一種重組人血小板衍生生長因子bb的純化方法
2023-07-18 12:03:51 2
一種重組人血小板衍生生長因子bb的純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組人血小板衍生生長因子BB（rhPDGF-BB）的純化方法，此法包括：將rhPDGF-BB發酵液離心，取上清液，將上清液超濾濃縮、洗濾。洗濾液經離心後，分別通過陰、陽離子交換層析柱以及凝膠層析柱進行純化，即可得純度較高的rhPDGF-BB溶液。該純化方法工藝簡單，可以規模化生產，產品得率和純度高，有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種重組人血小板衍生生長因子BB的純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物技術製藥領域，具體涉及一種重組人血小板衍生生長因子BB的 純化方法。
【背景技術】
[0002]血小板衍生生長因子（Platelet derived growth factorJDGF)是存於血小板α顆粒中的一種鹼性蛋白質，是低分子量促細胞分裂素，能刺激停滯於G0/G1期的成纖維 細胞、神經膠質細胞、平滑肌細胞等多種細胞進入分裂增殖周期。血小板衍生生長因子TOGF 於1974年發現的一種刺激結締組織等組織細胞增長的肽類調節因子，因其來源於血小板 而得名，正常生理狀態下存在於血小板的α顆粒內，當血液凝固時由崩解的血小板釋放出 來並且被激活，具有刺激特定細胞趨化與促進特定細胞生長的生物活性。此外，在組織受到 損傷時巨噬細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞、內皮細胞、胚胎幹細胞等也可以合成並釋 放TOGF。肝臟受損時，巨噬細胞、血小板、浸潤的炎細胞、受損的內皮細胞及激活的肝星形細 胞均可以分泌TOGF，以自分泌、旁分泌的方式發揮作用。
[0003] I3DGF家族包括A、B、C、D4種不同的多肽鏈，通過二硫鍵形成純合或雜合二聚體，組 成5種亞型：PDGF-AA，TOGF-AB，TOGF-BB，I3DGF-CC及TOGF-DD，其中具有生物活性的均為純 合二聚體形式，而I3DGF-BB與心血管疾病的關係最為密切，相關研究較多。
[0004] I3DGF對起源於間葉的細胞包括成骨細胞具有絲裂原作用，既能促進成骨細胞增殖 和複製，又能刺激骨吸收，起雙向調節作用，維持成骨細胞-破骨細胞之間的功能性平衡， 對於骨的重建過程有重要調節作用。有研究表明TOGF與創傷修復關係密切，能直接或間接 地參與創傷修復過程中的炎症反應、組織和細胞分化與增殖過程，特別是對一些慢性難愈 性傷口如糖尿病潰瘍等有明顯的促癒合作用。研究表明在I3DGF所有亞型中，PDGF-BB促進 創傷癒合及骨組織修復、重建的作用最為肯定。
[0005]目前，生產TOGF主要方式為：通過轉基因建立工程菌的方式利用中國倉鼠卵巢細 胞、大腸桿菌以及畢赤酵母來發酵生產。目前利用中國倉鼠卵巢細胞生產TOGF的方法雖 然能生產成熟的I3DGF-BB胞外產物，但其方法還不成熟，存在發酵條件要求較高，發酵成本 高，且產量低等缺點。而大腸桿菌生產的I3DGF-BB為包涵體形式的未成熟的胞內產物，在下 遊純化過程中還要進行菌體破碎、包涵體洗滌、變性、復性等工作，存在純化步驟繁瑣、純化 成本較高等缺點。而畢赤酵母能生產成熟的I3DGF-BB胞外產物，其方法成熟，能進行高密度 發酵生產，具有成本低、產量高等優點。如"人血小板衍生生長因子B鏈基因酵母表達載體 的構建"（楊春露等，第一軍醫大學學報，2004, 24 (3))、"畢赤酵母高效表達血小板源生長 因子研究"（李培旺等，生命科學研究，2005,9 (4))等文獻中詳細描述了用畢赤酵母製備 TOGF-BB的方法，但後續畢赤酵母製備的TOGF-BB如何進行純化並沒有做詳細的研究。鑑於 畢赤酵母高密度發酵製備的I3DGF-BB發酵液中，雜質較多，特別是色素，核酸和內毒素等產 物的存在，造成純化困難，成本高昂。為此，需要找出一種易於放大，適合大生產的純化路線 及其純化方法，以解決實驗室到生產階段的放大過程中的瓶頸，為生產工藝的落地做好鋪 墊，為此本發明經過研究，找到了一種易於放大，純化效率高的純化方法。
[0006] 在本發明中，其主要的純化步驟及作用為：離心去除菌體以及可見顆粒物，超濾濃 縮，陰離子交換層析去除發酵液中帶負電荷的DNA、色素、內毒素以及部分宿主細胞蛋白，陽 離子交換層析獲目的蛋白，凝膠層析進行精純以去除痕量的雜質，從而可以得到符合製劑 要求的目的蛋白。與現有技術中的發酵液稀釋法相比，本發明的方法節省了大量的注射用 水及其緩衝液的配製，縮短了純化的時間。
【發明內容】
[0007] 本發明的主要目的是提供一種重組人血小板衍生生長因子BB的純化方法，純化 目的是將I3DGF-BB從用畢赤酵母作為表達載體經過培養分離得到的含有TOGF-BB成分的 發酵培養液中分離出來，其中，用畢赤酵母作為表達載體經過培養分離得到的含有TOGF-BB 成分的發酵培養液的生產過程屬於現有技術的範疇。
[0008] 本發明的純化方法，主要包括以下步驟：
[0009] (1)發酵液預處理：發酵液離心取上清，上清液通過膜濃縮、洗濾，然後離心取上清 液；
[0010] (2)陰離子交換層析：洗濾好的上清液通過陰離子交換層析色譜柱上樣，接收透過 液，然後通過稀釋緩衝液對其稀釋；
[0011] (3)陽離子交換層析：通過陽離子交換層析色譜柱對稀釋液進行捕獲，洗脫緩衝液 進行洗脫，得到洗脫液；
[0012](4)凝膠色譜層析：洗脫液經凝膠色譜柱純化，即可得高純度TOGF-BB。
[0013] 其中，步驟（1)中所述膜濃縮，濃縮倍數為5-15倍；膜濃縮所用膜的材質選自下列 之一：纖維素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚碸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚碸 醯胺、磺化聚碸、交鏈的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物，膜的截留分子量選自下列之一 ：1KD， 3KD，5KD，IOKD或20KD ;所述洗濾，採用緩衝液洗濾，緩衝液選自下列緩衝液之一：磷酸氫二 鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液或乙酸-乙 酸鈉緩衝液，所述洗濾緩衝液pH為3.5-4. 5,濃度為10-50mM，洗濾倍數為0-10倍。
[0014] 其中，步驟（2)所述陰離子交換層析，所使用的陰離子交換層析介質選自下列之 -：Q-SepharoseFastFlow,DEAE-SepharoseFastFlow,S0URCE30-Q,Q-SepharoseXL 或Q-BigBeds;陰離子交換層析柱首先採用平衡液進行平衡，所述平衡液選自下列緩衝液 之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液+氯化鈉，檸 檬酸-檸檬酸鈉緩衝液+氯化鈉或乙酸-乙酸鈉緩衝液+氯化鈉，平衡液PH為3. 5-4. 5， 濃度為l〇_5〇mM的緩衝液+150-250mM的氯化鈉；所述稀釋緩衝液選自下列之一：磷酸氫二 鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液或乙酸-乙 酸鈉緩衝液，所述的稀釋緩衝液pH為3. 5-4. 5,濃度為10-50mM，稀釋倍數為0-2倍。
[0015] 其中，步驟（3)所述陽離子交換層析，所使用的陽離子交換層析介質選自下列之 一 ：SP-SepharoseFastFlow,CM-SepharoseFastFlow,SP-SepharoseHP,MacroCap-SP, SP-S印haroseXL，S0URCE30-S，Capto-MMC或Capto-S，；陽離子交換層析柱首先採用平衡 液進行平衡，所述平衡液選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧 化鈉-鹽酸緩衝液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液或乙酸-乙酸鈉緩衝液，平衡液PH3. 5-4. 5,濃 度為10-50mM;所述用洗脫液進行洗脫，為分別用洗脫緩衝液1、2、3進行洗脫，其中洗脫緩 衝液1選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽 酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液+氯化鈉或乙酸-乙酸鈉緩衝液+氯化鈉；洗 脫緩衝液2選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩 衝液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫 鉀緩衝液，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液，巴比妥鈉-鹽酸緩衝液或Tris-鹽酸緩衝液；洗 脫緩衝液3選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-氫氧化 鈉-鹽酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液+氯化鈉，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩 衝液+氯化鈉，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液+氯化鈉，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液+ 氯化鈉，巴比妥鈉-鹽酸緩衝液+氯化鈉或Tris-鹽酸緩衝液-氯化鈉。
[0016] 其中，步驟（4)所述凝膠層析，所使用的凝膠層析介質選自下列之一：S^hacryl S-100,SephacrylS-200,SephacrylS-300,Sepharose6FF,Superdex75,Superdex200,Superose6或Superosel2 ;凝膠層析柱首先採用平衡液進行平衡，所使用的平衡緩衝液選 自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液，檸檬 酸-檸檬酸鈉緩衝液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液， 磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液，巴比妥鈉-鹽酸緩衝液或Tris-鹽酸緩衝液。
[0017] 本發明的純化方法，優選包括以下步驟：
[0018] 步驟（1)中所述膜濃縮，膜的截留分子量為IOKD;所述洗濾，採用緩衝液洗濾，緩 衝液選自乙酸-乙酸鈉緩衝液，其pH為3. 5-4. 5,濃度為10-50mM，洗濾倍數為0-10倍。
[0019] 其中，步驟（2)所述陰離子交換層析，所使用的陰離子交換層析介質選自 Q-Sepharose Fast Flow層析介質；陰離子交換層析柱首先採用平衡液進行平衡，所述平 衡液選自乙酸-乙酸鈉緩衝液+氯化鈉，其為pH為3. 5-4. 5,濃度為10-50mM的緩衝液 +150-250mM的氯化鈉；所述稀釋緩衝液選自乙酸-乙酸鈉緩衝液，其pH為3. 5-4. 5,濃度為 10-50mM，稀釋倍數為0-2倍。
[0020] 其中，步驟（3)所述陽離子交換層析，所使用的陽離子交換層析介質選自 SP-Sepharose Fast Flow層析介質；陽離子交換層析柱首先採用平衡液進行平衡，所述平 衡液選自乙酸-乙酸鈉緩衝液，其PH3. 5-4. 5,濃度為10-50mM;所述用洗脫液進行洗脫，為 分別用洗脫緩衝液1、2、3進行洗脫，其中洗脫緩衝液1選自乙酸-乙酸鈉緩衝液+氯化鈉， 其為pH3. 5-4. 5,濃度為10-50mM的緩衝液+150-250mM的氯化鈉；洗脫緩衝液2選自檸檬 酸-檸檬酸鈉緩衝液，其PH6. 0-7. 0,濃度為50-150mM;洗脫緩衝液3選自檸檬酸-檸檬酸 鈉緩衝液+氯化鈉，其為PH6. 0-7. 0,濃度為50-150mM緩衝液+300-700mM氯化鈉。
[0021] 其中，步驟（4)所述凝膠層析，所使用的凝膠層析介質選自SephacrylS-100層析 介質；凝膠層析柱首先採用平衡液進行平衡，所使用的平衡緩衝液選自檸檬酸-檸檬酸鈉 緩衝液，其PH6. 0-7. 0,濃度為50-150mM。
[0022] 在上述純化方法中，所有緩衝液均用濾膜過濾，濾膜孔徑為0. 22μm或0. 45μm。
[0023] 在上述純化方法中，所有的純化設備管路、色譜柱及填料、超濾膜、離心杯均用 0. 1-1.OMNaOH處理至少30分鐘除去內毒素。
[0024] 在上述純化方法中，所用的容器均幹烤除去內毒素，幹烤條件為幹烤溫度大於 150°C，幹烤時間大於2小時。
[0025] 在上述純化方法中，純化步驟的順序還可以為：①發酵液預處理②陽離子交換層 析③陰離子交換層析④凝膠色譜層析，或①發酵液預處理②陽離子交換層析③凝膠色譜層 析④陰離子交換層析，或①發酵液預處理②陽離子交換層析③凝膠色譜層析。
[0026] 本發明的純化方法，主要優點在於：純化工藝的放大簡單，適合中試及其生產規模 的純化，純化時間短，生產效率高，純化費用顯著降低，所生產出的蛋白原液均能夠滿足制 劑的各方面要求。
[0027] 本發明對純化前後的內毒素等進行了含量檢測，數據如下：
[0028]
【權利要求】
1. 一種重組人血小板衍生生長因子BB的純化方法，其特徵在於，主要包括以下步驟： (1) 發酵液預處理：發酵液離心取上清，上清液通過膜濃縮、洗濾，然後離心取上清液； (2) 陰離子交換層析：洗濾好的上清液通過陰離子交換層析色譜柱上樣，接收透過液， 然後通過稀釋緩衝液對其稀釋； (3) 陽離子交換層析：通過陽離子交換層析色譜柱對稀釋液進行捕獲，洗脫緩衝液進行 洗脫，得到洗脫液； (4) 凝膠色譜層析：洗脫液經凝膠色譜柱純化，即可得高純度重組人血小板衍生生長因 子BB ; 其中，所述重組人血小板衍生生長因子BB為畢赤酵母表達的胞外產物。
2. 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於，其中，步驟（1)中所述膜濃縮，濃縮 倍數為5-15倍；膜濃縮所用膜的材質選自下列之一：纖維素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯 乙烯、聚偏氟乙烯、聚碸、聚丙烯腈、聚醯胺、聚碸醯胺、磺化聚碸、交鏈的聚乙烯醇、改性丙 烯酸聚合物，膜的截留分子量選自下列之一 ：1KD，3KD，5KD，10KD或20KD ;所述洗濾，採用 緩衝液洗濾，緩衝液選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧化 鈉-鹽酸緩衝液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液或乙酸-乙酸鈉緩衝液，所述洗濾緩衝液pH為 3. 5-4. 5,濃度為10-50mM，洗濾倍數為0-10倍。
3. 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於，其中，步驟（2)所述陰離子交換層析， 所使用的陰離子交換層析介質選自下列之一 ：Q_Sepharose Fast Flow, DEAE-Sepharose Fast Flow, S0URCE30-Q，Q-Sepharose XL 或 Q-Big Beds,;陰離子交換層析柱首先採用平 衡液進行平衡，所述平衡液選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液+氯化鈉，檸 檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液+氯化鈉或乙酸-乙酸 鈉緩衝液+氯化鈉，平衡液pH為3. 5-4. 5,濃度為10-50mM的緩衝液+150-250mM的氯化鈉； 所述稀釋緩衝液選自下列之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝 液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液或乙酸-乙酸鈉緩衝液，所述的稀釋緩衝液pH為3. 5-4. 5,濃 度為10-50mM，稀釋倍數為0-2倍。
4. 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於，其中，步驟（3)所述陽離子交換層 析，所使用的陽離子交換層析介質選自下列之一：SP-Sepharose Fast Flow，CM_Sepharose Fast Flow，SP-Sepharose HP，MacroCap-SP，SP-Sepharose XL，S0URCE30-S，Capto-MMC 或 Capto-S ;陽離子交換層析柱首先採用平衡液進行平衡，所述平衡液選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液或 乙酸-乙酸鈉緩衝液，平衡液PH3. 5-4. 5,濃度為10-50mM ;所述用洗脫液進行洗脫，為分別 用洗脫緩衝液1、2、3進行洗脫，其中洗脫緩衝液1選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸 檬酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液 +氯化鈉或乙酸-乙酸鈉緩衝液+氯化鈉；洗脫緩衝液2選自下列緩衝液之一：磷酸氫二 鈉-檸檬酸緩衝液，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液，磷酸氫二 鈉-磷酸二氫鈉緩衝液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液， 巴比妥鈉-鹽酸緩衝液或Tris-鹽酸緩衝液；洗脫緩衝液3選自下列緩衝液之一：磷酸氫 二鈉-檸檬酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液+氯化鈉，檸檬酸-檸檬酸 鈉緩衝液+氯化鈉，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝液+氯化鈉，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩 衝液+氯化鈉，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液+氯化鈉，巴比妥鈉-鹽酸緩衝液+氯化鈉或 Tris-鹽酸緩衝液-氯化鈉。
5. 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於，其中步驟（4)所述的凝膠層析，所使 用的凝膠層析介質選自下列之一 ：Sephacryl S-100, Sephacryl S-200, Sephacryl S-300， Sepharose6FF，Superdex75, Superdex200, Superose6 或 Superosel2 ;凝膠層析柱首先米用 平衡液進行平衡，所使用的平衡緩衝液選自下列緩衝液之一：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液， 檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩衝液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝 液，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩衝液，巴比妥鈉-鹽酸緩衝 液或Tris-鹽酸緩衝液。
6. 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於，其中，步驟（1)中所述膜濃縮，膜的 截留分子量為10KD ;所述洗濾，採用緩衝液洗濾，緩衝液選自乙酸-乙酸鈉緩衝液，其pH為 3. 5-4. 5,濃度為10-50mM，洗濾倍數為0-10倍。 其中，步驟（2)所述陰離子交換層析，所使用的陰離子交換層析介質選自Q-Sepharose Fast Flow層析介質；陰離子交換層析柱首先採用平衡液進行平衡，所述平衡液選自乙 酸-乙酸鈉緩衝液+氯化鈉，其pH為3. 5-4. 5,濃度為10-50mM的緩衝液+150-250mM的氯 化鈉；所述稀釋緩衝液選自乙酸-乙酸鈉緩衝液，其pH為3. 5-4. 5,濃度為10-50mM，稀釋倍 數為0-2倍。 其中，步驟（3)所述陽離子交換層析，所使用的陽離子交換層析介質選自SP-Sepharose Fast Flow層析介質；陽離子交換層析柱首先採用平衡液進行平衡，所述平衡液選自乙 酸-乙酸鈉緩衝液，其PH3. 5-4. 5,濃度為10-50mM ;所述用洗脫液進行洗脫，為分別用洗 脫緩衝液1、2、3進行洗脫，其中洗脫緩衝液1選自乙酸-乙酸鈉緩衝液+氯化鈉，其pH為 3. 5-4. 5,濃度為10-50mM的緩衝液+150-250mM的氯化鈉；洗脫緩衝液2選自檸檬酸-檸檬 酸鈉緩衝液，其PH6. 0-7. 0,濃度為50-150mM ;洗脫緩衝液3選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液 +氯化鈉，其pH為6. 0-7. 0,濃度為50-150mM緩衝液+300-700mM氯化鈉。 其中，步驟（4)所述凝膠層析，所使用的凝膠層析介質選自Sephacryl S-100層析介 質；凝膠層析柱首先採用平衡液進行平衡，所使用的平衡緩衝液選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩 衝液，其 PH6. 0-7. 0,濃度為 50-150mM。
7. 根據權利要求1-6任一所述的純化方法，其特徵在於所述的所有緩衝液均用濾膜過 濾，濾膜孔徑為〇. 22 u m或0. 45 u m。
8. 根據權利要求1-6任一所述的純化方法，其特徵在於所述的純化方法中所有的純化 設備管路、色譜柱及填料、超濾膜、離心杯均用0. 1-1. 〇M NaOH處理至少30分鐘除去內毒 素。
9. 根據權利要求1-6任一所述的純化方法，其特徵在於所述的純化方法中所用的容器 均幹烤除去內毒素，幹烤條件為幹烤溫度大於150°C，幹烤時間大於2小時。
10. 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於純化步驟的順序還可以為：①發酵液 預處理②陽離子交換層析③陰離子交換層析④凝膠色譜層析，或①發酵液預處理②陽離子 交換層析③凝膠色譜層析④陰離子交換層析，或①發酵液預處理②陽離子交換層析③凝膠 色譜層析。
【文檔編號】C07K14/49GK104327180SQ201310309907
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年7月23日 優先權日:2013年7月23日
【發明者】李劍, 範寶慶, 徐立華, 李靜, 張學況, 張玲, 薛雯, 曹小丹 申請人:天士力製藥集團股份有限公司