Methods.Enzymol.，194182-187(1990)]、原生質球法[Hinnen，A.等Proc.Natl.Acad Sci.，美國，751929-1933(1978)]和乙酸鋰法[Itoh，H.J.Bacteriol.，153163-168(1983)]。
當動物細胞要作為宿主時，可以使用猴細胞COS-7、非洲綠猴腎細胞株系(Vero)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、小鼠L細胞、大鼠GH3細胞和人FL細胞等。至於啟動子，可以使用SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV啟動子或諸如此類的啟動子。還可以使用人巨細胞病毒的起始啟動子等等。
將所述重組載體引入到動物細胞中的方法實例包括電穿孔、磷酸鈣法和脂質轉染法。
當昆蟲細胞要作為宿主時，可以使用Sf9細胞、Sf21細胞和諸如此類的細胞。
將所述重組載體引入到昆蟲細胞中的方法的實例包括磷酸鈣法、脂質轉染和電穿孔。4.生產本發明所述蛋白本發明的蛋白具有由本發明的基因編碼的胺基酸序列，或具有其中已經引入所述至少1個胺基酸的修飾的所述胺基酸序列，並具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性。
可以通過培養上文提及的轉化體並由該培養產物中收集所述蛋白獲得本發明所述蛋白。「培養產物」是指培養上清液、培養的細胞或微生物細胞，或破碎的細胞或破碎的微生物細胞。
天然培養基或合成培養基可以用作培養由微生物(諸如大腸桿菌或酵母)作為宿主獲得的轉化體的培養基，只要其包含能夠被所述微生物吸收的碳源、氮源、無機鹽等，並可以用於對所述轉化體進行有效培養。
至於碳源，使用諸如葡萄糖、果糖、蔗糖和澱粉的碳水化合物；諸如乙酸和丙酸的有機酸以及諸如乙醇和丙醇的醇類。
至於氮源，使用諸如氨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨的無機酸；諸如乙酸銨的有機酸或其它含氮化合物，以及蛋白腖、肉膏、玉米漿等。
至於無機物，使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣等。
通常在諸如振搖培養或通氣攪拌培養的有氧條件下於37℃進行12至72小時的培養。在培養過程中，pH保持在4-7.5。使用無機酸或有機酸或鹼性溶液等對pH進行調節。
在培養過程中，可以根據需要向所述培養基中加入抗生素，諸如氨苄青黴素和四環素。
當培養用包含誘導型啟動子的表達載體轉化的微生物時，可以根據需要向所述培養物中加入誘導劑。例如當培養使用Lac啟動子的表達載體轉化的微生物時，可以向該培養物中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等，而當培養使用trp啟動子的表達載體轉化的微生物時，可以加入吲哚乙酸(IAA)。
至於用於培養由動物宿主細胞獲得的轉化體的培養基，使用通常使用的RPMI1640培養基、DMEM培養基或已加入胎牛血清等的這些培養基。
培養通常在5％CO2存在下於37℃進行2至10天。在培養過程中可以根據需要加入諸如卡那黴素和青黴素的抗生素。
培養後，當已在所述微生物或細胞中產生本發明所述蛋白時，通過破碎所述微生物或細胞提取本發明所述蛋白。當已在所述微生物或細胞外產生本發明所述蛋白時，可以原樣使用所述微生物或細胞的培養液，或可以使用通過離心分離等除去所述微生物或細胞的培養液。
通過適當組合已知的分離和純化方法，進行所述重組新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的純化。這些方法的實例包括利用溶解性差異的方法，諸如鹽沉澱和溶劑沉澱法；利用分子量差異的方法，諸如透析、超濾、凝膠過濾和SDS-聚丙烯醯胺電泳；利用靜電荷(化合價)差異的方法，諸如離子交換層析；利用疏水性差異的方法，諸如疏水層析和反相層析；以及利用等電點差異的方法，諸如等電聚焦。
在本發明中，正如以下實施例所指出，當所述基因在GAPDH啟動子控制下於釀酒酵母宿主中進行表達時，證實了細胞提取物中的高酶活性。這表明，通過在所述重組體中表達本發明所述基因，可以大量產生活性新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
附圖簡述

圖1是表示內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶純化結果的電泳圖片。
圖2是包含新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的全長序列的pZL-Endo的限制酶圖譜。
圖3表示在包含新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的全長序列的pZL-Endo的SalI-NotI位點插入的片段的完整核苷酸序列。
圖4表示在包含新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的全長序列的pZL-Endo的SalI-NotI位點插入的片段的完整核苷酸序列(圖3的延續)。
圖5顯示根據新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因推斷的胺基酸序列和編碼所述胺基酸序列的DNA的核苷酸序列。
圖6顯示根據新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因推斷的胺基酸序列和編碼所述胺基酸序列的DNA的核苷酸序列(圖5的延續)。
圖7顯示根據新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因推斷的胺基酸序列和編碼所述胺基酸序列的DNA的核苷酸序列(圖6的延續)。
圖8顯示表達載體pGEndo-SC的結構，它包含用於釀酒酵母的新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因。
圖9是表示在其中已引入新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的酵母中表達所述酶的層析圖片。
實施本發明的最好方式以下將利用實施例更具體地描述本發明。然而，要考慮的是本發明的技術範圍不限於這些實施例。除非本文另有說明，否則按照在Molecular CloningA Laboratoy Manual(Sambrook，Maniatis等，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))中描述的方法進行所述步驟。實施例1檢測酶活性基本上按照在S.Kadowaki等，Agric.Biol.Chem.，54，97(1990)中指出的方法對內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的活性進行檢測。即，使用丹磺醯化人脫唾液酸運鐵蛋白糖肽(DNS-GP)作為底物，在磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中於37℃進行反應，並在以下條件下通過薄層層析(TLC)或通過HPLC檢測活性。用於TLC的分析條件展開相HPTLC矽膠60(Merck)溶劑丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1檢測通過螢光法檢測用於HPLC的分析條件柱TSK-膠ODS80TM(TOSO)溶劑25mM硼酸鈉緩衝液(pH 7.5)+11％乙腈柱溫50℃流速；0.5ml/分鐘檢測器螢光檢測器將活性定義為1單位等於在上述HPLC檢測條件下1分鐘產生1μmol丹磺醯化天冬醯胺醯乙醯葡糖胺所需的酶的量。實施例2培養凍土毛黴將100ml培養基(半乳糖2％，酵母提取物3％)置於500mlSakaguchi瓶中，用1/3至1/5斜面的凍土毛黴孢子接種，於28℃進行2天的培養。通過吸濾從所述培養物中分離微生物細胞，用於製備mRNA。
關於所述酶的製備，將培養後的上述培養物轉移到在3升小型發酵罐中的2升所述培養基中，在28℃、300-400rpm轉速和2升/分鐘通氣體積的條件下進行4天的培養。實施例3純化新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶對在實施例2中獲得的4升所述培養物(來自在3升小型發酵罐中進行的兩批培養)進行吸濾，以分離所述細胞，並使用超濾濃縮至200ml.將此粗製酶溶液進行離子交換層析(Pharmacia Q SepharoseFF，500ml)，該層析柱用包含5mM EDTA的10mM磷酸鉀緩衝液平衡。用相同緩衝溶液清洗該柱，接著用900ml線性梯度的0M-0.3MNaCl洗脫。向活性流分中加入試劑，以便獲得1M硫酸銨、包含5mMEDTA的50mM磷酸鉀的終濃度。將所述產物進行疏水層析(TOSOPhenyl-TOYOPEARL 650S 200ml)，該層析柱用相同緩衝液平衡。用此相同緩衝液清洗該柱，然後用線性梯度的包含1mM EDTA的1M-0M硫酸銨洗脫內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
用超濾膜(截流分子量13000)將獲得的洗出液濃縮至5ml，然後用包含1mM EDTA和0.15M NaCl的10mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)清洗並脫鹽。接下來將所述活性流分上凝膠過濾層析柱(PharmaciaSephacryl S300)，該柱用相同緩衝溶液平衡，並用相同緩衝溶液洗脫內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
用超濾膜(截流分子量13000)濃縮所述活性流分，然後用包含1mM EDTA的10mM磷酸鉀(pH 7.0)清洗並脫鹽。接下來對所述活性流分進行羥磷灰石層析(TOSO TSK-凝膠HA1000)，該層析柱用相同緩衝溶液平衡。用此相同緩衝溶液清洗該柱，然後用線性梯度的包含1mM EDTA的0M-0.3M硫酸銨(pH 7.0)(30ml)洗脫內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
用超濾膜(截流分子量13000)濃縮所述活性流分，然後用25mM雙Tris緩衝溶液(用亞氨基二乙酸調節至pH 7.1)清洗並脫鹽。對所述活性流分進行等電點層析(Pharmacia，MonoQ)，該層析柱用相同緩衝溶液平衡。用此相同緩衝溶液清洗該柱，然後用50ml的10％Polybuffer 74(Pharmacia)(用亞氨基二乙酸調節至pH 3.9)洗脫內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
用超濾膜(截流分子量13000)濃縮所述活性流分，然後用包含1mM EDTA的10mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)清洗並脫鹽。接下來對所述活性流分進行離子交換層析(Pharmacia，MonoQ)。用此相同緩衝溶液清洗該柱，然後用線性梯度的0M-0.3M NaCl(30ml)洗脫內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
用超濾膜(截流分子量13000)濃縮所述活性流分，然後用包含1mM EDTA的50mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)清洗並脫鹽，以獲得酶樣品。應當注意的是每個柱層析都使用FPLC(Pharmacia)進行。
使用BioRad生產的蛋白質檢定試劑盒或通過吸光度(280nm)檢測所述蛋白的量。通過SDS-PAGE(15-25％梯度)、凝膠過濾層析、IEF-PAGE等檢測所述蛋白的分子量和等電點。
根據在Native-SDSPAGE和IEF-SDSPAGE的雙向電泳和在上述層析中的每個所述流分的活性，並根據SDS-PAGE分析的結果，檢測到在SDS-PAGE上的至少60kDa(用p60代表)和14kDa(用p14代表)的帶(圖1)。實施例4測定新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列按照Iwamatsu法(Seikagaku(Biochemistry)63，139-143(1991))對部分胺基酸序列進行分析。在電泳緩衝溶液(10％甘油、2.5％SDS、2％2-巰基乙醇、62mM Tris-HCl緩衝液(pH 6.8))中懸浮純化的酶，並進行SDS聚丙烯醯胺電泳。電泳後，通過電印跡將所述酶由所述凝膠轉移到10cm×7cm PVDF膜((ProBlot)Applied Biosystems)。使用ZARUTO Blot II型(Zarutorius)作為電印跡裝置，於160mA進行1小時的電印跡。轉移後，切除所述酶轉移至其上的所述膜部分，將此部分的一部分直接用氣相蛋白質測序儀分析，從而測定N端胺基酸序列。此外，在300μl的還原緩衝溶液(8M鹽酸胍、0.5M Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)、0.3％EDTA、2％乙腈)中浸泡剩餘的膜，加入1mg二硫蘇糖醇(DTT)，在氬氣存在下於25℃進行約1小時的還原。向其中加入溶解在10μl 0.5N氫氧化鈉溶液中的3.0mg一碘乙酸，並在黑暗條件下攪拌20分鐘。取出PVDF膜，在用2％乙腈充分清洗後將其浸泡在包含0.5％聚乙烯吡咯烷酮-40的100mM乙酸中，並使其靜止30分鐘。其後，用水徹底清洗所述PVDF膜。由所述膜切下1mm2，將其浸泡在消化緩衝液(8％乙腈、90mM Tris-HCl緩衝液pH 9.0)中，向其中加入1pmol Acromobacter蛋白酶I(Wako Pure ChemicalsInduatries)。然後於室溫消化所述酶15分鐘。通過在C18柱(Wakosil ARII C18 300 2.0×150mm(Wako Pure Chemicals Induatries))上的反相高效液相層析分離所述消化產物，並獲得每個亞單位的7個肽片段。
至於用於所述肽的洗脫溶劑，使用溶劑A(0.05％三氟乙酸)和溶劑B(2-丙醇/乙腈溶液7∶3，包含0.02％三氟乙酸)，並用2-50％線性濃度梯度的溶劑B以0.25ml/分鐘的流速進行40分鐘的洗脫。
分析得自新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶候選蛋白的肽片段的胺基酸序列。得自p60的片段和得自p14的片段分別命名為p60-AP和p14-AP。使用氣相蛋白測序儀PPSO-10(Shimadzu)，採用Edman降解法根據說明書對獲得的肽片段進行測序。
獲得的部分胺基酸序列示於表1。
表1-內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶候選蛋白的部分胺基酸序列p60p60-AP-5 PSLQLQPDDK (SEQ ID NO17)p60-AP-6(K)SYRNPEIYPtDQNIK (SEQ ID NO18)p60-AP-8(K)FNVSSVALQPRVK (SEQ ID NO19)p60-AP-9(K)MDRLFLCGgK (SEQ ID NO20)Sp60-AP-11 (K)GQRFNHREShDVETEI(SEQ ID NO21)mal p llltp14p14-AP-1(K)EGYISSSGSIDLSLN (SEQ ID NO22)在表1描述的胺基酸序列中，由字母表的小寫字體字母表示的胺基酸是在所述胺基酸序列中未測定的胺基酸。
因為應用在部分胺基酸序列上的Acromobacter蛋白酶I特異性切割賴氨酸殘基的羧基側，所以已將K(賴氨酸)記入在下文所述序列的N端側的括號中。
因為所述p60-AP-5見於胺基酸序列的N端，所以去除括號中的K(賴氨酸)。
關於p60和p14的Acromobacter蛋白酶I消化產物，也用在線質量分析儀(PE Sciex API-III)連同在C18柱(GL Science Inertsil ODS-30.5×40mm)上的反相高效液相層析(Hitachi L6200)對分子量進行分析。分析結果示於表2。表2通過LC/MS分析60kDa肽(p60)和14kDa肽(p14)的Lys-C消化產物的結果

*B代表羧甲基半胱氨酸。
在表2中，具有質量(M+H+)檢測值701.50的片段為p60-AP-7，而檢測值1541.50的片段幾乎同p14-AP-3的分子量一樣，並發現在該C端的胺基酸不是K(賴氨酸)。關於用Acromobacter蛋白酶I消化的所述片段，因為所述亞單位自身的片段而不是C端片段將由於所述底物對該酶的特異性而具有為賴氨酸(K)的C端胺基酸殘基，所以這些肽片段明顯是所述亞單位p60和p14的C端片段。
使用蛋白質資料庫BLASTP對測定的p60和p14部分胺基酸序列進行同源性檢索，結果表明獲得的序列是新的。根據以上結果，對p60和p14進行基因克隆，選擇所述p60和p14作為內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶候選物。實施例5構建凍土毛黴菌株cDNA文庫。
首先，使用ISOGEN(Nippon Gene，Inc.)由5克在實施例2中獲得的微生物中提取總的RNA。使用mRNA純化試劑盒(PharmaciaBiotech)由提取的總的RNA中純化mRNA。使用用於cDNA合成的SuperScriptTMλ系統和λ克隆試劑盒(GIBCO BRL)，由所述mRNA合成cDNA，然後將其連接至Sal I連接物，並最終連接至λZipLoxTMSalI-Not Arms(GIBCO BRL)。使用Gigapack III Gold Packaging Extract(Stratagene)進行包裝，用於感染大腸桿菌Y1090菌株，從而構建所述cDNA文庫。實施例6克隆新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶cDNA。
消化基於部分胺基酸序列p60-AP-5、p60-AP-6、p60-AP-11的PCR引物。這些序列示於下文。本文使用的符號全部基於IUPAC-IUB。p60-AP-5p60-AP-5F5′CARTTRCARCCNGAYGAYAA 3′(有義引物)(SEQ ID NO5)p60-AP-6p60-AP-6F5′CCHACNGAYCARAAYATYAA 3′(有義引物)(SEQ ID NO7)p60-AP-6R3′GGDTGNCTRGTYTTRTARTT 5′(反義引物)(SEQ ID NO8)p60-AP-11p60-AP-11R 3′TTYCCDGTYGCDAARTTRGT 5′(反義引物)(SEQ ID NO10)通過酚法由凍土毛黴大量培養物中純化基因組DNA，並在進行基因組PCR(94℃ 30秒，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，30個循環)時，證實特異性擴增的條帶。關於p60，用組合的p60-AP-5F和p60-AP-11R引物獲得1.7kb的PCR片段，用組合的p60-AP-5F和p60-AP-6R引物獲得1.5kb的PCR片段，而用組合的p60-AP-6F和p60-AP-11R引物獲得0.2kb的PCR片段。關於此片段，使用pCR-Script克隆試劑盒(Stratagene)將其亞克隆到pCR-Script Amp中。由限制酶消化分析可知，p60-AP-5F和p60-AP-11R的擴增片段包括p60-AP-5F和p60-AP-6R的擴增片段以及p60-AP-6F和p60-AP-11R的擴增片段。因此，使用PRISM Ready反應試劑盒(Applied Biosystems)和PRISM 377DNA測序儀(Applied Biosystems)測定p60-AP-5F和p60-AP-11R的擴增片段的核苷酸序列。使用DNASIS(Hitachi Software Engineering Co.，Ltd.)等進行基因分析。
結果，p60-AP-5F和p60-AP-11R的擴增片段包括測定的其它部分胺基酸序列。因此確定此片段為p60基因的一部分。於是基於所述PCR擴增片段的內部序列構建新DNA引物，然後使用AccessRT-PCR系統(Promega)，並用在實施例5中獲得的mRNA作為模板，(在和基因組PCR一樣的條件下)進行RT-PCR。新構建的DNA引物的序列如下p60-AP-5NF 5′CACTTAAGTCTATGAATGAG 3′(有義引物)(SEQ ID NO13)p60-AP-6NR 3′CGATAGCTTTAGGTCTCTAA 5′(反義引物)(SEQ ID NO14)結果，擴增了約1.2kb的片段。在對擴增的片段測序時發現已經獲得了不包括內含子的片段。因此，使用此片段作為探針進行cDNA克隆。使用Megaprime DNA標記系統(Amersham)用α-32PdCTP(110TBq/mmol)進行標記。
通過噬菌斑雜交由在實施例5中獲得的cDNA文庫得到全長基因。結果，由200,000噬菌斑中獲得5個陽性克隆。其中4個克隆進行二次篩選，從而獲得單一噬菌斑。此外，用由所述噬菌斑獲得的噬菌體流體感染大腸桿菌DH10B，並由所述噬菌體回收衍生自pZL1的質粒。對這些克隆進行限制酶分析，並對包含最長上遊區的克隆進行核苷酸序列分析。此質粒稱為pZL-Endo(圖2)。
測定插入的約2.3kb的Sal I-Not I片段的核苷酸序列。換言之，將所述限制片段亞克隆到pBluescript II KS+(Stratagene)或pUC118(Takara Shuzo)中，並通過用外切核酸酶III和綠豆核酸酶產生連續的缺失突變體，構建具有各種缺失突變的質粒，以及用DNA測序儀測定包括2370bp的Sal I-Not I片段的序列(圖3-4，SEQ ID NO1)。
對所述結構基因的預定區進行分析，發現存在編碼由744個胺基酸殘基組成的胺基酸序列(推斷分子量85kDa，圖5-7，SEQ ID NO2)的可讀框，此胺基酸序列包含所有測定的p60和p14的部分胺基酸序列。因為在N端側的p60-AP-5的下一個胺基酸不是賴氨酸而是蛋氨酸，所以證實編碼此蛋氨酸的ATG是翻譯的起始密碼子。因此已經明確，本發明所述酶的N端是脯氨酸。
在另一方面，正如定性分析結果一樣，發現p14-AP-3位於本發明所述基因編碼的蛋白的C端。此外，結合質量分析的結果可知，至少一種類型的p14的N端是絲氨酸，該胺基酸位於SEQ ID NO2表示的胺基酸序列中的位置628。
根據以上所述，顯然本發明所述基因的5′區編碼p60，而3′區編碼p14。因為在所述胺基酸序列中沒有發現N端信號序列，所以認為本發明所述酶是胞內蛋白。然而，由於在圖1中存在多個條帶，故認為本發明所述酶受到由細胞裂解產生的蛋白酶作用的影響。實施例7構建所述內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶表達載體在此實施例中，構建用於釀酒酵母的互補於TRP1基因的表達載體，它包括內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因和GAPDH基因啟動子-PGK終止子。
為獲得在實施例3中證實的編碼744個胺基酸的可讀框，合成基於與所述N端和C端的胺基酸序列等價的DNA序列的DNA引物，所述胺基酸序列的兩個末端都已經加入Not I位點，用pZL-Endo作為模板進行PCR，從而獲得擴增的片段。以下是所述有義和反義引物的序列Endo-Not-F(有義引物)5′GGGGCGGCCGCTTTTATTTTACATAAATATGCCTTCACTTC3′(SEQ ID NO15)Endo-Not-R(反義引物)5′CCCGCGGCCGCCTAGTTTAATGACAAATCTATGCTACC3′(SEQ ID NO16)在通過瓊脂糖凝膠電泳分離後，回收擴增的片段，並使用Prep-A-Gene DNA純化系統(Bio-Rad)對其純化。此外，在用Not I消化該片段後，對其純化並將其插入到pBluescript II KS+的Not I中，從而產生pBlue-Endo-Not。
因為新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因是衍生自黴菌的基因，所以認為其適於在酵母中表達。用表達載體pG-3構建用trp1基因作為選擇標記的用於釀酒酵母的表達質粒(Methods in Enzymology，第194卷，第389頁)，所述trp1基因包含釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GADPH)啟動子、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)基因終止子和色氨酸合成基因TRP1基因。通過用BamHI消化pG-3，用Klenow處理平端化，接著添加NotI連接體，構建所述pG-3-Not。
用NotI消化上述pBlue-Endo-Not，並通過瓊脂糖凝膠電泳分離和純化約2.3kb的插入片段。此片段於pG-3-Not的NotI位點插入，由此構建pG-Endo-SC(圖8)。實施例8在釀酒酵母中表達新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶使用酵母菌釀酒酵母YPH500菌株的pep4基因破壞的菌株(Stratagene)作為宿主。利用Sikorski，R.S.和Hieter，P的方法(Genetics第122卷19-27(1989))生產pep4基因破壞的菌株。用10μg pGEndo-SC轉化所述菌株。用乙酸鋰法(參見WO95/32289)進行轉化，並在不包括色氨酸的培養平板(0.67％酵母含氮鹼基，0.5％酪蛋白胺基酸、1％葡萄糖)上選擇轉化體。
對所述轉化體的胞內新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性進行證實。所述轉化細胞於30℃在5ml YPD培養基(1％酵母提取物、2％聚腖、2％葡萄糖)中培養2天，於4℃以1500g進行5分鐘的離心，由此分離上清液和細胞物質。用蒸餾水清洗所述細胞物質。向所述細胞物質中加入10μl的50mM硫酸鉀緩衝液(pH 6.0)和5mM EDTA的混合物，並充分懸浮。此外，加入50mg的玻璃珠，並在劇烈攪拌後離心，取出上清液作為細胞提取物。
使用DNS-GP作為底物，通過TLC或HPLC進行活性檢測。TLC的結果示於圖9。如同所述樣品和純化自凍土毛黴培養上清液的所述酶反應一樣，由pGEndo-SC產物獲得和丹磺醯化天冬醯胺醯乙醯葡糖胺(DNS-Asn-GlcNAc)相同的峰。另一方面，沒有從用pG-3-Not轉化的陰性對照菌株的培養上清液中檢測到對應於DNS-Asn-GlcNAc的峰。將所述pGEndo-SC細胞提取物濃縮10倍，脫鹽，與DNS-GP反應，並在上述條件下使用HPLC分離對應於DNS-Asn-GlcNAc的峰。用蒸發器濃縮分離的樣品，緊接著進行質譜分析。結果證實，質譜結果和DNS-Asn-GlcNAc結果相匹配。因此由所述pGEndo-SC插入片段編碼的基因產物明顯是新的內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
表3顯示了每升培養物的本發明所述新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的活性(產物量)。該活性是凍土毛黴值的48倍。
表3新內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性

*由所述培養物收集細胞後，用玻璃珠破碎所述細胞。在採用離心分離上清液後，檢測所述上清液的活性，並由此值計算每培養體積的活性。
本說明書加入了在日本專利申請第10-141717號中的說明書和/或附圖中描述的內容，本申請的優先權以該專利申請為依據。
本文引用的所有公開出版物、專利和專利申請都通過引用整體結合到本文中。
工業適用性本發明提供內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶、內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因、包含所述基因的重組質粒、用所述質粒轉化的生物，以及生產內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的方法。
通過將包含本發明所述基因的載體引入到宿主中，並使所述基因表達，可以有效並大規模地生產內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
本發明所述酶是分析和測定糖鏈和糖鏈修飾的工業上重要的酶。通過本發明獲得的轉化體產生大量題述酶，並對使用這些酶的工業產生巨大貢獻。序列表獨立文本SEQ ID NO4內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列SEQ ID NO5根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列設計的寡核苷酸SEQ ID NO5n表示a、g、c或t(位置12)SEQ ID NO6內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列SEQ ID NO7根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列設計的寡核苷酸SEQ ID NO7n表示a、g、c或t(位置6)SEQ ID NO8根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列設計的寡核苷酸SEQ ID NO8n表示a、g、c或t(位置15)SEQ ID NO9內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列SEQ ID NO10根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列設計的寡核苷酸SEQ ID NO11根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的5′末端區設計的寡核苷酸序列SEQ ID NO12根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的3′末端區設計的寡核苷酸序列SEQ ID NO13根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列設計的寡核苷酸SEQ ID NO14根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列設計的寡核苷酸SEQ ID NO15根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列設計的寡核苷酸SEQ ID NO16根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列設計的寡核苷酸SEQ ID NO20Xaa表示Met或Ser(位置2)SEQ ID NO21Xaa表示Gly或Met(位置2)SEQ ID NO21Xaa表示Gln或Ala(位置3)SEQ ID NO21Xaa表示Arg或Leu(位置4)SEQ ID NO21Xaa表示Asn或Pro(位置6)SEQ ID NO21Xaa表示Arg或Leu(位置8)SEQ ID NO21Xaa表示Glu或Leu(位置9)SEQ ID NO21Xaa表示Ser或Leu(位置10)SEQ ID NO21Xaa表示His或Thr(位置11)SEQ ID NO27羧甲基半胱氨酸(位置3)SEQ ID NO28羧甲基半胱氨酸(位置6)SEQ ID NO33羧甲基半胱氨酸(位置8)
序列表110 KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA120內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因130PH-657-PCT140141150JP 98/1417171511998年5月22日16037170PatentIn，版本2.021012112369212DNA213凍土毛黴4001gtcgacccac gcgtccgcgg acgcgtgggc ggacgcgtgg gcggacgcgt gggttttatt 60ttacataaat atgccttcac ttcaattgca acctgatgac aaactagcac ctgtttcttt 120tgcacttaag tctatgaatg agttgaggga ctggacgcca gacgaaaaga taaagtttaa 180cgtttcaagc gtggcactac agcctcgtgt gaaaaacgcc ctgaaacctc aattattgtt 240aactcatgat atggcaggag gatataaaga agataaaaat attcaaggaa acaattataa 300agacatttat aacattcaat attggcattt agctgatact tttgtatatt tctctcatga 360gcgagttagc attcctccag tcaattggac aaatgcttgt catagaaatg gtgtaaagtg 420tttaggtact tttttagtag aaggaaataa ccaaatgcat gaaatggaag ccttgcttca 480cggtccacct ttacttaata acactgacga ccctatgaga ttatggagtc cgtattatgc 540agaccaatta gttgctattg ctaaacacta tggttttgat ggctggttgt tcaatattga 600atgcgaattc tttccttttc ctacaaatcc aaaattcaaa gctgaagagt tggcaaagtt 660tctacactat tttaaggaaa aattgcataa cgaaatacct ggatctcaac tcatttggta 720cgacagcatg acaaatgaag gagaaatcca ctggcagaac cagctcacat ggaaaaatga 780gttatttttt aaaaacacgg atggtatttt tttgaattat tggtggaaaa aagaataccc 840tgaaatggcg cgtagagtag ctgaaggaat aggtagatca ggtttagaag tttattttgg 900tacagatgta tggggaaggc atacttatgg tggcggtggt ttcaaatcat ataagggtgt 960aaaaactgcc tactctgcaa tgacatcttc tgcattattt ggtatggcat ggacatacga 1020gcatttcgaa aagtctgaat ttgaaaagat ggatcgtttg ttttggtgtg gtggtaaata 1080ctctgactat cctcccccac ctcctaaaaa cccagatgac gaaaaagaag tagaaagcga 1140tgatagtgaa gatgagctca tgtacggaca caagaaaggt attgctgaca cggtagaatc 1200tattcctgta ccaggaacag attggtttgt taccaatttt gatagggggt ttggaaatag 1260gttttattat agaggaaaga gattactttc tcagccttgg tcccatttat cgcatcaagc 1320tattctcccc aataaaagct atcgaaatcc agagatttat cccactgatc aaaacattaa 1380aatcactagt tctctcgatt gcgatcatgg agcttttctt ggtggaacct cgcttattat 1440caaaggccaa cgtttcaatc atagagaatc gcatgatgtt gaaactgaaa ttagtatacc 1500tctgtataag ctttcattag atgctagtaa aggatgctca ttgcgttata tttatagaac 1560tttgttgatg aaagatgtaa agttgacagt agcatgtcac ttttcgttaa aaacaaacga 1620ctcagttaat ttcttcaagg tatggcagcc agatgaaaat ttctcttttg aatatgatga 1680tggaatgaga gccactgtta caactgaaaa ttctaccgaa agcagatgct ttttattacg 1740tacaacagaa gaagatacag gagaaaatga ttggataaca aaaactatta atgtgcctgc 1800tgttccagaa ggaagtcaat tatacattac aagacttgaa gtgagcgtag tattagatac 1860agctggttta gtaggtcttg ttaatcaagt tattgcttgc ttgggatata ttagcatcat 1920accaactata aattctggaa taaaaacaga ttcatcacgc attattcagg atctcttttg 1980gaaagatcag aaatatacca aaatcggaaa agaaagttta gacgacatag ctcaagaaga 2040agttcataga tattatggaa cattgaactg ggaaaacaca gcaaatgtag taaacgcttg 2100ggaggaaata gattactaca acgtttttta caaagaaagt gacgactctg caactcgcat 2160ctttttagga acagcattct gtaatcaatt tcgtgtatct ggtttagata ttattttatc 2220taagctacca aagatagtta ttgaagctgt taacaaagaa ggatacatct cttcaagtgg 2280tagcatagat ttgtcattaa actaggactt gaaataaaat attatgataa agaaaaaaaa 2340aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ggcggccgc 236921022112235212DNA213凍土毛黴220221CDS222(1)..(2235)4002atg cct tca ctt caa ttg caa cct gat gac aaa cta gca cct gtt tct 48Met Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser1 5 10 15ttt gca ctt aag tct atg aat gag ttg agg gac tgg acg cca gac gaa 96Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu20 25 30aag ata aag ttt aac gtt tca agc gtg gca cta cag cct cgt gtg aaa 144Lys Ile Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gln Pro Arg Val Lys35 40 45aac gcc ctg aaa cct caa tta ttg tta act cat gat atg gca gga gga 192Asn Ala Leu Lys Pro Gln Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly
50 55 60tat aaa gaa gat aaa aat att caa gga aac aat tat aaa gac att tat 240Tyr Lys Glu Asp Lys Asn Ile Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asp Ile Tyr65 70 75 80aac att caa tat tgg cat tta gct gat act ttt gta tat ttc tct cat 288Asn Ile Gln Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His85 90 95gag cga gtt agc att cct cca gtc aat tgg aca aat gct tgt cat aga 336Glu Arg Val Ser Ile Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg100 105 110aat ggt gta aag tgt tta ggt act ttt tta gta gaa gga aat aac caa 384Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gln115 120 125atg cat gaa atg gaa gcc ttg ctt cac ggt cca cct tta ctt aat aac 432Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn130 135 140act gac gac cct atg aga tta tgg agt ccg tat tat gca gac caa tta 480Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gln Leu145 150 155 160gtt gct att gct aaa cac tat ggt ttt gat ggc tgg ttg ttc aat att 528Val Ala Ile Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn Ile165 170 175gaa tgc gaa ttc ttt cct ttt cct aca aat cca aaa ttc aaa gct gaa 576Glu Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu180 185 190gag ttg gca aag ttt cta cac tat ttt aag gaa aaa ttg cat aac gaa 624Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu195 200 205ata cct gga tct caa ctc att tgg tac gac agc atg aca aat gaa gga 672Ile Pro Gly Ser Gln Leu Ile Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly210 215 220gaa atc cac tgg cag aac cag ctc aca tgg aaa aat gag tta ttt ttt 720Glu Ile His Trp Gln Asn Gln Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe225 230 235 240aaa aac acg gat ggt att ttt ttg aat tat tgg tgg aaa aaa gaa tac 768Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr245 250 255cct gaa atg gcg cgt aga gta gct gaa gga ata ggt aga tca ggt tta 816Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly Ile Gly Arg Ser Gly Leu260 265 270gaa gtt tat ttt ggt aca gat gta tgg gga agg cat act tat ggt ggc 864Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly275 280 285ggt ggt ttc aaa tca tat aag ggt gta aaa act gcc tac tct gca atg 912Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met290 295 300aca tct tct gca tta ttt ggt atg gca tgg aca tac gag cat ttc gaa 960Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu305 310 315 320aag tct gaa ttt gaa aag atg gat cgt ttg ttt tgg tgt ggt ggt aaa 1008Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys325 330 335tac tct gac tat cct ccc cca cct cct aaa aac cca gat gac gaa aaa 1056Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys340 345 350gaa gta gaa agc gat gat agt gaa gat gag ctc atg tac gga cac aag 1104Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys355 360 365aaa ggt att gct gac acg gta gaa tct att cct gta cca gga aca gat 1152Lys Gly Ile Ala Asp Thr Val Glu Ser Ile Pro Val Pro Gly Thr Asp370 375 380tgg ttt gtt acc aat ttt gat agg ggg ttt gga aat agg ttt tat tat 1200Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr385 390 395 400aga gga aag aga tta ctt tct cag cct tgg tcc cat tta tcg cat caa 1248Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gln Pro Trp Ser His Leu Ser His Gln405 410 415gct att ctc ccc aat aaa agc tat cga aat cca gag att tat ccc act 1296Ala Ile Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr420 425 430gat caa aac att aaa atc act agt tct ctc gat tgc gat cat gga gct 1344Asp Gln Asn Ile Lys Ile Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala435 440 445ttt ctt ggt gga acc tcg ctt att atc aaa ggc caa cgt ttc aat cat 1392Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu Ile Ile Lys Gly Gln Arg Phe Asn His450 455 460aga gaa tcg cat gat gtt gaa act gaa att agt ata cct ctg tat aag 1440Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu Ile Ser Ile Pro Leu Tyr Lys465 470 475 480ctt tca tta gat gct agt aaa gga tgc tca ttg cgt tat att tat aga 1488Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr Ile Tyr Arg485 490 495act ttg ttg atg aaa gat gta aag ttg aca gta gca tgt cac ttt tcg 1536Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser500 505 510tta aaa aca aac gac tca gtt aat ttc ttc aag gta tgg cag cca gat 1584Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gln Pro Asp
515 520 525gaa aat ttc tct ttt gaa tat gat gat gga atg aga gcc act gtt aca 1632Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr530 535 540act gaa aat tct acc gaa agc aga tgc ttt tta tta cgt aca aca gaa 1680Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu545 550 555 560gaa gat aca gga gaa aat gat tgg ata aca aaa act att aat gtg cct 1728Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp Ile Thr Lys Thr Ile Asn Val Pro565 570 575gct gtt cca gaa gga agt caa tta tac att aca aga ctt gaa gtg agc 1776Ala Val Pro Glu Gly Ser Gln Leu Tyr Ile Thr Arg Leu Glu Val Ser580 585 590gta gta tta gat aca gct ggt tta gta ggt ctt gtt aat caa gtt att 1824Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gln Val Ile595 600 605gct tgc ttg gga tat att agc atc ata cca act ata aat tct gga ata 1872Ala Cys Leu Gly Tyr Ile Ser Ile Ile Pro Thr Ile Asn Ser Gly Ile610 615 620aaa aca gat tca tca cgc att att cag gat ctc ttt tgg aaa gat cag 1920Lys Thr Asp Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gln625 630 635 640aaa tat acc aaa atc gga aaa gaa agt tta gac gac ata gct caa gaa 1968Lys Tyr Thr Lys Ile Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp Ile Ala Gln Glu645 650 655gaa gtt cat aga tat tat gga aca ttg aac tgg gaa aac aca gca aat 2016Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn660 665 670gta gta aac gct tgg gag gaa ata gat tac tac aac gtt ttt tac aaa 2064Val Val Asn Ala Trp Glu Glu Ile Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys675 680 685gaa agt gac gac tct gca act cgc atc ttt tta gga aca gca ttc tgt 2112Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg Ile Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys690 695 700aat caa ttt cgt gta tct ggt tta gat att att tta tct aag cta cca 2160Asn Gln Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp Ile Ile Leu Ser Lys Leu Pro705 710 715 720aag ata gtt att gaa gct gtt aac aaa gaa gga tac atc tct tca agt 2208Lys Ile Val Ile Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser725 730 735ggt agc ata gat ttg tca tta aac tag 2235Gly Ser Ile Asp Leu Ser Leu Asn740 7452103211744212PRT213凍土毛黴4003Met Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser1 5 10 15Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu20 25 30Lys Ile Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gln Pro Arg Val Lys35 40 45Asn Ala Leu Lys Pro Gln Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly
50 55 60Tyr Lys Glu Asp Lys Asn Ile Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asp Ile Tyr65 70 75 80Asn Ile Gln Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His85 90 95Glu Arg Val Ser Ile Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg100 105 110Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gln115 120 125Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn130135 140Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gln Leu145 150 155 160Val Ala Ile Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn Ile165 170 175Glu Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu180 185 190Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu195 200 205Ile Pro Gly Ser Gln Leu Ile Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly210 215 220Glu Ile His Trp Gln Asn Gln Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe225 230 235 240Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr245 250 255Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly Ile Gly Arg Ser Gly Leu260 265 270Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly275 280 285Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met290 295 300Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu305 310 315 320Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys325 330 335Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys340 345 350Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys355 360 365Lys Gly Ile Ala Asp Thr Val Glu Ser Ile Pro Val Pro Gly Thr Asp370 375 380Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr385 390 395 400Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gln Pro Trp Ser His Leu Ser His Gln405 410 415Ala Ile Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr420 425 430Asp Gln Asn Ile Lys Ile Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala435 440 445Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu Ile Ile Lys Gly Gln Arg Phe Asn His450 455 460Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu Ile Ser Ile Pro Leu Tyr Lys465 470 475 480Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr Ile Tyr Arg485 490 495Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser500 505 510Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gln Pro Asp
515 520 525Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr530 535 540Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu545 550 555 560Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp Ile Thr Lys Thr Ile Asn Val Pro565 570 575Ala Val Pro Glu Gly Ser Gln Leu Tyr Ile Thr Arg Leu Glu Val Ser580 585 590Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gln Val Ile595 600 605Ala Cys Leu Gly Tyr Ile Ser Ile Ile Pro Thr Ile Asn Ser Gly Ile610 615 620Lys Thr Asp Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gln625 630 635 640Lys Tyr Thr Lys Ile Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp Ile Ala Gln Glu645 650 655Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn660 665 670Val Val Asn Ala Trp Glu Glu Ile Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys675 680 685Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg Ile Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys690 695 700Asn Gln Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp Ile Ile Leu Ser Lys Leu Pro705 710 715 720Lys Ile Val Ile Glu AlaVal Asn Lys Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser725730 735Gly Ser Ile Asp Leu Ser Leu Asn740210421110212PRT213人工序列220223內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列4004Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys1 5 10210521120212DNA213人工序列220223根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列設計的寡核苷酸220221修飾的鹼基22212223n代表a、g、c或t4005carttrcarc cngaygayaa20210621115212PRT213人工序列220223內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列4006Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr Asp Gln Asn Ile Lys1 5 10 15210721120212DNA213人工序列220223根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列設計的寡核苷酸220221修飾的鹼基2226223n代表a、g、c或t4007cchacngayc araayatyaa 20210821120212DNA213人工序列220223根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列設計的寡核苷酸220221修飾的鹼基22215223n代表a、g、c或t4008ttratrttyt grtcngtdgg 20210921116212PRT213人工序列220223內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列4009Gly Gln Arg Phe Asn His Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu Ile1 5 10 152101021120212DNA213人工序列220223根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的部分胺基酸序列設計的寡核苷酸40010tgrttraadc gytgdccytt 202101121123212DNA213人工序列220223內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的5′末端區的寡核苷酸序列40011atgccttcac ttcaattgca acc 232101221123212DNA213人工序列220223內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的3′末端區的寡核苷酸序列40012ctagtttaat gacaaatcta tgc 232101321120212DNA213人工序列220223根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的序列設計的寡核苷酸40013cacttaagtc tatgaatgag 202101421120212DNA213人工序列220223根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的序列設計的寡核苷酸40014gatctctgga tttcgatagc 202101521141212DNA213人工序列220223根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的序列設計的寡核苷酸40015ggggcggccg cttttatttt acataaatat gccttcactt c 412101621138212DNA213人工序列220223根據內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因的序列設計的寡核苷酸40016cccgcggccg cctagtttaa tgacaaatct atgctacc 382101721110212PRT213凍土毛黴40017Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys1 5 102101821116212PRT213凍土毛黴40018Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr Asp Gln Asn Ile Lys1 5 10 152101921114212PRT213凍土毛黴40019Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gln Pro Arg Val Lys1 5 102102021111212PRT213凍土毛黴220221肽2222223Xaa代表Met或Ser40020Lys Xaa Asp Arg Leu Phe Leu Cys Gly Gly Lys1 5 102102121117212PRT213凍土毛黴220221肽2222223Xaa代表Gly或Met220221肽2223223Xaa代表Gln或Ala220221肽2224223Xaa代表Arg或Leu220221肽2226223Xaa代表Asn或Pro220221肽2228223Xaa代表Arg或Leu220221肽2229223Xaa代表Glu或Leu220221肽22210223Xaa代表Ser或Leu220221肽22211223Xaa代表His或Thr40021Lys Xaa Xaa Xaa Phe Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Glu Thr Glu1 5 10 15Ile2102221116212PRT213凍土毛黴40022Lys Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ile Asp Leu Ser Leu Asn1 5 10 15210232119212PRT213凍土毛黴40023Lys Asn Ile Gln Gly Asn Asn Tyr Lys1 52102421111212PRT213凍土毛黴40024Lys Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys1 5 10210252118212PRT213凍土毛黴40025Lys Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys1 52102621113212PRT213凍土毛黴40026Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys1 5 102102721115212PRT213凍土毛黴220221肽2223223羧甲基半胱氨酸40027Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr Ile Tyr Arg Thr Leu Leu Met Lys1 5 10 15210282117212PRT213凍土毛黴220221肽2226223羧甲基半胱氨酸400 28Lys Leu Thr Val Ala Cys His1 52102921115212PRT213凍土毛黴40029Lys Pro Gln Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly Tyr Lys1 5 10 152103021114212PRT213凍土毛黴40030Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu Lys1 5 102103121110212PRT213凍土毛黴40031Lys Leu Ala Pro Val Ser Phe Ala Leu Lys1 5 102103221123212PRT213凍土毛黴40032Lys Gly Gln Arg Phe Asn His Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu1 5 10 15Ile Ser Ile Pro Leu Tyr Lys202103321122212PRT213凍土毛黴220221肽2228223羧甲基半胱氨酸40033Lys Ile Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala Phe Leu Gly Gly1 5 10 15Thr Ser Leu Ile Ile Lys202103421119212PRT213凍土毛黴40034Lys Asn Glu Leu Phe Phe Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr1 5 10 15Trp Trp Lys210352119212PRT213凍土毛黴40035Lys Ile Val Ile Glu Ala Val Asn Lys152103621111212PRT213凍土毛黴40036Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys1 5 102103721114212PRT213凍土毛黴40037Lys Thr Asp Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys1 5 10
權利要求
1.選自以下的重組蛋白(a)包含SEQ ID NO3代表的胺基酸序列的蛋白；和(b)包含衍生自缺失、置換、插入或添加至少一個胺基酸的SEQID NO3代表的胺基酸序列的胺基酸序列並具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
2.內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶基因，它編碼(a)具有SEQ ID NO3代表的胺基酸序列的蛋白；或(b)具有缺失、置換、插入或添加至少一個胺基酸的SEQ ID NO3代表的胺基酸序列並具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
3.包含以下DNA的基因(c)由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列組成的DNA；或(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2代表的核苷酸序列組成的DNA雜交並編碼具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA。
4.在嚴格條件下與按照權利要求2的基因雜交並包含編碼具有內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA的基因。
5.按照權利要求2至4中任一項的基因，其中所述基因衍生自屬於毛黴菌(Mucor)屬的微生物。
6.按照權利要求5的基因，其中所述屬於毛黴菌屬的微生物是凍土毛黴(Mucor hiemalis)。
7.包含按照權利要求2至6中任一項的基因的重組載體。
8.包含權利要求7的重組載體的轉化體。
9.生產內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶的方法，該方法包括培養按照權利要求8的轉化體並由所述培養產物中收集內切-β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶。
全文摘要
編碼以下蛋白(a)或(b)的內切－β－N－乙醯葡糖胺糖苷酶基因:(a)包含SEQ ID NO:3表示的胺基酸序列的蛋白;和(b)包含衍生自缺失、置換、插入或添加至少一個胺基酸的SEQ ID NO:3表示的胺基酸序列的胺基酸序列並具有內切－β－N－乙醯葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
文檔編號C12N1/19GK1376195SQ99808731
公開日2002年10月23日 申請日期1999年5月20日 優先權日1998年5月22日
發明者小林和男, 竹內誠, 巖松明彥, 吉田聰, 山本憲二, 熊谷英彥 申請人:麒麟麥酒株式會社